ES2256515T5

ES2256515T5 - Bacterias atenuadas útiles en vacunas.

Info

Publication number: ES2256515T5
Application number: ES02755363T
Authority: ES
Inventors: Judith Acambis Research Limited Greenwood; Jonathan C. Acambis Research Limited Stephens; Michael J. Acambis Research Limited Darsley; Arthur K. Acambis Research Limited Turner; Juliet C. Acambis Research Limited Beavis
Original assignee: Acambis Research Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Holding Ltd
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2011-02-25
Anticipated expiration: 2022-09-11
Also published as: ATE308992T1; EP1425037B1; EP1425038B1; US8318148B2; DE60207277D1; ATE308991T1; EP1425037A2; WO2003022307A1; AU2002321644B2; CA2459586A1; DK1425038T3; DK1425038T4; DK1425037T3; US20040253710A1; DE60207278D1; ES2256515T3; US7943122B2; DE60207278T2; CA2460025A1; US20050054075A1

Abstract

Una célula bacteriana que expresa antígeno de factor de colonización CFA/I de un plásmido nativo, pero no expresa toxina estable al calor (ST) ni tampoco expresa toxina labil al calor (LT).

Description

Bacterias atenuadas útiles en vacunas.

La invención está relacionada con bacterias atenuadas útiles en las vacunas.

Antecedentes de la invención

El principio que hay detrás de la vacunación consiste en inducir una respuesta inmune en el receptor, proporcionando de este modo protección contra el desafío posterior con un patógeno. Esto puede conseguirse mediante inoculación con una cepa atenuada viva del patógeno, es decir, una cepa que tiene una virulencia reducida, de tal manera que no causa la enfermedad producida por el patógeno virulento mientras que sigue estimulando una amplia respuesta inmune.

Usando técnicas genéticas modernas, actualmente es posible construir cepas bacterianas atenuadas dirigidas al sitio en las que se han creado deleciones de atenuación estables. Se han creado diversos mutantes dirigidos al sitio de Salmonella usando este tipo de tecnología (2, 7, 9, 14, 19, 35, 36, 37). Las mutaciones en un gran número de genes han sido informadas como atenuantes, incluyendo los genes aro (p. ej. aroA, aroC, aroD y aroE (15, 18)), pur, htrA (4), ompR, ompF, ompC (2), galE (14), cya, crp (7), phoP (13, 19), rfaY (48), dksA (48), hupA (48), sipC (48) y clpB 48).

Una clase de bacteria que ha sido atenuada mediante estas técnicas genéticas modernas es Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), que causa diarrea. La virulencia de las cepas de (ETEC) depende de su expresión de antígenos de factor de colonización (CFAs) fimbrial, que les permite adherirse y colonizar la superficie mucosa del intestino delgado de su especie anfitriona. Las cepas de ETEC adaptadas a los seres humanos expresan diferentes CFAs, siendo las más frecuentes CFA/I, CFA/II (comprendiendo CS3 expresado con CS1 o CS2) y CFA/IV (que comprende CS6 expresado sólo o con CS4 o CS5). Dependiendo de la ubicación geográfica, CFA/I, CFA/II y CFA/IV ascienden a entre el 50% y el 80% de las cepas ETEC. Se han descrito muchas otras CFAs, pero cada una de ellas se encuentra en sólo una pequeña proporción de cepas ETEC (33). La evidencia indica que las respuestas inmunes a anti-CFA son importantes para la protección contra la enfermedad ETEC (6, 24, 28, 29, 30).

La colonización del intestino delgado va acompañada por la secreción de enterotoxinas. Se han identificado dos tipos de enterotoxinas en las cepas ETEC, la toxina lábil al calor (LT) y la toxina estable al calor (ST). La LT tiene una estructura muy homóloga a la toxina del cólera, una proteína multi-subunidad de la forma AB_{5}. La subunidad A es el componente activo de la toxina, que funciona para aumentar la actividad de la adenilato ciclasa. Ésta se suministra dentro de células anfitrionas por las subunidades B, que enlazan los gangliósidos en la superficie de la célula. ST es un pequeño polipéptido no inmunogénico (19 aminoácido) que tiene actividad de estimulación de guanilato ciclasa. Además, se ha demostrado recientemente que una gran proporción de cepas ETEC producen también EAST1, una toxina estable al calor similar en tamaño y modo de funcionamiento a ST pero de secuencia diferente, que se identificó originalmente en cepas E. coli enteroagregativas (34).

Se ha propuesto que los derivados de las cepas ETEC, que han perdido la capacidad de producir toxinas, pueden ser vacunas vivas efectivas contra los aislados virulentos. Un derivado de una cepa ETEC de tipo salvaje, E1392/75, que ha perdido espontáneamente las actividades ST y LT pero que sigue expresando CFA/II se identificó y designó E1392/75-2A (5). En los estudios con voluntarios humanos, la vacunación oral con 2x10^{10} cfu E1392/75-2A proporcionó un 75% de protección contra el desafío con una ETEC que expresa toxinas de un serotipo diferente pero que expresó las mismas CFAs (revisado por (30)). Sin embargo, aproximadamente el 15% de las vacunas experimentaron diarrea suave como efecto secundario de la vacuna. Se concluyó que la atenuación posterior de esta cepa era necesaria antes de que pudiese ser considerada para su uso como vacuna viva contra las infecciones ETEC.

Se generaron dos derivados de E1392/75-2A mediante deleción dirigida de los genes atenuadores potenciales y se evaluó en pruebas clínicas (32, 38). Se demostró que los dos derivados (PTL002, \DeltaaroC/\DeltaompR, y PTL003, \DeltaaroC/\DeltaompC/\DeltaompF) estaban atenuados cuando se compararon con la cepa padre y no causaron síntomas clínicos en voluntarios que ingirieron hasta 5x10^{9} cfu de organismos vivos recién cosechados. Todos los voluntarios que recibieron la dosis máxima de estas vacunas candidatas generaron respuestas inmunes específicas contra el antígeno CFA/II expresado por las cepas.

Resumen de la invención

Una vacuna efectiva contra ETEC debe inmunizar contra CFA/I, CFA/II y CFA/IV como mínimo y por lo tanto, son necesarias cepas atenuadas expresando todos estos antígenos. De este modo, es necesario que los genes que expresan las toxinas LT, ST y EAST1 se inactiven o borren de las cepas que expresan todas estas CFAs. Las cepas toxina negativa se han sugerido previamente como punto de partida para desarrollar una vacuna multicepa atenuada viva contra ETEC (Chatfield, 38). Sin embargo, no hubo explicación en Chatfield sobre cómo pueden generarse dichas cepas.

Ahora hemos encontrado que hay dificultades particulares asociadas con la generación de una cepa que expresa CFA/I o una cepa que expresa CS5 y CS6 de las que se han delecionado los genes de toxinas, especialmente el gen ST. Hemos diseñado una nueva estrategia y vector suicida para superar estas dificultades y producir formas toxina negativa de estas cepas.

Sin querer estar atados por esta teoría, creemos que el motivo de que resultara difícil generar formas ST negativa de cepas expresando CFA/I o CS5 y CS6 fue que los genes CFA/CS están estrechamente vinculados al gen ST y están en el mismo plásmido. En una revisión global de estudios epidemiológicos en los que se han recopilado datos suficientes (33) se informa que de las 204 cepas que expresan CFA/I, todas las 204 expresaron ST, bien solas (149/204) o en combinación con LT (55/204). Además, los estudios más recientes han confirmado este hallazgo, p. ej. Qadri et al (22), donde las 87 cepas que expresan CFA/I aisladas durante un periodo de dos años en Bangladesh expresaron ST, bien sola o en combinación con LT. No se identificaron cepas que expresaran CFA/I y LT solas, sugiriendo un enlace genético extremadamente estrecho entre los locus ST y CFA/I. Numerosos artículos científicos documentan el estrecho enlace entre los genes CFA/I y ST en cepas ETEC en la medida en que siempre que se ha realizado un esfuerzo para derivar una cepa que ha perdido uno de estos locus, el otro se ha perdido siempre concurrentemente. En ningún caso tenemos conocimiento que haya sido posible separar los dos locus mediante deleción o inactivación del gen ST y producir una cepa que exprese todavía CFA/I (42-46).

La invención proporciona una célula bacteriana que exprese el antígeno de factor de colonización CFA/I de un plásmido nativo pero no expresa toxina estable al calor (ST) como se ha expuesto en la reivindicación 1. La invención proporciona también una célula bacteriana que expresa antígeno de factor de colonización CS5 de un plásmido nativo pero no expresa toxina estable al calor (ST) como se ha expuesto en la reivindicación 2. El gen EAST1 puede eliminarse o inactivarse también en las células de la invención. Las células contienen generalmente otras mutaciones de atenuación, como mutaciones en cada uno de los genes aroC, ompF y ompC para hacerlos aceptables para su uso en vacunas.

Las células de la invención pueden diseñarse genéticamente para expresar un antígeno heterólogo, como un componente no tóxico o forma de LT o un antígeno de factor de colonización (CFA). Estas células inducen una respuesta inmune contra el antígeno heterólogo, así como los antígenos nativos y, por lo tanto, mejoran la protección proporcionada por una vacuna.

La invención incluye una vacuna contra la diarrea que contiene las células de la invención. Preferiblemente, la vacuna incluye una mezcla de diferentes células que transportan entre ellas todas las CFAs más comunes, en concreto CFA/I, CFA/II y CFA/IV.

Además, la invención proporciona un vector suicida y un método que permite el aislamiento fiable y rápido de las células de la invención y otras células bacterianas que contienen genes delecionados, inactivados o sustituidos. El vector representa una mejora sobre los vectores suicida conocidos y que permite una dirección más específica y más fiable que los vectores conocidos. El vector tiene un tamaño inferior a 5 kb (p. ej. de 2,5 a 5 kb o de 2,5 a 4 kb) y comprende la región sacB que codifica un producto que es tóxico para las bacterias cuando se cultivan en sacarosa, en cuya región se deleciona o inactiva la secuencia de inserción IS1. El tamaño pequeño del vector y la ausencia de la secuencia de inserción IS1 ayuda a evitar que el vector se dirija al lugar incorrecto en el ADN
celular.

Descripción detallada de la invención Bacterias útiles en la invención

Las células bacterianas de la invención se derivan generalmente de las células E. coli enterotoxicogénicas (ETEC) mediante deleción o inactivación del gen ST, el gen LT y opcionalmente otros genes de toxinas. Como se ha mencionado anteriormente, ETEC es una clase de E. coli que causa diarrea. Colonizan el intestino delgado. Pueden aislarse de las muestras clínicas humanas, normalmente deposiciones producidas mientras se sufre de diarrea. Una cepa ETEC estándar es H 10407, depositada en el ATCC con el nº de catálogo 35401.

Las infecciones de ETEC son la causa única más frecuente de diarrea del viajero, causando 3-9 millones de casos anuales entre los visitantes a países en vías de desarrollo. En las zonas endémicas, las infecciones ETEC son una causa importante de diarrea deshidratante en bebés y niños pequeños, causando hasta 400.000 muertes al año, predominantemente en este grupo de edad. En los países en vías de desarrollo, la incidencia de las infecciones de ETEC que causan una enfermedad clínica se reduce con la edad, indicando que puede adquirirse la inmunidad a la infección de ETEC. En contraste, los adultos naive de países industrializados que visitan zonas endémicas son altamente susceptibles a las infecciones de ETEC. Sin embargo, con las visitas prolongadas o repetidas a las zonas endémicas se reduce la susceptibilidad a las infecciones de ETEC, sugiriendo que había demostrado tener éxito un enfoque atenuado vivo de la vacunación de ETEC.

Una vacuna para proteger contra la diarrea ETEC en los seres humanos debe proporcionar protección contra los siete factores de colonización principales y, como mínimo, la toxina lábil al calor (LT) para asegurar que se obtiene protección contra diferentes cepas. Para lograrlo, pueden realizarse las mismas atenuaciones en una gama de diferentes cepas ETEC, cada una con un factor de colonización diferente. Esto implicaría delecionar las toxinas de todas estas cepas. La presente invención proporciona una serie de cepas adecuadas de las que se han delecionado completamente todos los genes de toxinas, que pueden proporcionar el punto de partida para la generación de una vacuna multicepa. Alternativamente, puede ser posible expresar múltiples factores de colonización en un número menor de cepas de las que se han delecionado de modo similar las toxinas.

Las cepas con las toxinas delecionadas de la presente invención se derivaron de los aislados clínicos de tipo salvaje obtenidos de un estudio epidemiológico a largo plazo llevado a cabo en Egipto por científicos en las instalaciones de la US Navy NAMRU3 en El Cairo. En la tabla siguiente se proporciona una lista de las cepas.

1

Quedará claro para las personas con experiencia en la técnica que las otras cepas pueden ser igualmente indicadas como punto de partida para la generación de una vacuna multicepa atenuada con las toxinas delecionadas.

Las cepas con los códigos A, B, E, H y J se atenuaron mediante la eliminación específica de todos los genes de toxinas conocidos y después se manipularon como se describe en los ejemplos adjuntos. Las cepas de toxina negativa resultantes y cepa PTL003 descritas anteriormente fueron depositadas por Acambis Research Limited of Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT, Reino Unido en European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido el 3 de septiembre de 2001 (números de referencia 010903**) o 29 de agosto de 2002 (números de referencia 020829**) de acuerdo con el Tratado de Budapest. Las características de las cepas y los números de referencia de las que se depositaron son las siguientes:

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

Además de las cepas en la tabla anterior, se depositó un derivado toxina negativa de la cepa B descrita en el Ejemplo 2 siguiente, con el número de referencia 01090303.

La invención incluye "descendientes" de estas células depositadas. Un "descendiente" es cualquier célula derivada de una célula depositada. Los descendientes de una célula depositada incluyen células con una o más mutaciones de atenuación posteriores, como las mutaciones descritas a continuación. También son descendientes las células que han sido diseñadas para los antígenos heterólogos expresos, como los antígenos heterólogos descritos a continuación.

Aunque las bacterias de la invención son generalmente bacterias E. coli, pueden usarse otros tipos de bacterias. Un plásmido de acuerdo con la invención puede construirse suprimiendo o inactivando el gen ST en un plásmido nativo para E. coli enterotoxigénica y después se transfiere el plásmido resultante a otra bacteria. De este modo, puede hacerse que la otra bacteria transporte el antígeno CFA/I o los antígenos CS5 y CS6.

Las bacterias que se utilizan para fabricar las vacunas de la invención son generalmente las que infectan por vía oral. Las bacterias pueden ser las que invaden y crecen dentro de las células eucarióticas y/o colonizan las superficies mucosas. Las bacterias son generalmente gram negativas pero en algunas materializaciones pueden usarse bacterias gram positivas. Las bacterias son generalmente patógenas.

Las bacterias usadas pueden ser del género Escherichia, Salmonella, Shigella o Vibrio.

Aparte de E. coli, ejemplos de las especies de bacterias que pueden usarse en la invención son Salmonella typhimurium - la causa de la salmonelosis en varias especies animales; Salmonella typhi - la causa de la fiebre tifoidea humana; Salmonella enteritidis - una causa de intoxicación por alimentos en los humanos; Salmonella choleraesuis - una causa de salmonelosis en los cerdos; y Salmonella dublin - una causa de enfermedad sistémica y diarreica en ganado, especialmente de terneros recién nacidos.

En la invención son particularmente útiles cepas de E. coli y Salmonella. Las Salmonellas son inmunógenos potentes y pueden estimular respuestas celulares y de anticuerpos sistémicas y locales. En particular, para usar en la invención se prefiere una cepa atenuada de Salmonella typhi. Las cepas de Salmonella typhi preferidas para usar en la presente invención incluyen CVD908-htrA (\DeltaaroC \DeltaaroD \DeltahtrA) y CVD908 (\DeltaaroC \DeltaaroD) (49). Las cepas de E. coli diferentes de ETEC que pueden usarse incluyen E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli enterohemorrágicas (EHEC).

Tal como se utiliza aquí, las referencias a un plásmido "nativo", que expresa CFA/I o CS5/6 significan un plásmido que existe en células de tipo salvaje, por ejemplo, células ETEC aisladas de una persona con diarrea. Éstas excluyen un plásmido construido en el laboratorio para expresión de CFA/I o CS5/6. En unas células de la invención, el gen ST en el plásmido nativo se elimina. Sin embargo, el gen CFA/I o CSS/6 en el plásmido es funcional, es decir, expresa CFA/I o CS5/6.

Mutación posterior de las bacterias

Para que las bacterias se utilicen en una vacuna, deben atenuarse posteriormente. La atenuación puede llevarse a cabo eliminando o inactivando uno o más de los genes siguientes: aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, surA, rfaY, dksA, hupA, sipC y cipB. Las combinaciones preferidas de genes incluyen:

\bullet: por lo menos un gen aro (p. ej. aroA, aroC, aroD o aroE) y por lo menos un gen omp (p. ej. ompC, ompF u ompR);

\bullet: por lo menos un gen aro (p. ej. aroA, aroC, aroD o aroE) y el gen htrA;

\bullet: aroC, ompF y ompC.

Las mutaciones de atenuación posteriores pueden introducirse usando el vector suicida y métodos de la invención o métodos conocidos para las personas con experiencia en la técnica (véase la ref. 25). Los métodos conocidos apropiados incluyen la clonación de la secuencia de ADN del gen de tipo salvaje en un vector, p. ej. un plásmido, y la inserción de un marcador seleccionable dentro de la secuencia de ADN clonada o la supresión de una parte de la secuencia de ADN, resultando en su inactivación. Puede introducirse una deleción, por ejemplo, mediante el corte de la secuencia de ADN usando enzimas de restricción que se cortan en dos puntos en o justo fuera de la secuencia de codificación y ligando entre sí los dos extremos de la secuencia restante. Alternativamente y más usualmente ahora, puede construirse (32) un alelo mutante en el que las regiones de flanco de un gen objetivo se amplifican separadamente y se enlazan directamente entre sí en una reacción PCR solapada independiente, con omisión de la secuencia objetivo de intervención. Un plásmido que transporta la secuencia de ADN mutada puede transformarse en la bacteria por medio de técnicas conocidas, como por ejemplo, electroporación y conjugación. Entonces es posible, mediante la selección apropiada, identificar un mutante donde la secuencia de ADN inactivada se ha recombinado en el cromosoma de la bacteria y la secuencia de ADN de tipo salvaje se ha manifestado como no funcional mediante recombinación homóloga.

Además, los genes de resistencia a los antibióticos deben eliminarse generalmente de las bacterias antes de que se usen en una vacuna. Las bacterias aisladas del tipo salvaje contienen con frecuencia genes de resistencia a los antibióticos, como genes de resistencia contra ampicilina, estreptomicina, sulfometoxazol, canamicina, trimeteprim y tetraciclina. Estos genes pueden eliminarse usando el vector suicida y métodos de la invención o con métodos conocidos para las personas con experiencia en la técnica.

La naturaleza de las mutaciones

Las mutaciones introducidas en la vacuna bacteriana para evitar la expresión de enterotoxinas u otros genes eliminan o inactivan el gen. Anulan la función del gen completamente. Esto puede lograrse aboliendo la síntesis de cualquier polipéptido del gen o realizando una mutación que resulta en síntesis de los polipéptidos no funcionales. Para abolir la síntesis de polipéptidos puede delecionarse el gen completo o su extremo 5'. Una deleción o inserción dentro de la secuencia de codificación de un gen puede usarse para crear un gen que sintetice sólo los polipéptidos no funcionales (p. ej. polipéptidos que contienen sólo la secuencia N-terminal de la proteína de tipo salvaje). En el caso de un gen de toxina, la mutación puede hacer que el producto del gen sea no tóxico.

Las mutaciones son generalmente irreversibles. Se trata de mutaciones que esencialmente no muestran reversión al tipo salvaje cuando la bacteria se usa como una vacuna. Dichas mutaciones incluyen inserciones y deleciones. Las inserciones y deleciones son preferiblemente grandes, normalmente de un mínimo de 10 nucleótidos de longitud hasta la longitud de todo el gen o secuencia de codificación, por ejemplo, de 10 a 600 nucleótidos. Preferiblemente, se deleciona toda la secuencia de codificación o todo el gen.

Las mutaciones son normalmente dirigidas al sitio. Pueden ser específicas o selectivas para el gen de toxina u otro gen de factor de virulencia. En el caso de deleción del gen ST en una cepa CFA/I o CS5/CS6, la mutación debe dirigirse específicamente al gen ST sin eliminar ni inactivar el gen CFA/I, gen CS5 o el gen CS6 (estrechamente enlazados).

Expresión de antígenos heterólogos

Una bacteria atenuada de la invención puede estar diseñada genéticamente para expresar un antígeno que no está expresado por la bacteria nativa (un "antígeno heterólogo"), de forma que la bacteria atenuada actúa como un portador del antígeno heterólogo. En el caso de que la bacteria sea una bacteria ETEC, el antígeno puede ser de otra especie o de otra cepa de ETEC, de forma que la vacuna proporciona protección contra la otra especie o cadena. Además, la bacteria puede diseñarse para expresar más de un antígeno heterólogo, en cuyo caso los antígenos heterólogos pueden ser de la misma especie o cepa o de una diferente.

El antígeno heterólogo puede ser una proteína completa, una parte de una proteína que contiene un epitope o una proteína de fusión. El antígeno puede ser de otra bacteria, un virus, una levadura o un hongo. Más especialmente, la secuencia antigénica puede ser de una cepa patogénica de E. coli (p. ej. ETEC). Los antígenos útiles incluyen antígenos de factor de colonización ETEC, componentes no tóxicos o mutantes no tóxicos de E. coli LT (p. ej. la subunidad B y mutantes de la subunidad A), proteínas de fusión LT-ST y la subunidad B de toxina del cólera (CT-B) (50-55).

Los CFAs de ETEC y componentes de los mismos son candidatos principales para la expresión como antígenos heterólogos. Para instigar la enfermedad diarreica, las cepas patogénicas de ETEC deben ser capaces de colonizar el intestino y elaborar enterotoxinas. Para la mayoría de las cepas de ETEC, se han identificado CFAs que son responsables de la adhesión a la mucosa intestinal. En casi todos los casos, los CFAs se expresan como fimbrias en la superficie exterior de la bacteria. Se han identificado un gran número de CFAs, siendo los más prevalentes CFA/I, CFA/II (incluye CS1, CS2, CS3) y CFA/IV (incluye CS4, CS5, CS6). Los antígenos adicionales incluyen CS17, CS7, CS9, CS14, CS12, PCFO159, PCFO166.

La codificación de ADN del antígeno heterólogo puede expresarse desde un promotor que esté activo in vivo. Los promotores que se ha demostrado que funcionan bien son el promotor nirB (10, 39), el promotor htrA (10), el promotor pagC (57) y el promotor ssaH (58). Para la expresión de los antígenos de factor de colonización ETEC o derivados de LT, CT o ST, pueden usarse los promotores de tipo salvaje.

Una construcción de ADN que comprenda el promotor vinculado operativamente al ADN que codifica el antígeno heterólogo puede realizarse y transformarse dentro de la bacteria atenuada usando técnicas convencionales. Los transformadores que contienen la construcción de ADN pueden seleccionarse, por ejemplo, haciendo un screening de un marcador seleccionable en la construcción. Las bacterias que contienen la construcción pueden cultivarse in vitro antes de ser formuladas para la administración al anfitrión para fines de vacunación.

Estabilización del plásmido

Para evitar la pérdida del plásmido que expresa el antígeno heterólogo o de un plásmido nativo, puede añadirse un elemento al plásmido que mejora su estabilidad. En general, ocurre que los plásmidos que se encuentran en las cepas ETEC que codifican los diferentes antígenos de factor de colonización tienen un número de copia bajo y son suficientemente estables para asegurar su mantenimiento durante muchas generaciones en ausencia de mecanismos de selección específicos. Sin embargo, después de la manipulación de estos plásmidos de acuerdo con la invención, por ejemplo para delecionar genes para toxinas como ST u otros determinantes de la virulencia, estas propiedades estables pueden verse perjudicadas. Este problema puede mitigarse utilizando métodos para mejorar la estabilidad del plásmido.

Existen diversos sistemas para determinar la estabilidad del plásmido "toxina/antitoxina" conocidos, por ejemplo, parDE (23) del plásmido RP4 (1), y hok/sok (conocido también como parB del plásmido R1 o pndAB del plásmido R483 (11, 12)), que pueden utilizarse para llevarlo a cabo. Estos sistemas codifican dos funciones: en primer lugar una entidad tóxica que mataría las células en las que está expresada, que tiene una vida media biológica prolongada y en segundo lugar una entidad antitóxica, que evita esta exterminación pero tiene una vida media biológica corta. En el caso de que un plásmido que codifica estas funciones se segregue durante la división, la célula hermana que no contiene el plásmido expulsa su suministro de antitoxina y es exterminada por la mitad de la toxina más persistente. De este modo, sólo las células que continúan alojando el plásmido se mantienen en la población en crecimiento.

Otro sistema que puede usarse para mejorar la estabilidad de un plásmido de acuerdo con la invención es un sistema de resolución de multímeros. Los sistemas de resolución de multímeros confieren estabilidad resolviendo multímeros de plásmidos dentro de copias de plásmido individuales y, por lo tanto, reduciendo la posibilidad de que las células hijas libres de plásmido sean generadas mediante segregación aleatoria en la división celular. Se han identificado una serie de sistemas de recombinación específicos del sitio que actúan para resolver los multímeros de plásmidos dentro de monómeros. De acuerdo con un sistema de este tipo, el plásmido a estabilizar contiene un sitio de reconocimiento para una recombinasa específica del sitio y la célula anfitriona contiene una secuencia de ADN que codifica una recombinasa específica del sitio. La recombinasa actúa sobre el sitio de reconocimiento y de este modo dirige la segregación correcta del plásmido durante la división celular. La recombinasa puede codificarse en el plásmido a estabilizar o en el cromosoma de la célula anfitriona.

La recombinasa es generalmente una resolvasa. Los ejemplos de resolvasas que pueden usarse en la invención incluyen la recombinasa Cre de plásmido P1, la proteína E. coli XerC (ArgR), la proteína D recombinasa de plásmido F, las recombinasas ParA de plásmidos RP4 y RK2, la recombinasa específica del sitio de plásmido R1, las resolvasas codificadas por los elementos genéticos transportables similares a Tn3 y la resolvasa Rsd del plásmido de virulencia Salmonella dublin.

Los elementos de reconocimiento que pueden utilizarse en la presente invención incluyen los de las recombinasas anteriores. Puede utilizarse cualquier elemento de reconocimiento reconocido por la recombinasa específica del sitio utilizada. Los elementos de reconocimiento apropiados incluyen los sitios reconocidos por la recombinasa específica del sitio XerC, como el sitio cer de plásmido ColE1 y el sitio ckr similar de plásmido ColK (59), el sitio psi de plásmido pSC101 y el sitio similar a cer de plásmido pHS-2 de Shigella flexneri. Otros elementos de reconocimiento que pueden utilizarse incluyen el sitio crs del plásmido de virulencia Salmonella dublin, el sitio IoxP de plásmido P1, el sitio rfs del plásmido F y el sitio res del elemento genético transposable similar a Tn3.

En una materialización especialmente preferente de la invención, la recombinasa es la resolvasa Rsd que actúa a través del elemento de reconocimiento crs. El sistema Rsd/crs se describe detalladamente en nuestra solicitud de patente pendiente relacionada, Solicitud de Patente RU nº 0024203.2.

Formulación de vacunas

La invención proporciona una vacuna contra la diarrea que comprende una célula E. coli de la invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Generalmente, la vacuna incluye una mezcla de diferentes células toxina negativa (p. ej., 2, 3, 4, 5 o 6 células) que transportan entre ellas todas los CFAs más comunes. Por ejemplo, la vacuna puede contener cinco cepas diferentes de célula toxina negativa, según se indica:

(i): una célula que expresa CFA/I (p. ej., ECACC nº referencia 01090303 o 02082967)

(ii): una célula que expresa CS5 y CS6 (p. ej., ECACC nº referencia 01090305 o 02082968);

(iii): una célula que expresa CS4 y CS6 (p. ej., ECACC nº referencia 01090306 o 02082966);

(iv): una célula que expresa CS2 y CS3 (p. ej., ECACC nº referencia 01090304 o 02082964); y

(v): una célula que expresa CS1 y CS3 (p. ej., PTL003, ECACC nº referencia 01090302 o 02082965).

Como se ha mencionado anteriormente, la célula depositada en ECACC nº referencia 01090302 (PTL003) ya se ha testado en dos pruebas clínicas y ha demostrado ser segura e inmunogénica.

La vacuna puede formularse usando técnicas conocidas para formular vacunas bacterianas atenuadas. La vacuna se presenta ventajosamente para administración oral, por ejemplo, en forma de polvo estabilizado seco para la reconstitución en un tampón apropiado antes de la administración. La reconstitución se realiza de forma ventajosa en un tampón con un pH apropiado para asegurar la viabilidad de las bacterias. Para proteger las bacterias atenuadas y la vacuna de la acidez gástrica, se administra ventajosamente un preparado de bicarbonato sódico con cada administración de la vacuna. Alternativamente, la vacuna se presenta en forma encapsulada liofilizada.

La vacuna puede usarse en la vacunación de un anfitrión mamífero, especialmente un anfitrión humano. Por lo tanto, puede evitarse una infección causada por un microorganismo, especialmente un patógeno, administrando una dosis efectiva de una vacuna preparada según la invención. La dosificación utilizada puede quedar en última instancia a discreción del médico, pero dependerá de diversos factores, incluyendo el tamaño y el peso del anfitrión y el tipo de vacuna formulada. Sin embargo, una dosificación que comprende la administración oral de, desde 10^{7} hasta 10^{11}, p. ej., desde 10^{8} hasta 10^{10} bacterias por dosis puede ser conveniente para un anfitrión humano adulto de 70 kg.

Ejemplos

Los Ejemplos descritos en esta sección sirven para ilustrar la invención.

Descripción resumida de los dibujos

Figura 1: Mapa de plásmido de vector suicida pDM4. u = secuencia desconocida, longitud desconocida.

Figura 2: Mapa de vector suicida mejorado pJCB12.

Figura 3: Diagrama del método usado para crear construcciones de deleción de genes específica mediante PCR de extensión por solapamiento. Paso 1 = amplificación de PCR de dos fragmentos de ADN. Paso 2 = PCR de extensión por solapamiento usando productos de ADN de la reacción 1 y la reacción 2 del paso 1 y amplificación del producto PCR de extensión por solapamiento. R y S suponen restricción de sitios de enzimas.

Figura 4: Diagrama de método usado para demostrar la integración correcta del vector suicida en el locus dirigido mediante PCR de enlace.

Figura 5: Secuencia del gen ST y regiones flanco del plásmido en la cepa B que muestra el marco de lectura abierto del gen estructural y la posición de todos los oligonucleótidos descritos en el texto y detallados en la Tabla 1.

Figura 6: Secuencia del gen EAST1 y regiones flanco de IS1414 (Genbank nº AF143819) que muestra el marco de lectura abierto del gen estructural y la posición de todos los oligonucleótidos descritos en el texto y detallados en la Tabla 1.

Figura 7: Secuencia del locus LT que muestra la posición de los oligonucleótidos usados para crear la construcción de deleción. El codón ATG subrayado cerca del extremo de la secuencia es el codón de inicio de LTA.

Figura 8: Secuencia de la región de flanco 3' del gen ST-1 determinado de la cepa E que muestra la posición de los oligonucleótidos descritos en el texto y detallados en la Tabla 1. El marco de lectura abierto del gen estructural y los codones de inicio y parada ATG y TAA están subrayados.

Figura 9: Diagrama de las etapas individuales implicadas en la atenuación de cepa E.

Figura 10: Diagrama de las etapas individuales implicadas en la atenuación de la cepa H.

Figura 11: Secuencia del locus de gen aroC que muestra la posición de los oligonucleótidos usados para crear la construcción de deleción y de otros mencionados en el texto y descritos en la Tabla 1.

Figura 12: Diagrama de las etapas individuales implicadas en la atenuación de la cepa J.

Figura 13: Gel que muestra la secuencia de codificación LT-B amplificada PCR de la cepa E. La flecha a la izquierda indica el producto PCR LTB y la flecha a la derecha indica un marcador 600 bp.

Figura 14: Secuencia del gen LT-B clonado de la cepa E.

Figura 15: Diagrama que muestra la construcción de plásmido para la expresión de LT-B bajo control del promotor nirB. El ADN LTB fue digerido con BglII y NheI. El vector de inicio, pNCAT4, fue digerido con las mismas enzimas y se aisló el fragmento de vector más grande. El ADN LTB y el fragmento de vector se enlazaron entre sí. Los sitios KpnI y BglII en el plásmido final, pNLTB, pueden usarse para clonar el promotor LTB.

Figura 16: Western blot que muestra la expresión de LT-B en la vacuna ETEC atenuada cepa PTL003 en citoplasma y periplasma.

Figura 17: Gel que muestra la secuencia de promotor LTAB amplificada PCR de la cepa E. La flecha a la izquierda indica un marcador 200 bp y la flecha a la derecha indica el producto PCR de promotor LT.

Figura 18: Secuencia de promotor LTAB clonado de la cepa E.

Figura 19: Western blot que muestra la expresión de LT-B en la vacuna ETEC atenuada cepa PTL003 bajo control del promotor LT nativo. PLLTB-1, -2 y -3 son tres colonias independientes de PTL003 transformada con pLLTB. Las tres flechas a la izquierda indican el fondo, la flecha a la derecha superior indica LTA y la flecha a la derecha inferior indica LTB.

Figura 20: Diagrama de la técnica "de rescate de plásmido" para obtener la secuencia de la región de flanco 3' de ST de cepa B. La técnica se describe detalladamente en el Ejemplo 2. Se realizó un casete ST mediante PCR (cebadores 4764 y 4765) y se clonó en plásmido pJCB12. El plásmido pJCB12-ST resultante se introdujo en la cepa B mediante conjugación. El ADN de plásmido de uno de los transconjugantes fue aislado y digerido con una enzima de restricción (Bg/II) que corta en un sitio distante del gen objetivo. Los extremos 5' y 3' del plásmido de corte resultante se ligaron entre sí para cerrar el plásmido. El plásmido fue propagado en SY327\lambdapir y después se secuenció con un cebador (4792) que solamente hibridará en el gen ST nativo (no en el gen ST de pJCB12-ST). La secuencia obtenida usando este cebador puede usarse para diseñar otros cebadores para ampliar la secuencia.

Ejemplo 1 Un proceso mejorado para la introducción de múltiples mutaciones genéticas en cepas de vacunas bacterianas

Esta sección describe la generación de un plásmido de vector suicida nuevo, pJCB12, y su uso en la generación de un procedimiento optimizado para la introducción de mutaciones en locus de genes codificados de cromosomas o plásmidos. También describe muchos de los métodos estándar usados en este ejemplo y posteriores de la especificación, al final de la sección. La secuencia y propósito de los oligonucleótidos usados en PCR para la construcción o análisis de construcciones se proporcionan en la Tabla I al final de los Ejemplos.

Un proceso mejorado para la introducción de múltiples mutaciones genéticas en cepas de vacunas bacterianas

La generación de una cepa ETEC atenuada de una cepa de tipo salvaje requiere mutación de diferentes locus genéticos. Estas mutaciones se introducen secuencialmente, cada una usando un proceso que requiere varios pasos diferentes. Cuando requieren atenuación diferentes cepas ETEC, esto supone diversos pasos significativos, cada uno potencialmente con sus dificultades asociadas. Por lo tanto, es vital que el proceso de introducir mutaciones se optimice totalmente.

Los plásmidos de vector suicida como pDM4 (20), pJCB12, pCVD442 (8) y otros pueden usarse para introducir construcciones genéticas definidas dentro de objetivos específicos en el genoma bacteriano. El plásmido pJCB12 es un nuevo vector suicida optimizado basado en el vector suicida construido anteriormente pDM4. La construcción genética definida para ser introducida en el genoma bacteriano puede ser una mutación de deleción de un gen específico o una estructura más compleja, como por ejemplo, una inserción de un gen dentro de otro y expresado de un promotor escogido de dentro de la construcción. Generalmente, las extremidades de las construcciones constarán de secuencias de nucleótidos derivadas de la región del genoma que debe dirigirse.

Los vectores suicidas pDM4 y pJCB12 poseen diversos componentes clave (véanse las figuras 1 y 2): Un origen de replicación que dirige la replicación del vector en algunas cepas de bacterias pero no en otras oriR6K. oriR6K es el origen de replicación derivado del plásmido producido naturalmente R6K. Este origen requiere el gen R6K pir para replicación, que está ausente de los vectores suicidas. Hay disponibles tres cepas E. coli de laboratorio que transportan el gen pir en su cromosoma, que son SY327\lambdapir, SM10\lambdapir, y DH5\alpha\lambdapir. Estas tres cepas pueden usarse para propagar pDM4, pJCB12 y sus derivados.

Un origen de transferencia que dirige la transferencia conjugativa del vector de una cepa bacteriana a otra, mobRP4. mobRP4 es el origen de transferencia del plásmido producido naturalmente RP4. Esto permite la transferencia conjugativa de pDM4 y pJCB12 y sus derivados a cepas bacterianas receptoras. Para la función, mobRP4 requiere que los genes que codifican las funciones de transferencia de RP4 estén presentes en la célula bacteriana donadora. La cepa de E. coli de laboratorio SM10\lambdapir transporta estos genes en su cromosoma y de este modo esta cepa puede usarse como una cepa donadora para pDM4, pJCB12 y sus derivados.

Un gen que codifica un producto que es tóxico para las células bacterianas cuando las células se cultivan en condiciones definidas, sacB. sacB codifica levansucrasa que produce un producto que es tóxico para bacterias gram-negativas cuando se cultivan en sacarosa.

Un marcador seleccionable, cat. cat codifica cloramfenicol acetiltransferasa y proporciona resistencia al cloramfenicol antibacteriano.

Un sitio de clonación múltiple (MCS), es decir, un sitio en el que las construcciones genéticas definidas pueden clonarse para la introducción en una célula bacteriana receptora.

Para nosotros resulta claro a partir de nuestra experiencia que los vectores suicida existentes como pDM4 y pCVD442 con frecuencia no se dirigen al locus correcto y el screening de un gran número de transconjugantes o transformantes es necesario para identificar uno que esté correctamente dirigido (si es que puede llegar a identificarse uno correctamente dirigido). Además, pCVD442 transporta un determinante de resistencia de ampicilina para permitir la selección de recombinantes. Sin embargo, la selección en la ampicilina no es tan eficiente como el cloramfenicol y los intentos para seleccionar números muy pequeños de recombinantes dentro de una mezcla muy grande de bacterias, como cuando se realizan experimentos de conjugación, se ven con frecuencia frustrados por el "crecimiento de fondo". El "crecimiento de fondo" puede adoptar la forma de extensiones de bacterias dentro de las que no es posible la identificación de transconjugantes o pequeñas colonias que después de un análisis posterior no son transconjugantes.

Creemos que los problemas de realización incorrecta se deben parcialmente al tamaño relativamente grande (6-7 kb) de estos vectores suicida conocidos que están ellos mismos construidos con componentes de plásmidos que se producen naturalmente. Por lo tanto, los vectores suicidas pueden dirigir los plásmidos producidos naturalmente dentro de una cepa bacteriana que transporta secuencias de nucleótidos similares. En particular, las funciones de transferencia entre los plásmidos conjugativos están relativamente conservadas y la región de transferencia mobRP4 de pDM4 y pCVD442 es aproximadamente 2,5 kb. Además, en vista del problema de dirección incorrecta llevamos a cabo secuenciamiento. Nuestros datos de secuencia de nucleótidos obtenidos para la región sacB de pDM4 mostraron que incluye aproximadamente 600 bp de una secuencia de inserción similar a IS1, una secuencia de inserción que es prevalente en los genomas de muchas bacterias. Deducimos que esto podría ser al menos parcialmente responsable del direccionamiento incorrecto.

El vector suicida pJCB12 es una versión modificada de pDM4 donde se ha eliminado gran parte del ADN intergénico y no funcional. Por lo tanto, existe una oportunidad mucho menor para el direccionamiento incorrecto usando este vector suicida. Mientras que pDM4 tiene un tamaño aproximado de 7 kb, pJCB12 sólo de 3 kb pero retiene todos los componentes clave. En particular, la región mobRP4 de pJCB12 es de únicamente 0,15 kb y las secuencias de nucleótidos similares a IS1 se han eliminado de la región sacB. Estas modificaciones son particularmente ventajosas cuando se manipulan cepas ETEC que generalmente alojan muchos plásmidos que podrían actuar como objetivos no deseables de recombinación homóloga con componentes del vector suicida. Además, el tamaño menor del pJCB12 permite la manipulación más fácil in vitro y la construcción de derivados dado que las moléculas de ADN más pequeñas se enlazan entre sí y se transforman en anfitriones de E. coli más eficientemente, mejorando las oportunidades de obtener derivados de la construcción correcta. El tamaño más pequeño permite también una mayor eficiencia cuando se intro-
ducen las construcciones dentro de las bacterias receptoras mediante transformación en lugar de mediante conjugación.

La cepa E. coli de laboratorio SM10\lambdapir puede usarse para transferir pJCB12 y sus derivados a las cepas bacterianas receptoras mediante conjugación porque tiene las funciones tra del plásmido RP4 insertado dentro de su cromosoma. Sin embargo, la cepa SM10\lambdapir muestra frecuencias de transformación relativamente bajas. Por este motivo, la cepa DH5\alpha\lambdapir se utilizaría normalmente para la construcción de derivados pJCB12 y una vez se han identificado derivados de la construcción correcta, se transfieren a SM10\lambdapir para la introducción en cepas receptoras mediante conjugación.

Construcción de vector suicida pJCB12

El vector suicida pJCB12 fue construido mediante varias rondas de PCR de extensión por solapamiento (31, Figura 3) usando como plantilla el ADN de plásmido pDM4. Inicialmente, se amplificaron cuatro fragmentos de pDM4 mediante PCR usando la polimerasa de ADN de alta fidelidad, Pfu Turbo^{TM}. Estos fueron el fragmento oriR6K, amplificado usando oligonucleótidos 4714 y 4715; el fragmento mobRP4 amplificado usando oligonucleótidos 4716 y 4717; y el gen cat que fue amplificado en dos partes usando oligonucleótidos 4718 con 4719 y 4720 con 4721. Esto se llevó a cabo para eliminar un sitio enzimático de restricción EcoRI dentro del gen cat. El fragmento oriR6K y el mobRP4 se unieron entonces en una reacción de PCR de extensión por solapamiento usando oligonucleótidos 4714 y 4717. Del mismo modo, los fragmentos cat se unieron usando oligonucleótidos 4718 y 4721. Estos dos fragmentos resultantes se unieron después en una reacción PCR de extensión por solapamiento final usando oligonucleótidos 4717 y 4718. El producto PCR resultante fue enlazado y transformado en células SY327\lambdapir y se seleccionaron transformantes en agar L complementado con cloramfenicol a 20 \mug/ml. Se obtuvieron transformantes que alojaban plásmidos del tamaño correcto y uno de estos, llamado pDM4A7 se seleccionó para su manipulación posterior.

En esta etapa, son claramente funcionales los componentes oriR6K y cat del plásmido pDM4A7. Sin embargo, para confirmar que el locus mobRP4 era funcional, el plásmido pDM4A7 se transformó en cepa SM10\lambdapir. Estos transformantes se colocaron en agar L complementado con cloramfenicol a 15 \mug/ml y ácido naladíxico a 5 \mug/ml. Este agar L fue veteado transversalmente con células de cepa SY327\lambdapir. Mientras que el cloramfenicol selecciona las células bacterianas que albergan pDM4A7, el ácido nalidíxico selecciona SY327\lambdapir. Después de la incubación de un día para otro, crecieron muchas colonias donde las cepas se vetearon transversalmente, pero no creció ninguna en ningún lugar de la placa, confirmando que pDM4A7 puede movilizarse desde la cepa SM10\lambdapir y que el locus mobRP4 es funcional.

El plásmido pDM4A7 fue digerido entonces con EcoRI, tratado con polimerasa de ADN Pfu Turbo^{TM} y enlazado para eliminar el locus enzimático de restricción EcoRI para generar plásmido pDM4A7\DeltaEcoRI. Un fragmento HindIII corto de pDM4 que incluye el sitio de clonación múltiple se ligó entonces en pDM4A7\DeltaEcoRI digerido con HindIII. La reacción de ligación fue transformada en SY327\lambdapir y se seleccionaron transformantes en agar L complementado con cloramfenicol 20 \mug/ml.

El oligonucleótido R6K-01 hibridiza dentro del fragmento HindIII corto de pDM4 que incluye el sitio de clonación múltiple. Por lo tanto, se hizo un screening de los transformantes mediante PCR usando oligonucleótidos R6K-01 y 4720 para identificar los que alojan la construcción de plásmido deseada. Se identificaron una determinada cantidad de estos transformantes y uno de ellos, llamado pDM4A7\DeltaE fue escogido para su manipulación posterior.

El plásmido pDM4A7\DeltaE transporta tres sitios EcoRI muy próximos entre sí en el fragmento HindIII corto de pDM4 que incluye el sitio de clonación múltiple. Los dos fragmentos EcoRI muy cortos de pDM4A7\DeltaE se eliminaron por lo tanto mediante digestión con EcoRI seguido por ligación. Esto resultó en un derivado pDM4A7\DeltaE que posee sólo un sitio EcoRI que fue llamado pJCB10. La región de pJCB10 que incluye oriR6K y el MCS se amplificó utilizando los oligonucleótidos 4715 y 4917 y las determinaciones de secuencia de nucleótidos para parte de este fragmento se realizaron utilizando el oligonucleótido 4917. Esto se nos presentó con la secuencia de nucleótidos a través del MCS que anteriormente era desconocida.

El gen sacB se amplificó entonces utilizando la polimerasa de ADN Pfu y los oligonucleótidos 4722 y 4723. El producto 1.6 kb se ligó con el vector de plásmido pPCR-Script^{TM} (Stratagene) y se transformó en células E. coli XL10 Gold^{TM} (Stratagene). Se obtuvieron transformantes y la funcionalidad del gen sacB se confirmó cultivando en placas los clones en agar L y agar con 5% sacarosa. Una construcción proporcionó un buen crecimiento en agar L y ninguno en agar con 5% sacarosa y de este modo se escogió como fuente del gen sacB. El gen sacB fue entonces digerido de este clon usando la enzima de restricción PstI, sitios para los que se incorporó en oligonucleótidos 4722 y 4723 para este propósito y ligado con pJCB10 también digerido con PstI. Las colonias fueron verificadas por PCR usando oligonucleótidos 4716 y 4766, proporcionando un producto del tamaño esperado (\sim1700 bp). De nuevo, la funcionalidad del gen fue confirmada cultivando en placas los clones en agar L y agar con 5% sacarosa. Una construcción se cultivó en agar L, pero no en agar con 5% sacarosa. El secuenciamiento de esta construcción usando oligonucleótidos 4716 y 4766 respectivamente indicó la orientación del gen sacB. Esta construcción fue llamada pJCB12.

Principio de uso de pJCB12

Una vez se ha ligado la construcción genética definida dentro de pJCB12 para proporcionar un derivado de pJCB12, el plásmido se transfiere a una cepa receptora como una cepa ETEC. Esto puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica, bien mediante conjugación de la cepa anfitriona pJCB12 SM10\lambdapir o mediante transformación del derivado de pJCB12 purificado directamente dentro de la cepa receptora.

Los transconjugantes o transformantes se seleccionan en medio de crecimiento bacteriológico complementado con el antibiótico cloramfenicol. Dado que el vector suicida pJCB12 es incapaz de replicar en ausencia del gen pir, todos los transconjugantes o transformantes que crecen habrán resultado generalmente de la fusión del derivado de pJCB12 con otra réplica mediante recombinación homóloga. Usando pDM4 y otros vectores suicidas más grandes resultará con frecuencia en direccionamiento incorrecto y consecuentemente los mutantes no pueden aislarse en pasos laboriosos posteriores.

A pesar de que el direccionamiento mediante pJCB12 está muy mejorado respecto a pDM4, todavía puede ocurrir direccionamiento incorrecto. Por lo tanto, para poder optimizar totalmente el proceso de mutación definido, se adoptó un nuevo enfoque para screening de transformantes o transconjugantes usando PCR para identificar en los que el derivado de pJCB12 ha dirigido la región deseada del genoma. Para ello, se ha diseñado un oligonucleótido que hibridiza dentro de las secuencias de nucleótidos pJCB12 adyacentes al MCS donde se ha insertado la construcción genética definida. El otro oligonucleótido está diseñado para hibridar a la región del genoma que debe dirigirse, adyacente pero fuera de la construcción genética definida. Los transformantes o transconjugantes que son positivos usando este PCR tendrán el derivado de pJCB12 dirigido a la región correcta del genoma (véase la Figura 4).

Una vez se han identificado los recombinantes correctos tienen que aislarse los derivados en los que se ha perdido el vector pJCB12. Dichos derivados pueden seleccionarse complementando el medio de crecimiento bacteriológico con 5% sacarosa. Esta selección de sacarosa puede hacerse más eficiente usando un medio L modificado en el que está ausente el ingrediente NaCl y complementado con 5% sacarosa. Bajo estas condiciones, el gen sacB de pJCB12 es tóxico y sólo crecerán derivados en los que se ha perdido el gen sacB. Este evento se produce de nuevo mediante recombinación homóloga y tiene diferentes resultados. En primer lugar, se producirá un evento de reversión en la región dirigida quedando como estaba. En segundo lugar, puede producirse una recombinación homóloga en la construcción genética definida siendo intercambiada por la región dirigida dando como resultado que la construcción definida se incorpora en la región objetivo. Además, si la región dirigida forma parte de un plásmido, como muchos de los genes de toxinas de las cepas ETEC, pueden producirse dos eventos adicionales. En tercer lugar, son un evento de deleción espontánea indefinida, resultando en la pérdida de una parte de la región dirigida que puede extenderse más allá de los límites de la construcción genética definida y, en cuarto lugar, la pérdida de todo el plásmido, un evento que puede denominarse "depuración de plásmido específica".

Las pruebas en los derivados resistentes a la sacarosa mediante PCR pueden identificar los recombinantes deseados. Para ello, se usan los oligonucleótidos que hibridizan en cada extremo de la región dirigida y se usan fuera de la construcción genética definida. Si el producto PCR es del mismo tamaño que antes para la introducción de la construcción del derivado de pJCB12, se ha producido un evento de reversión. Por ejemplo, si la construcción definida genéticamente es una mutación de deleción, el producto PCR debe ser más pequeño que anteriormente y de un tamaño predecible. El depurado de plásmido específico y la deleción espontánea indefinida resultará normalmente en un producto no PCR o productos no específicos de tamaño imprevisto en este tipo de reacción PCR.

En resumen, el vector pJCB12 (u otro vector similar de la invención) puede usarse en un método para producir una célula bacteriana en la que un gen objetivo (p. ej. gen de toxina como ST, LT o EAST1 o un gen cromosómico como un gen omp o aro) se deleciona, inactiva o sustituye, cuyo método comprende la transferencia del vector a una célula bacteriana que contiene el gen objetivo y la selección para una célula en la que el gen objetivo ha sido delecionado, inactivado o sustituido.

La selección puede llevarse a cabo usando un procedimiento de múltiples etapas a lo largo de las líneas siguientes:

- Selección de una colonia de células que contiene el marcador seleccionable. Si la célula dentro de la que se transfiere el vector no soporta replicación del vector desde el origen de replicación en el vector, seleccionando una colonia de células de este tipo se identifican las células en las que el vector se ha incorporado dentro de la réplica celular;

- Realización de PCR para seleccionar una célula en la que el vector se ha dirigido correctamente al gen objetivo, donde uno de los cebadores usados en el PCR hibridiza a secuencia vectorial adyacente al sitio de clonación y el otro hibridiza a un sitio en el ADN celular adyacente al gen objetivo. Un PCR positivo indica que el vector ha dirigido al gen objetivo.

- Selección de una célula de la que se ha perdido la secuencia vectorial cultivando la célula en condiciones que hacen efectivo el gen, que codifica un producto que es tóxico para las células cuando se cultiva bajo condiciones definidas. La supervivencia de una célula indica que se ha perdido la secuencia vectorial. Cuando el gen que codifica el producto tóxico es sacB, la célula puede cultivarse en un medio complementado con sacarosa y en el que NaCl está ausente; el producto de sacB es tóxico cuando las células se cultivan en este medio.

- Finalmente, PCR puede llevarse a cabo usando cebadores que hibridizan en posiciones exteriores y adyacentes a cada extremo del gen objetivo, donde un producto PCR menor que el producto obtenido de una célula de tipo salvaje indica una mutación de deleción.

Materiales y métodos

Cepas bacterianas usadas. Las cepas ETEC tal como se describen en cualquier lugar de la especificación y cepas de laboratorio de E. coli:

3

Medios de cultivo bacteriológico. Las cepas ETEC se cultivaron rutinariamente en caldo L y en agar L y se incubaron a 37ºC de un día para otro. El caldo L consta de 10 g/l peptona, 5 g/l extracto de levadura y 5 g/l de NaCl disueltos en 1 1 de agua desionizada. El agar L es caldo L complementado con 15 g/l agar. El medio de cultivo que contiene un 5% de sacarosa fue como se ha descrito anteriormente pero sin los 5 g/l de NaCl. Para optimizar la expresión de CFAs, las cepas ETEC se cosecharon del CFA-agar (1% ácidos casamino), 2% agar, 0,15% extracto de levadura, 0,005% MgSO_{4}, 0,0005% MnCl_{2}). Se utilizó cloramfenicol en una concentración de 10 \mug/ml, tetraciclina a 15 \mug/ml y estreptomicina a 20 \mug/ml.

Conjugaciones bacterianas. Se realizaron mezclando las cepas ETEC donadora y receptora en agar L y se incubaron a 37ºC durante 3 a 18 h. El cultivo bacteriano fue rascado y vertido en el caldo L y cultivado en placas de agar L complementado con cloranfenicol y otro antibiótico apropiado para seleccionar cepas ETEC (estreptomicina para la cepa B, tetraciclina para otras cepas ETEC) que lleven incorporado el derivado pJCB 12.

Identificación de recombinantes correctamente dirigidos. Los transconjugantes o transformantes obtenidos mediante el cultivo en agar L complementado con cloramfenicol siguiendo la introducción de las construcciones de derivado pJCB12 se probaron por medio de PCR para identificar en cuáles se había dirigido el locus genético deseado. Para ello, uno de los oligonucleótidos hibridizó dentro de las secuencias de nucleótidos pJCB12 adyacentes al sitio de clonación múltiple (MCS) donde se había insertado la construcción genética definida.

El otro oligonucleótido hibridizó en el genoma, adyacente pero fuera de la construcción genética definida. En un PCR de este tipo, la generación de un fragmento indicó que los sitios de unión para los oligonucleótidos respectivos habían quedado enlazados, lo que no se produciría solo si el derivado pJCB12 hubiese dirigido la región correcta del genoma.

Excisión de pJCB12 de los transconjugantes mediante cultivo en presencia de 5% sacarosa. Los transconjugantes o transformantes que tienen el derivado pJCB12 dirigido a la región correcta del genoma se vetearon sobre agar L fresco complementado con cloramfenicol y otro antibiótico apropiado para seleccionar cepas ETEC (ver anteriormente) y se incubaron a 37ºC para el cultivo de colonias. Los cultivos de caldo L inoculados desde estas placas frescas se cultivaron a continuación. Las células de estos cultivos se cosecharon, se resuspendieron en caldo con 5% sacarosa y se incubaron de un día para otro antes de cultivar en placas diluciones en serie de agar con 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se hubiese excisado el derivado de pJCB12. Las placas de agar con sacarosa inoculadas se incubaron entonces de un día para otro y las colonias resultantes se probaron mediante PCR usando los oligonucleótidos relevantes para identificar mutantes.

Se realizaron manipulaciones de ADN usando procedimientos estándar (25). Se preparó ADN de plásmido usando kits de purificación de plásmido de QIAGEN (Crawley, RU) y se aislaron fragmentos de ADN de los geles de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAquick^{TM} de QIAGEN.

Se realizaron reacciones PCR rutinariamente usando polimerasa de ADN Taq (Life Technologies); cuando fue necesario PCR de alta fidelidad, como en la construcción de pJCB12, se usó polimerasa de ADN Pfu "Turbo" (Stratagene). Se usaron las dos polimerasas de ADN, de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Rutinariamente, se usó el ciclo de PCR siguiente:

Paso 1; 95ºC, 50 seg.

Paso 2; 95ºC, 10 seg.

Paso 3; 55ºC, 1 min.

Paso 4; 72ºC, 1 min.

Paso 5; repetir los pasos 2 a 4 veinticinco veces

Paso 6; 72ºC, 1 min.

Para la construcción de pJCB12, se utilizó un preparado de ADN de plásmido pDM4 como plantilla en las reacciones de PCR. Para el screening de PCR rutinario se utilizó un pico de una colonia bacteriana como plantilla. Para la construcción de mutaciones de deleción de toxinas se usaron preparados de ADN de plásmido extraídos de cepas ETEC apropiadas. Los fragmentos de ADN y de pJCB12 de plásmido que incorporan mutaciones de deleción se generaron usando una modificación de PCR de extensión por solapamiento (31). En la versión modificada, no existe solapamiento en los fragmentos amplificados. En lugar de ello, los fragmentos flanquean la región que debe delecionarse y las secuencias complementarias que permiten la unión de los dos fragmentos se incluyen en los extremos 5' de los oligonucleótidos relevantes; véase la Figura 3.

SDS-PAGE

Esto se realizó esencialmente como describe Laemmli (16) y se utilizó para la visualización de los CFAs expresados y para la comprobación de los perfiles LPS. Para los perfiles LPS, se cultivaron células de un día para otro en caldo L, se cosecharon y se resuspendieron en agua para proporcionar una suspensión celular con un A600 de 20/cm. La suspensión celular se mezcló con un volumen igual de 50 mM TrisHCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerol, 0,25% (w/v) bromofenol azul, 2% (v/v) 2-mercaptoetanol y se hirvió durante 5 minutos. A continuación, se añadió proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg/ml y las muestras se incubaron a 60ºC durante 1 h antes de cargar de 5 a 10 \mul en geles SDS-PAGE. Para los CFAs, se cosecharon bacterias de agar CFA y se resuspendieron en agua para proporcionar una suspensión celular con un A600 de 20/cm. La suspensión celular se calentó a 65ºC durante 10 min., las muestras se centrifugaron a continuación para eliminar células enteras. Se añadió un volumen igual de 50 mM TrisHCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerol, 0,25% (w/v) bromofenol azul, 2% (v/v) 2-mercaptoetanol. A continuación se cargaron volúmenes de 3 a 10 \mul en geles SDS-PAGE de Tris-glicina 12% (Invitrogen).

Los CFAs se visualizaron mediante manchado con Coomassie blue (Sambrook et al. 1989, ref. 25) mientras que LPS se visualizó usando un kit de manchado plateado SilverXpress^{TM} (Invitrogen).

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Ejemplo 2 Eliminación de geles de toxinas e introducción de mutaciones de atenuación en cepas que expresan CFA/I Manipulación de cepa A para producir cepa ACAM 2010

La cepa A (WS-1858B) expresa el antígeno de factor de colonización CFA/I y la toxina estable al calor ST. Para generar un derivado ST negativo que siga expresando los factores de colonización CFA/I, en primer lugar la cepa se transformó con un plásmido que proporciona resistencia a la tetraciclina. Esto fue para permitir la selección posterior de la cepa en las mezclas de conjugación. El plásmido que proporciona resistencia a la tetraciclina es un derivado del plásmido pACYC184 (40) en el que el determinante de resistencia al cloramfenicol se ha inactivado mediante deleción de un fragmento de enzima de restricción BsmBI usando procedimientos de manipulación de ADN estándar. Este plásmido fue denominado "pACYC-Tc" y se introdujo en la cepa A mediante electrotransformación.

El derivado TetR de la cepa A fue conjugado con SM10\lambdapir que aloja plásmido pJCB12-STI. Este derivado pJCB12 contiene un fragmento del gen STI amplificado de la cepa B usando oligonucleótidos 4764 y 4765 clonados en el MCS. La secuencia de esta construcción se indica en la Figura 5. Téngase en cuenta que el fragmento STI de este derivado no es una deleción; el objetivo es dirigir el locus con los marcadores codificados mediante pJCB12 para permitir la selección para eventos de deleción que den como resultado un producto correcto.

Los transconjugantes se seleccionaron cultivando en placas la mezcla en agar-L complementado con tetraciclina y cloramfenicol y las colonias obtenidas se confirmaron como transconjugantes mediante comprobación PCR usando oligonucleótidos 4720 y 4721, lo que amplifica el determinante de resistencia al cloramfenicol. Se identificaron tres transconjugantes y se denominaron A13, A14 y A18, respectivamente. Cada transconjugante se cultivó en un medio con 5% sacarosa y las colonias obtenidas se sometieron a screening para ST usando oligonucleótidos 4764 y 4765. Uno de los derivados ST-negativo identificado fue denominado A 18-34 y fue probado mediante PCR en cuanto a la presencia del gen cfaB usando oligonucleótidos BglIIFOR y BglmodREV, respecto a la presencia del gen cfaC usando oligonucleótidos 4727 y 4728 y la presencia del gen cfaR usando oligonucleótidos 4785 y 4786. Las tres reacciones PCR fueron positivas, confirmando la presencia de los genes relevantes. A continuación se cultivó la cepa derivada A 18-34 en agar CFA/I y se procesó para SDS-PAGE con el fin de visualizar la expresión CFA/I. Esto confirmó que se había aislado la cepa A 18-34 expresada CFA/I y, por lo tanto, una cepa expresando CFA/I, ST negativa.

En el paso siguiente se identificó un derivado sensible a la ampicilina de la cepa A18-34. Para ello, se cultivó la cepa A18-34 en caldo LB a través de tres pasos. El cultivo resultante se diluyó a continuación y se cultivó en placas en agar-LB. Cuando fueron visibles colonias pequeñas, se cultivaron en placas para réplica en agar LB complementado con ampicilina a 200 \mug/ml y después se incubaron para facilitar el crecimiento de las colonias. Se identificó la ausencia de una colonia de la placa de réplica complementada con ampicilina y posteriormente se confirmó como sensible a la ampicilina. Esta cepa fue denominada A 18-34 Ap^{S}.

En el paso siguiente, se aisló un derivado sensible a trimetoprim de la cepa A 18-34 Ap^{S}. Para ello, la cepa A 18-34 Ap^{S} fue cultivada en placa para réplica como se describe anteriormente, pero en agar LB y agar de sales mínimas M9 complementado con 0,4% glucosa y trimetoprim a 25 \mug/ml. Se identificaron dos colonias que no se habían cultivado en las placas de réplica complementadas con trimetoprim y una de ellas que fue denominada A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} se escogió para las manipulaciones posteriores.

El gen de toxina EAST 1 se delecionó a continuación de la cepa A 18-34 Ap^{S} Tp^{S}. Para ello, se realizaron conjugaciones con SM10\lambdapir, que aloja un derivado del plásmido pJCB12 que porta una deleción EAST1 definida como la cepa donadora y la cepa A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} como la cepa receptora. Se seleccionaron transconjugantes en agar-L complementado con tetraciclina a 15 \mug/ml y cloramfenicol a 10 \mug/ml. Se identificó un transconjugante mediante PCR usando oligonucleótidos 4917 y 4778 en los que se insertó el derivado de pJCB12 en el lugar correcto. Este transconjugante resistente a la tetraciclina y el cloramfenicol se cultivó a continuación en un medio con 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se había excisado el derivado de pJCB12 (como se describe en Materiales y Métodos). Las colonias que se cultivaron en agar L complementado con 5% sacarosa se probaron a continuación mediante PCR usando oligonucleótidos 4749 y 4752. Se identificaron tres aislados que fueron negativos en esta reacción PCR indicando que se había perdido el locus EAST1.

Seguidamente las mutaciones de deleción definidas se introdujeron en los genes aroC, ompC y ompF para atenuar todavía más el derivado A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 como se describe en otros ejemplos. Los intentos iniciales de introducir la mutación \DeltaaroC tuvieron poco éxito, como ocurrió al construir una mutación de deleción \DeltaaroC de derivado de la cepa J (véase más adelante). Por lo tanto, se realizaron intentos para introducir la mutación \DeltaaroC^{J} (véanse más adelante los detalles de la mutación). Después de la transferencia de pJCB12-\DeltaaroC^{J} dentro del derivado A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1, se identificó un transconjugante mediante PCR usando oligonucleótidos 4917 y 4742. Este transconjugante se cultivó a continuación en medio de 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se había excisado el derivado de pJCB12 (como se describe en Materiales y Métodos). Las colonias que se cultivaron en agar-L complementado con 5% sacarosa se probaron a continuación mediante PCR usando oligonucleótidos 47116 y 47117 y se identificó un derivado que portaba la mutación de deleción definida \DeltaaroC^{J}. Se demostró auxotrofia de aminoácidos aromáticos en esta cepa A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} mediante veteado en agar mínimo y agar mínimo complementado con "aro mix". La cepa creció sólo en el agar complementado con aro mix, mientras que la cepa padre A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 creció tanto en presencia como en ausencia de "aro mix".

A continuación, la mutación de deleción definida \DeltaompC se introdujo en el derivado de A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} como se ha descrito para la cepa H (ejemplo 4) y se identificó un mutante de deleción \DeltaompC. La expresión de CFA/I y LPS mediante esta cepa A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} \DeltaompC se confirmó a través de SDS-PAGE.

A continuación, la mutación de deleción definida \DeltaompF se introdujo dentro del derivado de A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} \DeltaompC como se ha descrito para la cepa H (ejemplo 4) y se identificó un mutante de deleción \DeltaompF. La expresión de CFA/I y LPS por medio de esta cepa A18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} \DeltaompC \DeltaompF fue confirmada mediante SDS-PAGE.

Finalmente, el plásmido pACYC-Tc que fue introducido en la cepa A para conferir resistencia a la tetraciclina fue depurado específicamente desde la cepa A 18-34 Ap^{S} Tp^{S} \DeltaEAST1 \DeltaaroC^{J} \DeltaompC \DeltaompF. Para ello, el plásmido pJCB12-pACYCori descrito en el ejemplo 4 fue introducido mediante electrotransformación. Los transformantes que alojan pJCB12-pACYCori se seleccionaron mediante cultivo en agar-L complementado con cloramfenicol. A continuación, se cultivó un transformante en un medio con 5% sacarosa para seleccionar derivados de los que se había depurado el plásmido pJCB12-pACYCori (como se ha descrito en Materiales y Métodos). Las colonias que se cultivaron en agar-L complementado con 5% sacarosa se colocaron a continuación en medio de agar L complementado con cloramfenicol y en medio de agar-L complementado con tetraciclina. Esto identificó una serie de derivados que eran sensibles a estos dos antibióticos, confirmando que el plásmido pJCB12-pACYCori había depurado realmente de forma específica la cepa del plásmido marcador pACYC-Tc y después se había depurado el mismo mediante crecimiento en presencia de sacarosa.

Se escogió uno de estos derivados sensibles a los antibióticos y se probó mediante PCR respecto a la presencia de los genes cfaA, cfaC y cfaD usando pares de oligonucleótidos 47104 con 47105, 4729 con 4730 y 4785 con 4786 respectivamente. Además se confirmó la presencia de las mutaciones de deleción de \DeltaaroC^{J}, \DeltaompC y \DeltaompF usando los pares de oligonucleótidos 47116 con 47117, 4732 con 4743 y 4733 con TT1. La expresión de CFA/I y LPS se confirmó en esta cepa usando SDS-PAGE y se confirmó la secuencia de nucleótidos a través de las mutaciones \DeltaaroC^{J}, \DeltaompC y \DeltaompF.

Manipulación de la cepa B para producir cepa ACAM 2011

La cepa B (WS-4437A) expresa el antígeno de factor de colonización CFAI y la toxina estable al calor ST. Inicialmente, se intentó el aislamiento de una mutación de deleción ST espontánea accediendo a ST usando plásmido pJCB12-STI. Este plásmido fue introducido dentro de la cepa B mediante conjugación de SM 10\lambdapir y se obtuvieron transconjugantes mediante cultivo de agar-L complementado con cloramfenicol. Después de varios intentos, se identificaron diferentes mutantes ST-negativos, pero fueron todos negativos para CFA/I.

Por lo tanto, se decidió construir una mutación de deleción STI definida específica para la cepa B. El primer requisito fue determinar la secuencia de nucleótidos que flanquea el extremo 3' del gen ST. El proceso utilizado para llevarlo a cabo se ilustra en la Figura 20. Se aisló ADN de plásmido de una cepa transconjugante en la que pJCB12-STI se dirigió al gen ST. El ADN purificado fue sometido a digestión con endonucleasa de restricción por medio de Bg/II que corta el plásmido ETEC, pero no el gen ST ni la construcción pJCB12. El ADN digerido fue ligado y electrotransformado en SY327\lambdapir y los transformantes se seleccionaron en agar-L complementado con cloramfenicol. Este proceso se denomina "rescate plásmido" y da como resultado el reaislamiento de la réplica de pJCB12 que incorpora un fragmento grande de DMA que incluye la región STI completa y una gran cantidad de ADN de flanco. Se obtuvo la secuencia de ADN de flanco. Los datos de secuencia de nucleótidos obtenidos de ello permitieron el diseño de otros oligonucleótidos (4797 y 4798) y se utilizaron para determinar la secuencia de nucleótidos adicional más downstream del gen STI en la cepa B. En la Figura 5 se muestra la secuencia determinada y la ubicación de todos los sitios de unión de oligonucleótidos.

Usando la secuencia de nucleótidos determinada, se construyó una mutación de deleción ST. Esto se realizó amplificando dos fragmentos del locus STI usando oligonucleótidos 47101 con 47114 y 47115 con 47100. Los dos fragmentos resultantes se unieron mediante PCR de extensión por solapamiento usando oligonucleótidos 47100 y 47101 y se ligaron en MCS de pJCB12 usando técnicas estándar.

La construcción se introdujo en la cepa B mediante conjugación de SM10\lambdapir y transconjugantes resistentes al cloramfenicol donde el ST que había sido dirigido correctamente fue identificado mediante PCR usando oligonucleótidos 4917 y 4799. Estos transconjugantes se cultivaron en presencia de sacarosa y las colonias obtenidas se sometieron entonces a screening usando oligonucleótidos 47100 y 47101 para identificar mutantes de deleción ST. Se encontró un derivado que era negativo usando estos oligonucleótidos, sugiriendo que una deleción espontánea había dado como resultado la pérdida de todo el locus ST. Este derivado fue positivo mediante PCR usando oligonucleótidos 4727 con 4728, lo que amplifica parte del gen cfaC. También fue positivo usando oligonucleótidos BglIIFOR y BglmodREV, que amplifican el gen cfaA y usando los oligonucleótidos 4785 y 4786 que amplifican el gen regulador CFA/I, cfaD. Un ensayo funcional para ST confirmó que este derivado era ST-negativo, mientras que SDS-PAGE confirmó que continuaba expresando CFA/I.

Las deleciones definidas se introdujeron entonces en los genes aroC, ompC y ompF para atenuar el derivado ST-negativo de la cepa B. Los intentos iniciales de introducir la deleción \DeltaaroC no tuvieron éxito. Por lo tanto, se utilizó la deleción \DeltaaroC^{J} (véanse más adelante los detalles de la mutación). Después de la transferencia de la deleción pJCB12\DeltaaroC^{J} dentro del derivado ST-negativo de la cepa B, se identificaron transconjugantes mediante PCR utilizando oligonucleótidos 4917 con 4742. Se identificó un transconjugante y después se cultivó en un medio de 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se había excisado el derivado pJCB12 (como se ha descrito en Materiales y Métodos). Las colonias cultivadas en agar-L complementado con 5% sacarosa se probaron a continuación mediante PCR usando oligonucleótidos 47116 con 47117 y se identificó un derivado que portaba la deleción \DeltaaroC^{J}. El estado CFA/I del exconjugante se comprobó mediante PCR usando oligonucleótidos 4727 con 4728 para cfaC, 4785 con 4786 para cfaD y BglIIFOR con BglIImodREV para cfaA.

La mutación de deleción definida \DeltaompC se introdujo a continuación dentro del derivado \DeltaaroC^{J} ST-negativo de la cepa B, como se ha descrito para la cepa H (ejemplo 4) y se identificó un mutante de deleción \DeltaompC. El estado CFA/I del exconjugante fue comprobado mediante PCR usando oligonucleótidos 4727 con 4728 para cfaC, 4785 con 4786 para cfaD y BglIIFOR con BglIImodREV para cfaA.

La mutación de deleción definida \DeltaompF fue introducida dentro del derivado \DeltaaroC^{J}, \DeltaompF, \DeltaompC ST-negativo de la cepa B como se ha descrito para la cepa H (ejemplo 4) y se identificó un mutante de deleción ompF. El estado CFA/I del exconjugante fue comprobado mediante PCR usando oligonucleótidos 4727 con 4728 para cfaC, 4785 con 4786 para cfaD y BglIIFOR con BglIImodREV para cfaA.

Finalmente, el plásmido pStrep que confiere resistencia a la estreptomicina fue depurado específicamente del derivado \DeltaaroC^{J}, \DeltaompF, \DeltaompC ST-negativo de la cepa B. Para ello, se construyó un derivado plásmido de pJCB12 que incorporaba el origen de replicación de pStrep. Esto se realizó mediante fragmentos de pStrep de clonación al azar generados mediante digestión de endonucleasa de restricción con SphI dentro del sitio SphI de pJCB12 y transformando el ADN en células E. coli ultracompetentes XL-10 Gold (Stratagene). Se cultivaron en placa transformantes en agar-L complementado con cloramfenicol. Dado que pJCB12 es un vector suicida que requiere cepas anfitrionas especiales que porten el gen pir, los transformantes que crecen en presencia de cloramfenicol se asumió que eran derivados de PJCB12, que portaban el origen de réplica pStrep. El ADN de plásmido de estos cuatro transformantes mostró que en todos los casos se había clonado un fragmento de ADN SphI de aproximadamente 2 kb dentro de pJCB12. Este derivado de pJCB12 fue denominado pJCB12-pStrep-ORI.

El plásmido pJCB12-pStrep-ORI fue introducido en el derivado \DeltaaroC^{J}, \DeltaompF, \DeltaompC ST-negativo de la cepa B mediante conjugación de la cepa SM10\lambdapir y los transconjugantes resultantes seleccionados mediante cultivo en un medio de agar complementado con cloramfenicol. Las colonias que crecieron se utilizaron para inocular caldo complementado con cloramfenicol y después de la incubación para permitir el crecimiento se cultivaron en placas diluciones de este cultivo en agar complementado con cloramfenicol. Las colonias que crecieron en este medio se colocaron en agar complementado con estreptomicina para identificar las que habían perdido el plásmido pStrep. Una de estas colonias sensibles a la estreptomicina se cultivó en caldo L complementado con 5% sacarosa para seleccionar un derivado del que se había perdido el plásmido pJCB12-pStrep-ORI. Las diluciones de este caldo de cultivo se cultivaron en placa con agar-L complementado con 5% sacarosa y después de la incubación, algunas de las colonias resultantes se colocaron en agar complementado con cloramfenicol para identificar las que habían perdido el plásmido pJCB12-pStrep-ORI.

El estado CFA-I del exconjugante se comprobó de nuevo mediante PCR usando oligonucleótidos 4727 con 4728 para cfaC, 4785 con 4786 para cfaD y BglIIFOR con BglIImodREV para cfaA. La expresión de proteína CFA/I se comprobó entonces mediante SDS-PAGE y Western blotting. También se comprobó el perfil LPS. Además, se confirmaron las mutaciones \DeltaaroC^{J}, \DeltaompF y\DeltaompC mediante secuenciamiento y también se confirmó la dependencia de la cepa respecto a los aminoácidos aromáticos.

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Ejemplo 3 Derivado de una cepa ETEC de tipo salvaje virulenta que expresa CS5, CS6, LT, ST Y EAST1, donde se han delecionado los genes LT, ST y EAST1

La cepa E expresa CS5, CS6 y las toxinas EAST1, ST y LT. Para facilitar la manipulación genética, el plásmido pACYC-Tc (descrito en el ejemplo 2 anterior) se introdujo en la cepa E mediante electrotransformación para conferir resistencia a la tetraciclina.

El gen de toxina EAST1 fue delecionado primero de la cepa E. Esto requirió la construcción de un derivado de pJCB12 que porta una mutación de deleción EAST1 definida. Esta mutación de deleción fue generada amplificando los fragmentos de EAST1 de la cepa ETEC H10407, usando oligonucleótidos 4749 con 4750 y 4751 con 4752 para generar dos fragmentos de ADN que flanquean el gen EAST1. En la Figura 6 se muestra la secuencia del locus EAST1 derivado de IS1414 (número de referencia Genbank AF143819) y todos los oligonucleótidos usados. Estos se fusionaron después mediante una reacción PCR de extensión de solapamiento adicional usando cebadores 4749 y 4752 y el fragmento resultante fue clonado en pJCB12 usando los sitios de restricción SalI y SphI. De este modo, se construyó un derivado de pJCB12 que incorporaba esta mutación de deleción.

La cepa SM10\lambdapir que aloja pJCB12-\DeltaEAST1 fue conjugada con la cepa E y los transconjugantes seleccionados. Las colonias que crecieron en agar L complementadas con cloramfenicol y tetraciclina se sometieron a screening usando los oligonucleótidos 4917 y 4753 (equivalente a los oligos 4 y 1 en la Figura 4). Se obtuvieron dos transconjugantes, siendo positiva en ambos esta reacción PCR indicando que el plásmido pJCB12-\DeltaEAST1 se había dirigido correctamente al gen EAST1.

Estos transconjugantes resistentes al cloramfenicol se cultivaron después en un medio con 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se hubiese excisado el derivado de pJCB12. En el agar de sacarosa se obtuvieron cuatro exconjugantes que fueron negativos en la prueba de presencia del gen EAST1 y mediante PCR usando los oligonucleótidos 4749 y 4752, indicando que toda la región EAST1 se había perdido en este derivado.

El derivado EAST1 negativo de la cepa E fue probado mediante PCR usando los oligonucleótidos 4738 con 4780, que son específicos del operón CS5 y los oligonucleótidos 4740 con 4781, que son específicos del operón CS6. Estas reacciones PCR fueron positivas para los cuatro exconjugantes, confirmando que seguían alojando los genes CS5 y CS6.

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Seguidamente, se construyó un mutante de deleción LT del derivado EAST1-negativo de la cepa E. Para ello, se construyó un plásmido derivado de pJCB12 que portaba una deleción definida del gen LT-A en el locus LT. Véase la Figura 7.

Se construyó una deleción LT-A definida mediante amplificación PCR usando oligonucleótidos 4772 con 4773 y 4774 con 4746 para generar dos fragmentos de ADN que flanqueaban el gen LT-A. Estos se centraron después mediante una reacción de PCR de extensión de solapamiento adicional y el fragmento resultante se clonó en pJCB12 usando los sitios de restricción SalI y SphlI.

La construcción pJCB12-\DeltaLT-A fue introducida en el derivado \DeltaEAST1 de la cepa E mediante conjugación de la cepa anfitriona de pJCB12 SM10\lambdapir y se seleccionaron transconjugantes en agar-L complementado con cloramfenicol y tetraciclina. Las colonias resultantes se sometieron a screening mediante PCR usando oligonucleótidos 4762 y R6K-01 que identificaron dos transconjugantes en los que se había dirigido correctamente el locus LT.

Estos transconjugantes resistentes al cloramfenicol se cultivaron en un medio de 5% sacarosa para seleccionar recombinantes en los que se había excisado el derivado de pJCB12. Las colonias que crecieron en el agar de sacarosa se probaron mediante PCR usando oligonucleótidos 4762 y 4746 para identificar mutantes de deleción LT-A. Se identificaron tres derivados que fueron negativos en esta reacción PCR, sugiriendo que habían perdido todo el locus LT. Las reacciones PCR realizadas en estos tres derivados LT-negativos utilizando oligonucleótidos 4738 con 4780 y oligonucleótidos 4740 con 4781 confirmaron la presencia de los genes CS5 y CS6 respectivamente.

A continuación se suprimió el gen ST de este derivado LT-negativo EAST1 negativo de la cepa E. Para ello, el plásmido pJCB12-STI (como se ha descrito en el ejemplo 2) se transfirió a la cepa E desde SM10\lambdapir y el transconjugante seleccionado en agar-L se complementó con cloramfenicol. Se identificó un transconjugante mediante PCR usando oligonucleótidos 4917 y 4794 y este transconjugante se cultivó después en un medio con 5% sacarosa para seleccionar los derivados de los que se había perdido pJCB12-STI. De las 133 colonias del screening, sólo 3 habían perdido STI, siendo las otras revertientes y los 3 derivados STI-negativos fueron negativos también para CS5 y CS6. Estos resultados sugirieron que el locus STI estaba presente en el mismo plásmido que los genes CS5 y CS6 (como lo hicieron los datos de hibridación Southern) y que el locus STI era relativamente estable, de forma que los revertientes o derivados se obtuvieron en los que sólo se había producido depuración de plásmido específica.

Por lo tanto, se decidió que era necesaria una mutación de deleción STI definida específica para la cepa E. Con el fin de realizar esta construcción fueron necesarios datos de secuencia de nucleótidos adicionales para la región downstream del gen STI en la cepa E. Por lo tanto, se utilizó uno de los transconjugantes pJCB12-ST para las determinaciones de secuencia en el locus STI usando el procedimiento de rescate de plásmido descrito en el ejemplo 2 y se ilustró en la Figura 20. Se obtuvo un derivado de pJCB12 que incorpora un fragmento grande de ADN que incluye el gen ST-I y una gran cantidad de ADN de flanco de la cepa E. Este preparado de plásmido se utilizó como plantilla en las reacciones para la determinación de la secuencia de nucleótido usando oligonucleótido 4764 para determinar la secuencia a través del gen STI y oligonucleótido 4792 para determinar la secuencia dowstream del gen STI. Los nuevos datos de secuencia permitieron el diseño de un oligonucleótido adicional, el 47106, que fue utilizado para las determinaciones de secuencia de nucleótido posteriores. Estos nuevos datos de secuencia adicionales permitieron el diseño de los oligonucleótidos 47112, 47120 y 47121 para la construcción del casete de deleción. La secuencia del gen ST-1 y las regiones de flanco que muestran los sitios de unión de todos los oligonucleótidos utilizados se indica en la Figura 8.

Como ocurre con otras mutaciones de deleción, se amplificaron dos fragmentos de ADN de la región ST mediante PCR usando los oligonucleótidos 4764 con 47120 y 47121 con 47112 y los dos fragmentos generados se fusionaron mediante una reacción PCR de extensión por solapamiento adicional usando los oligonucleótidos 4764 y 47112. El fragmento resultante se clonó en pJCB12 usando los sitios de endonucleasa de restricción SacI y SalI de pJCB12 y los incorporados en los oligonucleótidos 4764 y 47112, respectivamente.

El plásmido recombinante resultante pJBC12-\DeltaSTI^{E} se introdujo en el derivado LT-negativo EAST1-negativo de la cepa E desde la cepa SM10\lambdapir. Los transconjugantes resistentes al cloramfenicol y la tetraciclina resultantes se sometieron a screening mediante PCR usando oligonucleótidos 4917 con 4794 y R6K-01 con 47113. Se identificaron dos transconjugantes que fueron positivos, indicando que el gen STI se había dirigido correctamente.

Estos transconjugantes resistentes al cloramfenicol se cultivaron después en un medio complementado con sacarosa, seguido por cultivo en placa en agar con 5% sacarosa para obtener la excisión del derivado de pJCB12. Las colonias que crecieron en agar de sacarosa se sometieron a screening usando oligonucleótidos 4764 con 47112 y se identificaron unos cuantos que fueron negativos, así como tres colonias, que mostraron la presencia de la mutación de deleción de STI. Las reacciones de PCR realizadas en los mutantes de deleción de STI usando oligonucleótidos 4738 con 4739 para detectar CS5, 4740 y 4741 para detectar CS6 y 4783 con 4784 para detectar el gen regulador CS5 fueron todas positivas, indicando que estos genes habían sido retenidos en estos mutantes de deleción de STI definidos. Se introdujeron mutaciones de atenuación adicionales en aroC, ompC y ompF como se ha descrito (ref. 32 y ejemplo 4). Véase la Figura 9.

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Ejemplo 4 Eliminación de los genes de toxina e introducción de mutaciones de atenuación en cepas expresando CS2/CS3 (cepa H) y CS4/CS6 (cepa J) Manipulación de la cepa H

La cepa H expresa CS2 y CS3 y las toxinas EAST y ST. También tiene los genes para LT, pero la proteína LT no se ha detectado en los ensayos in vitro. Para facilitar la manipulación genética, el plásmido pACYC-Tc (descrito en el ejemplo 2) se introdujo en la cepa H mediante electrotransformación para conferir resistencia a la tetraciclina.

El gen de toxina EAST1 fue el primero en ser delecionado de la cepa H. La cepa SM10\lambdapir que contiene el plásmido pJBC12-\DeltaEAST1 descrito en el ejemplo 3 fue conjugado con la cepa H y los transconjugantes seleccionados en agar-L, que contenían cloramfenicol y tetraciclina. Las colonias de transconjugantes en las que se dirigió correctamente el gen EAST1 se identificaron mediante PCR usando los oligonucleótidos 4917 y 4753. A continuación, se procesaron los transconjugantes para seleccionar derivados en los que se había excisado el derivado de pJCB12 (descrito anteriormente). Las colonias que crecieron en agar con 5% sacarosa se probaron mediante PCR usando los oligonucleótidos 4775 y 4777 y se identificaron unos cuantos que fueron negativos mediante PCR indicando que se había perdido toda la región EAST1. Estos derivados EAST1-negativos de la cepa H se probaron a continuación en cuanto a la presencia de un activador transcripcional para factores de colonización, rns, mediante PCR usando los oligonucleótidos RNS-03 y RNS-04. Dos de los mutantes EAST1-negativos de la cepa H fueron positivos para rns. La comprobación posterior mediante PCR para CS2 usando los oligonucleótidos 4712 y 4779 y CS3 usando los oligonucleótidos CS3-02 y CS3-03 indicaron que los mutantes eran ambos CS2 y CS3 positivos. La comprobación mediante PCR del locus LT usando los oligonucleótidos LT-04 y LT-05 y para el locus STI usando los oligonucleótidos EST-01 y 4765 mostraron que los mutantes eran negativos para estas toxinas, indicando que se habían perdido los locus ST y LT de forma concomitante con EAST1. La expresión de CS2 y CS3 en los mutantes toxina negativos de la cepa H fue confirmada mediante SDS-PAGE.

A continuación se introdujeron las mutaciones de deleción definidas en los genes aroC, ompC y ompF para atenuar posteriormente el derivado toxina negativo de la cepa H usando un método similar al descrito anteriormente (32). Sin embargo, esta descripción anterior para introducir estas mutaciones utilizaba el vector suicida pCVD442 descrito en el ejemplo 1. Este vector suicida codifica para resistencia a la ampicilina, lo cual no es óptimo para seleccionar un transconjugante infrecuente de una gran población de bacterias mezcladas. Además, en esta etapa, el derivado toxina negativo de la cepa H sigue expresando su propia resistencia a la ampicilina haciendo pCVD442 inútil con esta cepa. Por lo tanto, las mutaciones de deleción \DeltaaroC, \DeltaompC y \DeltaompF anteriormente clonadas en pCVD442 (32) se subclonaron en pJCB12. Para ello, la mutación \DeltaaroC fue subclonada usando los sitios de endonucleasa de restricción XbaI y SacI, \DeltaompC utilizó los sitios SacI y SalI y \DeltaompF utilizó los sitios SacI y SphI. Los derivados de pJCB12 se transformaron después en la cepa SM10\lambdapir.

La mutación \DeltaaroC definida fue la primera en ser introducida en el derivado de toxina de la cepa H, de la cepa SM10\lambdapir. Las colonias de transconjugantes que crecieron en agar-L complementado con cloramfenicol y tetraciclina se sometieron a screening mediante PCR usando los oligonucleótidos 4917 y 4742 para identificar en los que el locus aroC se había dirigido correctamente. Estas colonias de transconjuvantes se vetearon entonces en agar-L fresco complementado con cloramfenicol y tetraciclina. Después de la incubación, las colonias que crecieron fueron probadas en cuanto a la presencia de rns mediante PCR usando los cebadores de oligonucleótidos RNS-03 y RNS-04 y para CS2 usando los cebadores 4712 y 4779. Las reacciones confirmaron que los transconjugantes fueron positivos para estos dos locus. Después se procesaron los transconjugantes para seleccionar los derivados en los que se había excisado el derivado de pJCB12 (como se ha descrito en los ejemplos anteriores). Las colonias que crecieron en agar con 5% sacarosa fueron probadas mediante PCR usando los cebadores de oligonucleótidos 4731 y TT20 para identificar derivados que alojaran la mutación de deleción \DeltaaroC definida. Se identificó un mutante de deleción \DeltaaroC definido y se comprobó de nuevo mediante PCR para confirmar la presencia de rns y CS2, como se ha descrito anteriormente. La expresión de CS2 y CS3 por medio de este mutante de deleción \DeltaaroC definido fue confirmada usando SDS-PAGE y su LPS se comprobó usando SDS-PAGE.

Seguidamente, la mutación de deleción definida ompC fue introducida en este derivado \DeltaaroC toxina negativo de la cepa H mediante conjugación desde la cepa SM10\lambdapir, que aloja pJCB12-\DeltaompC. Las colonias de transconjugantes que crecieron en agar L complementado con cloramfenicol y tetraciclina se sometieron a screening mediante PCR usando los oligonucleótidos 4917 y 4743 para identificar en los que el locus ompC se había dirigido correctamente. A continuación, se procesaron los transconjugantes para seleccionar derivados en los que se hubiese delecionado el derivado de pJCB12 (como se ha descrito anteriormente). Las colonias que crecieron en agar con 5% sacarosa se probaron mediante PCR usando los cebadores de oligonucleótidos 4732 y 4743 para identificar derivados que alojaran la mutación de deleción \DeltaompC definida.

Entonces se introdujo la mutación ompF definida dentro de este derivado \DeltaaroC \DeltaompC toxina negativo de la cepa H de forma similar a la descrita para la mutación ompC anterior, excepto que las colonias de transconjugantes se sometieron a screening mediante PCR usando los oligonucleótidos R6K-01 y 4733 para identificar en los que el locus ompF se había dirigido correctamente. Las colonias que crecieron en agar con 5% sacarosa se probaron mediante PCR usando
los oligonucleótidos 4733 y TT1 para identificar derivados que alojaran la mutación de deleción \DeltaompF definida.

Todas las mutaciones de deleción definidas del derivado \DeltaaroC \DeltaompC \DeltaompF toxina negativo de la cepa H se comprobaron después mediante PCR por comparación con la cepa H de tipo salvaje. Para ello, los oligonucleótidos utilizados para aroC fueron 4731 y TT20, para ompC fueron 4732 y 4743 y para ompF fueron 4733 y TT1. Los productos PCR generados por estas reacciones se utilizaron para las determinaciones de secuencia de nucleótidos a través de las mutaciones de deleción. Los oligonucleótidos utilizados para las reacciones de determinación de la secuencia de nucleótidos fueron TT35, TT38 y TT33 para aroC, ompC y ompF, respectivamente. Todas las mutaciones de deleción tenían la secuencia de nucleótido esperada. El mutante fue comprobado también mediante PCR en cuanto a la presencia de rns y CS2 y la ausencia de locus de toxina, como se ha descrito anteriormente. La presencia del locus CS3 fue confirmada también mediante PCR usando los oligonucleótidos CS3-03 y CS3-06. La expresión de CS2 y CS3 fue confirmada usando SDS-PAGE y se comprobó el LPS usando SDS-PAGE.

El determinante de resistencia a la ampicilina fue eliminado del derivado \DeltaaroC, \DeltaompC, \DeltaompF toxina negativo de la cepa H. Para ello, la cepa derivada fue cultivada a través de tres pasos en caldo L y después las diluciones se cultivaron en placa en agar-L para obtener colonias bien separadas. Las colonias se cultivaron después en placa para réplica en agar-L complementado con ampicilina a 100 \mug/ml. Después de la incubación para permitir el recultivo de las colonias, las placas de agar-L fueron examinadas para identificar las colonias presentes en el agar-L, que no crecieron en el agar-L complementado con ampicilina. Se identificó una colonia de este tipo y se usó en experimentos posteriores.

Finalmente, el plásmido pACYC-Tc que fue introducido en la cepa H para conferir resistencia al cloramfenicol se depuró específicamente desde el derivado \DeltaaroC, \DeltaompC, \DeltaompF toxina negativo de la cepa H. Esto requirió la construcción del plásmido pJCB12-pACYCori. Para ello, el pACYC-Tc origen de la réplica fue amplificado mediante PCR usando los oligonucleótidos 4760 y 4761 y se clonaron en pJCB12 usando los sitios de endonucleasa de restricción SacI y SalI. La cepa SM10\lambdapir que contenía pJCB12-pACYCori fue conjugada con el derivado \DeltaaroC, \DeltaompC, \DeltaompF toxina negativo de la cepa H y se seleccionaron transconjugantes en agar-L, que contenía cloramfenicol. Se esperaba que introduciendo un segundo plásmido que portara la misma réplica pACYC 184 origen y seleccionándolo para su mantenimiento, el primer plásmido pACYC-Tc se haría inestable y en ausencia de cualquier selección de su mantenimiento se perdería más frecuentemente de forma espontánea. Las colonias de transconjugantes resistentes al cloramfenicol que alojaban el derivado de plásmido pJCB12-pACYCori se colocaron en agar-L complementado con tetraciclina y una de estas colonias se determinó que era sensible a la tetraciclina, indicando que se había perdido el plásmido pACYC-Tc. Esta colonia resistente al cloramfenicol, sensible a la tetraciclina se había cultivado en un medio con 5% sacarosa para seleccionar derivados de los que pJCB12-pACYCori se hubiese perdido espontáneamente. Las colonias cultivadas en agar con 5% sacarosa se colocaron en agar-L complementado con cloramfenicol para confirmar que el plásmido pJCB12-pACYCori se había perdido realmente.

Estas manipulaciones se muestran esquemáticamente en la Figura 10.

Manipulación de la cepa J

La cepa J expresa CS4 y CS6 y las toxinas EAST y ST. También tiene los genes para LT, pero la proteína LT no ha sido detectada en los ensayos in vitro. Para facilitar la manipulación genética, el plásmido pACYC-Tc (descrito en el ejemplo 2) fue introducido en la cepa J mediante electrotransformación, confiriendo de este modo resistencia a la tetraciclina.

El gen de toxina EAST1 fue borrado en primer lugar de la cepa J. La cepa SM10\lambdapir que contenía pJCB12-\DeltaEAST1 fue conjugada con la cepa J y los transconjugantes seleccionados en agar L que contenía cloramfenicol y tetraciclina. Las colonias que crecieron se sometieron a screening mediante PCR usando los oligonucleótidos 4917 y 4753 para identificar en los que el gen EAST1 se había dirigido correctamente. Estas colonias de transconjugantes se vetearon después en agar-L fresco complementado con cloramfenicol y tetraciclina y se incubaron para permitir el crecimiento de las colonias. Estas colonias se comprobaron mediante PCR para confirmar la presencia continua del operón CS4 usando los oligonucleótidos 4768 y 4769 y para el operón CS6 usando los oligonucleótidos 4740 y 4781.

Un transconjugante que era positivo para estas dos reacciones PCR fue procesado para seleccionar derivados en los que se había excisado el plásmido derivado de pJCB12 (descrito anteriormente). Las colonias que crecieron en agar con 5% sacarosa fueron probadas mediante PCR usando los oligonucleótidos 4749 y 4752 para identificar mutantes EAST1. Todas las colonias probadas fueron negativas mediante esta reacción PCR indicando que en estos derivados se había perdido toda la región EAST1. Se realizaron otras reacciones PCR para comprobar la presencia continua de los genes CS4 y CS6 como se ha descrito anteriormente y la expresión de CS6 se confirmó mediante SDS-PAGE.

Las reacciones PCR usando los oligonucleótidos LT-04 y LT-05 amplificaron un producto del tamaño esperado para el locus-LT en el derivado EAST1-negativo de la cepa J. Las reacciones de determinación de secuencia de nucleótidos usando estos mismos oligonucleótidos mostraron que este fragmento generado por PCR era realmente del locus LT. Por lo tanto, este locus fue dirigido usando la construcción pJCB12-\DeltaLT-A del mismo modo que se ha descrito en el ejemplo 3. Los derivados LT-negativos en los que se había delecionado todo el locus-LT fueron identificados. Otras reacciones PCR para comprobar la presencia de CS4 usando los oligonucleótidos 4768 y 4769, y CS6 usando los oligonucleótidos 4740 y 4781 confirmaron la presencia continua de estos locus en los derivados LT-negativos. La expresión de CS6 mediante derivados LT-negativos EAST1-negativos de la cepa J fue confirmada mediante SDS-PAGE.

Las reacciones PCR realizadas usando los oligonucleótidos ST-01 y ST-02 indicaron que el ST presente en la cepa J era el codificado mediante el transposón Tn1681 (41). Los derivados LT-negativos EAST1-negativos de la cepa J fueron comprobados mediante PCR usando los oligonucleótidos ST-01 y ST-02 y demostraron ser ST-negativos.

El locus aroC del derivado toxina-negativo de la cepa J fue dirigido usando pJCB12-\DeltaaroC como se ha descrito anteriormente para la cepa H. Se identificaron los transconjugantes correctamente dirigidos. Sin embargo, normalmente, después del cultivo en un medio con 5% sacarosa, todos los derivados generados en un gran número de experimentos fueron identificados como revertientes. Por lo tanto, se realizó una nueva construcción pJCB12-\DeltaaroC que incorporó una deleción menor en el locus aroC. Este fue construido mediante amplificación PCR usando los oligonucleótidos 47116 con 47118 y 47119 con 47117 para generar dos fragmentos de ADN flanqueando la región del gen aroC que debía delecionarse. Luego se fusionaron mediante una reacción PCR de extensión por solapamiento adicional usando oligonucleótidos 47116 con 47117 y el fragmento resultante fue clonado en pJCB12 usando los sitios de endonucleasa de restricción XbaI y SacI. Esta construcción fue denominada pJCB12-\DeltaaroC^{J} y fue electrotransformada en SM10\lambdapir. La secuencia del gen aroC y los sitios de unión de los oligonucleótidos usados para construir esta nueva construcción de deleción se muestran en la Figura 11.

Mientras pJCB12-\DeltaaroC^{J} estaba en construcción, se introdujo la mutación de deleción definida ompC dentro del derivado toxina negativo de la cepa J usando la construcción pJCB12-\DeltaompC y el procedimiento descrito para la cepa H. Se identificó un mutante de deleción definido ompC mediante PCR usando oligonucleótidos 4732 y 4743.

A continuación se introdujo la mutación de deleción aroC definida en este mutante \DeltaompC toxina negativo de la cepa J usando la nueva construcción pJCB12-\DeltaaroC^{J} mediante conjugación de la cepa SM10\lambdapir. Las colonias que crecieron en agar-L complementado con cloramfenicol y tetraciclina se sometieron a screening mediante PCR usando los oligonucleótidos 4917 y 4742 para identificar en los que el gen aroC se había dirigido correctamente. A continuación, se procesaron los transconjugantes para seleccionar derivados en los que el plásmido derivado de pJCB12 se había excisado (descrito anteriormente). Las colonias que se cultivaron en agar con 5% sacarosa se probaron mediante PCR usando los oligonucleótidos 4731 y TT20 para identificar los que tenían incorporada la mutación de deleción aroC^{J} definida.

La mutación de deleción ompF definida se incorporó entonces en un derivado \DeltaompC \DeltaaroC toxina negativo de la cepa J. Esto se realizó exactamente como se ha descrito anteriormente para la cepa H y se identificó un mutante de deleción ompF.

El plásmido pACYC-Tc resistente a la tetraciclina fue depurado entonces específicamente desde el derivado \DeltaompC \DeltaaroC \DeltaompF toxina negativo de la cepa J usando pJCB12-pACYCori y después se eliminó este propio plásmido, de nuevo como se ha descrito anteriormente para la cepa H.

Finalmente, se realizaron las reacciones PCR para confirmar la presencia de CS4 usando oligonucleótidos 4768 con 4769, y CS6 usando los oligonucleótidos 4740 con 4781. De modo similar, se confirmó la presencia del gen regulatorio CFA/IV usando oligonucleótidos 4785 y 4786. Las secuencias de nucleótidos de las mutaciones de deleción aroC, ompC y ompF definidas se determinaron como se ha descrito para la cepa H y fueron como se esperaba. La ausencia de los locus EAST1, LT y ST fue confirmada de nuevo mediante PCR como se ha descrito anteriormente, la expresión de CS6 fue confirmada mediante SDS-PAGE y el LPS fue comprobado también usando SDS-PAGE.

En la Figura 12 se muestra un diagrama que presenta todos los pasos implicados en estas manipulaciones.

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Ejemplo 5 Aumento de la estabilidad de los plásmidos CFA manipulados

En este ejemplo se describe a modo de ilustración, un sistema para estabilizar un plásmido CFA. El locus parDE se utilizó como la mitad de estabilización.

Para obtener un derivado de una cepa ETEC que no codifique para ST, pero siga expresando sus genes CFA se ha construido el derivado pJCB12-\DeltaSTI, donde el locus parDE está flanqueado por regiones homólogas a las regiones que flanquean el gen ST en el plásmido que debe ser dirigido. La introducción de este plásmido dentro de una cepa receptora y la selección en cloramfenicol dará como resultado ahora transconjugantes en los que están presentes ambos locus en el plásmido CFA. El locus parDE funcional asegurará ahora que este plásmido se mantiene en estas células. El cultivo en sacarosa para identificar derivados en los que se ha perdido el componente pJCB12 seleccionará ahora intensamente células que contengan un plásmido recombinante en el que se ha producido el cruce deseado (es decir, la sustitución del gen estructural ST por el locus parDE). Las células en las que se ha producido un evento de reversión o en las que se ha perdido todo el plásmido serán aniquiladas por la acción de la toxina. La incorporación del locus parDE funcionará también como estabilización de la herencia del plásmido CFA durante las rondas de mutación posteriores, por ejemplo, la introducción de mutaciones de atenuación adicional, como en los genes aroC, ompC y ompF.

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Los oligonucleótidos 4789 y 4790 se utilizan para amplificar el locus parDE del plásmido RP4. El producto PCR purificado se clona entonces en pJCB12-\DeltaSTI usando los sitios de enzimas de restricción XhoI para proporcionar plásmido pJCB12-\DeltaSTI::parDE. Este plásmido se introduce ahora en una cepa receptora mediante conjugación de SM10\lambdapir o electrotransformación con ADN de plásmido purificado y los intermedios y derivados requeridos aislados por métodos descritos detalladamente en los ejemplos anteriores.

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Ejemplo 6 Expresión de LT-B en una cepa ETEC atenuada, PTL003, para inducir una respuesta inmune protectora contra LT Objetivo

El objetivo de este trabajo era expresar la subunidad B de la toxina lábil al calor Escherichia coli en una cepa de vacuna de ETEC. El gen LTB se derivó de la cepa WS2773-E (NAMRU3, El Cairo, Egipto) pero podría derivarse de cualquier cepa que codifique LTB. De modo similar, el enfoque podría extenderse para incluir mutantes de LT-A, LT-B fusionados con otras proteínas (por ejemplo, ST) o para la expresión de CT-B o derivados de él. Las construcciones de plásmido iniciales fueron diseñadas para demostrar que LT-B podía expresarse en una cepa de vacuna ETEC en ausencia de LT-A y podía exportarse y ensamblarse correctamente. Las construcciones posteriores usaban el promotor LT nativo para promover la expresión. En última instancia, podía insertarse una construcción similar dentro del cromosoma de ETEC para crear una cepa estable sin necesidad de selección de antibiótico.

Métodos

Sección 1

Amplificación de PCR de LTB CDS (secuencia de codificación de proteína) Cebadores

Las secuencias de Genbank se utilizaron para diseñar cebadores PCR apropiados (Tabla 1). El cebador adelante (Bfor) fue diseñado para amplificar desde el codón inicial del gen LTB y se basó en la secuencia de Genbank M17874 (17). Para facilitar la clonación en vectores de expresión, se incluyó un sitio de restricción BglII iniciando 8 bases cebador 5' del codón de inicio ATG. El cebador inverso (Brev) fue diseñado para amplificar desde 200 bases downstream del codón de parada, de forma que cualesquiera terminadores de transcripción se incluirían en el producto PCR y se basó en la secuencia de Genbank AF 190919 (26). Se incluyó un sitio de restricción NheI en el cebador para facilitar la clonación en vectores de expresión.

Plantilla

El ADN de plásmido fue aislado de la cepa WS2773-E (NAMRU3, El Cairo, Egipto) para su uso como plantilla.

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Resultados

Se sintetizó y aisló un producto PCR 600 bp de un gel de 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 13).

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Sección 2

Clonación del producto LTB PCR Clonación en pPCR-Script Amp SK+

El producto PCR aislado de gel se ligó en pPCR-ScriptAmp SK+^{TM} (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones en el manual de instrucciones del fabricante (nº 211188). Se utilizó 2 \mul de mix de ligación para transformar las células supercompetentes de E. coli XL10-Gold^{TM} (Stratagene nº 230350) y se identificaron construcciones correctas mediante digestión de ADN de plásmido purificado con PvuII. Se diseñó una construcción correcta pPCRLTB. El gen LTB fue totalmente secuenciado (Fig. 14) y se comparó con la secuencia de Genbank M17874 (17). Se encontraron cuatro cambios básicos que resultaron en dos cambios de aminoácidos. El PCR se repitió y se secuenció un segundo clon y proporcionó resultados idénticos, mostrando que la secuencia LT-B en la cepa WS2773-E difería de la secuencia de la base de datos.

Clonación en un vector de expresión inducible

El gen LTB se transfirió en el vector de expresión pNCAT4 (Fig. 15). pNCAT4 es un vector de expresión diseñado para el uso en Salmonellas typhi y typhimurium. El vector fue originalmente derivado de pTETnir15 (3), pero había sido modificado mediante sustitución del gen TetC por medio del gen de catalasa H. pylori y sustitución del gen de resistencia a la ampicilina bla por un gen de resistencia a la canamicina. En este plásmido, el gen de catalasa se encuentra bajo control del promotor nirB que está favorecido en condiciones anaerobias. Para el propósito de la presente invención, muchos plásmidos de expresión alternativos que son bien conocidos en la técnica podrían ser sustituidos por pNCAT4 o pTETnir15.

El plásmido pYCRLTB fue digerido con enzimas de restricción BglII y NhcI y se aisló un fragmento de 600 bp, que contenía el gen LTB de un gel de 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido pNCAT4 fue digerido con enzimas de restricción BglII y NheI y se aisló un fragmento de vector 2.6 kb de un gel de 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El vector fue ligado al gen LTB (25) y la mezcla de ligación se utilizó para transformar las células supercompetentes E. coli XL10-Gold^{TM} (Stratagene nº 230350). Se identificaron clones correctos mediante análisis de enzimas de restricción y se usó uno (pNLTB diseñado) para transformar ETEC-PTL003 electrocompetente.

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Sección 3

Expresión y localización de LTB en ETEC-PTL003 Preparación de muestras

Se realizaron cultivos de PTL003 y PTL003-pNLTB de un día para otro en medio LB con antibióticos apropiados. Se diluyeron muestras (1 ml) en 100 ml de medio y se cultivaron agitando durante \sim 3 h. Los frascos se transfirieron a un incubador estático y el cultivo continuó durante otras 1,5 h.

Las bacterias se fraccionaron en componentes periplásmicos y esferoplastos por el método siguiente: las células se cosecharon mediante centrifugado durante 5 min. a 10 400 x g. El pellet de células fue resuspendido en 5 ml de 200 mM Tris HCl, pH 8.0 y se transfirió a un vaso para análisis de vidrio de 50 ml, que contiene una barra imantada. A esto se añadió 5 ml de tampón TES (200 mM Tris HCl, Ph 8.0, 1 mM Na_{2}EDTA, 1 M sacarosa). La agitación se realizó en movimiento y se puso en marcha un temporizador. Con t = 90 s, se añadió 1 mg de lisocima (solución 10 mg/ml) y con t = 135 s, se añadieron 10 ml de agua; la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante otros 30 min. La formación de esferoplasto se comprobó con un microscopio óptico y, si estaba completo, el preparado se centrifugó durante 20 min. a 47 500 x g a 20ºC. El supernadante que contenía las proteínas periplásmicas se cosechó y se concentró \sim dos veces en un concentrador centrífugo Centricon Macrosep^{TM} (3.000 NMWL, Millipore). El pellet que contenía las proteínas de esferoplasto (citoplásmico y unido a la membrana) se resuspendió en PBS. Las muestras de fracciones de células se mezclaron con cantidades iguales de tampón de muestra Tris-glicina SDS-PAGE (Invitrogen LC267) conteniendo 0,1 M de ditiotreitol. Una parte de la muestra periplásmica se calentó a 95ºC durante 5 min., el resto se mantuvo a temperatura ambiente.

Análisis de muestras

Las muestras se separaron mediante electroforesis en geles 18% Tris-glicina (Invitrogen EC6505) y se transfirieron en membranas de nitrocelulosa, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el Xcell II Blot Module^{TM} (Invitrogen EI9051). Los blots se incubaron del modo siguiente:

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Los resultados de los Western blots se presentaron en la Figura 16. Los monómeros LTB se detectaron tanto en las fracciones hervidas esferoplásticas como periplásmicas. En las muestras periplásmicas conservadas a temperatura ambiente se detectaron pentámeros LTB indicando que el LTB podía transportarse a través de la membrana de la célula y ensamblarse de forma normal.

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Sección 4

Amplificación PCR del promotor LTB Cebadores

Los cebadores PCR se diseñaron en base a datos de secuencia preliminares de la región ascendente del gen LTA de WS2773-E (Figura 7). El cebador adelante (Pfor) apareó \sim 200 bp upstream del gen LTA. Se incluyó un sitio de restricción KpnI en el cebador para facilitar la clonación en vectores de expresión. El cebador inverso (Prev) apareó justo upstream del codón inicial del gen LTA y fue diseñado para introducir el sitio de restricción BglII para permitir el posicionamiento correcto del fragmento de promotor con respecto al gen LTB.

Plantilla

Se aisló ADN de plásmido de la cepa WS2773-E (NAMRU3, El Cairo, Egipto) para usar como una plantilla.

Reacción

Las condiciones de reacción fueron como se describe para el gen LTD en la sección 1.

Resultados

Un producto PCR 200 bp fue sintetizado y aislado de un gel 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante (Figura 17).

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Sección 5

Clonación del promotor LT Clonación en el pPCR-Script Amp SK+

El producto PCR aislado fue ligado en pPCR-Script Amp SK+^{TM} (Stratagene) según las instrucciones del manual de instrucciones del fabricante (nº 211188). Se usó 2 \mul de mezcla de ligación para transformar las células supercompetentes E. coli XL10-Gold^{TM} (Stratagene nº 230350) y se identificaron construcciones correctas mediante digestión de ADN de plásmido purificado con PvuII. Se designó una construcción correcta pPCRProm. La secuencia de esta construcción se describe en la Figura 18.

Clonación en un vector de expresión LTB

El plásmido pPCRProm fue digerido con KpnI y BglII y el fragmento de promotor de 200 bp fue aislado de un gel de 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El promotor nirB de pNLTB fue excisado mediante digestión con Kpln y BglII (Figura 15) y el fragmento de vector 3,7 kb restante fue aislado de un gel 1% agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El vector fue ligado al fragmento de promotor LT (Sambrook et al., 1989, ref. 13) y la mezcla de ligación se utilizó para transformar las células supercompetentes E. coli XL10-Gold^{TM} (Stratagene nº 230350). Se identificaron los clones correctos mediante análisis de enzimas de restricción de ADN de plásmido purificado y se utilizó uno (designado pLLTB) para transformar ETEC-PTL003 electrocompetente.

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Sección 6

Expresión de LTB bajo el control del promotor LT Preparación de muestras

Se realizaron cultivos de PTL003 y PTL003-pLLTB de un día para otro en medio LB con antibióticos apropiados. La absorbancia de 600 mm se utilizó para determinar la concentración de células en los cultivos. Las alícuotas conteniendo 5 x 10^{7} células se concentraron mediante centrifugación y los pellets se resuspendieron en 10 \mul de tampón de muestra Tris-glicina SDS-PAGE (Invitrogen LC267) conteniendo 0,1 M de ditiotreitol.

Análisis de muestras

Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE (16) y Western blotting exactamente como se describe en la Sección 3.

Los resultados se presentaron en la Figura 19. LTB se expresó en PTL003 bajo el control del promotor LTAB.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2

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Referencias

1. Burkardt, H.J., G. Riess, and A. Puhler, Relationship of group P1 plasmids revealed by heteroduplex experiments: RP1, RP4, R68 and RK2 are identical. J Gen Microbiol, 1979. 114(2): p. 341-8.

2. Chatfield, S.N., et al., Role of ompR-dependent genes in Salmonella typhimurium virulence: mutants deficient in both ompC and ompF are attenuated in vivo. Infect Immun, 1991. 59(1): p. 449-52.

3. Chatfield, S.N., et al., Use of the nirB promoter to direct the stable expression of heterologous antigens in Salmonella oral vaccine strains: development of a single-dose oral tetanus vaccine. Biotechnology (N Y), 1992. 10(8): p. 888-92.

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Claims

```
\global\parskip0.970000\baselineskip
```
1. Una célula bacteriana viva que expresa el antígeno del factor de colonización CFA/I de un plásmido nativo pero no expresa toxina estable al calor (ST) debido a la deleción de todo o parte del gen ST del plásmido y no expresa toxina lábil al calor (LT), en la que la bacteria está atenuada mediante la deleción o inactivación de uno o más de aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, surA, rfaY, dksA, hupA, sipC y clpB.
2. Una célula bacteriana viva que expresa el antígeno del factor de colonización CS5 de un plásmido nativo pero no expresa toxina estable al calor (ST) debido a la deleción de todo o parte del gen ST del plásmido y no expresa toxina lábil al calor (LT), en la que la bacteria está atenuada mediante la deleción o inactivación de uno o más de aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, surA, rfaY, dksA, hupA, sipC y clpB.
3. Una célula de acuerdo con la reivindicación 2, que expresa el antígeno del factor de colonización CS6 de un plásmido nativo.
4. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es una célula de Escherichia coli.
5. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que:

(a)

el plásmido es un plásmido de E. coli enterotoxigénico en el que se ha delecionado el gen ST;

(b)

la célula puede obtenerse mediante un método que comprende deleción de todo o parte del gen ST con un vector suicida;

(c)

la célula no expresa EAST1;

(d)

la célula no expresa un gen de resistencia a antibióticos; y/o

(e)

la célula puede obtenerse mediante un método que comprende deleción o inactivación dirigida del gen LT.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
6. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que puede obtenerse mediante un método que comprende producir una mutación en el gen LT que hace al producto génico no tóxico.
7. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el plásmido contiene un elemento que mejora su estabilidad.
8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, en la que:

(a)

dicho elemento es un elemento toxina-antitoxina o un elemento de reconocimiento de recombinasa; o

(b)

el elemento de estabilidad es parDE o crs.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
9. Una célula de Escherichia coli depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de referencia 01090303, número 01090304, número 01090305, número 01090306, número 02082964, número 02082966, número 02082967 o número 02082968; o un descendiente de dicha célula.
10. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está atenuada mediante deleción o inactivación de:

(a)

al menos un gen aro y al menos un gen omp;

(b)

al menos un gen aro y el gen htrA; o

(c)

cada uno de aroC, ompF y ompC.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
11. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que expresa un antígeno heterólogo.
12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el antígeno heterólogo es un antígeno de E. coli.
13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el antígeno heterólogo es:

(a)

un antígeno del factor de colonización de E. coli (CFA); o

(b)

un componente no tóxico o forma de LT.
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el componente no tóxico de LT es la subunidad B.
15. Un plásmido de E. coli enterotoxigénico nativo, en el que todo o parte del gen que codifica la toxina ST se ha delecionado y que codifica:

-

el antígeno del factor de colonización CFA/I; o

-

el antígeno del factor de colonización CS5 y/o el antígeno del factor de colonización CS6.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
16. Una vacuna contra la diarrea que comprende una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
17. Una vacuna contra la diarrea que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 1 y una célula de acuerdo con la reivindicación 2, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
18. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, que comprende además una célula que expresa el antígeno del factor de colonización CFA/II.
19. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, 17 ó 18, que comprende:

(i)

una célula que expresa CFA/I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 14;

(ii)

una célula que expresa CS5 y CS6 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14;

(iii)

una célula que expresa CS4 y CS6;

(iv)

una célula que expresa CS2 y CS3; y

(v)

una célula que expresa CS1 y CS3.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
20. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, en la que:

(i)

la célula que expresa CFA/I es la depositada en la ECACC con el número de referencia 01090303 ó 02082967, o un descendiente de la misma;

(ii)

la célula que expresa CS5 y CS6 es la depositada en la ECACC con el número de referencia 01090305 ó 02082968, o un descendiente de la misma;

(iii)

la célula que expresa CS4 y CS6 es la depositada en la ECACC con el número de referencia 01090306 ó 02082966, o un descendiente de la misma;

(iv)

la célula que expresa CS2 y CS3 es la depositada en la ECACC con el número de referencia 01090304 ó 02082964, o un descendiente de la misma; y

(v)

la célula que expresa CS1 y CS3 es la depositada en la ECACC con el número de referencia 01090302 ó 02082965, o un descendiente de la misma.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
21. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 para uso en un método de vacunación contra la diarrea.
22. Uso de una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una combinación de células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 para la fabricación de un medicamento para la vacunación contra la diarrea.
23. Un vector suicida con un tamaño inferior a 5 y que comprende la región sacB que codifica un producto que es tóxico para las bacterias cuando se cultiva en sacarosa, región en la que la secuencia de inserción IS1 se ha delecionado o inactivado.
24. Un vector de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende además:

(a)

un origen de transferencia que dirige la transferencia conjugativa del vector de una cepa bacteriana a otra;

(b)

un origen de replicación.

(c)

un marcador seleccionable; y/o

(d)

un sitio de clonación que comprende al menos un sitio de enzima de restricción único en el vector.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
25. Un vector de acuerdo con la reivindicación 24, en el que:

(a)

el origen de transferencia es mobRP4;

(b)

el origen de replicación es oriR6K que requiere el gen pir para la replicación;

(c)

el marcador seleccionable es el gen cat que codifica cloramfenicol acetiltransferasa y otorga resistencia a cloramfenicol; y/o

(d)

el vector comprende la secuencia de un gen objetivo en el sitio de clonación.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
26. A vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 que tiene aproximadamente 3 kb de tamaño.
27. Un vector de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además la secuencia de un gen objetivo en el sitio de clonación, en el que el gen objetivo es un gen de toxina de E. coli de tipo salvaje o inactivado.
28. Un vector de acuerdo con la reivindicación 27, que contiene un gen ST de tipo salvaje o inactivado en el sitio de clonación.
29. Un método para producir una célula bacteriana en la que se ha delecionado, inactivado o sustituido un gen objetivo, método que comprende transferir

(a)

un vector de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además la secuencia de un gen objetivo en el sitio de clonación; o

(b)

un vector de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28; en una célula bacteriana que contiene el gen objetivo y que selecciona una célula en la que el gen objetivo se ha delecionado, inactivado o sustituido.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
30. Un método de acuerdo con la reivindicación 29, que comprende:

(a)

realizar una PCR para seleccionar una célula en la que el vector se ha dirigido correctamente al gen objetivo, en el que uno de los cebadores usados en la PCR hibrida con la secuencia del vector adyacente al sitio de clonación y el otro hibrida con un sitio en el ADN celular adyacente al gen objetivo, y en el que una PCR positiva indica que el vector se ha dirigido al gen objetivo; y/o

(b)

seleccionar una célula, a partir de la cual se ha extraído el vector cultivando la célula en medio suplementado con sacarosa en el que está ausente NaCl.