JP5963260B2 - 新規高温性酢酸生産菌 - Google Patents
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Description
[1] 受託番号NITE P−1412又は受託番号NITE P−1413によって特定されるモーレラ属細菌株。
[2] 相同組換え法による形質転換効率が、モーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica) ATCC39073と比較して高い、請求項1に記載のモーレラ属細菌株。
[3] [1]又は[2]に記載のモーレラ属細菌株において、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子が相同組換え法により破壊された、モーレラ属細菌株。
[4] ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、[3]に記載のモーレラ属細菌株。
[5] [3]に記載のモーレラ属細菌株においてピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の機能が相同組換え法により相補されたモーレラ属細菌株。
[6] ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、[5]に記載のモーレラ属細菌株。
[7] [1]又は[2]に記載のモーレラ属細菌株を相同組換えにより形質転換することを特徴とする、形質転換方法。
[8] [1]又は[2]に記載のモーレラ属細菌株を相同組換えにより形質転換することを特徴とする、形質転換モーレラ属細菌株の製造方法。
[9] 相同組換え法によりピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を破壊することを含む、[7]又は[8]に記載の方法。
[10] ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、[9]に記載の方法。
[11] [3]又は[4]に記載のモーレラ属細菌株の前記破壊されたピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を、相同組換え法により相補することを含む、形質転換方法。
[12] [3]又は[4]に記載のモーレラ属細菌株の前記破壊されたピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を、相同組換え法により相補することを含む、形質転換モーレラ属細菌株の製造方法。
本発明に係るモーレラ属細菌の性質について説明する。本発明に係るモーレラ属細菌は、モーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)ATCC39073と比較して高い効率で形質転換することができる。形質転換は相同組換え法により行うことができる。好ましくは、本発明に係るモーレラ属細菌は相同組換え法により形質転換した場合、モーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)ATCC39073と比較して形質転換効率が20倍以上高い。
〔形態的性質〕
(1) 細胞の形及び大きさ: Y72株は光学顕微鏡により細胞形態は桿菌(0.8-1.0X2.0-3.0μm)であった。
(2) 運動性の有無:Y72株は運動性を示さなかった。
(3) グラム染色:Y72株はグラム染色された。
Y72株の寒天培地上でのコロニー形態は、直径2.0-3.0mm、色調 クリーム色、形 円形、隆起状態 扁平、周縁 全縁、表面の形状 スムーズ、透明度 不透明、粘稠度 バター様であった。
最適生育pHは6.0〜6.5である。生育可能pHは4.5〜7.0である。生育可能温度は45℃〜65℃である。最適生育温度は60〜65℃である。
Y72株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列をシークエンサーを用いて配列決定した。得られた塩基配列を用いてブラストサーチを行い、類似する塩基配列を調べた。
その結果、16S rRNA遺伝子について、Y72株はMoorella sp. HUC22-1株と100%、M. thermoacetica ATCC39073株と99.9%の高い配列相同性が示された。
Y72株は偏性嫌気性であった。また、無機栄養性であった。
Y72株は、Moorella sp. HUC22-1株やM. thermoacetica ATCC39073株と比較して効率的に形質転換することができた。
〔形態的性質〕
(1) 細胞の形及び大きさ: Y73株は光学顕微鏡により細胞形態は桿菌(0.8-1.0X2.0-3.0μm)であった。
(2) 運動性の有無:Y73株は運動性を示さなかった。
(3) グラム染色:Y73株はグラム染色された。
Y73株の寒天培地上でのコロニー形態は、直径2.0-3.0mm、色調 クリーム色、形 円形、隆起状態 扁平、周縁 全縁、表面の形状 スムーズ、透明度 不透明、粘稠度 バター様であった。
最適生育pHは6.0〜6.5である。生育可能pHは4.5〜7.0である。生育可能温度は45℃〜65℃である。最適生育温度は60〜65℃である。
Y73株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列をシークエンサーを用いて配列決定した。得られた塩基配列を用いてブラストサーチを行い、類似する塩基配列を調べた。
その結果、16S rRNA遺伝子について、Y73株はMoorella sp. HUC22-1株と99.9%、M. thermoacetica ATCC39073株と99.8%の高い配列相同性が示された。
Y73株は偏性嫌気性であった。また、無機栄養性であった。
Y73株は、Moorella sp. HUC22-1株やM. thermoacetica ATCC39073株と比較して効率的に形質転換することができた。
本発明に係るモーレラ属細菌株は形質転換することができる。形質転換方法としては典型的には相同組換え法が挙げられるが、複製起点を有し宿主細胞内で増殖するプラスミドベクターを用いる方法や本発明に係るモーレラ属細菌株に感染するウイルスを用いる方法も想定される。
相同組換え(当技術分野においてダブルクロスオーバーとも言う)は、1対の2本鎖DNAの相同な塩基配列を有する部分に起こる組換えであり、これにより人工的にゲノム上の特定の遺伝子を変化させることができる。ゲノム上の特定の塩基配列と相同性を有するDNAを細胞に導入すると、当該相同部分(相同性部位)同士の間で組換えが起こり、外来DNAがゲノム中に取り込まれる。この性質を利用して特定の遺伝子を欠失若しくは破壊したり、又は他の遺伝子と置き換えたりすることができる。また、ゲノム中の非コード領域に遺伝子を導入することもできる。これにより破壊された遺伝子又は有用遺伝子を有する、形質転換体が得られる。
1.1 培地組成
培地にはClostridium ljungdahliiの培養に用いられるATCC 1754 PETC medium (http://www.atcc.org/Attachments/2940.pdf)を改変したものを基本培地として用いた。改変として、システイン・HCl・H2Oの最終濃度を0.6 g・l-1に減らしNa2S・9H2Oを除いた。培地作製は、還元剤(システイン・HCl・H2O, 30 g l-1)と基質(フルクトース等)を別に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Hungateの方法(Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol. 3B: 117-32 (1969))を改変したMillerらの方法(Miller, T. L. and Wolin, M. J.: A serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl. Microbiol. 27 (5): 985-7 (1974))を用いた。各成分の組成と調製手順を以下に示す。また、下記に行われる実験における培地は特に断らない限り、この培地を使用している。
表1に基本培地ATCC 1754 PETC 培地の組成を示す。また脚注に同培地の作製方法を説明する。
培地が青から赤に変色するまでボイル(20分)する
N2/CO2(80:20)を注入しながら氷中で冷却(20分)する
予めCO2を注入しておいた100 mlバイアル瓶に45 mlずつ分注する
さらに3分CO2を注入する
ブチルゴム栓とアルミシールで密閉後オートクレーブ(121℃, 15分)する。
KOHでpH6.0に調整後、他の試薬を添加する
蒸留水(dH2O)で1Lにフィルアップする
遮光し4℃に保存する。
蒸留水(DW) 100 mLを20分ボイルする
N2を注入しつつ氷中で室温まで冷却する
L-システイン・HCl・H2O 3.0 gを添加する(上記のとおり濃度を改変した。またNa2S・9H2Oを除いた)
N2を注入しつつさらに氷中で20min冷却する
N2を注入した滅菌済みバイアル瓶に、0.45 μmフィルターで濾過滅菌しつつ注入する
遮光して常温保存する
上記のようにして作製した還元剤は、使用時には、培地に対して1/100の量を添加する。
広島県の畑由来の土壌サンプル約1gを10mlの基本培地に懸濁した。懸濁したサンプルの上精1mlを50mlの基本培地が入ったバイアルに植菌し、H2(80%)+CO2(20%)ガスを封入した。これを55℃で1か月培養し、ガスの消費が確認されたバイアルから培養液を5ml抜き取り、50mlの基本培地が入ったバイアルへ植菌し、55℃で継代培養(H2+CO2ガス)した。この際、ガスの消費はバイアル内部が陰圧になり、ブチルゴム栓がへこむことによって確認した。菌の増殖及びガスの消費が確認されたバイアルから培養液を抜き取り、適度に希釈してロールチューブ法(Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol., 3B, 117-132 (1969))によるコロニー単離を試みた。ロールチューブの作製はHungateの方法(Hungate, (1969)前掲)に従った。炭素源としてはフルクトース(4g/L)を用いた。コロニーが形成されたバイアルからコロニーを取得し、5mlの基本培地+フルクトース(4g/L)へ植菌した。これを55℃で2〜3日培養し、菌体の増殖が確認されたバイアルから培養液を抜き取り、50mlの基本培地へ植菌し、55℃で培養(H2+CO2ガス)した。
畑の土を分離源としてガス資化性菌をスクリーニングした結果、ガス消費が確認されたバイアルを得た。ロールチューブ法によるコロニー単離により、8株のガス資化性菌を取得することができた。これらの株の中から、増殖の速い株を2株選択し、それぞれY72株、Y73株とした。
2.1 方法
ゲノムDNAはNucleoSpin Tissue (TAKARA BIO INC., Shiga, Japan)を用いて抽出した。16s rDNAはプライマーセット16s-F(GAAGAGTTTGATCATGGCTCAG:配列番号3)及び16s-R(AGGTGATCCAACCGCAGGTTC:配列番号4)を用いて増幅した。PCR酵素として、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.)を用いた。PCR産物はEcoRV処理したpBlueScript II SK(+)を用いてクローニングした。DNA配列を決定し、16s rDNA塩基配列の相同性(類似性)はBLASTとGenetyxソフトウェア(Genetyx, Tokyo, Japan)を用いて解析した。
Y72株とY73株の16s rDNAの配列(1516bp)は、それぞれ図1及び図2に示した。Y72株及びY73株の16s rDNA配列の相同性を検索したところ、表4に示すようにMoorella属細菌との相同性が高かった。特に、Moorella sp. HUC22-1株とは100%(Y72株)及び99.9%(Y73株)、M. thermoacetica ATCC39073株とは99.9%(Y72株)及び99.8%(Y73株)と非常に高い相同性を示した。これらの結果から、Y72株及びY73株はMoorella属細菌である可能性が強く示唆された。
3.1 方法
3.1.1 最適温度
Y72株及びY73株を基本培地+フルクトース(2g/L)で前培養した。スクリューキャップ付試験管に基本培地+イーストエキストラクト(1g/L)+フルクトース(2.5g/L)を8ml入れ、これに前培養液を10%植菌し、OD660を経時的に36時間まで測定した。
OD660の経時変化をもとに、数式1に基づき比増殖速度[μ(h-1)]を求めた。
Y72株及びY73株は基本培地+フルクトース(2g/L)で前培養した。スクリューキャップ付試験管に基本培地+イーストエキストラクト(1g/L)+フルクトース(2.5g/L)を8ml入れ、HCl又はNaOHを用いてpHを5.0、5.5、6.0、6.5、6.8、7.0に調整した。pHを安定させるため、各pHに合わせたリン酸バッファー又はMES-NaOHバッファーを50mMとなるように加えた。前培養液を10%植菌し、OD660を経時的に測定した。増殖と共に酢酸が生産され、pHが低下していくため培養12時間目までの経時変化をもとにμを求めた(数1)。
3.2.1 最適温度
Y72株及びY73株の最適温度は60〜65℃であった(図3)。M. thermoacetica ATCC39073株及びMoorella sp. HUC22-1株の最適温度は55〜60℃と報告されているため、Y72株及びY73株はそれらの株よりも若干最適温度が高かった。
種々のpHにてY72株及びY73株を培養し、最適pHを決定した。その結果、Y72株及びY73株の最適pHは6.0〜6.5であった。なおM. thermoacetica ATCC39073株の最適pHは6.9、Moorella sp. HUC22-1株の最適pHは5.7〜6.7とそれぞれ報告されている。
生化学的試験はアピケンキAPI20A(シスメックス・ビオメリュー株式会社)を用いて実施した。
Y72株 カタラーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性。インドール産性陰性、ウレアーゼ陰性、酸化試験はグルコース陽性、D-マンニトール陰性、ラクトース陰性、サッカロース陽性、マルトース陽性、サリシン陽性、D-キシロース陽性、L-アラビノース陽性、グリセリン陽性、D-セロビオース陽性、D-マンノース陽性、D-メレチトース陽性、D-ラフィノース陽性、D-ソルビトール陰性、L-ラムノース陰性、D-トレハロース陽性)、ゼラチン加水分解陽性、エスクリン加水分解陽性
Y73株 カタラーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性。インドール産性陰性、ウレアーゼ陰性、酸化試験はグルコース陽性、D-マンニトール陰性、ラクトース陰性、サッカロース陽性、マルトース陽性、サリシン陰性、D-キシロース陽性、L-アラビノース陽性、グリセリン陽性、D-セロビオース陽性、D-マンノース陽性、D-メレチトース陽性、D-ラフィノース陽性、D-ソルビトール陰性、L-ラムノース陰性、D-トレハロース陽性)、ゼラチン加水分解陽性、エスクリン加水分解陽性。
5.1 形質転換システムについて
M. thermoacetica ATCC39073株、Y72株、Y73株の形質転換は、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して行った。マーカーとして、以前の研究(特願2012-119501)で構築済みであるカナマイシン耐性遺伝子kanr及び、ウラシル合成に関与するオロチン酸一リン酸(OMP)デカルボキシラーゼの遺伝子pyrFを用いた。pyrF破壊株はウラシル要求性及び5-フルオロオロチン酸(5-FOA)耐性を示すようになるため、pyrFをマーカーとして使用することが可能となる。以前の研究でpyrF破壊株を構築する際に、自発的変異によって5-FOA耐性株が多数出現することが問題となっていた。そこで今回はpyrFをkanrと置換することにより、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を取得することにした(図4の(A))。また、得られたpyrF破壊株のkanrをpyrFと置換する相補試験を行った(図4の(B))。
PCRキットとしてKOD-FX-Neo(Toyobo社)を用いた。M. thermoacetica ATCC39073株、Y72株、Y73株の全DNAを鋳型とし、プライマーpyrF-up-F (5’-TGACGTGGAAGATGAGGTACACC:配列番号5)及びpyrF-dn-R(5’-tggctccacgccaaggatatc:配列番号6)を用いてPCRを行い、pyrF周辺領域約2.7kbを増幅した。M. thermoacetica ATCC39073株、Y72株、Y73株のtotal DNA由来PCR産物をSmaIで切断したpK18mobへクローニングし、それぞれpK18-pyrF-ATCC、pK18-pyrF-Y72、 pK18-pyrF-Y73を構築した(図4の(B))。以前の研究(特願2012-119501)で構築したプラスミドpK18-kanrを鋳型とし、プライマーG3PD-F12(AAGGGCTTCTGGCCTTGGACGGTTGCCAAGTACC:配列番号7)及びKmr-R12(ATGAAAGCAGGCCGAAGGCCGACTAAAACAATTCATCCAG:配列番号8)を用いて、カナマイシン耐性遺伝子(kanr)を増幅した。プラスミドpK18-kanrはM. thermoacetica ATCC39073株およびその派生株の染色体上(pyrF周辺領域)へkanrを挿入するためのプラスミドである。pK18-kanrのSmaIサイトにはインサートとして、pyrF上流約1kb-pyrF- kanr-pyrF下流約1kbが挿入されている。このkanr遺伝子にはM. thermoacetica ATCC39073株由来のグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(G3PD)プロモーターが融合されている。pK18-pyrF-ATCC、pK18-pyrF-Y72、 pK18-pyrF-Y73を鋳型とし、プライマーpyrF-1765-in-F12(TCGGCCTGCTTTCATGCTTG:配列番号9)及び pyrF-in-R12(AGGCCAGAAGCCCTTAAATATCG:配列番号10)を用いてインバースPCRを行い、pyrF領域を除去した。In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA)を用いて、上記のインバースPCR産物にkanrをクローニングし、pK18-kan-ATCC、pK18-kan-Y72又はpK18-kan-Y73を構築した(図4)。
菌株は基本培地(H2+CO2ガス)、55℃で培養した。OD660=0.1〜0.15まで増殖した菌体を遠心分離(5800×g、10分、4℃)で集菌した。ペレットを272mMのスクロースバッファーに懸濁し2回洗浄した。洗浄した菌体は適量(2〜3ml)のスクロースバッファーに懸濁した。400μlの細胞懸濁液にプラスミドを1〜2μgとなるように添加し、2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移した。1.5kV、500Ω、50μFの条件でパルスをかけた後、直ちに5mlの基本培地(4g/Lフルクトース)に植菌した。55℃で48時間培養後に、ロールチューブ法によりコロニー単離を行った。pyrF破壊株を構築する際、又は培養する際は培地にウラシルを10mg/Lとなるように添加した。またkanr挿入株を得る際にはカナマイシンを300mg/Lとなるように添加した。
5.3.1 pyrF破壊株の構築
M. thermoacetica ATCC39073株、Y72株、Y73株をpK18-kan、pK18-kan72、pK18-kan73を用いて形質転換した(図4の(A))。カナマイシンを指標とした選択によって、Y72株及びY73株でpyrF破壊株が得られた。しかし、M. thermoacetica ATCC39073株では自発的変異によるカナマイシン耐性株が多数出現したため、カナマイシン及び5-FOAを同時に用いて2つの選択圧を与えることによりpyrF破壊株を構築することができた。得られた形質転換体から染色体を抽出し、プライマーpyrF-up-F2(TGTCCTCAACACCCTCACC:配列番号11)及びpyrF-dn-R2(TCTTCCCAGGTCCTGTAGG:配列番号12)を用いてPCRを行うことによって形質転換体の確認を行った。PCR産物を電気泳動した結果を図5に示す。レーンMはDNA ladder marker。レーン1、3、5はそれぞれM. thermoacetica Y72、Y73、ATCC39073株に由来するpyrF周辺領域の増幅バンド(約1.6kb)。レーン2、4、6はそれぞれY72、Y73、ATCC39073株のpyrF破壊株(ΔpyrF株)に由来するpyrF周辺領域の増幅バンド(約1.85kb)。ΔpyrF株はpyrFがkanrに置換されているため、野生株と比較して約0.25kb長いバンドが確認できた。また、実際にPCR産物をシークエンシングすることによって、kanrが確かにpyrFと置換されていることを確認した。
5.3.1で得られた各破壊株、M. thermoacetica ATCC39073ΔpyrF株、Y72ΔpyrF株、Y73ΔpyrF株をプラスミドpK18-pyrF-ATCC、pK18-pyrF-Y72、pK18-pyrF-Y73を用いて形質転換した。ウラシル要求性を指標とした選択により、すべての株においてpyrF相補株が得られた。得られた形質転換体から染色体を抽出し、プライマーpyrF-up-F2及びpyrF-dn-R2を用いてPCRを行うことによって形質転換体の確認を行った。PCR産物を電気泳動した結果を図6に示す。レーンMはDNA ladder marker。レーン1、3、5はそれぞれM. thermoacetica Y72、Y73、ATCC39073株に由来するpyrF周辺領域の増幅バンド(約1.6kb)。レーン2、4、6はそれぞれY72ΔpyrF株、Y73ΔpyrF株、ATCC39073ΔpyrF株のpyrF相補株に由来するpyrF周辺領域の増幅バンド(約1.6kb)。ΔpyrF株のkanrをpyrFで置換しているため、野生株と同じ長さのバンドが確認できた。また、コントロールとしてpK18mobを使って形質転換を行ったが、すべての株においてコロニーは得られなかった。M. thermoacetica ATCC39073、Y72、Y73(pyrF破壊株)の相補試験における形質転換効率は、それぞれ(4.1 ± 2.6)×101、(8.6 ± 6.1)×102、(8.0 ± 2.4)×102であった。
NITE P−1413
Claims (12)
- 受託番号NITE P−1412又は受託番号NITE P−1413によって特定されるモーレラ属細菌株。
- 相同組換え法による形質転換効率が、モーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica) ATCC39073と比較して高い、請求項1に記載のモーレラ属細菌株。
- 請求項1又は2に記載のモーレラ属細菌株において、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子が相同組換え法により破壊された、モーレラ属細菌株。
- ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、請求項3に記載のモーレラ属細菌株。
- 請求項3に記載のモーレラ属細菌株においてピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の機能が相同組換え法により相補されたモーレラ属細菌株。
- ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、請求項5に記載のモーレラ属細菌株。
- 請求項1又は2に記載のモーレラ属細菌株を相同組換えにより形質転換することを特徴とする、形質転換方法。
- 請求項1又は2に記載のモーレラ属細菌株を相同組換えにより形質転換することを特徴とする、形質転換モーレラ属細菌株の製造方法。
- 相同組換え法によりピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を破壊することを含む、請求項7又は8に記載の方法。
- ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子がオロチン酸一リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)である、請求項9に記載の方法。
- 請求項3又は4に記載のモーレラ属細菌株の前記破壊されたピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を、相同組換え法により相補することを含む、形質転換方法。
- 請求項3又は4に記載のモーレラ属細菌株の前記破壊されたピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を、相同組換え法により相補することを含む、形質転換モーレラ属細菌株の製造方法。
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