JP2016531589A - 単離されたストレプトマイセス属の細菌 - Google Patents
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Abstract
Description
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された細菌、及び
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される。
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された細菌、及び
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される単離された細菌に関する。
− ヒトに対して非病原性(無害)である;
− グラム陽性細菌である;
− 腐生菌、つまり、土壌の有機物を分解する能力をもつ菌である。
− ISP−2培地又はベネット固形培地で培養された場合、固形培地の組成に応じて黄−褐色から灰−褐色に変化する色の、固形培地の奥で増殖した分枝した菌糸体、いわゆる基中菌糸を有する;
− ISP−2培地又はベネット固形培地で培養された場合、白色の空気/固体界面で増殖する空中菌糸を有する;
− 12℃から37℃、好ましくは28℃から30℃の至適増殖温度を有する;
− 6から8を含む至適増殖pHを有する;
− 炭素源として、D−グルコース、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトース及びデキストリンを利用する能力をもつ;
− 唯一の炭素源として、優先的にガラクトース、イノシトール、ソルボース、フルクトース、アラビノース、ラフィノース、ラムノース、セルロースを使用する能力をもたない;
− 窒素源として、アミノ酸、硝酸塩及びアンモニウム塩を使用する能力をもつ;
− 硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力をもち、アデニン、tween20及び酢酸ナトリウムを分解できる;
− デンプンを加水分解する能力をもたず、その加水分解産物を利用できない。
− 液体組成物は栄養増殖期の細菌、つまり、活性な代謝を呈している、及び/又は細胞分裂により増殖している細菌を含む。生菌は、したがって、栄養増殖期又は定常期にある。
− 前記液体培地は水性培養培地、特に、本発明に係る細菌の増殖に必要な全ての無機成分と有機前駆体、特に、炭素源、窒素源、リン源、ビタミン及び痕跡元素を含む完全培地及び富栄養培地からなる群より選択される水性培養培地である。
− 前記液体培地は、D−グルコース、酵母抽出物、リン酸二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、及びグリセリンを含む。
− 液体組成物は、胞子の形態にある本発明に係る細菌を含む。本発明に係る細菌−例えば、番号I−4467の下、CNCMに対して寄託された本発明の第1の変形形態に係る細菌、又は本発明の第2の変形形態に係る細菌、番号I−4467の下、CNCMに寄託され、登録された前記細菌の変異体−が、空気/固体界面で増殖して一次菌糸体を形成し、空中増殖を開始するとき、胞子の形成が観察される。分岐していない空中のフィラメント又は「菌糸」は、そのとき、一次菌糸体から発生し、その端部に胞子前駆体の区画化構造を有する。これは、したがって、胞子の形態にある生菌である;
− 配列番号1の配列に100%相同であるDNA配列を含む前記胞子;
− 胞子は滑らかで、「S」型の螺旋状につながれており、これらの滑らかな胞子鎖は平均10から50個の胞子を有する;
− 前記液体培地はストレス誘発因子として、D−グルコース、酵母抽出物、ペプトン、炭酸カルシウム(CaCO3)を含む。
− 本発明に係る少なくとも1つの細菌を、前記細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、24時間より長い期間、12℃から37℃の温度で培養し、それから;
− 無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細胞を抽出するか、細菌を不活化する。
− 本発明に係る細菌;
− 本発明に係る液体組成物;
− 本発明に係る固形組成物;
− 本発明に係る無細胞性組成物。
当業者に公知の方法により、細菌の16S rDNAの配列を解析する。このために、本発明に係る細菌を液体培地中で培養し、それから、そのゲノムDNAを抽出し、以下を用いたPCR(「ポリメラーゼ連鎖反応」)によって、16S rDNAの配列を選択的に増幅させる:
− 以下の配列番号2の配列のユニバーサルプライマー「27f」、
「agagtttgat cctggctcag」、及び;
− 以下の配列番号3の配列のユニバーサルプライマー「1492r」、
「ggttaccttg ttacgactt」。
− 98℃で3分間、変性;
− 「Taqポリメラーゼ」の添加;
− 以下を含む30サイクルの増幅:
■ 94℃で1分間の加熱段階、続いて;
■ 52℃で1分間の加熱段階、続いて;
■ 72℃で2分間の加熱段階、続いて;
− 72℃で10分間の伸長段階。
番号I−4467の下、CNCMに寄託されたもののような本発明に係る細菌の一定量の種菌を20倍量の富栄養培地に播種する。バイオマスの生産のための、そのような富栄養培地は例えば、pH7.2でD−グルコース、酵母抽出物、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、塩化カリウム(KCl)及びグリセロールを含む。培養を5日間、30℃の温度に維持する。
本発明に係る細菌の一定量の種菌を20倍量の胞子形成培地に播種する。例えば、胞子形成液体培地は、pH7.2でD−グルコース、酵母抽出物、ペプトン、炭酸カルシウム(CaCO3)及び蒸留水から形成される。
本発明に係る細菌を含む液体組成物は、例えば、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌及びストレプトマイセス・スカビエスなどの特定の細菌の増殖の阻害能を有する。
CNCMに寄託された株の細菌を固形寒天ベネット培地に播種し、固体処理組成物を形成するように、この播種した培地を5日間、30℃に置く円筒法(Bauer等, 1996)により、標的微生物の増殖の阻止活性を測定し、定量する。固体処理組成物の円筒形の断片、例えば、直径6mmの円筒形の断片を採取し、標的微生物、例えば、植物病原性の標的微生物を播種した培養培地の表面に、この円筒形の断片を置く。標的微生物の培養培地は、例えば、植物病原性真菌用のPDA(「ポテトデキストロース寒天」)培地又は植物病原性細菌用のベネット培地であり得る。標的微生物を播種した培地における本発明に係る細菌の培養培地の化合物の拡散を可能とするように、標的微生物を播種した培養培地の表面に4℃で4時間、円筒形の断片を維持する。
本発明に係る細菌は、培養培地の固形栄養素−特にリン−の可溶化を促進する。本発明者らは、リン酸カルシウム粉末によって不透明化された固形寒天培地(9)において、本発明に係る細菌のコロニー(2)を取り囲む半透明の光輪(10)の形成を観察した(図3)が、これは、細菌によるリン酸カルシウムの可溶化を証明している。本発明に係る細菌は、植物により吸収されない固形施肥製品の−植物の根圏における−溶解を増大させ、植物の栄養を改善することができる。
本発明に係る細菌の栄養型の細胞と胞子を含む、本発明に係る液体組成物を調製し、ヒマワリの種子とトウモロコシの種子に対して薄膜コーティングによって適用する。液体組成物は、組成物1リットル当たり1から2gの細菌を含むが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。並行して、本発明に係る組成物によって処置していない対照として、ヒマワリ(図4a)及びトウモロコシ(図5c)の種まきと苗の栽培を行う。また、本発明者らは、ヒマワリの苗(図4b)及びトウモロコシの苗(図5d)の初期の成長の刺激も観察した。種子に対して適用した本発明に係る細菌は、ヒマワリやトウモロコシのような植物の成長−特に植物の地上部の成長−を刺激することができる。
CNCMに寄託された株の前培養1体積を60体積の水に懸濁させることにより、本発明に係る細菌の栄養型細胞と胞子を含む本発明に係る液体組成物を調製する。前培養は、定常増殖期にある培養であり、前培養液1リットル当たり約10g(湿重量)の細菌を含む。16.4グラムのナタネと490μlの液体組成物(つまり、30リットルの液体組成物中に約1トンのナタネ種子)を混合して均質化することによって、ナタネの種子上に本発明に係る液体組成物の膜を形成するように、本発明に係る液体組成物を種子に適用する。液体組成物は、組成物1リットル当たり1から2gの細菌を含むが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。「Pikaw」培養培地上に、本発明に係る組成物でコーティングされたナタネの種子の種まきを行う。実生の成長の8日後、本発明に係る組成物で処置した種子から得られた実生の根の部分12を回収し、秤量する。本発明の組成物で処置した種子から得られたナタネ実生の根部の質量は85mgであり、コントロールとして本発明に係る細菌を含まない組成物で処置した種子から得られたナタネ実生の根部12の質量(59mg)を上回っている。図6a及び図6bにそれぞれ示されている処置及び未処置のナタネ実生の写真を再現したものは、コントロールとして本発明に係る細菌を含まない組成物で処置したナタネ実生の根部11に比べて増大した、本発明に係る組成物で処置したナタネ実生の根部12の成長を示している。CNCMに寄託されたもののような本発明に係る細菌を含む液体組成物は、ナタネの発芽と実生の成長を刺激する。
Claims (16)
- 16S rDNAと呼ばれる配列番号1の配列に100%相同である細菌の16SリボゾームRNAをコードするDNA配列を含む、単離された細菌であって、以下からなる群:
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された細菌、及び
− CNCMに対して寄託され、番号I−4467の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される細菌。 - ストレプトマイセス(Streptomyces)属のものであることを特徴とする、請求項1に記載の細菌。
- 配列番号4に相同なRNAポリメラーゼのβサブユニット(polB)をコードするDNA配列を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の細菌。
- 配列番号5に相同なジャイレース(gyrB)をコードするDNA配列を有することを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の細菌。
- 配列番号6に相同なリコンビナーゼ(RecA)をコードするDNA配列を有することを特徴とする、請求項1から4の何れか一項に記載の細菌。
- 配列番号7に相同なトリプトファンシンターゼのβサブユニット(trpB)をコードするDNA配列を有することを特徴とする、請求項1から5の何れか一項に記載の細菌。
- 配列番号8に相同なATPシンターゼのβサブユニット(AtpB)をコードするDNA配列を有することを特徴とする、請求項1から6の何れかに記載の細菌。
- 灰色かび病菌(Botrytis cinerae)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フィチウム・ウルチムム(Pythium ultimum)、ファエモニエラ・クラミドスポラ(Phaeomoniella chlamydospora)、ファエモニエラ・アエロフィルム(Phaeomoniella aelophilum)、エウティパ・ラタ(Eutypa lata)、フォミチポリア・メジテラネア(Fomitiporia mediterranea)及びボトリオスフェリア・オブツサ(Botryosphaeria obtusa)からなる群より選択される、標的微生物と呼ばれる少なくとも1つの微生物の増殖を遅らせる能力をもつことを特徴とする、請求項1から7の何れか一項に記載の細菌。
- 請求項1から8の何れか一項に記載の少なくとも1つの細菌を含む組成物。
- 請求項1から8の何れか一項に記載の細菌を液体培地中に含む液体組成物であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 栄養増殖期の細菌を含むことを特徴とする、請求項10に記載の組成物。
- 胞子の形態にある細菌を含むことを特徴とする、請求項9から11の何れか一項に記載の組成物。
- 固体であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- − 請求項1から8の何れか一項に記載の少なくとも1つの細菌を、細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、24時間より長い期間、12℃から37℃の温度で培養し、次いで;
− 無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細菌を抽出するか、細菌を不活性化する
方法によって得ることができる無細胞組成物。 - 配列番号1の配列に100%相同なDNA配列を含む、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- 11.925分の保持時間における第1の主要なシグナルと20.04分の保持時間における第2の主要なシグナルを含む、水中20%から95%のアセトニトリル勾配により0.8mL/minの流速で25cm/4.6mm/5μmのサイズのXbridgeカラムにより行われるHPLCのクロマトグラムを示すことを特徴とする、細菌の培養培地から形成される請求項14又は15に記載の組成物。
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