ES2431327T3 - Salmonella entérica serotipo Paratyphi A atenuada y usos de la misma - Google Patents
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Abstract
Cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada, teniendo dicha cepa una mutación atenuante en los loci guaBAy una mutación atenuante en el gen clpX.
Description
Salmonella enterica serotipo Paratyphi A atenuada y usos de la misma.
SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional US nº 60/731.349 presentada el 28 de octubre de 2005.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La fiebre entérica causada por miembros del género Salmonella, incluyendo las fiebres tifoidea y paratifoidea, sigue constituyendo una importante carga de morbilidad y mortalidad entre las poblaciones de los países en vías de desarrollo (Lancet 2005; 366: 749-762) y representa un riesgo notable para los viajeros (Lancet Infect Dis. 2005; 5(10): 623-628). Las incidencias de fiebre entérica causada por Salmonella enteric serotipo Typhi y Paratyphi A (S. Typhi y S. Paratyphi A) están aumentando debido a la aparición y propagación de variantes resistentes a los antibióticos (Lancet Infect Dis. 2005 5(10): 623-8). Aunque en general la enfermedad clínica causada por S. Paratyphi A es algo más leve que la debida a S. Typhi, la primera puede resultar en una fiebre entérica en su estado más avanzado con toda una serie de complicaciones y, si no se trata o se trata incorrectamente, puede tener como consecuencia la muerte. Existe la necesidad de disponer de vacunas que sean seguras y eficaces para combatir infecciones por Salmonella.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una cepa de S. Paratyphi A atenuada, donde dicha cepa A tiene una mutación atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX. En realizaciones preferentes, la cepa S. Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpP. En una realización especialmente preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpX. En otra realización preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA, el gen clpP y el gen clpX.
En una realización, la mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce el nivel de expresión de los loci o los genes o bloquea la expresión de los loci o los genes.
En otra realización, la mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce la actividad de un polipéptido codificado por los loci o los genes o inactiva un polipéptido codificado por los loci o los genes.
En una realización preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A es la cepa S. Paratyphi A 9150.
La presente invención incluye también cepas de S. Paratyphi A según la presente invención que comprenden además un sistema de expresión plasmídico estabilizado.
En una realización preferente, el sistema de expresión plasmídico estabilizado comprende un vector de expresión que tiene (a) un casete de origen de replicación de número de copias restringido, (b) como mínimo un casete de destrucción postsegregacional, (c) como mínimo un casete de partición y (d) un casete de expresión.
En realizaciones preferentes, el casete de origen de replicación de número de copias restringido comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación que limita el vector de expresión a un número medio de copias plasmídicas de aproximadamente 2 a 75 copias por célula, (ii) un primer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación y (iii) un segundo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación.
En las mismas realizaciones, el casete de destrucción postsegregacional comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional, (ii) un tercer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional y (iii) un cuarto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional.
En las mismas realizaciones, el casete de partición comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición, (ii) un quinto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición y (iii) un sexto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición.
En las mismas realizaciones, el casete de expresión comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor, (ii) un séptimo sitio de corte de enzima de
restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor y (iii) un octavo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor.
En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia oriE1 de SEQ ID nº: 28, la secuencia ori101 de SEQ ID nº: 30 y la secuencia ori15A de SEQ ID nº: 29.
En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado asd, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema proteico phd-doc y una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema antisentido hok-sok. Con especial preferencia, el locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb seleccionada del grupo consistente en el locus ssb de Shigella flexneri, el locus ssb de Salmonella Typhi y el locus ssb de E. coli. Aun más preferentemente, el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb que comprende un promotor inducible de ssb, un promotor constitutivo de ssb y una región codificadora de ssb de la cepa de S. flexneri 2a CVD 1208s mostrada en la SEQ ID nº: 34.
En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en el locus parA de E. coli de SEQ ID nº: 31 y el locus pSC101 par de E. coli de en SEQ ID nº: 32.
En realizaciones preferentes, el promotor es un promotor inducible, en especial un promotor de ompC y con mayor preferencia el promotor de ompC mostrado en la SEQ ID nº: 33.
En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno homólogo. En otra realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo.
En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo seleccionado del grupo consistente en un antígeno vírico, bacteriano, un antígeno de cáncer y un antígeno autoinmune.
La presente invención incluye también una formulación farmacéutica que comprende una o más de las cepas de Salmonella Paratyphi A atenuadas de la presente invención. Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente formulaciones farmacéuticas orales.
La presente invención incluye además las formulaciones farmacéuticas de la presente invención para el uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una formulación farmacéutica de la presente invención a un sujeto. La respuesta inmunitaria es preferentemente una respuesta inmunitaria protectora.
La cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu, con mayor preferencia entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu, de la cepa de S. Paratyphi A atenuada dentro de la formulación farmacéutica.
En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta a Salmonella Paratyphi A. En otra realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta al antígeno seleccionado. En otra realización más, la respuesta inmunitaria es una respuesta tanto a Salmonella Paratyphi A como al antígeno seleccionado.
Para mutar o delecionar diversos genes y loci cromosómicos de las cepas S. Paratyphi de la presente invención puede utilizarse el sistema de mutagénesis mediada por Lambda Red.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: muestra los productos de amplificación por PCR de guaBA y guaBA::cml. La línea 1 es guaBA de tipo salvaje; las líneas 2 y 3 son guaBA::cml. Las flechas indican bandas de marcador de peso molecular de 3 kb (arriba) y 1,5 kb (abajo).
Figura 2: muestra los productos de amplificación por PCR de deleciones de guaBA::cml y guaBA. La línea 1 es guaBA::cml; las líneas 2 a 5 son deleciones de guaBA. Las flechas indican bandas de marcador de peso molecular de 1,5 kb (arriba) y 0,5 kb (abajo).
Figura 3: muestra los resultados de un estudio de complementación de la deleción de guaBA. La placa 1 es el mutante de guaBA transformado con pLowBlu 184; la placa 2 es el mismo mutante transformado con pATGguaBA.
Figura 4: muestra los productos de amplificación por PCR de S. Paratyphi A atenuada con wt, clpX y clpXguaBA. El panel A muestra productos de PCR producidos empleando cebadores específicos para clpX, mientras que el panel B muestra productos de PCR producidos empleando cebadores específicos para guaBA. Las flechas indican bandas de marcador de peso molecular de 1,5 kb (arriba) y 0,5 kb (abajo) en el panel A, y de 3 kb (arriba) y 0,5 kb (abajo) en el panel B.
Figura 5: muestra los productos de amplificación por PCR de S. Paratyphi A atenuada con wt, clpP y clpPguaBA. El panel A muestra productos de PCR producidos empleando cebadores específicos para clpP, mientras que el panel B muestra productos de PCR producidos empleando cebadores específicos para guaBA. Las flechas indican bandas de marcador de peso molecular de 1 kb (arriba) y 0,5 kb (abajo) en el panel A, y de 3 kb (arriba) y 0,5 kb (abajo) en el panel B.
Figura 6: representación gráfica de datos de ensayos de LD50 en ratones a los que se les inyectó wt, S. Paratyphi A con deleción de guaBA, con deleción de guaBA complementada con pLowBlu 184 y con deleción de guaBA complementada con pATGguaBA.
Figura 7: representación gráfica de datos de ensayos LP50 en ratones a los que se les inyectó wt, S. Paratyphi A con deleción de clpX, S. Paratyphi A con deleción de guaBA, o S. Paratyphi A con deleción de clpXguaBA. Los datos incluyen ratones a los que se les inyectó S. Paratyphi A con deleción de clpX complementada con pLowBlu 184 o pATGclpX, así como S. Paratyphi A con deleción de clpX-guaBA complementada con pLowBlu 184 o pATGclpXATGguaBA.
Figura 8: representación gráfica de datos de ensayos de LD50 en ratones a los que se les inyectó wt, S. Paratyphi A con deleción de clpP, S. Paratyphi A con deleción de guaBA, o S. Paratyphi A con deleción de clpPguaBA. Los datos incluyen ratones a los que se les inyectó S. Paratyphi A con deleción de clpP complementada con pLowBlu 184 o pATGclpP, así como S. Paratyphi A con deleción de clpP-guaBA complementada con pLowBlu 184 o pATGclpPATGguaBA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una cepa de S. Paratyphi A atenuada, teniendo dicha cepa una mutación atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX. Tales cepas de S. Paratyphi A atenuadas pueden emplearse para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto sin provocarle una enfermedad.
La cepa de S. Paratyphi A empleada como material de partida de la presente invención puede ser cualquier cepa de
S. Paratyphi A, no siendo crítica la identidad de la cepa. Entre las cepas de S. Paratyphi A preferidas se incluye la cepa de S. Paratyphi A 9150.
Las cepas de S. Paratyphi A de la presente invención están atenuadas. En el presente documento, las cepas de S. Paratyphi A atenuadas son aquellas que tienen una capacidad reducida, disminuida o reprimida para provocar una enfermedad en un sujeto, o aquellas que carecen por completo de la capacidad para provocar una enfermedad en un sujeto. Las cepas atenuadas pueden presentar una expresión reducida o no presentar ninguna expresión de uno
o más genes, pueden expresar una o más proteínas con una actividad reducida o sin actividad, pueden presentar una capacidad reducida para crecer y dividirse, o una combinación de dos o más de estas características. Las cepas atenuadas de la presente invención pueden estar vivas o muertas.
Además de las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención, dentro del alcance de la invención se incluyen también cepas atenuadas de otros patógenos entéricos (por ejemplo Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi B, Shigella, Vibrio cholerae), comensales (por ejemplo Lactobacillus, Streptococcus gordonii) y cepas utilizadas en vacunas autorizadas (por ejemplo BCG). Estas cepas adicionales tienen todas las mutaciones atenuantes de las cepas de S. Paratyphi A de la presente invención, pueden transformarse con el sistema de expresión plasmídico estabilizado de la presente invención y pueden utilizarse como composición inmunizadora según se describe en el presente documento.
En realizaciones preferentes, las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención tienen un atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX de S. Paratyphi. Por ejemplo, las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención pueden tener una mutación (i) en el gen guaB y el gen clpP, (ii) en el gen guaA y el gen clpP, (iii) en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpP, (iv) en los loci guaBA y el gen clpP, (v) en el gen guaB y el gen clpX, (vi) en el gen guaA y el gen clpX, (vii) en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpX, (viii) en los loci guaBA y el gen clpX, (ix) en el gen guaB, el gen clpP y el gen clpX, (x) en el gen guaA, el gen clpP y el gen clpX, (xi) en el gen guaB, el gen guaA, el gen clpP y el gen clpX, o (xii) en los loci guaBA, el gen clpP y el gen clpX.
Las mutaciones de los loci y genes aquí descritas pueden ser cualesquiera mutaciones, tales como deleciones, inserciones o sustituciones de uno o más ácidos nucleicos. Las mutaciones pueden ser cualquier deleción, inserción
o sustitución de los loci o genes que resulte en una reducción o ausencia de la expresión de los loci o genes, o una reducción o ausencia de la actividad de un polipéptido codificado por los loci o genes. Las mutaciones pueden estar en las regiones codificadoras o no codificadoras de los loci o genes.
Preferentemente, en la presente invención, el genoma cromosómico de la cepa de S. Paratyphi A se modifica por eliminación u otra modificación de los loci guaBA, bloqueando así la biosíntesis de novo de nucleótidos de guanina. Con especial preferencia, una mutación en los loci guaBA inactiva las enzimas IMP deshidrogenasa (codificada por guaB) y GMP sintetasa (codificada por guaA) de la vía metabólica de la purina. A consecuencia de estas mutaciones, las S. Paratyphi A son incapaces de sintetizar de novo GMP y, por consiguiente, los nucleótidos GDP y GTP, lo que limita seriamente el crecimiento bacteriano en tejidos de mamífero. In vitro, los mutantes lguaBA de S. Paratyphi A de la presente invención son incapaces de crecer en un medio mínimo, a no ser que se complemente con guanina. En un cultivo tisular se comprobó que los mutantes lguaBA de S. Paratyphi A de la presente invención muestran una importante reducción en su capacidad para la invasión. Los mutantes lguaBA de S. Paratyphi A pueden eliminar nucleótidos de guanina de los tejidos del huésped mamífero. Sin embargo, su asimilación en S. Paratyphi A requiere antes una desfosforilación a nucleósidos mediante nucleotidasas periplásmicas para ser incorporados como precursores de nucleótido en la vía de rescate de la guanina. Por tanto, dado que los nucleótidos están fácilmente disponibles en el entorno intracelular del huésped mamífero, la atenuación debida a la síntesis de novo de nucleótidos de guanina se debe bien a la ineficacia de la vía de rescate o a razones ocultas para los conocimientos actuales.
El gen guaA de S. Paratyphi A 9150, que codifica la GMP sintetasa, tiene un tamaño de 1.578 pb (SEQ ID nº: 36) y es en un 98% homólogo al gen guaA de S. Typhi Ty2, según se ha determinado mediante comparación de nucleótidos por NCBI BLAST. Pueden producirse mutantes de deleción eliminando porciones de la región codificadora del gen guaA de S. Paratyphi A, de modo que se impida una actividad o un plegado adecuados de GuaA. Por ejemplo pueden delecionarse de la región codificadora entre aproximadamente 25 y aproximadamente
1.500 pb, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 1.400 pb, entre aproximadamente 100 y aproximadamente
1.300 pb, o todos ellos. Como alternativa, los mutantes de deleción pueden producirse eliminando, por ejemplo, un fragmento de 1 a 100 pb del gen guaA de S. Paratyphi A, de modo que se desplace el marco de lectura adecuado del gen. En el último caso, puede producirse un polipéptido sin sentido o puede abortarse la síntesis del polipéptido debido a un codón de terminación inducido por desplazamiento del marco. El tamaño preferido de la deleción es de aproximadamente 75 a 750 pb. También pueden realizarse deleciones que se extiendan más allá del gen guaA, es decir deleciones en los elementos que controlan la traducción del gen guaA, por ejemplo en un sitio de unión ribosómica.
El gen guaB de S. Paratyphi A 9150, que codifica la IMP deshidrogenasa, tiene un tamaño de 1.467 pb (SEQ ID nº: 35) y es en un 98% homólogo al gen guaB de S. Typhi Ty2, según se ha determinado mediante comparación de nucleótidos por NCBI BLAST. Pueden producirse mutantes de deleción eliminando porciones de la región codificadora del gen guaB de S. Paratyphi A, de modo que se impida una actividad o un plegado adecuados de GuaB. Por ejemplo pueden delecionarse de la región codificadora entre aproximadamente 25 y aproximadamente
1.400 pb, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 1.300 pb, entre aproximadamente 100 y aproximadamente
1.200 pb, o todos ellos. Como alternativa, los mutantes de deleción pueden producirse eliminando, por ejemplo, un fragmento de 1 a 100 pb del gen guaB de S. Paratyphi A, de modo que se desplace el marco de lectura adecuado del gen. En el último caso, puede producirse un polipéptido sin sentido o puede abortarse la síntesis del polipéptido debido a un codón de terminación inducido por desplazamiento del marco. El tamaño preferido de la deleción es de aproximadamente 75 a 750 pb. También pueden realizarse deleciones que se extiendan más allá del gen guaB, es decir deleciones en los elementos que controlan la traducción del gen guaB, por ejemplo en un promotor.
El gen clpP de S. Paratyphi A 9150, que codifica una serina proteasa, tiene un tamaño de 624 pb (SEQ ID nº: 37) y es en un 99% homólogo al gen clpP de S. Typhi Ty2, según se ha determinado mediante comparación de nucleótidos por NCBI BLAST. Pueden producirse mutantes de deleción eliminando porciones de la región codificadora del gen clpP de S. Paratyphi A, de modo que se impida una actividad o un plegado adecuados de ClpP. Por ejemplo pueden delecionarse de la región codificadora entre aproximadamente 25 y aproximadamente 600 pb, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 500 pb, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 400 pb, o todos ellos. Como alternativa, los mutantes de deleción pueden producirse eliminando, por ejemplo, un fragmento de 1 a 100 pb del gen clpP de S. Paratyphi A, de modo que se desplace el marco de lectura adecuado del gen. En el último caso, puede producirse un polipéptido sin sentido o puede abortarse la síntesis del polipéptido debido a un codón de terminación inducido por desplazamiento del marco. El tamaño preferido de la deleción es de aproximadamente 25 a 600 pb. También pueden realizarse deleciones que se extiendan más allá del gen clpP, es decir deleciones en los elementos que controlan la traducción del gen clpP, por ejemplo en un promotor.
El gen clpX de S. Paratyphi A 9150, que codifica una chaperona ATPasa, tiene un tamaño de 1.272 pb (SEQ ID nº: 38) y es en un 99% homólogo al gen clpX de S. Typhi Ty2, según se ha determinado mediante comparación de nucleótidos por NCBI BLAST. Pueden producirse mutantes de deleción eliminando porciones de la región codificadora del gen clpX de S. Paratyphi A, de modo que se impida una actividad o un plegado adecuados de ClpX. Por ejemplo pueden delecionarse de la región codificadora entre aproximadamente 25 y aproximadamente 1.200 pb, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 1.100 pb, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1.000 pb,
o todos ellos. Como alternativa, los mutantes de deleción pueden producirse eliminando, por ejemplo, un fragmento de 1 a 100 pb del gen clpX de S. Paratyphi A, de modo que se desplace el marco de lectura adecuado del gen. En el último caso, puede producirse un polipéptido sin sentido o puede abortarse la síntesis del polipéptido debido a un codón de terminación inducido por desplazamiento del marco. El tamaño preferido de la deleción es de aproximadamente 75 a 750 pb. También pueden realizarse deleciones que se extiendan más allá del gen clpX, es decir deleciones en los elementos que controlan la traducción del gen clpX, por ejemplo en un promotor.
Las deleciones pueden realizarse en cualquiera de los loci o genes aquí incluidos, utilizando sitios de restricción convenientes situados dentro de los loci o genes, o mediante una mutagénesis de sitio dirigido con oligonucleótidos (Sambrook y col., en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ed., Cold Spring Harbor Publications (1989)).
Puede realizarse también una inactivación de los loci o genes mediante una inserción de ADN extraño, utilizando cualquier sitio de restricción conveniente, o mediante una mutagénesis de sitio dirigido con oligonucleótidos (Sambrook y col., supra), de modo que se interrumpa la transcripción correcta de los loci o genes. El tamaño típico de una inserción que pueda inactivar los loci o genes está entre 1 par de bases y 100 kpb, aunque son preferibles las inserciones inferiores a 100 kpb. La inserción puede realizarse en cualquier lugar dentro de las regiones codificadoras de los loci o genes o entre las regiones codificadoras y los promotores.
Otros métodos para la inactivación de los loci y los genes incluyen la transferencia a Salmonella de deleciones o inserciones realizadas en loci guaBA, genes guaA, guaB, clpP o clpX de otras enterobacterias, deleciones generadas por transposón, y la excisión imprecisa de inserciones de ADN.
Preferentemente, los loci y genes bacterianos se mutan empleando mutagénesis mediada por Lambda Red (Datsenko y Wanner, PNAS USA 97: 6640-6645 (2000)). Resumiendo, en la etapa 1 las bacterias huésped a las que va dirigida la mutación se transforman con un plásmido sensible a la temperatura que codifica A, Red recombinasa. Estas bacterias se cultivan en presencia de arabinosa para inducir la producción de A, Red. Se realiza una mutagénesis cromosómica de una secuencia diana mediante electroporación del huésped con ADN lineal en el que el gen diana se sustituye por un marcador de resistencia a los antibióticos. Este ADN codifica también regiones cortas de secuencias cromosómicas flanqueantes para permitir una integración cromosómica del marcador de resistencia mediante recombinación homóloga mediada por A Red. Se seleccionan los recombinantes en un medio sólido que contiene el antibiótico adecuado y se incuban a una temperatura que facilita la pérdida del plásmido que codifica la A Red recombinasa. Para la etapa 2, la retirada del marcador de resistencia cromosómico se facilita transformando las bacterias con un plásmido sensible a la temperatura que codifica FLP recombinasa y que se dirige a secuencias únicas dentro del marcador de resistencia a los antibióticos ahora presentes en el cromosoma huésped. Se cultivan transformantes a temperaturas permisivas para la presencia de la FLP recombinasa, que se expresa de manera constitutiva. Se criban los mutantes mediante PCR, se cultivan a una temperatura que facilita la pérdida del plásmido que codifica FLP recombinasa y se seleccionan para su almacenamiento.
Las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención pueden contener mutaciones en uno o más genes adicionales. Aunque la patente US nº 6.682.729 incluye una extensa discusión sobre mutaciones atenuantes adicionales de Salmonella spp., entre los ejemplos de genes se incluyen los que codifican diversas vías bioquímicas, sistemas reguladores globales, proteínas de choque térmico, otros genes reguladores y propiedades de virulencia putativas. Entre los ejemplos específicos de tales mutaciones atenuantes se incluyen, sin limitarse a las mismas: (i) mutaciones auxotróficas, tales como mutaciones de aro, gua, nad, thy y asd; (ii) mutaciones que inactivan funciones reguladoras globales, tales como mutaciones de cya, crp, phoP/phoQ, phoPc y ompR; (iii) mutaciones que modifican la respuesta al estrés, tales como mutaciones de recA, htrA, htpR, hsp y groEL; (iv) mutaciones en factores de virulencia específicos, tales como mutaciones de pag y prg; (v) mutaciones que afectan a la topología del ADN, tales como mutaciones de topA; (vi) mutaciones que bloquean la biogénesis de polisacáridos de superficie, tales como mutaciones de rfb, galE y via; (vii) mutaciones que modifican sistemas suicidas, tales como mutaciones de sacB, nuc, hok, gef, kil y phlA; (viii) mutaciones que introducen sistemas suicidas, tales como lisógenos codificados por P22, A murein transglicosilasa y gen S; y (ix) mutaciones que alteran o modifican el ciclo celular correcto, tales como mutaciones de minB.
Las cepas de S. Paratyphi A atenuadas según la reivindicación 1 de la presente invención incluyen las cepas diseñadas por ingeniería para expresar polipéptidos seleccionados (antígenos). Tales cepas de S. Paratyphi A atenuadas pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria en la S. Paratyphi misma o para inducir una respuesta inmunitaria en los antígenos seleccionados expresados por las cepas de S. Paratyphi A atenuadas, o ambas respuestas.
Tales cepas de S. Paratyphi A atenuadas se transforman con un sistema plasmídico de expresión estabilizado. El sistema plasmídico de expresión estabilizado codifica un antígeno seleccionado.
El sistema plasmídico de expresión estabilizado comprende un vector de expresión que comprende un sistema de mantenimiento plasmídico (PMS) y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado.
El sistema plasmídico de expresión estabilizado optimiza el mantenimiento del vector de expresión en las bacterias en dos niveles independientes, mediante: (1) eliminación de la dependencia exclusiva de los sistemas de mantenimiento letales equilibrados y (2) incorporación de un sistema de partición plasmídica para impedir la segregación aleatoria de vectores de expresión, mejorando así su herencia y estabilidad.
El PMS incluye (a) un origen de replicación, (b) como mínimo una función de destrucción postsegregacional y (c) como mínimo una función de partición. Cada uno de los elementos del PMS mencionados puede ser un casete individual del sistema plasmídico de expresión estabilizado. Cada uno de los casetes puede comprender sitios de corte de enzima de restricción únicos situados en los extremos 5' y 3' de los casetes.
Los sistemas plasmídicos de expresión estabilizados preferentes son los descritos en la solicitud de patente US nº 11/542.264 en trámite.
1. Origen de replicación
El PMS incluye un origen de replicación de número de copias restringido que limita el vector de expresión a un margen de copias plasmídicas por célula. Debido a los diversos grados de toxicidad asociados a los diferentes antígenos seleccionados (por ejemplo toxicidad elevada para antígenos derivados de organismos parasitarios tales como el Plasmodium falciparum contra la ausencia prácticamente total de toxicidad para el fragmento C de la toxina del tétanos), el sistema plasmídico de expresión estabilizado de la presente invención está basado en un vector de expresión (plásmido) de número de copias bajo o medio. El técnico en la materia comprenderá que la selección de un origen de replicación dependerá del grado de toxicidad, es decir que el número de copias debería disminuir según aumenta la toxicidad con respecto a la cepa bacteriana.
Es preferible que el origen de replicación confiera un número medio de copias entre aproximadamente 2 y aproximadamente 75 copias por célula, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 60 copias por célula, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 copias por célula o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 copias por célula. Los orígenes de replicación aquí incluidos se derivan del plásmido pAT153 de E. coli (oriE1, ~60 copias por equivalente cromosómico), el plásmido pACYC184 de E. coli (ori15A, ~15 copias por equivalente cromosómico) y el plásmido pSC101 de Salmonella typhimurium (ori101, ~5 copias por equivalente cromosómico). Las organizaciones estructurales de los casetes de origen de replicación obtenidos por ingeniería para pSC101, pACYC184 y pAT153 son análogas en estructura y función.
Los orígenes de replicación de la presente invención incluyen no sólo orígenes de replicación presentes en la naturaleza, sino también orígenes de replicación codificados por secuencias de nucleótidos que son esencialmente homólogas a secuencias de nucleótidos que codifican orígenes de replicación presentes en la naturaleza y que conservan la función de aquellas de los orígenes de replicación presentes en la naturaleza.
En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia oriEl de SEQ ID nº: 28, la secuencia ori101 de SEQ ID nº: 30 y la secuencia ori15A de SEQ ID nº: 29.
En una realización especialmente preferente, el origen de replicación es el locus oriE1 de pSC101 que confiere un número de copias de aproximadamente 5 copias por equivalente genómico, de SEQ ID nº: 28.
2. Función de partición
El PMS incluye también una función de partición, también conocida en la técnica y en el presente documento como "sistema de segregación" y "sistema de partición". La función de partición es cualquier función mejoradora de la estabilidad plasmídica que actúe aumentando la frecuencia de suministro exitoso de un plásmido a cada célula bacteriana recién dividida, en comparación con la frecuencia de suministro de un plásmido correspondiente sin dicha función. Entre los sistemas de partición se incluyen, por ejemplo, sistemas de equipartición, sistemas de partición par-sitio y los sistemas facilitados en la Tabla 1 del Capítulo 5, Partition Systems of Bacterial Plasmids, B.E. Funnell y R.A. Slavcev, en Plasmid Biology. 2004, BE Funnell y GJ Phillips, ed. ASM Press, Washington, DC.
Los sistemas de partición de la presente invención incluyen no sólo sistemas de partición presentes en la naturaleza, sino también sistemas de partición codificados por secuencias de nucleótidos que son esencialmente homólogas a las secuencias de nucleótidos que codifican sistemas de partición presentes en la naturaleza y que conservan la función de los sistemas de partición naturales.
Ejemplos de funciones de partición incluyen, sin limitación, sistemas de pSC101, el factor F, el profago P1 y los plásmidos de resistencia a los fármacos IncFII.
En particular puede utilizarse el locus de partición pasivo par. La función del locus par parece estar relacionada con el sobreenrollado plasmídico creciente en el origen de replicación, que también es el sitio de unión para ADN girasa. Un ejemplo de secuencia par es la de E. coli, de SEQ ID nº: 32 (Miller y col., Nucleotide sequence of the partition
locus of Escherichia coli plasmid pSC101, Gene 24:309-15 (1983); nº de registro GenBank X01654, nucleótidos 4524 - 4890).
También puede emplearse el locus parA de partición activa. En SEQ ID nº: 31 se expone un ejemplo de secuencia de locus parA.
3. Función de destrucción postsegregacional
El PMS incluye además como mínimo una función de destrucción postsegregacional (PSK). La función PSK es una función que resulta en la muerte de toda célula bacteriana recién dividida que no herede el plásmido de interés, e incluye específicamente sistemas letales equilibrados tales como asd o ssb, sistemas proteicos tales como phd-doc y sistemas antisentido tales como hok-sok.
La función PSK de la presente invención incluye no sólo funciones PSK presentes en la naturaleza, sino también funciones PSK codificadas por secuencias de nucleótidos que son esencialmente homólogas a las secuencias de nucleótidos que codifican funciones PSK presentes en la naturaleza y que conservan la función presentada por las funciones PSK naturales.
En realizaciones preferentes, la función PSK es el sistema letal equilibrado ssb. Se utiliza la proteína de unión a cadena simple (SSB) de S. Typhi para transcomplementar una mutación de otro modo letal introducida en el gen ssb cromosómico. Los papeles bioquímico y metabólico de la proteína SSB de E. coli se han analizado extensamente en Lohman y col., Annual Reviews in Biochemistry 63:527, 1994 y Chase y col., Annual Reviews in Biochemistry 55:103, 1986.
En las cepas de S. Paratyhphi A de la presente invención que comprenden un sistema plasmídico de expresión estabilizado donde la función PSK es el sistema letal equilibrado ssb, el locus ssb nativo de las bacterias se inactiva. El locus ssb nativo puede inactivarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como un vector suicida que comprenda un origen de replicación sensible a la temperatura o por mutagénesis mediada por Lambda-Red (Datsenko y Wanner, PNAS USA 97:6640-6645 (2000)). En un aspecto preferente, la mutagénesis mediada por Lambda Red se utiliza para inactivar el locus ssb de las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención.
En otro aspecto de la invención, la función PSK es el locus ssb en el que, como promotores de la función PSK de ssb, se utilizan tanto el promotor del gen ssb inducible como el promotor del gen ssb constitutivo. En una realización preferente, la función PSK comprende un promotor inducible de ssb, un promotor constitutivo de ssb y una región codificadora de ssb. El locus ssb es preferentemente el locus ssb de Shigella flexneri, de Salmonella Typhi o de E. coli. En una realización, el locus ssb es el locus ssb de la cepa CVD 1208s de S. flexneri 2a mostrado en la SEQ ID nº: 34.
En un aspecto relacionado de la invención pueden incorporarse al sistema plasmídico de expresión estabilizado alelos mutados tales como ssb-1 (o cualquier mutación funcionalmente equivalente a este alelo, tal como W54S; Carlini y col., Mol. Microbiol. 10:1067-1075 (1993)), con el fin de mejorar los plásmidos de número de copias elevado mediante una sobreexpresión de proteínas afines a SSB1 para formar los tetrámeros biológicamente activos de SSB requeridos.
En otra realización, el PMS comprende dos funciones PSK.
4. Antígeno seleccionado
El sistema plasmídico de expresión estabilizado comprende también un polinucleótido que codifica el antígeno seleccionado bajo el control de un promotor.
El promotor es preferentemente un promotor regulable con respecto al entorno, controlado por una señal biológicamente relevante tal como la osmolaridad. En una realización preferente, el promotor es el promotor ompC. El gen ompC codifica una proteína porina que se inserta en forma de trímero en la membrana exterior de una célula bacteriana. La expresión y el control de ompC se han analizado en detalle en Pratt y col., Molecular Microbiology 20:911, 1996 y Egger y col., Genes to Cells 2: 167, 1997. En una realización preferente, el fragmento del promotor ompC de E. coli se muestra en la SEQ ID nº: 33. Véase la patente US nº 6.703.233. La transcripción de este casete puede terminarse en la región 3'-distal mediante un terminador transcripcional trpA.
En un aspecto, el promotor inducible es el promotor PompC3 o PompC1 mutado. El promotor puede emplearse para controlar exclusivamente la transcripción del antígeno seleccionado aguas abajo.
La invención abarca la expresión de cualquier antígeno que no destruya la cepa de S. Paratyphi A atenuada que lo expresa y que provoque una respuesta inmunitaria cuando se administra al sujeto la cepa de S. Paratyphi A
atenuada que expresa el antígeno. Los antígenos seleccionados pueden ser homólogos (de S. Paratyphi A) o heterólogos.
Entre los ejemplos, no limitativos, del antígeno seleccionado se incluyen: antígeno de toxina Shiga 1 (Stx1), antígeno de toxina Shiga 2 (Stx2), hepatitis B, Haemophilus influenzae tipo b, hepatitis A, pertussis acelular (acP), varicela, rotavirus, Streptococcus pneumoniae (neumocócico) y Neisseria meningitidis (meningocócico). Véase Ellis y col., Advances in Pharm., 39:393423, 1997. Si el antígeno es un antígeno de toxina Shiga 2, el antígeno de toxina Shiga 2 puede, por ejemplo, ser un pentámero de subunidad B o bien una Stx 2 genéticamente destoxificada. Entre otros antígenos de relevancia para la biodefensa se incluyen: 1) uno o más dominios de la parte del antígeno protector PA83 de la toxina carbuncosa, incluyendo, pero sin limitarse al mismo, el dominio 4 (el dominio de unión celular eucariota; D4), la forma biológicamente activa de 63 kDa procesada de PA83, o el PA83 en toda su longitud; y 2) antígenos de Clostridium botulinum que comprenden el fragmento de cadena pesado de unión celular eucariota de cualquier neurotoxina serotipo A, B, C, D, E, F o G, en cualquier combinación. Entre otros antígenos seleccionados se incluyen todos los descritos en la patente US nº 6.190.669.
En un aspecto, el antígeno seleccionado es un antígeno que induce una respuesta inmunitaria al cáncer. En otro aspecto, el antígeno seleccionado está diseñado para provocar una respuesta inmunitaria a autoantígenos, receptores de células B y/o receptores de células T implicados en enfermedades autoinmunes o inmunológicas. Por ejemplo, en los casos en que se provoquen respuestas inmunitarias inadecuadas contra tejidos corporales o antígenos ambientales, las composiciones inmunizadoras de la presente invención pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria a los autoantígenos, receptores de células B y/o receptores de células T para modular las respuestas y mejorar las enfermedades. Por ejemplo, tales técnicas pueden resultar eficaces para tratar la miastenia grave, el lupus eritematoso, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, alergias y el asma.
En otro aspecto de la presente invención, el sistema plasmídico de expresión estabilizado puede incluir un polinucleótido que codifique un marcador seleccionable o un marcador sensible a la temperatura, tal como un marcador de resistencia a los fármacos. Un ejemplo no limitativo de marcador de resistencia a los fármacos es aph, del que en la técnica actual se sabe que confiere resistencia a los aminoglucósidos kanamicina y/o neomicina.
En el presente documento, los términos "en esencia homólogo" o "esencialmente homólogo" en relación con una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos indican que la secuencia de ácidos nucleicos o la secuencia de aminoácidos tiene suficiente homología con respecto a la secuencia de referencia (por ejemplo una secuencia nativa o presente en la naturaleza) para permitir a la secuencia realizar la misma función básica que la secuencia de referencia correspondiente; en general, una secuencia esencialmente homóloga es al menos aproximadamente en un 70 por ciento idéntica a la secuencia de referencia, en general como mínimo aproximadamente en un 85 por ciento idéntica, con preferencia como mínimo aproximadamente en un 90 o un 95 por ciento idéntica y con la máxima preferencia aproximadamente en un 96, 97, 98 o 99 por ciento idéntica, a dicha secuencia de referencia. Se entiende que, en esta memoria descriptiva, cuando se haga referencia a secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos específicas, tales secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos pueden sustituirse por secuencias esencialmente homólogas.
La presente invención incluye también una formulación farmacéutica según las reivindicaciones 19 y 20 para su uso en métodos para inducir en un sujeto una respuesta inmunitaria a la cepa de S. Paratyphi A atenuada misma, a un antígeno seleccionado expresado por una cepa de S. Paratyphi A atenuada transformada con un sistema plasmídico de expresión estabilizado, o a ambos.
En una realización, el empleo de una formulación farmacéutica según las reivindicaciones 19 y 20 para su uso en métodos para inducir una respuesta inmunitaria comprende la administración a un sujeto de una o más de las cepas de la presente invención en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en él. En el presente documento, la cepa de la presente invención incluye cepas de S. Paratyphi A atenuadas tanto transformadas como no transformadas.
En otra realización, el empleo de una formulación farmacéutica según las reivindicaciones 19 y 20 para su uso en métodos para inducir una respuesta inmunitaria comprende la administración a un sujeto de la formulación farmacéutica que comprende una o más de las cepas de la presente invención en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto (una cantidad inmunológicamente eficaz).
Por conveniencia, en el presente documento nos referiremos a las cepas de la presente invención y a las formulaciones farmacéuticas que comprenden las cepas como "composiciones inmunizadoras". El técnico en la materia comprenderá que composiciones inmunizadoras es sinónimo de vacunas.
En el presente documento, una "respuesta inmunitaria" es la respuesta fisiológica del sistema inmunitario del sujeto a la composición inmunizadora. Una respuesta inmunitaria puede incluir una respuesta inmunitaria innata, una respuesta inmunitaria adaptativa, o ambas.
En una realización preferente de la presente invención, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora. Una respuesta inmunitaria protectora confiere memoria celular inmunológica al sujeto, con el efecto de que una exposición secundaria al mismo antígeno o a uno similar está caracterizada por una o más de las siguientes características: fase de latencia más corta que la fase de latencia resultante de la exposición al antígeno seleccionado en ausencia de una exposición previa a la composición inmunizadora; producción de anticuerpos que continúa durante un periodo más largo que la producción de anticuerpos resultante de la exposición al antígeno seleccionado en ausencia de una exposición previa a la composición inmunizadora; un cambio en el tipo y la calidad de los anticuerpos producidos en comparación con el tipo y la calidad de los anticuerpos producidos con una exposición al antígeno seleccionado en ausencia de una exposición previa a la composición inmunizadora; un desplazamiento en la respuesta de clase, con una aparición de anticuerpos IgG en mayores concentraciones y con una mayor persistencia que IgM, en relación con lo que ocurre en respuesta a una exposición al antígeno seleccionado en ausencia de una exposición previa a la composición inmunizadora; una afinidad media (constante de unión) entre los anticuerpos y el antígeno mayor que la afinidad media entre los anticuerpos y el antígeno resultante de una exposición al antígeno seleccionado en ausencia de una exposición previa a la composición inmunizadora; y/u otras características de las que conocidas en el estado actual de la técnica por caracterizar una respuesta inmunitaria secundaria.
El sujeto al que pueden administrarse las composiciones inmunizadoras es preferentemente un humano, pero también puede ser otro mamífero, por ejemplo simios, perros, gatos, caballos, vacas o cerdos, o aves, por ejemplo gallinas.
En una realización, el sujeto es un sujeto con riesgo de desarrollar una infección por S. Paratyphi A. En otra realización, el sujeto es inmunológicamente naïve o, como alternativa, presenta una inmunidad preexistente a la infección por S. Typhi o la infección por S. Paratyphi A.
En otra realización, el sujeto al que se administran las cepas de la presente invención desarrolla una respuesta inmunitaria protectora contra la fiebre paratifoidea.
Las cepas atenuadas de la presente invención, tanto las no transformadas como las transformadas con un sistema plasmídico de expresión estabilizado, pueden administrarse a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria. En una realización preferente, las cepas de la presente invención se administran en una formulación farmacéutica.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir vehículos, excipientes y otros ingredientes, tales como adyuvantes, farmacéuticamente aceptables. Los vehículos, excipientes y otros ingredientes farmacéuticamente aceptables son compuestos, soluciones, sustancias o materiales que son compatibles con las cepas de la presente invención y no son indebidamente perjudiciales para su destinatario. En particular, los vehículos, excipientes y otros ingredientes de la presente invención son aquellos que resultan útiles para preparar una formulación farmacéutica que, en líneas generales, sea segura, no sea tóxica, no sea indeseable desde el punto de vista biológico ni desde otro punto de vista y pueda presentar perfiles farmacológicamente favorables, e incluyen vehículos, excipientes y otros ingredientes aceptables tanto para el uso veterinario como para el uso farmacéutico en humanos.
En el estado actual de la técnica son bien conocidos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, que el técnico en la materia puede determinar según lo justifique la situación clínica. El técnico en la materia entenderá que los diluyentes están incluidos en el alcance de los términos "vehículos" y "excipientes". Entre los ejemplos de vehículos y excipientes adecuados se incluyen: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y más en particular: (1) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de seroalbúmina humana, (2) solución salina al 0,9% (0,9% p/v NaCl), (3) dextrosa al 5% (p/v) y (4) agua.
El modo de administración de las composiciones inmunizadoras de la presente invención puede ser cualquier método y/o medio de suministro adecuado que tenga como resultado la inducción de una respuesta inmunitaria en el sujeto. Los medios de suministro pueden incluir, sin limitación, métodos de administración parenteral, tales como inyección subcutánea (SC), inyección intravenosa (IV), transdérmica, intramuscular (IM), intradérmica (ID), así como de administración no parenteral, por ejemplo oral, nasal, intravaginal, pulmonar (inhalación), oftálmica, rectal, o cualquier otro método que tenga como resultado un contacto de la composición inmunogénica con los tejidos mucosos. La administración es preferentemente vía oral.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunizadoras existen en forma de una dispersión atomizada para el suministro por inhalación. Mediante métodos convencionales pueden prepararse diversas formulaciones líquidas y en polvo para su inhalación en los pulmones del sujeto a tratar. En general, la dispersión atomizada de las composiciones inmunizadoras contiene vehículos habituales para dispersiones atomizadas o en aerosol, tales como solución salina tamponada y/u otros compuestos bien conocidos por el técnico en la materia. El suministro de las composiciones inmunogénicas mediante inhalación tiene el efecto de dispersar rápidamente las
composiciones inmunizadoras en una gran área de los tejidos mucosos, así como de una rápida absorción por la sangre para la circulación de las composiciones inmunizadoras.
Adicionalmente, las composiciones inmunizadoras existen también en forma líquida. El líquido puede ser para la administración vía oral, vía oftálmica o nasal en forma de gotas, o para el uso como enema o irrigación. Si la composición inmunizadora está formulada en forma de líquido, el líquido puede ser bien una solución o bien una suspensión de la composición inmunizadora. Existen diversas formulaciones adecuadas para la solución o suspensión de la composición inmunizadora ya conocidas por el técnico en la materia, que dependen del uso previsto para las mismas. Las formulaciones líquidas para la administración vía oral preparadas en agua u otros vehículos acuosos pueden contener diversos agentes de suspensión, por ejemplo metilcelulosa, alginatos, tragacanto, pectina, kelgina, carragenina, goma arábiga, polivinilpirrolidona y alcohol polivinílico. Las formulaciones líquidas pueden incluir también soluciones, emulsiones, jarabes y elixires que contengan, junto con las composiciones inmunizadoras, agentes humectantes, edulcorantes, colorantes y aromatizantes.
El suministro de las composiciones inmunizadoras descritas en forma líquida mediante la administración vía oral expone la mucosa de los tractos gastrointestinal y urogenital a las composiciones inmunizadoras. Una dosis adecuada, estabilizada para resistir los valores pH extremos del estómago, suministra la composición inmunizadora en todas las zonas del tracto gastrointestinal, especialmente sus partes superiores. Para el uso con las composiciones inmunizadoras aquí descritas se contemplan cualesquiera métodos adecuados para estabilizar la composición inmunizadora en una dosificación oral líquida de manera que el suministro efectivo de la composición se distribuya a lo largo del tracto gastrointestinal, incluyendo cápsulas y una solución salina tamponada resuspendida para proteger las bacterias atenuadas contra el pH ácido. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables empleados en concreto no son críticos para la presente invención y son habituales en la técnica actual. Entre los ejemplos de diluyentes se incluyen: tampones para el tamponado contra el ácido gástrico del estómago, tales como tampón citrato (pH 7,0) con contenido en sacarosa, tampón bicarbonato (pH 7,0) solo o tampón bicarbonato (pH 7,0) con contenido en ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine y col., Lancet, II:467-470 (1988)). Entre los ejemplos de vehículos se incluyen: proteínas, por ejemplo aquellas se hallan en la leche desnatada; azúcares, por ejemplo sacarosa; o polivinilpirrolidona.
El suministro de las composiciones inmunizadoras descritas en forma líquida por medio de gotas oftálmicas expone la mucosa de los ojos y los tejidos asociados a las composiciones inmunizadoras. Un vehículo líquido típico para las gotas oculares está tamponado y contiene otros compuestos ya conocidos y fácilmente identificables para el técnico en la materia.
El suministro de las composiciones inmunizadoras descritas en forma líquida por medio de aerosol o gotas nasales expone la mucosa de la nariz y los senos y los tejidos asociados a las composiciones inmunizadoras. En general, los vehículos líquidos para las gotas nasales son diversas formas de solución salina tamponada.
Las formulaciones inyectables de las composiciones inmunizadoras pueden contener diversos vehículos, tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol, polioles (glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y similares. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5%, solución salina al 0,9%, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Las preparaciones intramusculares pueden disolverse y administrarse en un excipiente farmacéutico tal como agua para inyección, solución salina al 0,9% o solución de glucosa al 5%.
Las cepas de S. Paratyphi A atenuadas de la presente invención pueden administrarse a un sujeto junto con otros agentes farmacológica o fisiológicamente activos, por ejemplo sustancias antigénicas y/u otras sustancias biológicamente activas.
Las cepas de S. Paratyphi A atenuadas que comprenden un sistema plasmídico de expresión estabilizado pueden administrarse a un sujeto antes, durante o después de que haya comenzado la expresión del antígeno seleccionado. Por ejemplo, la cepa de S. Paratyphi A atenuada que comprende un sistema plasmídico de expresión estabilizado puede cultivarse durante cierto tiempo antes de su administración a un sujeto, para permitir a las bacterias producir cantidades suficientes del antígeno seleccionado, de manera que al administrarse las bacterias se provoque una respuesta inmunitaria al antígeno seleccionado.
La cantidad y la velocidad de administración de las composiciones inmunizadoras de la presente invención pueden ser fácilmente determinadas por el técnico en la materia sin una excesiva experimentación, por ejemplo utilizando técnicas de determinación por titulación de anticuerpos convencionales y protocolos de bioeficacia/biocompatibilidad convencionales. La cantidad y la velocidad de administración variarán en función de factores tales como el peso y la salud del sujeto, la identidad de las bacterias que se están administrando al sujeto, la identidad del polipéptido expresado en las cepas diseñadas por ingeniería para expresar un antígeno seleccionado, el efecto terapéutico deseado, el intervalo de tiempo de bioactividad deseado y el modo de administración de la composición inmunizadora.
En general, la cantidad de una composición inmunizadora administrada a un sujeto es una cantidad suficiente para inducir en el sujeto una respuesta inmunitaria a una cepa de S. Paratyphi A o al antígeno seleccionado expresado por la cepa de S. Paratyphi A (una cantidad inmunológicamente eficaz). La respuesta inmunitaria es preferentemente una respuesta inmunitaria protectora.
En general, la dosis empleada contendrá entre aproximadamente 102 cfu y 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A, con preferencia entre aproximadamente 102 cfu y 107 cfu, o entre aproximadamente 106 cfu y 109 cfu. Las formulaciones para la administración oral comprenden entre aproximadamente 102 cfu y 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A, con preferencia entre aproximadamente 106 cfu y 109 cfu, y la formulación se halla en una cápsula o resuspendida en una solución tampón para proteger las bacterias atenuadas contra el pH ácido del estómago. Las formulaciones para la administración nasal comprenden entre aproximadamente 102 cfu y 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A, con preferencia entre aproximadamente 102 cfu y 107 cfu, y se utilizan para una administración intranasal donde las bacterias se suministran en forma de gotas o aerosol.
Las composiciones inmunizadoras pueden administrarse en una única dosis o en múltiples dosis a lo largo de periodos de tiempo prolongados. En particular, las composiciones inmunizadoras pueden administrarse durante un periodo de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, seis semanas, dos meses, diez semanas, tres meses, cuatro meses, seis meses, un año, o durante periodos prolongados de más de un año.
Las composiciones inmunizadoras pueden suministrarse en una unidad de dosificación para lograr una dosificación uniforme y facilitar la administración. Cada forma de unidad de dosificación contiene una cantidad predeterminada de las cepas de la presente invención calculada para producir una respuesta inmunitaria deseada, junto con un vehículo, excipiente u otro ingrediente farmacéuticamente aceptable.
La presente solicitud describe también un kit no reivindicado, que comprende una o más de las composiciones inmunizadoras de la presente solicitud y opcionalmente medios para administrar las composiciones e instrucciones para ello.
1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Para todas las construcciones plasmídicas se utilizó la cepa de Escherichia coli DH5 alfa. La cepa de S. Typhi viva atenuada CVD 908-htrA contiene mutaciones de deleción en aroC y aroD, que interrumpen la vía de biosíntesis de compuesto aromático, y htrA, que codifica una proteína de respuesta al estrés (véase Infect Immun. 60:2 (1992), pp. 536-541 y J. Biotechnol. 44:1-3 (1996), pp. 193-196). Se adquirió el lote # 11848 de S. Paratyphi A 9150 de American Type Culture Collection (Manassas, VA), que se almacenó como CV 223 y CV 224. En todos los experimentos se utilizó el CV 223.
Se cultivó la E. coli DH5 alfa utilizando medio líquido Luria Bertani (LB) o agar (Difco, Detroit, Mich), complementado con los antibióticos carbenicilina (carb; 50 μg/ml), kanamicina (kan; 50 μg/ml) o cloranfenicol (cml; 25 μg/ml) cuando era necesario. Se cultivaron la CVD 908-htrA y la S. Paratyphi A 9150 y sus derivados con 2x medio de soja (20 g de peptona Hy-soy, 10 g de extracto de levadura Hy-soy, 3 g de NaCl, ± 15 g de agar granulado (Difco) por litro) con guanina (0,001% v/v) y antibióticos añadidos cuando era necesario. Los cultivos líquidos se incubaron a 30ºC o 37ºC, a 250 rpm, durante 16-24 horas, a no ser que se indique otra cosa.
El medio mínimo modificado (MMM) utilizado para el análisis de complementación estaba compuesto de sales M9 (K2HPO4, 7 g/l; KH2PO4, 3 g/l; (NH4)2SO4, 1 g/l (pH 7,5)), 0,5% (p/v) de casaminoácidos (Difco), 0,5% (p/v) de glucosa, 0,01% (p/v) de MgSO4·7H2O, 15 g de agar granulado (Difco) por litro y 1 μg/ml de vitamina B1.
2. Plásmidos y técnicas de genética molecular
Para la construcción de los plásmidos aquí representados se utilizaron técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989). La extracción de plásmidos y la purificación con gel de los fragmentos de ADN se realizaron empleando los kits QIAprep Spin Miniprep y QIAquick Gel Extraction, respectivamente, según las instrucciones del fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA). Se utilizaron los plásmidos pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), pGEM®-T o pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI) como productos intermedios para clonar productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extremo romo generados con VentTM DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA). El plásmido pLowBlu 184 (E.M. Barry, datos no publicados; CVD, University of Maryland, Baltimore) es un plásmido de bajo número de copias que está basado en pACYC184 (ATCC), pero que contiene la secuencia del operón lactosa de pGEM®-5Zf(+) (2767 - 273 pb; Promega, Madison, WI) en lugar del gen de resistencia a la tetraciclina entre AvaI y HindIII. Se utilizó ADN polimerasa Taq-Pro™ (Denville Sci., Metuchen, NJ) para una mutagénesis mediada por lambda Red, y para una PCR de diagnóstico utilizando 5 μl de una única colonia bacteriana diluida en 20 μl de agua estéril. La ADN polimerasa Taq-Pro™ se utilizó también para añadir a la PCR de tratamiento previo fragmentos generados mediante ADN polimerasa VentTM antes de clonar en pGEM®-T o pGEM®-T Easy. Todas las enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs. Se utilizó ADN polimerasa T4
(NEB) para crear fragmentos de ADN de extremo romo. Se realizó una electroporación de cepas en un aparato Gene Pulser (Bio-Rad) ajustado a 2,5 kV, 200 0 y 25 μF. Los marcadores de peso molecular empleados en la electroforesis en gel de ADN son O’GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, ready-to-use (#SM1163, Fermentas, Hanover, MD).
- 3.
- Mutagénesis mediada por Lambda Red
Esta técnica se realizó según describen Datsenko y Wanner (Proc Natl Acad Sci USA, 6 de junio de 2000; 97(12):6640-50), con ciertas modificaciones. Resumiendo, se añadieron 10 colonias de bacterias que llevaban el plásmido auxiliar de Red pKD46 (remitimos al lector a la referencia de Datsenko y Wanner para más información sobre este plásmido) a 20 ml de 2x medio de soja, complementado con carbenicilina y L-arabinosa (0,2%), y se cultivaron a 30ºC, 250 rpm, durante 3 horas (OD 600 nm de ~ 0,6). Se volvieron las bacterias electrocompetentes lavando 3 veces con agua estéril fría y concentrando en un factor de 100. Se sometieron las células competentes a una electroporación con 100 fg - 1 μg de producto de PCR purificado en gel. Después de la electroporación, se repararon las bacterias utilizando 2x medio de soja con o sin guanina. Se incubaron las células en 2x medio de soja a 37ºC, durante 3 horas, antes de cultivarlas en placas de 2x agar de soja con contenido en guanina y cml durante la noche. Se seleccionaron colonias resistentes a los antibióticos y se cribaron mediante PCR en cuanto a alteraciones en las regiones cromosómicas de interés. Las colonias positivas se extendieron de nuevo en líneas sobre 2x medio de soja que contenía cml, pero no contenía carbenicilina, para asegurar la pérdida de pKD46. La retirada del casete de resistencia a cml se realizó según describen Datsenko y Wanner e implicó la utilización de pCP20. Las colonias que presentaban el genotipo deseado se extendieron de nuevo en líneas sobre 2x medio de soja sin antibióticos para asegurar la pérdida del fenotipo de resistencia a los antibióticos. Las seleccionadas para el almacenamiento se cribaron de nuevo mediante PCR antes de congelarlas a -70ºC en 2x medio de soja que contenía glicerol al 20% (v/v).
- 4.
- Aglutinación
Se ensayaron cepas de S. Paratyphi A con sueros comerciales (Difco™ Salmonella O Antiserum Group A, Becton Dickson, Sparks, MD, lote # 4092221). Resumiendo, un pequeño inóculo de bacterias tomado de una placa fresca se emulsionó en 20 μl de PBS en un portaobjetos de cristal. Se añadieron 5 μl de antisueros y se agitó el portaobjetos suavemente hasta observarse aglutinación. Como bacterias de control negativo se utilizó la cepa vacunal de S. flexneri CVD 1208 (J Infect Dis. 15 de noviembre de 2004; 190(10):1745-54) o E. coli DH5 alfa.
- 5.
- Evaluación de virulencia mediante inoculación intraperitoneal de ratones
Se evaluó la virulencia de la Salmonella según se ha descrito previamente en Infect Immun. agosto de 2001; 69(8):4734-41. Resumiendo, a ratones BALB/c hembra (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, Mass.), de 6 a 8 semanas de edad (tres ratones por grupo, tres grupos por cepa vacunal), se les inyectaron vía intraperitoneal (i.p.) diversas diluciones en un factor de 10 de las bacterias (cultivadas en presencia de guanina y antibióticos cuando era necesario, y resuspendidas en solución salina tamponada con fosfato PBS), mezcladas con mucina gástrica de cerdo al 10% (peso/volumen) (Difco, lote #4092018) en un volumen final de 0,5 ml. Los ratones se observaron en cuando a una cercanía extrema a la muerte o la muerte, cada 24 horas durante 72 horas después de la inoculación. La dosis 50% letal (LD50) para cada grupo de ratones se calculó mediante análisis de regresión lineal.
- 6.
- Construcción de una deleción en guaBA.
La secuenciación del genoma de S. Paratyphi A estaba incompleta al comienzo de este proyecto. Por tanto, todos los cebadores de oligonucleótidos y moldes de ADN subsiguientes para la mutagénesis mediada por Lambda Red se construyeron en base a la secuencia genómica de S. Typhi Ty2 anotada (número de registro Genbank NC_004631, versión del 16 de diciembre de 2004). La comparación de las secuencias de las regiones mutadas en
S. Paratyphi A con las de S. Typhi reveló más de un 99% de identidad de la secuencia de ADN.
Los genes que codifican inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa (guaB) y guanosina monofosfato sintetasa (guaA) forman un operón y están situados en los pb 414059 a 417178 en el genoma de S. Typhi Ty2 (SEQ ID nº: 26; véase también la patente US nº 6.190.669 para información detallada con relación a los loci guaBA). Los cebadores CVOL 13 y CVOL 15 (tabla 1) se unen a secuencias fuera de la región designada para la mutación. Se diseñaron los cebadores CVOL 28 y CVOL 32 para la unión a las regiones del plásmido molde de Lambda Red pKD3. El producto de PCR resultante codificaba un cartucho de resistencia a cml flanqueado a cada lado por 100 pb de secuencia homóloga a guaBA en las posiciones 413846 a 413945 (CVOL 28) y 417109 a 417010 (CVOL 32) en el genoma de
S. Typhi Ty2, respectivamente.
Nombre Secuenciaa Diana Regiónb
a. Los cebadores son en la dirección 5’ > 3’ con los sitios de corte de enzima de restricción subrayados. b.
Indica región de homología con genoma de S. Typhi Ty2 (nº reg. genbank NC_004631) o plásmido
pKD3 (nº reg. genbank AY048742).
La cepa S. Paratyphi A 9150 se hizo electrocompetente y se transformó con pKD46, lo que tuvo como resultado la cepa CV 250. Se realizó una mutagénesis por Lambda Red en CV 250 utilizando el producto de PCR generado empleando los cebadores CVOL 28 y CVOL 32 con el molde pKD3 que contenía un marcador de resistencia a cml (véase la referencia de Datsenko y Wanner para más información sobre este plásmido). Los transformantes se cultivaron en placas a 37ºC y los que presentaban resistencia a cml se cribaron mediante PCR utilizando CVOL 13 y CVOL 15. Se descubrió que el guaBA no modificado amplificado de S. Paratyphi A 9150 era - 3,5 kb (Figura 1, línea 1), mientras que se halló un fragmento de ~1,4 kb en dos clones con una región guaBA mutada (Figura 1, líneas 2 y 3). Estos mutantes se denominaron CV 411 y CV 412, respectivamente. Un tratamiento de estos mutantes con pCP20 (véase la referencia de Datsenko y Wanner para más información sobre este plásmido) liberó el cartucho de resistencia a cml. Se analizaron cuatro elementos de deleción mediante PCR con los cebadores CVOL 13 y CVOL 15 y se descubrió que tenían una banda de ~ 0,5 kb (Figura 2, líneas 2 - 4) en comparación con un progenitor de guaBA::cml (Figura 2, línea 1). Los elementos de deleción de guaBA de S. Paratyphi A 9150 resultantes se denominaron CV 415 - CV 418. La región guaBA mutada en CV 415 se amplificó por PCR con CVOL 15 y CVOL 13 y el producto secuenciado (secuencia de polinucleótidos SEQ ID nº: 1); las regiones 5' y 3' de SEQ ID nº: 1 son homólogas a guaBA, mientras que la región central es homóloga a pKD3. Se eligió la cepa CV 415 para todos los estudios subsiguientes.
7. Complementación in vitro de la deleción en guaBA
S. Paratyphi A 9150 contiene una auxotrofía indefinida, lo que la hace incapaz de crecer en un medio mínimo sin la adición de casaminoácidos. La cepa 11511 de ATCC y una CVD S. Paratyphi A aislado 516 también son incapaces de crecer en un medio mínimo, lo que sugiere que contienen la misma auxotrofía encontrada en S. Paratyphi A 9150.
Para demostrar que la mutagénesis mediada por Lambda Red tenía como diana sólo guaBA en CV 415, se diseñó un plásmido basado en pLowBlu 184 (bajo número de copias) que contenía un fragmento mínimo que codificaba guaBA bajo el control del promotor lactosa (PlacZ). Se utilizaron los cebadores CVOL 13 y CVOL 14 para amplificar un fragmento de - 3,1 kb que codificaba guaBA con un sitio de unión ribosómica optimizado (GAAGGAG) 8 pb corriente arriba del codón de inicio, utilizando el cromosoma de CVD 908-htrA como molde. Este fragmento se subclonó en pGEM®-T Easy y se escindió con EcoRI, se enromó con ADN polimerasa T4 y se clonó en el sitio Notl de pLowBlu 184, creando pATGguaBA (almacenado en CV 295).
Se sometió CV 415 a electroporación bien con pATGguaBA o bien con pLowBlu 184 (control) y se cultivó en placas sobre 2x medio de soja que contenía guanina y cml, creando las cepas CV 486 y CV 487, respectivamente. El 2x medio de soja sin guanina es capaz de soportar el crecimiento de S. Paratyphi A con deleción de guaBA. Unas colonias individuales de cada una se extendieron de nuevo en líneas sobre MMM que contenía cml y se incubaron a 37ºC durante la noche. Como se muestra en la Figura 3, CV 486 era capaz de crecer en MMM (placa 2), a diferencia del control (CV 487; placa 1), lo que indica que el fragmento mínimo clonado en pATGguaBA era capaz de complementar la deleción de guaBA del cromosoma de CV 415.
8. Construcción de deleciones secundarias en CV 415
Con el fin de minimizar la reversión de S. Paratyphi A 9150 con deleción de guaBA a un genotipo de tipo salvaje (wt), se fijaron como diana genes adicionales como marcadores de atenuación secundarios. Estos genes eran clpP y clpX, que codifican una serina proteasa y una chaperona ATPasa, respectivamente (analizados en Structure (Camb). febrero de 2004; 12(2):175-83). Se ha comprobado que la interrupción de clpP y/o clpX reduce considerablemente el potencial de colonización de Salmonella Typhimurium en ratones (Infect Immun. mayo de 2001; 69(5):3164-74). En S. Typhi Ty2, clpX (SEQ ID nº: 39) y clpP (SEQ ID nº: 40) están ambos situados entre 2483597 y 2485743 (SEQ ID nº: 27) en la cadena complementaria del cromosoma, respectivamente, y son expresados por promotores individuales. Se sometió S. Paratyphi A 9150 wt también a una mutagénesis, de manera
que pudiera evaluarse en ratones la virulencia de mutantes que contenían deleciones individuales bien en clpX o bien en clpP.
Para delecionar clpX, se diseñaron los cebadores CVOL 85 y 86 con el fin de amplificar un fragmento de ~ 1,3 kb que codifica clpX sin un codón de inicio de CVD 908-htrA. Este fragmento se purificó en una columna, se trató con ADN polimerasa Taq-Pro™ y se clonó en pGEM®-T (almacenado en CV 472). El vector resultante, pGEM®-T::clpX, se digirió con NruI y EcoRI para eliminar un fragmento de - 0,9 kb y se trató con ADN polimerasa T4 para crear extremos romos. Un cartucho de cml aislado de pCR-Blunt II-TOPO como un fragmento de EcoRI se enromó y se insertó en pGEM®-T::clpX. Este cartucho de cml se había creado previamente mediante PCR utilizando CVOL 25 y CVOL 26 con pKD3 como molde (almacenado en CV 134). Después de una ligación y una transformación, se empleó una PCR con los cebadores CVOL 26 y CVOL 85 para confirmar la inserción del cartucho de cml en la orientación correcta para la mutagénesis por Lambda Red. Se identificó un clon positivo, denominado pGEM®T::(clpX::cml) y almacenado como CV 481.
Se transformó S. Paratyphi A con deleción de guaBA (CV 415) con pKD46 y se almacenó como CV 421. Se sometieron CV 421 y CV 250 (S. Paratyphi A 9150 wt transformada con pKD46) a una mutagénesis por Lambda Red con un producto de PCR de ~ 1,4 kb amplificado a partir de pGEM®-T::(clpX:cml) utilizando CVOL 85 y CVOL 86. Se aislaron mutantes resistentes a cml y se cribaron por PCR con CVOL 87 y CVOL 88, que se unen a regiones fuera de las homólogas a CVOL 85 y CVOL 86. Los mutantes que presentaban un perfil PCR correcto se seleccionaron para un tratamiento con pCP20 con el fin de eliminar el cartucho de cml. La Figura 4 muestra que los mutantes que contenían un gen clpX alterado presentaban una banda más pequeña de ~ 0,6 kb por PCR (panel A, líneas 1 - 6), comparada con la hallada en S. Paratyphi A 9150 inalterada (panel A, línea 7). Un análisis por PCR de las mismas cepas con CVOL 13 y 15 confirmó que guaBA se había delecionado sólo de las cepas derivadas de CV 415 y no de CV 250 (panel B, líneas 4 - 6, comparadas con las líneas 1 - 3 y 7). Los mutantes que carecían de clpX, y tanto clpX como guaBA, se almacenaron como CV 532 y CV 534, respectivamente. La región clpX mutada en CV 532 y CV 534 se amplificó por PCR con los cebadores CVOL 87 y CVOL 88 y el producto se secuenció (SEQ ID nº: 2); las regiones 5' y 3' de SEQ ID nº: 2 son homólogas a clpX, mientras que la región central es homóloga a pKD3.
Para delecionar clpP, se diseñaron CVOL 89 y 90 con el fin de amplificar un fragmento de ~ 0,7 kb que codifica clpP sin un codón de inicio de CVD 908-htrA. Este fragmento se purificó en una columna y se clonó en pGEM®-T, creando pGEM®-T::clpP (almacenado como CV 470). Se digirió pGEM®-T::clpP con PstI y NsiI, se trató con ADN polimerasa T4 y se ligó de nuevo (creando pGEM®-T::clpPm, almacenado como CV 484) con el fin de eliminar los sitios NdeI y HincII de la estructura principal del vector. A continuación se digirió pGEM®-T::clpPm con NdeI y HincII para eliminar fragmentos de ADN con un tamaño total de ~ 0,5 kb, y se trató con ADN polimerasa T4. De manera similar a lo arriba mencionado, un cartucho de cml aislado de pCR-Blunt II-TOPO como un fragmento de EcoRI se trató con ADN polimerasa T4 y se utilizó para sustituir los fragmentos eliminados de pGEM®-T::clpPm. Después de una ligación y una transformación, se empleó una PCR con los cebadores CVOL 26 y CVOL 85 para confirmar la inserción del cartucho de cml en la orientación correcta para la mutagénesis por Lambda Red. Se identificó un clon positivo, denominado pGEM®-T::(clpPm::cml) y almacenado como CV 501.
Se sometieron S. Paratyphi A 9150 wt y con deleción de guaBA que contenían pKD46 (CV 250 y CV 421, respectivamente) a una mutagénesis por Lambda Red con un producto de PCR de ~ 1,4 kb amplificado de pGEM®T::(clpPm::cml) utilizando CVOL 89 y CVOL 90. Se aislaron mutantes resistentes a cml y se cribaron por PCR con CVOL 91 y CVOL 92, que se unen a regiones fuera de las homólogas a CVOL 89 y CVOL 90. Los mutantes que presentaban un perfil PCR correcto se seleccionaron para un tratamiento con pCP20 con el fin de eliminar el cartucho de cml.
La Figura 5 muestra que los mutantes que contenían un gen clpP alterado presentaban una banda más pequeña de ~ 0,4 kb por PCR (panel A, líneas 1 - 6), comparada con la hallada en S. Paratyphi A 9150 inalterada (panel A, línea 7). Un análisis por PCR de las mismas cepas utilizando los cebadores CVOL 13 y 15 confirmó que guaBA se había delecionado sólo de las cepas derivadas de CV 415 y no de las basadas en CV 250 (panel B, líneas 4 - 6, comparadas con las líneas 1 - 3 y 7). Los mutantes que carecían de clpP, y tanto clpP como guaBA, se almacenaron como CV 528 y CV 530, respectivamente. La región clpP mutada en CV 528 y CV 530 se amplificó por PCR con los cebadores CVOL 87 y CVOL 88 y el producto se secuenció (secuencia de polinucleótidos SEQ ID nº: 3); las regiones 5' y 3' de SEQ ID nº: 3 son homólogas a clpP, mientras que la región central es homóloga a pKD3.
9. Construcción de plásmidos de bajo número de copias para análisis de complementación
Como se ha hecho más arriba, para confirmar que la mutagénesis mediada por Lambda Red tenía como diana sólo loci específicos, se diseñaron plásmidos monocistrónicos o bicistrónicos basados en pLowBlu 184 (bajo número de copias) que contenían fragmentos mínimos que codificaban clpX o clpP, o guaBA inmediatamente corriente abajo de clpX o clpP. La expresión constitutiva de los genes en estos plásmidos se dirigió mediante PlacZ.
Se utilizaron los cebadores CVOL 64 y CVOL 65 para amplificar por PCR guaBA de CVD 908-htrA que contenía un sitio de unión ribosómica mejorado, con los sitios de restricción NdeI y NsiI en los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto se purificó en una columna y se ligó en pCR-Blunt II-TOPO (almacenado como CV 394), se extrajo como un fragmento de ~ 3,5 kb NdeI -NsiI y se clonó en los sitios NdeI -NsiI en pLowBlu 184, creando pguaBAV.2 (almacenado como CV 482).
Con el fin de crear un plásmido de bajo número de copias que codificara clpP, se utilizaron los cebadores CVOL 122 y CVOL 123 para amplificar clpP con un sitio de unión ribosómica mejorado de CVD 908-htrA, con sitios NotI y NruI en los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto de ~ 0,7 kb se purificó en una columna y se ligó en pCR-Blunt II-TOPO (almacenado como CV 567), se extrajo como un fragmento NotI -NruI y se ligó en pLowBlu 184, previamente cortado con NotI y NdeI, creando pATGclpP (almacenado como CV 584). Con el fin de construir un plásmido bicistrónico que contuviera clpP y guaBA, se diseñaron los cebadores CVOL 122 y CVOL 128 para amplificar clpP con un sitio de unión ribosómica mejorado de CVD 908-htrA, con sitios NotI tanto en el extremo 5' como en el extremo 3'. El producto de 0,7 kb se purificó en una columna y se ligó en pCR-Blunt II-TOPO (almacenado como CV 600), se extrajo como un fragmento NotI y se ligó en pguaBAV.2, previamente cortado con NotI, creando pATGclpPATGguaBA (almacenado como CV 603).
Con el fin de crear un plásmido de bajo número de copias que codificara clpX, se utilizaron los cebadores CVOL 124 y CVOL 125 para amplificar clpX con un sitio de unión ribosómica mejorado de CVD 908-htrA, con sitios NotI y NdeI en los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto de ~ 1,3 kb se purificó en columna y se ligó en pCR-Blunt II-TOPO (almacenado como CV 569), se extrajo como un fragmento NotI -NdeI y se ligó bien en pLowBlu 184 o bien en pguaBAV.2, ambos previamente cortados con NotI y NdeI, creando pATGclpX (almacenado como CV 582) y pATGclpXATGguaBA (almacenado como CV 573).
10. Evaluación de la virulencia de S. Paratyphi A y mutantes en ratones
Se realizaron estudios LD50 para comparar la virulencia de S. Paratyphi A 9150 wt con la de cada mutante en ratones inyectados por vía intraperitoneal.
La Figura 6 muestra los datos LD50 obtenidos al inyectar a ratones S. Paratyphi A wt y con deleción de guaBA. S. Paratyphi A wt tiene un valor LD50 < 10 bacterias por ratón. En cambio, S. Paratyphi A con deleción de guaBA tenía un valor LD50 - 4,5 log. mayor. La complementación del mutante guaBA con pLowBlu 184 no alteró el valor LD50, mientras que la transformación con pATGguaBA restauró la virulencia similar a la del tipo salvaje.
La Figura 7 muestra los datos LD50 obtenidos al inyectar a ratones S. Paratyphi A wt, S. Paratyphi A con deleción de clpx o S. Paratyphi A con deleción de clpX-guaBA. Los valores LD50 de S. Paratyphi A wt y con deleción de guaBA concordaban con los obtenidos anteriormente. S. Paratyphi A con deleción de clpX mostró un valor LD50 ~ 1 log mayor que los mutantes guaBA, lo que indicaba que una deleción en clpX no era tan atenuante como la efectuada en guaBA. La complementación de las cepas con deleción de clpX o las cepas con deleción de clpX-guaBA con pLowBlu 184 no tuvo efecto alguno, mientras que la transformación con pATGclpX y pATGclpXATGguaBA, respectivamente, restauró la virulencia similar a la del tipo salvaje.
La Figura 8 muestra los datos LD50 obtenidos de ratones a los que se les había inyectado S. Paratyphi A wt, S. Paratyphi A con deleción de clpP o S. Paratyphi A con deleción de clpP-guaBA. Los valores LD50 de S. Paratyphi A wt y con deleción de guaBA concordaban con los obtenidos anteriormente. Al igual que la cepa con deleción de clpX, S. Paratyphi A con deleción de clpP mostró una virulencia aumentada en relación con el mutante guaBA. Esto indicaba que una deleción en clpP no era tan atenuante como la efectuada en guaBA. La complementación de las cepas con deleción de clpX o las cepas con deleción de clpX-guaBA con pLowBlu 184 no tuvo efecto alguno en la virulencia. La transformación de estas cepas con pATGclpP y pATGclpPATGguaBA, respectivamente, no restauró por completo la virulencia del tipo salvaje. Sin ceñirse a ninguna teoría, la expresión regulada de clpP, a diferencia de la expresión no regulada como la codificada por pATGclpP y pATGclpPATGguaBA, se requiere para complementar totalmente la mutación clpP.
Las descripciones de las siguientes referencias son todas las publicaciones, patentes, libros, artículos y otros documentos mencionados y expuestos a lo largo de toda esta solicitud.
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<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
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<213> Salmonella Typhi Ty2
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<213> Salmonella typhimurium
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- <211>
- 1955 10 <212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<212> ADN
<213> Escherichia coli
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- <211>
- 459 10 <212> ADN
<213> Escherichia coli
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<211> 734
<212> ADN
<213> Shigella flexneri 2a cepa CVD 1208s
<400> 34
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- <211>
- 1467 10 <212> ADN
<213> Salmonella Paratyphi A 9150
<220>
<221> misc_feature 15 <223> guaB
<400> 35 <210> 36
<211> 1578
5 <212> ADN
<213> Salmonella Paratyphi A 9150
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<221> misc_feature
<223> guaA 10 <400> 36
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<211> 624
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<213> Salmonella Paratyphi A 9150
<220>
<221> misc_feature
<223> clpP
<400> 37
5 <210> 38
<211> 1272
<212> ADN
<213> Salmonella Paratyphi A 9150
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<223> clpX
<400> 38
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<213> Salmonella Typhi Ty2
<220>
<221> misc_feature
<223> gen clpX
<400> 39
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<212> ADN
<213> Salmonella Typhi Ty2
<220>
<221> misc_feature
<223> gen clpP
<400> 40
Claims (32)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada, teniendo dicha cepa una mutación atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX.
-
- 2.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación atenuante en los loci guaBA es una mutación atenuante en el gen guaB o una mutación atenuante en el gen guaA o una mutación atenuante en ambos genes.
-
- 3.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación atenuante en los loci guaBA es una mutación atenuante en el gen guaB o una mutación atenuante en el gen guaA o una mutación atenuante en ambos genes y porque la cepa tiene una mutación atenuante adicional en el gen clpP.
-
- 4.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce el nivel de expresión de dichos loci o dichos genes o bloquea la expresión de dichos loci o dichos genes.
-
- 5.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce la actividad de un polipéptido codificado por dichos loci o dichos genes o inactiva un polipéptido codificado por dichos loci o dichos genes.
-
- 6.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cepa es la cepa S. Paratyphi A 9150.
-
- 7.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cepa comprende además un sistema de expresión plasmídico estabilizado.
-
- 8.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho sistema de expresión plasmídico estabilizado comprende un vector de expresión que comprende:
- (a)
- un casete de origen de replicación de número de copias restringido que incluye
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación que limita el vector de expresión a un número medio de copias plasmídicas de aproximadamente 2 a 75 copias por célula,
- (ii)
- un primer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación y
(iii) un segundo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación;- (b)
- como mínimo un casete de destrucción postsegregacional que incluye
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional,
- (ii)
- un tercer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus o los loci de destrucción postsegregacional y
(iii) un cuarto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus o los loci de destrucción postsegregacional;- (c)
- como mínimo un casete de partición que comprende
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición,
- (ii)
- un quinto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la o las funciones de partición y
(iii) un sexto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la o las funciones de partición; y- (d)
- un casete de expresión que comprende
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor,
- (ii)
- un séptimo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor y
(iii) un octavo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor. -
- 9.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia oriE1 mostrada en SEQ ID nº: 28, la secuencia ori101 mostrada en SEQ ID nº: 30 y la secuencia ori15A mostrada en SEQ ID nº: 29.
-
- 10.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado asd, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema proteico phd-doc y una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema antisentido hok-sok.
-
- 11.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 10, caracterizada porque el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb seleccionado del grupo consistente en el locus ssb de Shigella flexneri, el locus ssb de Salmonella typhi y el locus ssb de E. coli.
-
- 12.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 10, caracterizada porque el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb que comprende un promotor inducible de ssb, un promotor constitutivo de ssb y una región codificadora de ssb de la cepa de S. flexneri 2a CVD 1208s mostrada en SEQ ID nº: 34.
-
- 13.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en el locus parA de E. coli mostrado en SEQ ID nº: 31 y el locus pSC101 par de E. coli mostrado en SEQ ID nº: 32.
-
- 14.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque el promotor (d)(i) es un promotor inducible.
-
- 15.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor (d)(i) es el promotor de ompC mostrado en SEQ ID nº: 33.
-
- 16.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d)(i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno homólogo.
-
- 17.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d)(i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo.
-
- 18.
- Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d)(i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado del grupo consistente en un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno de cáncer y un antígeno autoinmune.
-
- 19.
- Formulación farmacéutica que comprende la cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 20.
- Formulación farmacéutica que comprende la cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 21.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha formulación farmacéutica es una formulación farmacéutica oral.
-
- 22.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 20, caracterizada porque dicha formulación farmacéutica es una formulación farmacéutica oral.
-
- 23.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 19 para su uso en un método para inducir en un sujeto una respuesta inmunitaria a una cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada.
-
- 24.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 20 para su uso en un método para inducir en un sujeto una respuesta inmunitaria a un antígeno seleccionado.
-
- 25.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.
-
- 26.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.
-
- 27.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria al antígeno seleccionado.
-
- 28.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria al antígeno seleccionado y una respuesta inmunitaria a la cepa de Salmonella Paratyphi A.
-
- 29.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.
-
- 30.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.
-
- 31.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.
-
- 32.
- Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.
Figura 3Figura 4Figura 5Figura 6LD50 (log10 cfu por ratón)Figura 7LD50 (log10 cfu por ratón)Figura 8LD50 (log10 cfu por ratón)
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