KR20160058942A - 스트렙토마이세스 종의 분리된 박테리아 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아의 16S 리보좀 RNA를 암호화하는 16s rDNA를 의미하는 DNA 서열을 포함하는 분리된 박테리아와 관련되는 것으로서, 상기에서 DNA 서열은 SEQ ID NO.1과 100% 상동이고, 상기 분리된 박테리아는 다음을 포함하는 군으로부터 선택된다: 프랑스 국립 미생물 보존기관 (CNCM)에 제1-4467호로 제출되고 등록된 박테리아; 및 CNCM에 제I-4467호로 제출되고 등록된 상기 박테리아의 돌연변이.
Description
본 발명은 스트렙토마이세스 종에서 분리된 신규 박테리아, 적어도 하나의 상기 박테리아를 포함하는 조성물, 및 적어도 하나의 상기 박테리아를 배양함으로써 획득될 수 있는 무-세포 조성물에 관한 것이다.
집약적 농업 작물의 개발은 오늘날 전 세계적 식량 필요를 충족하기 위해 필요하다. 이러한 집약적 작물재배는 작물의 성장촉진 및 원치않는 작물 및/또는 병균의 번식을 최소화하기 위해 농업적 관점의 작물의 영양을 최적화하는 제제의 사용이 필요하다. 특히 작물의 영양 최적화용도의 제제, 병원균, 특히 식물의 최적의 성장에 영향을 미칠 수 있는 식물 병원균 및/또는 곰팡이에 대항하는 작물보호용 제제가 사용된다.
화학비료는 종종 고체형태이며 땅에 잘 용해되지 않으며, 작물 최적의 성장을 위해 상기 비료 제품이 필요한 곳에 정확한 시기에 대량으로 들여와야 한다. 작물이 사용하지 않고 토양에 남은 고체형 비료 제품의 과잉 분은 토양이 일시적으로 남아 있다가 빗물 또는 관개용 물을 통해 점차적으로 용해되고 이는 강과 지하수층의 오염을 일으킨다.
작물의 성장을 촉진하면서 환경, 특히 지하수층을 오염하지 않고 토양 비옥화의 최적화를 개선하기 위한 해결책들이 요구되고 있다.
본 발명은 상기 문제점에 대한 해결책을 제시하는 것을 목적으로 한다.
또한, 많은 식물 병원균들이 작물 재배 시 성장하여 작물의 가격, 생산 품질 및 생산성을 감소시킬 수 있다. 상기 식물 병원균으로 예를 들어, 감자 재배에 피해를 줄 수 있는 Streptomyces scabies와 같이 많은 박테리아가 있다. 또한, 예를 들어, Fusarium culmorum, 잿빛 곰팡이병의 원인인 Botrytis cinerea 또는 Phythium ultimum, 또는 포도나무 질병의 원인이 되는 Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aleophilum , Eutypa lata 또는 Fomitiporia 같은 많은 병원균 곰팡이들이 있다.
본 발명은 또한 식물 병원균인 특정 식물-박테리아 유기체 및/또는 곰팡이로부터의 보호를 위한 해결책을 제시한다.
이를 위해, 본 발명은
- 프랑스국립미생물보존기관 (French National Collection of Microorganism Cultures (CNCM))에 제1-4467호로 기탁되고 등록된 박테리아; 및
- CNCM에 제I-4467호로 기탁되고 등록된 상기 박테리아의 돌연변이로 구성된 군에서 선택되는 분리된 박테리아에 관한 것으로, 상기 분리된 박테리아는 하나의 DNA 서열을 포함하고, 이는 16S rDNA로 지칭되며, 상기 박테리아의 16S 리보솜 RNA을 암호화하고, 상기 DNA 서열은 SEQ ID_NO 1 서열과 100% 상동성이 있다.
SEQ ID_NO 1 서열은 다음과 같다:
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg 60 gaaacggggt ctaataccgg atatgacacg ctcccgcatg ggatgcgtgt ggaaagctcc 120 ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg 180 cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 240 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 300 acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 360 gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 420 gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc 480 gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg caggctagag 540 ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 600 caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 660 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggaac taggtgtggg 720 cgacattcca cgtcgtccgc gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 780
gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac ggggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 840 gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccc ggaaacctct 900 ggagacaggg gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggcttgt cgtcagctcg 960 tgtcgtgaga tgttgggtta agtccccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag 1020 catgcctttc gggggntgat ggggacttnc acaggagact gccggggtca actcggagga 1080 aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa 1140 tggccggtac aatgagctgc gaagccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca 1200 gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc 1260 agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa 1320 gtcggtaaca cctgaa 1336
상기 SEQ ID_NO 1 서열에서, SEQ ID_NO 1 서열의 1036 및 1049 위치의 기호 "n"은, IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry )에 따르면, 네 개의 뉴클레오티드 a, t, c 또는 g 중 하나를 지칭한다. 따라서 1036 위치의 뉴클레오티드 n은 뉴클레오티드 "a", 뉴클레오티드 "t", 뉴클레오티드 "g" 및 뉴클레오티드 "c"로 구성된 군에서 선택되고, 1049 위치의 뉴클레오티드 n은 1036 위치의 뉴클레오티드와는 독립적으로 뉴클레오티드 "a", 뉴클레오티드 "t", 뉴클레오티드 "g" 및 뉴클레오티드"c"로 구성된 군에서 선택된다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID_NO 1 서열로 확인되는 16S rDNA 서열을 포함하는 분리된 박테리아와 관련되고, 상기 분리된 박테리아는 하기로 구성된 군에서 선택된다:
- 프랑스국립미생물보존기관 (CNCM)에 제I-4467호로 기탁되고 등록된 박테리아, 및
- 프랑스국립미생물보존기관 (CNCM)에 제I-4467호로 기탁되고 등록된 상기 박테리아의 돌연변이(mutation).
본 발명에 따른 박테리아는 스트렙토마이세스 종이다.
본 발명에 따른 박테리아 균주 제1 변형형태는 출원인으로부터 제출되어 2011년 4월 7일자에 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관인 파스퇴르 연구소(주소지 25 rue du Docteur Roux 75724 Paris cedex 15) 의 프랑스국립미생물보존기관 (CNCM)에 제I-4467호로 등록되었다.
본 발명의 제1 변형형태에 따른 박테리아는 자연환경에서 분리된 박테리아로, 즉 원 자연환경으로부터 분리되어 얻어진 박테리아이다. 상기 박테리아는 이미 존재하고 있던 자연환경에서 분리되었다.
제2 변형형태에서, 본 발명은 CNCM에 제I-4467호로 기탁된 본 발명의 제1 변형형태에 따른 박테리아의 돌연변이 박테리아와 관련되고, 즉 본 발명에 따른 제1 변형형태 박테리아의 돌연변이에 의해 획득된 박테리아와 관련된다. 본 발명에 따른 돌연변이 박테리아는 또한 SEQ ID_NO 1 서열과 상동성인 16S rDNA 서열을 포함한다.
상기 돌연변이 박테리아는 본 발명에 따른 제1 변형형태 박테리아를 임의의 돌연변이유발(mutagenesis) 방법, 특히 무작위적 돌연변이유발 방법 및 위치-지정 돌연변이유발 방법으로 구성된 군에서 선택된 방법으로 처리함으로써 획득된다.
무작위적 돌연변이유발 처리가 수행되는데, 상기에서 본 발명에 따른 제1 변형형태를 적어도 하나의 물리적 돌연변이 유발 제제-특히 예를 들어 본 발명에 따른 박테리아를 UV 광선 또는 이온화 방사선 노출- 및 화학적 돌연변이 유발 제제로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 유발 제제에 적용하는 단계가 포함된다.
돌연변이 박테리아 DNA 서열은 CNCM에 제I-4467호로 기탁된 제1 변형형태에 따른 박테리아와 비교하여 상이하다. 상기 DNA 서열의 차이는 본 발명에 따른 16S rDNA의 엄격한 DNA의 서열에 영향을 미칠 수 있다.
바람직하게도 본 발명에 따르면, RNA 폴리머라제 베타 서브유닛(polB)을 암호화하는 분리된 박테리아 DNA 서열은 SEQ ID_NO 4와 상동이다. 따라서 분리된 박테리아는 RNA 중합효소 베타 유닛(polymerase polB)을 암호화하는 서열로서 SEQ ID_NO 4서열을 가진다.
바람직하게도 본 발명에 따르면, 자이레이스(gyrB)를 암호화하는 분리된 박테리아 DNA 서열은 SEQ ID_NO 5와 상동이다. 분리된 박테리아는 따라서 자이레이스(gyrase gyrB)를 암호화하는 서열로 SEQ ID_NO 5를 가진다. 바람직하게도 본 발명에 따르면, 재조합효소(recombinase RecA)를 암호화하는 분리된 박테리아 DNA 서열은 SEQ ID_NO 6와 상동이다. 따라서, 분리된 박테리아는 재조합효소(recombinase RecA)를 암호화하는 서열로 SEQ ID_NO 6를 가진다.
바람직하게도 본 발명에 따르면, 트립토판 합성 효소의 베타 서브 유닛 (trpB)을 암호화하는 분리된 박테리아 DNA 서열은 SEQ ID_NO 7와 상동이다. 따라서 분리된 박테리아는 트립토판 합성효소 (trpB)를 암호화하는 서열로 SEQ ID_NO 7 서열을 가진다.
바람직하게는 본 발명에 따르면, 베타 ATP 합성효소 유닛(beta synthase ATP unit AtpB)을 암호화하는 분리된 박테리아 DNA 서열은 SEQ ID_NO 8과 상동이다. 따라서, 분리된 박테리아는 베타 ATP 합성효소 유닛(ATPB)을 암호화하는 서열로서 SEQ ID_NO 8서열을 가진다.
바람직하게는 본 발명에 따르면, 분리된 박테리아는 SEQ ID_NO 4, SEQ ID_NO 5, SEQ ID_NO 6, SEQ ID_NO 7 및 SEQ ID_NO 8 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게 본 발명에 따르면, 분리된 박테리아는 SEQ ID_NO 4, SEQ ID_NO 5, SEQ ID_NO 6, SEQ ID_NO 7 및 SEQ ID_NO 8 서열 각각을 나타낸다.
바람직하게도 본 발명에 따른 박테리아는 적어도 하나의 미생물의 성장을 감소시킬 수 있는데, 상기의 표적 미생물은 Micrococcus luteus , Bacillus subtilis , Botrytis cinerae , de Fusarium culmorum , Pythium ultimum, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aelophilum , Eutypa lata , Fomitiporia mediterranea 및 Botryosphaeria obtusa로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 박테리아는 다음 특징의 전부 또는 일부를 특징으로 한다:
- 사람에게는 비-병원균(무해함)이다;
- 그람-양성 박테리아이다;
- 부생 박테리아, 즉 토양의 유기 물질을 분해할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제1 변형형태에 따른 박테리아로부터 기술적 방법에 의해 생산되고 SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 DNA 서열을 포함하는 임의의 박테리아로 확장된다. "기술적 방법"은 박테리아 배양 방법, 박테리아 선별, 분리, 복제 및/또는 박테리아의 유전 물질의 변형- 특히 돌연변이유발과 같은 방법을 의미한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 박테리아를 포함하는 박테리아 균주로 확장된다.
본 발명에 따른 박테리아 균주는 다음 특징의 전부 또는 일부를 특징으로 한다:
- SPI-2 배지 또는 Bennett 고체 배지에서 배양되는 경우, 고체 배지의 두께 내에서 분지되어 성장하는 기질 균사체로 지칭되는 균사체에 의해 고체 배지의 조성물에 따라 노랑-갈색 내지 회-갈색 범위의 색상을 가진다;
- SPI-2 배지 또는 Bennett 고체 배지에서 배양되는 경우, 공기/고체 계면에서 성장하는 기균사체에 의해 흰색을 가진다.
- 12℃ 내지 37℃ 사이, 바람직하게는 28℃ 내지 30℃ 사이에 포함되는 최적화된 성장 온도를 가진다;
- 6 내지 8 사이의 최적화된 성장 pH를 가진다;
- D-글루코오스, 만니톨, 락토오스, 슈크로오스, 말토스 및 덱스트린을 탄소원으로 사용할 수 있다;
- 우선적으로 갈락토오스, 이노시톨, 소르보스, 프럭토오스, 아라비노오스, 라피노오스, 람노오스 또는 셀룰로오스를 유일한 탄소원으로 사용하기에는 적합하지 않다;
- 아미노산, 질산염 및 암모늄염을 질소원으로 사용하기 적합하다;
- 질산염을 아질산염으로 환원하여 아데닌, 트윈 20 및 소듐 아세테이트를 분해(degrade) 시키는 것이 가능하다;
- 전분의 가수분해와 해당 가수분해의 생산물질을 사용하는 데 적합하지 않다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 박테리아를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 DNA서열을 포함하는 적어도 하나의 박테리아를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 박테리아 외 다른 박테리아를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 CNCM에 제I-4467호로 기탁된 박테리아 균주 및/또는 CNCM에 기탁된 적어도 하나의 돌연변이 박테리아 균주를 포함하고, SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 DNA서열을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 박테리아를 포함하고 상기 박테리아는 살아 있는 박테리아(적합한 영양환경에서 성장하고 번식할 수 있음)이거나 또는 죽은 박테리아(비활성화된 박테리아, 성장과 번식이 가능하지 않음)일 수 있다. 이와 같은 죽은 박테리아는 동종업자에게 알려진 미생물의 비활성화 처리 방법, 특히 가열 처리(예를 들어 본 발명에 따른 세포를 15분동안 90℃에서 가열함) 를 통해 본 발명에 따른 박테리아의 단백질 변성(denaturing)을 통해 얻어진다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 DNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 바람직하게도 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 동시에 포함할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 포함하고 있는 박테리아의 성장 및 보존에 적합한 환경을 적어도 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 액체 배지 내 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물 일 수 있다. 바람직하게도 액체 배지는 수성 배지이다.
본 발명의 제1 변형형태의 액체 조성물은 다음 특징의 전부 또는 일부를 특징으로 한다:
- 액체 조성물은 영양 생장 단계 즉 활성대사 및/또는 세포분할에 의한 증식을 하는 단계의 박테리아를 포함한다. 따라서 이는 영양 생장 단계 또는 정지단계의 살아 있는 박테리아들이다;
- 상기 액체 배지는 수성 배양 배지이며, 특히 본 발명에 따른 박테리아 성장에 필요한 모든 미네랄 요소 및 유기 전구체, 특히 탄소원, 질소원, 인(ph osphore)원, 비타민 및 미량원소를 포함하는 풍부한 배지 및 완전 배지로 구성된 군에서 선택된다.
- 상기 액체 배지는 D-글루코오스, 효모 추출물, 2염기 인산 칼륨, 황산 암모늄, 염화칼륨 및 글리세린을 포함한다.
본 발명에 따른 제2 변형형태의 액체 조성물은, 전술된 변형형태와 결합 될 수 있으며, 다음 특징의 전부 또는 일부를 특징으로 한다:
- 액체 조성물은 본 발명에 따른 박테리아를 포자 형태로 포함한다. 본 발명의 따른 박테리아 (예컨대, CNCM에 제I-4467호로 기탁된 제1 변형형태의 박테리아 또는 CNCM에 제I-4467호로 기탁된 상기 박테리아의 돌연변이로서 본 발명에 따른 제2 변형형태의 박테리아)가 대기/고체 계면에서 성장하는 일차 균사체를 형성하고 기생 성장(aerial growth)을 개시하는 경우 포자가 형성된다. 섬유 또는 미분지된 공중 "균사"는 일차 균사체로부터 성장하고 말단부에 포자를 예비하는 칸막이 구조를 지닌다. 이는 즉 포자 형태의 생균이다;
- 상기 포자들은 SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 DNA 서열을 포함한다;
- 포자들은 매끄럽고 체인 형태 나선형 "S"형이고, 매끄러운 포자 체인은 평균 10 내지 50개의 포자를 포함한다;
- 상기 액체 환경은 D-글루코오스, 효모 추출물, 펩톤, 탄산칼슘을 스트레스 유도제로 포함한다.
본 발명에 따른 박테리아 (예컨대, CNCM에 제I-4467호로 기탁된 제1 변형형태의 박테리아 또는 CNCM에 제I-4467호로 기탁된 상기 박테리아의 돌연변이로서 본 발명에 따른 제2 변형형태의 박테리아)의 포자의 생산은 제한된 액체 배양 또는 탄소 및/또는 질소 및/또는 인 및/또는 비타민 및/또는 미량원소 결핍 배지를 포함하여 박테리아 스트레스를 생산할 수 있는 배양 배지에서 본 발명에 따른 박테리아를 배양함으로써 촉진된다.
바람직하게는, 상기 포자는 영양단계(vegetative phase)에서 본 발명에 따른 박테리아의 집단(population)을 형성할 수 있도록 영양 배지에 놓여지고 재수화될 수 있다.
본 발명에 따른 액체 조성물은 영양단계의 박테리아 및 본 발명에 따른 포자형태의 박테리아를 포함할 수 있다. 어느 경우에도, 본 발명에 따른 영양 세포 및 포자는 SEQ ID_NO 1 서열과 100퍼센트 상동인 16S rDNA서열을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 박테리아를 포함하는 고체 상태의 조성물 일 수 있다.
제1 변형형태에서, 본 발명에 따른 고체 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 박테리아 및 고체 배양 배지, 특히 한 부분의 한천(- 한천(E406)-)을 포함하는 고체 배양배지를 포함한다.
제2 변형형태에서, 본 발명에 따른 고체 조성물은 -20℃ 아래의, 특히 -80℃ 온도 또는 액체 질소 온도에 가까운 온도에서 박테리아 보존 배지 내 본 발명에 따른 적어도 하나의 박테리아를 포함한다. 따라서, 본 발명은 특히 적어도 하나의 본 발명의 박테리아를 포함하는, 글리세롤 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 보존 배지 특히 글리세롤을 포함하는 저장 배지와 관련된다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 방법으로 획득되는 무-세포 조성물을 제공한다:
-
24시간 이상의 기간동안 및 12℃ 내지 37℃ 사이의 온도에서 박테리아 성장의 허용이 가능 한 배양 배지 내에서 본 발명에 따른 적어도 하나 이상의 박테리아를 씨딩하고 배양함. 이 후;
-
박테리아를 배양 배지에서 추출하거나 박테리아를 비활성화시켜서 무-세포 조성물을 형성함.
본 발명은 또한 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 무-세포 조성물을 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID_NO 1 서열과 100% 상동인 DNA 서열을 포함한다. 상기 무-세포 조성물은 특히 본 발명에 따른 박테리아의 성장을 가능하게 하는 배양 배지이고 상기 박테리아가 실질적으로 존재하지 않은 배지이다. 상기 무-세포 조성물은 SEQ ID_NO 1 서열과 100% 상동인 서열을 포함하는 DNA를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 균주의 배양 24시간 후 얻어진 본 발명에 따른 상기 무-세포 조성물은 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석되어 역상 컬럼 상 보존시간(ti) 을 지닌 복수 피크 (P24,i)가 아래 표 1에 열거된다.
[표 1]
본 발명에 따른 균주의 배양 3일(72시간) 이후 얻어진 본 발명에 따른 상기 무-세포 조성물은 HPLC에 의해 분석될 수 있어 역상 컬럼 상 보존시간(ti) 을 지닌 복수의 피크(P72,i)와 상기 피크(P72,i) 에 상대 값으로 표현되는 면적(A72,i)이 아래 표 2에 열거된다.
[표 2]
HPLC 분석에서, 본 발명에 따른 균주 배양 배지를 에틸 아세테이트로 추출하여 추출물이 얻어지고, 에틸 아세테이트 용액이 건조되고 및 추출물이 메탄올 내에서 용해된다. HPLC 크로마토그래피가 25cm/4,6mm/5μm 크기(dimension)의 Xbridge 컬럼 (Waters, Guyancourt, France) 상에서 수행된다. 용출(elution)이 0,8 mL/min 유속으로 물 내 20 % 내지 95% 의 아세토니트릴 구배 로 수행된다. 검출은 254 nm의 파장에서 수행된다.
바람직하게도 본 발명에 따라, 무-세포 조성물은 박테리아 배양 배지로 형성되고 0.8 mL/min 유속의 물 내 20% 내지 95 % 의 아세토니트릴 구배로 25cm/4,6mm/5μm 크기의 Xbridge 컬럼 상에서 수행될 때 11,925 min 머무름 시간(retention time)에서의 제1 메이저 시그널 및 20,04 min 머무름 시간에서의 제2 메이저 시그널을 포함하는 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
전술된 추출 및 분석 조건에서, 바람직하게도 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 균주의 배양 3일(72시간) 후 얻어진 무-세포 조성물은 1,925 min 머무름 시간에서의 제1 메이저 시그널(P72,6) 및 20,04 min 머무름 시간에서의 제2 메이저 시그널(P72,14)을 포함하는 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
전술된 분석 조건하에서, 바람직하게도 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 균주의 배양 3일(72시간) 후 얻어진 무-세포 조성물은 3,93 min, 5,30 min, 6,59 min, 8,83 min, 9,63 min, 12,39 min, 12,87 min, 13,76 min, 13,76 min, 15,93 min, 16,27 min, 18,41 min 및 19,38 min 머무름 시간에서의 소위 마이너 시그널을 포함하는 HPLC 크로마토그램을 가진다.
본 발명은 또한 박테리아 배양 배지 형태의 조성물로서, 11,925 min 머무름 시간에서의 제1 메이저 시그널 및 20,04 min 머무름 시간에서의 제2 메이저 시그널을 포함하는 HPLC 크로마토그램을 보인다. 바람직하게도, HPLC 크로마토그램 시그널은 3,93 min, 5,30 min, 6,59 min, 8,83 min, 9,63 min, 12,39 min, 12,87 min, 13,76 min, 13,76 min, 15,93 min, 16,27 min, 18,41 min 및 19,38 min의 머무름 시간에서의 소위 마이너 시그널을 포함한다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 적어도 하나의 박테리아와의 접촉으로 얻어졌으나, 본 발명에 따른 박테리아가 적어도 실질적으로 없는 및/또는 SEQ ID_NO 1 서열과 100% 상동인 서열을 포함하는 DNA를 보유 또는 미보유하는 상기 무-세포 조성물이 해바라기, 옥수수, 유채, 밀 및 토마토와 같은 재배 작물의 성장에 대한 촉진 효과를 가지고 또한 포도잎, 특히 Botrytis cinerea에 대한 항진균 작용을 나타내고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 24시간 이상의 기간동안 박테리아의 성장을 허용할 수 있는 배양 배지 내에서 본 발명의 적어도 하나의 박테리아를 배양하는 방법으로 얻어질 수 있는 무-세포 조성물로 확장된다.
바람직하게도 본 발명에 따르면, 박테리아가 실질적으로 없는 무-세포 조성물을 형성하도록 배양 환경의 박테리아를 제거한다.
바람직하게도 본 발명에 따르면, 무-세포 조성물의 SEQ ID_NO 1과 100% 상동인 서열을 포함하는 DNA를 예를 들면 무-세포 조성물의 뉴클레아제 처리를 통해 제거한다.
다른 형태로서, 바람직하게도 본 발명에 따르면, 배양 배지의 박테리아를 제거하지 않는다.
다른 형태로서, 바람직하게도 본 발명에 따르면, 무-세포 조성물의 SEQ ID_NO1과 100% 상동인 서열을 포함하는 DNA를 제거하지 않는다.
바람직하게도, 본 발명에 따른 박테리아를 성장이 가능한 충분한 시간, 즉 1일 내지 10일 사이에 포함된 기간동안 12℃ 내지 37℃에서, 바람직하게는 28℃ 내지 30℃ 사이의, 특히 약 30℃의 온도에서 씨딩(seeded) 및 배양하고, 이후 배양 배지에서 박테리아를 추출 (예컨대 배양 배지의 원심분리)하거나 또는 박테리아를 비활성화하여 무-세포 조성물을 형성한다. 상기 무-세포 조성물은 박테리아 성장에 적합한 조건 및 배양 배지에서 본 발명에 따른 박테리아를 접촉 및 배양하여 얻어지는, 본 발명에 따른 박테리아를 더이상 포함하지 않거나 사균을 포함하는 배양 배지이다. 본 발명에 따른 이와 같은 무-세포 조성물은 본 발명에 따른 박테리아의 속성-특히 항진균성-과 가깝거나 동일한 속성-특히 항진균성-을 지니고 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 액체 또는 고체-조성물 또는 박테리아 균주 또는 박테리아의 -특히 농업에서의- 용도와 관련된다.
본 발명은 또한 SEQ ID_NO 1 서열과 100% 상동인 DNA 서열을 포함하는 식물 처리 조성물의 농업에서의 용도와 관련된다.
특히, 바람직하게 본 발명에 따르면, 하기로 구성된 군에서 선택되는 적어도 생물학적 물질을 포함하는 식물 처리 조성물을 작물과 접촉시킨다:
-
본 발명에 따른 박테리아;
-
본 발명에 따른 액체 조성물 ;
-
본 발명에 따른 고체 조성물 ;
-
본 발명에 따른 무-세포 조성물.
또한, 본 발명은 이전 또는 이후 명시된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 특징으로 하는 박테리아, 박테리아 균주, 박테리아 (액체 또는 고체) 조성물 및 무-세포 조성물과 관련된다.
본 발명에 따른 목적, 특징 및 장점은 이후 이어지는 서술된 실시예에 따라 보여질 것이며 상기 예시들은 제한적이지 않고 다음과 같은 첨부된 도면을 참고 한다:
- 도 1은 본 발명에 따른 처리 조성물를 통한 처리를 통해 Botrytis cinerae 대한 보호/치료 효과를 보여주는 포도나무 잎의 비교 사진 견본(reproduction of photographs)(la 및 lb)이다;
- 도 2는 Phaeomoniella chlamydospora 성장에 대한 본 발명에 따른 박테리아를 통한 억제를 보여주는 페트리 접시(petri dish)의 사진 견본이다;
- 도 3은 본 발명에 따른 박테리아에 의한 인산칼슘의 가용화(solubilization)를 보여주는 사진 견본이다;
- 도 4는 본 발명에 따른 액체 조성물로 해바라기 씨 처리한 해바라기 식물 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다 ;
- 도 5는 본 발명에 따른 액체 조성물로 옥수수 씨를 처리한 옥수수 작물 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다 ;
- 도 6a 및 6b는 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물로 유채 새싹 뿌리 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다.
- 도 1은 본 발명에 따른 처리 조성물를 통한 처리를 통해 Botrytis cinerae 대한 보호/치료 효과를 보여주는 포도나무 잎의 비교 사진 견본(reproduction of photographs)(la 및 lb)이다;
- 도 2는 Phaeomoniella chlamydospora 성장에 대한 본 발명에 따른 박테리아를 통한 억제를 보여주는 페트리 접시(petri dish)의 사진 견본이다;
- 도 3은 본 발명에 따른 박테리아에 의한 인산칼슘의 가용화(solubilization)를 보여주는 사진 견본이다;
- 도 4는 본 발명에 따른 액체 조성물로 해바라기 씨 처리한 해바라기 식물 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다 ;
- 도 5는 본 발명에 따른 액체 조성물로 옥수수 씨를 처리한 옥수수 작물 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다 ;
- 도 6a 및 6b는 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물로 유채 새싹 뿌리 성장 촉진을 보여주는 사진 견본이다.
본 발명에 따른 박테리아 균주는 근권 및 포도나무 그루의 깊숙한 뿌리 부위 의 샘플로부터 분리되었다. 상기 근권 샘플은 표면에서 10 및 50cm 사이에 포함되는 깊이에서 수집되고 표면부를 제거한 후 멸균 봉투에 봉인되었고 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주의 분리 전 + 4℃ 온도에 보존되었다.
수집된 샘플은 30 분 동안 분당 200 회전 속도로 자석 교반 하에서 36ml 물 에 4g 샘플로 무균 증류 수 내에 현탁 된다. 수득 된 현탁액은 10분 동안 50℃ 온도에 놓이고 이후 무균증류수에 (x107)희석된다. 0.1ml의 상기 희석액은 항생제로는 날리딕스산(10 mg/L) 또는 노보비오신(25 mg/L) 및/또는 시클로헥사미드 항진균제(40 mg/L)로 보충되는 SEA ("Soil Extract Agar" ) 고체 한천 배양 배지를 포함하는 페트리 접시에 펼쳐진다. 페트리 접시는 21 일 동안 30℃ 온도의 인큐베이터에 놓여 진다.
방선균자(Actinomycetes) 균주들이 플레이팅(plating), 광학렌즈 관찰 및 형태학적 특징의 식별에 의해 분리된다. 따라서 분리되고 순수한 방선균자 균주들은 복제를 위해 Bennett 환경에 옮겨진다. 분리된 콜로니는 2달 동안 4℃에서 유지되고 수확되어 멸균 글리세롤 내에서 20%로 현탁 되고 이후 -20℃ 온도로 옮겨져 저장된다.
본 발명에 따른 박테리아 16S
rDNA의
시퀀싱
박테리아 16S rDNA의 서열이 당업자에게 공지된 방법으로 분석된다. 이를 위해, 본 발명에 따른 박테리아를 액체 배지에서 배양되고, 이후 DNA 게놈이 추출되며 하기를 사용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)에 의해 16S rDNA 서열이 선별적으로 증폭된다:
- SEQ ID_NO 2 서열 "agagtttgat cctggctcag"의 범용 프라이머 "27f", 및
- SEQ ID_NO3 서열 "ggttaccttg ttacgactt"의 범용 프라이머 "1492r".
이를 위해, 본 발명에 따른 박테리아는 100ml의 SPI-2 (" SPI Medium 2, International Streptomyces Project Yeast Malt Extract Agar") 액체 배지 내 5일 동안 30℃로 교반 하 배양된다. 얻어진 균사체와 배양 배지을 원심분리를 통해 분리하고 이중증류수에 2번 균사체를 씻어낸다. 상온에서 10분 동안 500 μl의 용해 완충용액(Tris-HC 400 mM, EDTA 60 mM, NaCl 150 mM, SDS 1 %, pH 8,0) 내에서 균사체의 용해를 수행한다.
환경에 5M 포타슘 아세테이트 60ml의, 빙초산 11.5ml 및 증류수 28.5의 혼합으로 획득된 용해 용액 pH 4.8) 150μL를 배지에 추가하고 힘차게 섞는다. 획득된 용해 배지를 1분 동안 10000g에서 원심 분리한다. 상청액을 수집하고 1분간 10000g에서 추가로 원심분리한다. 상청액을 수집하고, 동일한 부피의 이소프로판올을 부여한다. 교반 후, 2분 동안 10000g에서 원심 분리한다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 300μL로 세척하고, 원심분리하고, 이후 대기 건조하고 50μL의 무균 이중 증류수에 용해한다.
PCR이 키트(InVitrogen)와 열 프로파일(" Techne Touch Gene PCR Thermal Cycler)"과 함께 수행된다:
- 3분간 98℃에서 변성;
- " Taq-중합효소"의 첨가;
- 하기를 포함하는, 30 증폭 사이클:
■ 1분 동안 94℃에서 가열상(heating phase), 이어서;
■ 1분 동안 52℃에서 가열상, 이어서;
■ 2분 동안 72℃에서 가열상, 이어서 ;
- 10분 동안 72℃에서 확장 단계(extension step).
PCR 생성물은 전기영동을 통해 분석되고 자외선 및 에티디움 브로마이드를 사용하여 시각화된다. 본 발명에 따른 박테리아의 16S rDNA의 SEQ ID_NO1 서열을 " NCBI Blast" 소프트웨어를 이용하여 게놈 데이터 베이스 내 참조된 서열들과 비교한 결과, 어떤 게놈 데이터 베이스 내 서열들도 SEQ ID_NO 1 서열과 99% 이상의 상동성을 보이지 않았다.
실시예 1- 본 발명에 따른 박테리아의 생산
CNCM에 제I-4467호로 기탁된 본 발명에 따른 박테리아의 접종량을 풍부한 배지(rich medium)에 20개 규모로 뿌린다. 식물 총량 생산을 위한 이와 같은 풍부한 배지(rich medium)는 예를 들면 D-글루코오스, 효모추출물, 제2 인산칼륨(K2HPO4), 황산 암모늄((NH4)2SO4), 염화 칼륨(KCl) 및 글리세롤을 7.2 pH에서 포함한다. 5 일동안 30℃ 온도로 배양이 유지된다.
다른 형태로, 본 발명에 따른 박테리아와 배양 배지를 분리하여 적어도 본 발명에 따른 박테리아가 실질적으로 없는 본 발명에 따른 무-세포 조성물을 형성할 수 있다.
실시예 2 - 본 발명에 따른 포자 생산
본 발명에 따른 박테리아의 접종량을 포자형성 환경에 20개 규모로 뿌린다. 예를 들어, 포자형성 액체 배지가 D-글루코오스, 효모추출물, 펩톤, 탄산칼슘(CaCO3) 및 증류수를 7.2 pH에서 포함하도록 형성된다.
배양을 6일 동안 30℃ 온도에서 유지한다. 본 발명에 따른 포자를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 얻는다. 이후 본 발명에 따라 주로 포자형태의 박테리아 및 배양 배지를 액체/고체 분리를 위한 임의의 수단, 예를 들어 원심분리 또는 여과를 통해, 분리할 수 있다.
실시예 3 - 병원균으로부터의 보호
본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물은 예를 들어 Micrococcus luteus, Bacillus subtilis 및 Streptomyces scabie와 같은 특정 박테리아의 성장 억제 능력을 지니고 있다.
본 발명에 따른 포자의 포도나무 잎에 대한 선적용은 이후 상기 포도나무 잎에 접촉될 Botrytis cinerae 곰팡이 포자의 발아 및 성장을 억제한다. 상기 적용은 선 처리된 포도나무 잎 상에 Botrytis cinerae 곰팡이로 인한 증상 (잎에 갈색 반점 및 도 1B에 보이는 회색 자국(1))의 발생을 예방/제거할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 박테리아 포자 조성물로 선 처리된 포도나무 잎의 사진 견본(도 1a)과 미처리된 포도나무 잎의 사진 견본(도 1b)의 Botrytis cinerae 곰팡이 감염 사진이 도 1에 표시되어 있다. 도 1a의 잎은 Botrytis cinerae 곰팡이 감염 증상을 나타내지 않으며 따라서 이는 본 발명의 박테리아 포자를 통해 Botrytis cinerae 곰팡이로부터 보호되었다.
실시예 4 - 표적 미생물 성장의 억제
표적 미생물 성장의 억제 활성을 실린더 방법(Bauer et al, 1996)을 통해 검출 및 정량하였는데, 상기에서, CNCM에 기탁된 박테리아 균주를 Bennett 한천 고체 배지에 시딩하고, 접종된 배지를 5일 동안 30℃ 온도에 유지하여 고체 처리 조성물을 형성한다. 고체 처리 조성물의 원통형 모이어티, 예를 들어 6mm 지름의 원통형 단편이 증착되고 상기 원통형 단편은 표적 미생물, 예를 들면 병원균 표적 미생물이 뿌려진 배양 배지 표면에 놓여둔다. 표적 미생물의 배양 배지는 예를 들어 식물-병원성 곰팡이를 위한 PDA 배지 (Potato Dextrose Agar) 또는 식물-병원성 박테리아를 위한 Bennett 배지일 수 있다. 표적 미생물이 뿌려진 배양 배지 표면에 원통형 단편을 4시간 동안 4℃도 유지하여 화합물이 본 발명에 따른 배양 배지로부터 표적 미생물이 뿌려진 배지로 확산 될 수 있도록 한다.
표적미생물이 뿌려진 배지를 48시간 동안 30℃에 두고 이후 표적미생물 성장 억제 구역의 직경을 측정한다.
본 발명에 따른 박테리아는 박테리아 및/또는 곰팡이 성장의 억제 활성을 나타낸다. 미생물 성장에 대응하는 본 발명에 따른 박테리아의 활성 범위(spectrum)는 하기 표3에 표기되고, 표 중 (-) 기호는 억제 활성의 부재를, (+) 기호는 10mm 내지 15mm의 억제활동 직경, (++) 기호는 15mm 내지 20mm의 억제활동 직경, (+++) 기호는 20mm 이상에 해당되는 억제활동 직경에 상응한다.
[표 3]
이 같은 조건에서, 본 발명에 따른 균주에 의한 Botrytis cinerea 균주의 균사체 성장 억제 지름은 28 mm이며, Fusarium culmorum 균주의 균사체 성장 억제 지름은 30 mm 이고 Pythium ultimum 균주의 균사체 성장 억제 지름은 26 mm 이다.
본 발명에 따른 박테리아는 바람직하게는 포도나무 병원균, 예컨대 Phaeomoniella chlamydospora , Phaeomoniella aelophilum , Eutypa lata , Fomitiporia mediterranea 및 Botryosphaeria obtusa 의 성장 억제 효능을 지닌다.
도 2에서, 본 발명에 따른 박테리아 2 균주를 통해 포도나무 병원균으로 선택된 Phaeomoniella chlamydospora 곰팡이 균사체 8의 성장을 큰 거리로 억제하는 것을 본 발명의 균주와 다른 균주들 시리즈 3, 4 및 5를 통해 병원균 균사체 8의 성장 억제와 대응하여 비교할 수 있다. 균주 7 및 8은 병원균 균사체 8의 성장을 억제하지 않는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 박테리아는 박테리아 또는 포자성 병원균의 확장을 제한할 수 있게 한다.
실시예 5 - 비옥화 (Fertilization)
본 발명에 따른 박테리아는 고체 영양요소(특히 인)의 가용화를 배양 배지에서 용이하게 한다. 발명자들은 인산 칼슘 가루에 의해 불투명화 된 고체 한천 배양 배지 (9) 내에서 본 발명에 따른 박테리아 콜로니(2)를 둘러싸는 하나의 반투명 할로(10)의 형성을 확인 하였다(도 3). 본 발명에 따른 박테리아는 -작물의 근권 내에서- 상기 작물이 융화할 수 없는 고체 비료 제품의 용해를 증가시키고 식물의 영양을 개선할 수 있게 한다.
실시예 6 - 해바라기 및 옥수수의 성장 촉진
본 발명에 따른 박테리아의 영양 세포 및 포자를 포함하는 본 발명에 따른 액체 조성물을 준비하여 해바라기 종자 및 옥수수 종자에 막을 입힌다. 액체 조성물은 조성물 리터 당 1 내지 2그램의 박테리아를 포함하고, 박테리아 질량은 젖은 박테리아 질량에 해당한다. 동시에 본 발명에 따른 조성물로 처리되지 않은 해바라기(도 4a) 및 옥수수(도 5d) 작물 배양을 확인을 위해 진행한다. 발명자들은 해바라기 작물(도 4B) 및 옥수수(도 5d) 작물의 성장 촉진을 확인하였다. 본 발명에 따른 박테리아를 종자에 적용 시 해바라기 및 옥수수와 같은 작물-특히 작품의 대기부분-의 성장을 촉진하게 한다.
실시예 7 - 유채 모종 뿌리 성장의 촉진
본 발명에 따른 박테리아의 포자 및 영양 세포를 포함하는 본 발명에 따른 액체 조성물을 60 볼륨의 물에 CNCM에 제출된 균주 예비 배양의 1 볼륨을 물에 현탁한다. 예비 배양은 성장의 정지 단계 배양이며 예비 배양액 리터 당 10 g (젖은 질량)의 박테리아를 포함하고 있다. 본 발명에 따른 액체 조성물을 유채 종자에 본 발명에 따른 액체 조성물의 막을 형성하도록 16.4g의 유채 종자 및 490μL 의 본 발명에 따른 액체 조성물 (즉 30리터의 액체 조성물에 1톤의 유채 종자 정도의 양 )을 혼합 및 균질하게 종자 상에 투여한다. 액체 조성물은 조성물 리터 당 1 내지 2g의 박테리아를 포함하고, 박테리아 질량은 젖은 박테리아 질량에 해당한다. "Pikaw " 배양 배지에 본 발명에 따른 조성물로 막이 씌인 유채 종자를 심는다. 8일간의 작물성장 후, 본 발명에 따른 처리된 종자로 얻어진 12개 작물의 뿌리 부분을 수집하고 무게를 잰다. 본 발명에 따른 처리된 종자로 얻어진 유채 작물의 뿌리 부분은 85mg이며 이는 비교대상을 위해 본 발명에 따른 박테리아가 없는 조성물로 처리된 종자로 얻어진 유채 작물의 12개 뿌리 부분의 무게 (59mg)보다 크다. 처리 및 미처리된 유채 작물의 사진 견본은 각각 도 6a 및 도 6b에 표시되었고 이는 본 발명에 따라 처리된 유채 작품의 12개의 뿌리 부위의 빠른 성장을 비교대상을 위해 본 발명에 따른 박테리아가 없는 조성물로 처리된 종자로 얻어진 유채 작물의 11개 뿌리 부분을 비교하여 보여주고 있다. CNCM에 기탁된 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물은 유채 모종의 성장 및 발아를 촉진한다.
SEQUENCE LISTING
<110> AGRONUTRITION
<120> ISOLATED BACTERIUM OF THE GENUS STREPTOMYCES
<150> FR1359186
<151> 2013-09-24
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1336
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..1336
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Streptomyces"
<400> 1
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg 60
gaaacggggt ctaataccgg atatgacacg ctcccgcatg ggatgcgtgt ggaaagctcc 120
ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg 180
cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 240
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 300
acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 360
gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 420
gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc 480
gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg caggctagag 540
ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 600
caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 660
agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggaac taggtgtggg 720
cgacattcca cgtcgtccgc gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 780
gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac ggggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 840
gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccc ggaaacctct 900
ggagacaggg gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggcttgt cgtcagctcg 960
tgtcgtgaga tgttgggtta agtccccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag 1020
catgcctttc gggggntgat ggggacttnc acaggagact gccggggtca actcggagga 1080
aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa 1140
tggccggtac aatgagctgc gaagccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca 1200
gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc 1260
agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa 1320
gtcggtaaca cctgaa 1336
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Streptomyces"
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..19
<223> /mol_type="DNA"
/note="Amorce 1429r"
/organism="Streptomyces"
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 4
<211> 3483
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..3483
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Streptomyces"
/plasmid="rpoB"
<400> 4
ttggccgcct cgcgcaacgc ctcgactgcc aatacgaaca atggcgccag caccgccccg 60
ctgcgcatct cctttgcgaa gatcagggag cctctcgagg ttccgaacct cctcgcgctg 120
cagaccgaga gcttcgattg gctgctcggc aatgccgcct ggaaggctcg cgtcgaggct 180
gcgctggaca gcggtcagga cgtccccacc aagtccggtc tggaagagat cttcgaggag 240
atctccccga tcgaggactt ctccgggtcg atgtccctga ctttccgtga tcaccgtttc 300
gagccgccga agaactcgat cgacgagtgc aaggagcgtg acttcaccta cgccgctccg 360
ctcttcgtca cggccgagtt caccaacaac gagaccggcg agatcaagtc ccagacggtc 420
ttcatgggcg acttcccgct catgaccgac aagggcacct tctgcatcaa cggcaccgag 480
cgtgtcgtcg tctcgcagct ggtccgctcg ccgggtgtct acttcgactc ctccatcgac 540
aagacgtccg acaaggacat cttctccgtc aaggtcatcc cgtcccgggg tgcctggctg 600
gagatggaga tcgacaagcg tgacatggtc ggtgtgcgta tcgaccgcaa gcgcaagcag 660
tccgtcaccg ttctcctgaa ggctctcggc tggacgaccg agcagatcct ggaggagttc 720
ggcgagtacg agtcgatgcg cgccaccctg gagaaggacc acacccaggg ccaggacgac 780
gcgctgctcg acatctaccg caagctgcgt ccgggcgagc cccccacacg ggaggccgcg 840
cagacgctgc tcgagaacct ctacttcaac ccgaagcgct acgacctcgc gaaggtcggc 900
cgctacaagg tcaacaagaa gctgggttcg gccgctccgc tggacgcggg cgtcctgacg 960
gtcgaggacg tcatcgcctc gatcaagtac ctggtgaagc tgcacgccgg tgagaccgag 1020
accgtcgggg acaacggcca gtccgtggtc gtcgagaccg acgacatcga ccacttcggc 1080
aaccgccgta tccgtaacgt cggcgagctg atccagaacc aggtccgcac gggtctggcc 1140
cgtatggagc gcgtcgtgcg tgagcgcatg acgactcagg acgtcgaggc gatcacgccg 1200
cagaccctga tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc 1260
cagctgtcgc agttcatgga ccagacgaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgccgt 1320
ctgaacgcgc tcggccccgg tggtctctcc cgtgagcggg cgggcttcga ggtccgtgac 1380
gtgcacccgt cgcactacgg ccgcatgtgc ccgatcgaga cgcccgaagg cccgaacatc 1440
ggtctgatcg gctcgctcgc ctcgtacggc cgggtcaacg cgttcggttt catcgagacc 1500
ccgtaccgca aggtcgtcga cggtgtcgtc accgacgacg tcgactacct gacggccgat 1560
gaagaggacc gcttcgtcat cgcgcaggcc aacgccccgc tcgcggacga cctgcgcttc 1620
gccgagaacc gcgtcctggt ccgccgccgt ggcggcgagg tcgactacat ccccggcgac 1680
gacgtcgact acatggacgt ctcaccgcgc cagatggtgt cggtcgcgac cgcgatgatc 1740
cccttcctcg agcacgacga cgccaaccgc gcgctcatgg gctcgaacat gatgcgccag 1800
gccgtgccgc tgatcaaggc ggagtccccg ctggtcggca ccggcatgga gtaccgctgt 1860
gcggtcgacg ccggcgacgt catcaaggcc gagaaggacg gtgtcgtcca ggaggtctcc 1920
gccgactacg tgacggtggc caacgacgac ggcacctaca ccacctaccg ggtggccaag 1980
ttctcccgct ccaaccaggg cacctccttc aaccagaagg tcgtcgtgga cgagggtgcg 2040
cgggtgatcg ccggccaggt gctggccgac ggcccgtcca ccgaggacgg cgagatggcg 2100
ctcggcaaga acctcctggt ggcgttcatg ccgtgggagg gccacaacta cgaggacgcg 2160
atcatcctca gccagcgtct ggtgcaggac gacgtcctct cctcgatcca catcgaggag 2220
cacgaggtcg atgcccgtga caccaagctc ggccccgagg agatcacccg ggacatcccg 2280
aacgtctccg aggaggtcct cgccgacctc gacgagcgcg gcatcatccg gatcggtgcc 2340
gaggtcgtcg ccggcgacat cctggtcggc aaggtcaccc cgaagggcga gaccgagctg 2400
accccggagg agcggctgct gcgcgcgatc ttcggtgaga aggcccgtga ggtccgtgac 2460
acctcgctga aggtgccgca cggtgagatc ggcaaggtca tcggcgtccg cgtcttcgac 2520
cgcgaagagg gcgacgaact gccgccgggc gtgaaccagc tggtccgcgt ctacgtggcg 2580
cagaagcgca agatcaccga tggtgacaag ctcgccggcc gtcacggcaa caagggcgtc 2640
atctccaaga tcctgccggt cgaggacatg ccgttcctgg aggacggcac cccggtcgac 2700
atcatcctca acccgctggg tgtcccgtcc cgaatgaacc cgggacaggt cctggagatc 2760
cacctgggct ggctggcctc ccgcggctgg aaggtcgagg gctccgagga ctggatgcag 2820
cggctccagg ccatcggcgc cgacgaggtc gagcccggca ccaacgtcgc gaccccggtc 2880
ttcgacggcg cccgcgagga cgagatcgcc ggtctcttcg actcgacgat cccgaaccgc 2940
gacggcgacc gcctggtcca gtcgtccggc aaggcccggc tcttcgacgg ccgctccggc 3000
gagccgttcc cggagccgat ctcggtcggc tacatgtaca tcctcaagct gcaccacctg 3060
gtggacgaca agctgcacgc ccggtccacc ggtccgtact cgatgatcac ccagcagccg 3120
ctgggtggta aggctcagtt cggtggccag cgcttcggtg agatggaggt gtgggcgctg 3180
gaggcttatg gcgccgcgta cgccctccag gagctgctga ccatcaagtc cgacgacgtg 3240
accggccgcg tgaaggtcta cgaggccatc gtcaagggcg agaacattcc cgagcccggc 3300
atccccgagt ccttcaaggt gctcatcaag gagatgcagt ccctgtgcct caacgtggag 3360
gtgctgtcgt ccgacggcat gtccatcgag atgcgcgaca ccgacgagga cgtcttccgc 3420
gctgcggagg agctcggtat cgacctgtcc cggcgcgagc cgagcagcgt cgaagaggtc 3480
tga 3483
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<211> 2031
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..2031
<223> /mol_type="DNA"
/note="gyr B"
/organism="Streptomyces"
<400> 5
gtgctgtgcc agaaagggcg cttcgtggcc gattccggca accccatcga aaacatcccg 60
tccacgcccg acgacgaggc cctggctccg ccgtcgtacg acgccagtgc gattaccgtc 120
ctggaagggc tggaggcggt ccgcaagcga cccggtatgt acatcggttc caccggtgag 180
cgcggcctgc accatctcgt ccaagaggtc gtcgacaact ccgtcgacga ggccatggcc 240
ggtcacgcgg acagcatcga ggtcacgatc ctcgccgacg gcggcgtccg cgtcgtggac 300
aacggccgcg ggatcccggt gggcatcgtc ccctcggagg ggaagccggc tgtggaggtc 360
gtgctgaccg tgctgcacgc gggcggcaag ttcggcggcg gcggctacgc cgtctccggc 420
ggtctgcacg gcgtcggcgt ctccgtcgtc aacgccctgt cctcgaaggt gtcggtcgag 480
gtcaagacgg acggctaccg ctggacccag gactacaaga cgggagcgcc gaccgcgccc 540
ctggcccgga acgaggccac ggaggagacc ggcaccacgg tcaccttctg ggcggacccg 600
gacgtcttcg agaccaccga gtactccttc gagacgctgg cccggcgctt ccaggagatg 660
gcgttcctca acaagggcct gtcgatctcg ctcaaggacg agcgcgaggc ccatgtggac 720
gaggagggca agccgctctc cgtgaagtac cactacgagg gcggcatcgt cgacttcgtg 780
acctacctca actcccgcaa gggcgagctg gtccacccca cggtgatcgg gttcgaggcc 840
gaggacaagg agcggatgct ctccctcgag atcgcgatgc agtggaacac ccagtacacc 900
gagggtgtct acagcttcgc gaacaccatc cacacccatg agggcggcac ccacgaggag 960
ggcttccgcg ccgcgctgac gtacctgatc aacaagtacg cgcgcgacaa gaagctgctc 1020
cgggagcgtg acgacaacct caccggtgag gacatccgcg agggcctgac cgccatcatc 1080
tcggtcaagc tgggcgagcc gcagttcgag ggccagacca agaccaagct gggcaacacg 1140
gaggccaaga ccttcgtcca gaagatcgtc aacgagcatc tcgccgactg gctggaccgt 1200
aaccctaatg aggcggcgga catcgtccgc aaggggatcc aggcggcgac ggcccgggtc 1260
gcggcccgta aggcgcggga tctgacccgc cgtaaggggc tgctggagac cgcgtcgctg 1320
ccgggcaagc tgagcgactg ccagtccaat gacccgtcga agtgcgagat cttcatcgtc 1380
gagggtgact ccgccggcgg ctcggccaag tccggccgta acccgcagta tcaggcgatc 1440
ctcccgatcc gcggcaagat cctcaacgtg gagaaggccc gggtcgacaa gatcctgcag 1500
aacaacgagg tccaggcgct gatctccgcc ttcggcaccg gggtgcacga ggacttcgac 1560
atcgccaagc tccgctatca caagatcatt ctgatggcgg acgccgatgt cgacggccag 1620
cacatcaaca ccctgctgct gaccttcctc ttccgcttca tgcgcccgct ggtcgaggcg 1680
gggcatgtct tcctctcccg tccgccgctc tacaagatca agtggggccg ggacgacttc 1740
gagtacgcgt actcggaccg ggagcgggac gcgctgatcc aggtcggccg tgaacagggc 1800
aagcgcatca gggacgactc ggtccagcgc ttcaagggtc tgggcgagat gaacgccgaa 1860
gagctgcggg tcaccacgat ggaccccgac caccgcgtcc tgggccaggt caccctggac 1920
gacgcggcgc aggccgacga cctgttctcg gtcctgatgg gtgaggacgt cgaggcacgg 1980
cgctcgttca tccagcgcaa cgccaaggat gtccgcttcc tcgacatctg a 2031
<210> 6
<211> 990
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..990
<223> /mol_type="DNA"
/note="Rec A"
/organism="Streptomyces"
<400> 6
ggcgatcggc cgaacgagcc ggtcgaggtc atccccaccg ggtcgaccgc tctcgacgtc 60
gccctcggcg tcggcggtct gccgcgcggc cgggtggtcg aggtctacgg ccccgagtcc 120
tccggtaaga cgaccctgac cctgcacgcg gtggccaatg cccagcgggc cggcggcacc 180
gttgccttcg tggacgccga gcacgccctc gaccctgact acgcgcagaa gctgggcgtg 240
gacaccgact ccctgatcct gtcccagccg gacaacggcg agcaggcgct cgagatcgtg 300
gacatgctgg tccgctccgg cgccctcgac ctcatcgtca tcgactccgt cgccgccctg 360
gtgccgcgcg cggagatcga gggcgagatg ggcgactccc acgtcggcct ccaggcccgg 420
ctgatgagcc aggcgctccg taagatcacc agcgcgctca accagtccaa gaccaccgcg 480
atcttcatca accagctccg cgagaagatc ggcgtgatgt tcggctcgcc ggagaccacg 540
accggtggcc gggcgctgaa gttctacgcg tcggtgcgca tcgacatccg ccgcatcgag 600
accctcaagg acggcaccga cgcggtcggc aaccgcaccc gcgtcaaggt cgtcaagaac 660
aaggtcgcgc cgcccttcaa gcaggccgag ttcgacatcc tctacggcca gggcatcagc 720
cgtgagggcg gtctgatcga catgggcgtc gagcacggct tcgtccgcaa gtccggtgcc 780
tggtacacct acgagggcga ccagctcggc cagggcaagg agaacgcccg caacttcctg 840
aaggacaacc ccgatctcgc caatgagatc gagaagaaga tcaaggaaaa gctcggcatc 900
ggggtgaggc cccaggaccc ggcggccgcg gcacccacca cggacgcggc tggtgccgcg 960
ggcgtgaccg acgccgcacc ggcgaaggcc 990
<210> 7
<211> 1209
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..1209
<223> /mol_type="DNA"
/note="TrpB"
/organism="Streptomyces"
<400> 7
gtgcccagcg ccgagggcta tttcggcgcc ttcggcggca agttcatccc cgaggcgctc 60
gtcgccgccg tcgacgaggt cgcggccgag tacgagaagg ccaagacgga ccccgccttc 120
gcggccgagc tcgaggatct gctggtcaac tacaccggcc ggcccagtgc gctgaccgag 180
gtgcggcggt tcgccgagca cgccgggggc gcccgggtct tcctcaagcg ggaggacctc 240
aaccacaccg gctcccacaa gatcaacaat gtgctggggc aggccctgct caccaagcgc 300
atgggcaagt cccgggtcat cgccgagacc ggcgccggtc agcacggcgt ggccacggcc 360
accgcatgtg cgctgttcgg gctcgaatgc accatctaca tgggcgaggt cgacacccag 420
cggcaggcgc tcaatgtggc gcggatgcgg atgctgggcg ccgaggtcat ctccgtgacc 480
tccggcagcc gcaccctgaa ggacgccatc aacgaggcgt tccgggactg ggtcgccaat 540
gtggaccgca cccactacct cttcggtacg gtggccggcc cccacccctt cccggcgctg 600
gtgcgcgact tccaccgggt gatcggcgtg gaggcgcggc ggcagatcct ggagcggacc 660
gggcggctgc cggacgcggt cgcggcctgt gtgggcggcg gatccaacgc gatcgggctg 720
ttccacgcct tcctgccgga cgagagcgtg cgcctcgtcg gcttcgagcc cgccggacac 780
ggtgtggaga ccggggagca cgcggccacg ctgagccagg gcgagcccgg gatcctgcac 840
ggctcccggt cgttcgtgct ccaggacgag gacggccaga tcaccgagcc gtactcgatc 900
tcggccggtc tcgactaccc cggcgtcggg ccggagcacg cgtatctgaa ggacatcggc 960
cgtgccgagt accgggcggt caccgacgac gaggcgatgc gggcgctgcg gctgctctcg 1020
gagaccgagg gcatcatccc ggcgatcgag agcgcccacg cgctggcggg cgccctggac 1080
ctcggccgtg agctggggag cgacggcctg gtgctggtca acctctccgg gcgcggcgac 1140
aaggacatgg acacggcggc tcggtacttc gggctctacg accagcagag cgaccaggga 1200
gcgaagtga 1209
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<211> 1419
<212> DNA
<213> Streptomyces
<220>
<221> source
<222> 1..1419
<223> /mol_type="DNA"
/note="AtpD"
/organism="Streptomyces"
<400> 8
gtggcctccg gccgcgtcgc gcgggtcatc ggcccggtcg tcgacgtgga gttccccgtc 60
gacgcgatgc cggagatcta caacgcgctg caggtcgagg tcgccgaccc ctcccaggag 120
ggggcgaaga agaccctgac cctcgaggtc gcccagcacc tcggcgaggg cctggtccgc 180
gccatctcca tggagcccac cgacggcctg gtccgccagg ccgcggtgac cgacaccggc 240
gacggcatca cggtgccggt cggcgatgtc accaagggcc gggtgttcaa caccctcggc 300
aagatcctca acgagcccga ggccgagtcc gaggtcaccg agcgctggtc catccaccgc 360
aaggccccgg ccttcgacca gctcgagtcc aagaccgaga tgttcgagac cggcctgaag 420
gtcgtcgacc tgctgacccc gtacgtcaag ggcggcaaga tcggtctgtt cggcggcgcg 480
ggcgtcggca agaccgtgct catccaggaa atgatcatgc gtgtggccaa gctgcacgag 540
ggcgtttccg tgttcgccgg tgtcggcgag cgcacccgtg agggcaacga cctgatcgag 600
gagatggccg agtccggcgt gctcccgcag accgcgctgg tcttcggcca gatggatgag 660
cccccgggca cccgtctgcg cgtcgccctg gccggtctga ccatggcgga gtacttccgc 720
gatgtgcaga agcaggacgt gctgttcttc atcgacaaca tcttccgctt cacccaggcc 780
ggttccgagg tctcgaccct gctcggccgg atgccctccg cggtgggcta ccagccgaac 840
ctggccgacg agatgggcat cctgcaggag cgcatcacct cgacccgtgg tcactcgatc 900
acctcgatgc aggcgatcta cgtccccgcg gacgacctga ccgacccggc cccggcgacc 960
accttcgcgc acctcgacgc gaccacggtg ctctcccggc cgatctcgga gaagggcatc 1020
tacccggcgg tggacccgct ggactcgacg tcccggatcc tggacccgcg ctacatctcg 1080
caggagcact acgactgcgc ctcgcgcgtg aagtcgatcc tgcagaagta caaggacctc 1140
caggacatca tcaacatcct gggcatcgac gagctcggcg aggaggacaa gctcaccgtc 1200
ttccgcgccc gccggatcga gcgcttcctg tcgcagaaca cccacgcggc gaagcagttc 1260
accggcctcg acggatcgga tgtgccgctg gacgagtcca tcgccgcgtt caacgcgatc 1320
gccgatggtg agttcgacca cttccccgag caggcgttct tcatgtgcgg tggcctggac 1380
gacctcaagg ccaaggccaa ggagctgggc gtctcctga 1419
Claims (16)
- DNA 서열을 포함하는 분리된 박테리아로서, 상기 DNA 서열은 16S 리보좀 RNA를 암호화하는 16S rDNA로 지칭되고 SEQ ID_NO1 서열과 100% 상동이며, 상기 분리된 박테리아는 하기로 구성된 군에서 선택되는 박테리아:
- CNCM에 제I-4467호로 기탁 및 등록된 박테리아, 및
- CNCM에 제I-4467호로 기탁 및 등록된 박테리아 돌연변이. - 제1항에 있어서,
스트렙토마이세스 종인 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
SEQ ID_NO 4와 상동인 RNA 폴리메라아제 beta 서브 유닛(polB)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID_NO 5와 상동인 자이레이스(gyrB)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID_NO 6과 상동인 재조합효소(RecA)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID_NO 7과 상동인 트립토판 합성효소 beta 서브 유닛(trpB)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID_NO 8과 상동인 ATP 합성효소 beta 서브 유닛(AtpB)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
Botrytis cinerae , Fusarium cuimorum , Pythium ultimum , Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aelophilum , utypa lata , Fomitiporia mediterranea 및 Botryosphaeria obtusa로 구성된 그룹에서 선택되는 표적 미생물로 지칭되는 적어도 하나의 미생물의 성장을 둔화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 박테리아. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 박테리아를 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서,
조성물이 액체 배지 내 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 포함하는 액체 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제10항에 있어서,
영양 생장 단계의 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
포자 형태의 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제9항에 있어서,
고체 상태인 것을 특징으로 하는 조성물. - 하기의 방법에 의해 획득되는 무-세포 조성물:
- 적어도 하나의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 24시간 이상의 기간동안 12℃ 내지 37℃의 온도에서 상기 박테리아의 성장의 허용이 가능한 배양 배지에 시드(seed) 및 배양하고, 및;
- 배양 배지에서 박테리아를 추출하거나 박테리아를 비활성화하여 무-세포 조성물을 형성함. - 제14항에 있어서,
조성물이 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기에서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID_NO 1과 100% 상동인 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 박테리아 배양 배지에서 형성된 제14항 또는 15항에 따른 조성물로서,
0.8 mL/min의 유속으로 물 내 20% 내지 95%의 아세토니트릴 구배와 함께 25cm/4,6mm/5μm 크기(dimension)의 Xbridge 컬럼 상에서 수행되고 11,925 min 머무름 시간에서의 제1 메이저 시그널 및 20,04 min 머무름 시간에서의 제2 메이저 시그널을 포함하는 HPLC 크로마토그램을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
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