DE60207277T2 - Bakterieller impfstoff - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft bakterielle Zellen, die für Vakzine geeignet sind, insbesondere für Vakzine gegen Diarrhöe.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Im Allgemeinen ist der Zweck einer Vakzine, eine Immunantwort beim Empfänger zu induzieren, und dadurch einen Schutz gegen eine folgende Infektion durch ein Pathogen herzustellen. Dies kann durch die Impfung mit einem lebenden, abgeschwächten Stamm des Pathogens erreicht werden, d. h. mit einem Stamm, der eine verringerte Virulenz aufweist, so dass er die von dem virulenten Pathogen verursachte Krankheit nicht verursacht, aber dennoch eine breite Immunantwort stimuliert. Enterotoxigene E. coli-(ETEC)-Stämme sind die Hauptursache für die Reisediarrhöe und die Kindersterblichkeit in endemischen Gebieten. Die Virulenz steht in Verbindung mit der Expression fimbrialer Kolonisationsfaktorantigene (CFAs), die die Adhäsion im Intestinaltrakt vermitteln und durch die Absonderung von Toxinen (hitzestabilem Toxin (ST), hitzelabilem Toxin (LT) und EAST-Toxin), die für den Verlust der Fluidcharakteristik der Krankheit verantwortlich sind. Schutz gegen ETEC-Krankheiten ist verbunden mit der antikörpervermittelten Neutralisierung der Toxine und mit der humoralen Immunantwort gegen die CFAs.
  • WO 99/40926 betrifft ein durch eine nicht revertierende Mutation abgeschwächtes Bakterium in jedem der aroC-, ompF- und der ompC-Gene, die in einer Vakzine nützlich sein können.
  • Kurzdarstellung der Erfindung
  • Es gibt verschiedene Arten von CFAs, die mit virulenten ETEC-Stämmen verbunden sind, wobei jedoch CFA/I, CFA/II und CFA/IV die Haupttypen sind, verbunden mit etwa 70% klinischen Isolaten. CFA/I ist ein einfaches fimbriales Antigen, während CFA/II und CFA/IV jeweils Komplexe sind, die aus zwei verschiedenen Arten von Coli-Oberflächen-(CS)-Antigenen bestehen. CFA/II besteht aus CS3, entweder mit CS1 oder CS2. CFA/IV besteht aus CS6, entweder mit CS4 oder CS5.
  • Die CFA-Expression in Wildtyp-ETEC scheint beschränkt zu sein, so dass native ETEC-Stämme nur einen Typ von CFA und maximal zwei Typen von CS-Antigenen exprimieren. Daher exprimieren native CFA/II-ETEC-Zellen im Allgemeinen entweder CS1/CS3 oder CS2/CS3. Entsprechend exprimieren native CFA/IV-ETEC-Zellen im Allgemeinen entweder CS4/CS6 oder CS5/CS6. CS1 und CS2 wurden nicht in dem gleichen Wildtyp-Stamm (34) gefunden und ebenso werden CS4 und CS5 in natürlich auftretenden Stämmen niemals gemeinsam exprimiert (WO92/01703, (34)).
  • Eine wirksame Vakzine gegen ETEC muss mindestens gegen CFA/I-CFA/II- und CFA/IV-Stämme immunisieren. Daher erforderten ETEC-Vakzine traditionell mindestens 5 Bakterienstämme – ein Stamm, der CFA/I exprimiert, ein Stamm, der CS1/CS3 exprimiert, ein Stamm, der CS2/CS3 exprimiert, ein Stamm, der CS4/CS6 exprimiert und ein Stamm, der CS5/CS6 exprimiert. Die betreffenden Erfinder haben nun ein Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle erdacht, die in ihrer CS-Antigen-Expression nicht so beschränkt ist. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine bakterielle Zelle bereit, die drei oder mehr Coli-Oberflächen-(CS)-Antigene exprimiert. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Erzeugung einer solchen Zelle bereit, das die Einführung eines Polynukleotids, das ein heterologes CS-Antigen codiert, in eine bakterielle Zelle umfasst.
  • Eine bakterielle Zelle gemäß der Erfindung kann verwendet werden, um eine Vakzine gegen die ETEC-Krankheit herzustellen. Daher stellt die Erfindung eine Vakzine gegen Diarrhöe bereit, die eine Zelle der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst. Da die vorliegende Zelle die vorher vorhandenen Beschränkungen bei der zellulären CS-Antigen-Expression vermeidet, stellt die Erfindung zum ersten Mal eine Vakzine gegen Diarrhöe bereit, die bakterielle Zellen umfasst, die zusammen alle von DFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 exprimieren, wobei die Vakzine weniger als fünf Bakterienstämme umfasst. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Impfen eines Säugers gegen Diarrhöe bereit, das die Verabreichung eine Zelle oder Vakzine der Erfindung an den Säuger umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A Struktur des CS4-Operons.
  • 1B Chromosomenkarte des Plasmids pACYC184.
  • 1C Chromosomenkarte des Plasmids pACYC-csaA.
  • 1D Chromosomenkarte des Plasmids pACYC-CS4.
  • 2A SDS PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in den Stämmen WS-2252A, ACAM2006, ACAM2006-pCS4 und Stamm K-pCS4. Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
  • 2B SDS-PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in den Stämmen WS-2252A, ACAM2006, ACRM2006-pCS4 und Stamm K-pCS4, unter Verwendung von Western Blotting.
  • 2C SDS-PAGE-Analyse der Wirkung von Gallensalzen auf die CS-Antigen-Expression in den Stämmen ACAM2006, ACAM2009 und ACAM2006-pCS4. Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
  • 2D SDS PAGE-Analyse der Wirkung von Gallensalzen auf die CS-Antigen-Expression in den Stämmen ACAM2006, ACAM2009 und ACAM2006-pCS4, unter Verwendung von Western Blotting.
  • 2E SDS PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in Abwesenheit von Gallensalzen im Stamm ACAM2006-pCS4, transformiert mit pGEM-rns. Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
  • 3A Schritte 1 bis 5 bei der Konstruktion von pJCB12-ompC-CS4-ompC, und Merkmale der verwendeten Primere.
  • 3B Merkmale der bei der Konstruktion von pJCB12-ompC-CS4-ompC verwendeten Primere. Vorwärts-Primere sind in Größe 5' bis 3' fettgedruckt dargestellt. Rückwärts-Primere sind in Größe 3' bis 5' in normalem Font dargestellt. Restriktionsorte sind eingerahmt dargestellt. Weitere Nukleotide für die Einführung einer ergänzenden Sequenz für die Overlap-Extension-PCR sind unterstrichen dargestellt.
  • 4 SDS-PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in den Stämmen ACAM2006 und ACAM2006-CS4, die die Wirkungen der Gallensalze zeigt.
    • (A) Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen)
    • (B) Western Blot.
  • 5A Struktur des CS1-Operons.
  • 5B Chromosomenkarte des Plasmids pACYC-CS1.
  • 6 SDS-PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in den Stämmen PTL003, ACAM2007 und ACAM2007-pCS1 unter Verwendung von Western Blotting.
  • 7A Struktur des CS5-Operons.
  • 7B Konstruktion des Plasmids pACYC-Xmal.
  • 7C Struktur des Plasmids pACYC-CS5.
  • 8A SDS PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in Gegenwart von Gallensalzen in den Stämmen ACAM2009 und ACAM2009-pCS5, unter Verwendung von Western Blotting.
  • 8B SDS PAGE-Analyse der Wirkung von Gallensalzen auf die CS-Antigen-Expression in den Stämmen ACAM2006, ACAM2009 und ACAM2009-pCS5, unter Verwendung von Western Blotting.
  • 9 SDS-PAGE-Analyse der CS-Antigen-Expression in den Stämmen ACAM2009, PTL003 und PTL003-pCS4. Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen).
  • 10 SDS-PAGE-Analyse der CFA/I- und CS-Antigen-Expression in den Stämmen WS2252A, ACAM2010 und ACAM2010-pCS4:
    • (A) Färbung erfolgt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen)
    • (B) Western Blot.
  • 11 Chromosomenkarte des Suizid-Vektor-Plasmids pDM4. u = unbekannte Sequenz, unbekannte Länge.
  • 12 Chromosomenkarte des Suizid-Vektor-Plasmid pJCB12.
  • 13 Diagramm des Verfahrens, verwendet zur Erzeugung spezifischer Gendeletionskonstrukte durch Overlap-Extension-PCR. Schritt 1 = PCR-Amplifikation von zwei DNA-Fragmenten. Schritt 2 = Overlap-Extension-PCR unter Verwendung von DNA-Produkten aus Reaktion 1 und Reaktion 2 aus Schritt 1 und Amplifikation des Overlap-PCR-Produkts. R und S stehen für die Restriktionsorte der Enzyme.
  • 14 Diagramm des Verfahrens, das verwendet wurde, um die korrekte Integration von Suizid-Vektor in targetierten Genorten durch Kopplungs-PCR zu demonstrieren.
  • Kurze Beschreibung der Sequenzen
  • SEQ-ID-NR. 1 ist eine Nukleotidsequenz, die cooA des CS1-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer M58550.
  • SEQ-ID-NR. 2 ist eine Nukleotidsequenz, die cooB des CS1-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer X62495.
  • SEQ-ID-NR. 3 ist eine Nukleotidsequenz, die cooC und cooD des CS1-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer X76908.
  • SEQ-ID-NR. 4 ist eine Nukleotidsequenz, die cfaD codiert, gemäß Genbank-Akzessionsnummer M55609.
  • SEQ-ID-NR. 5 ist eine Nukleotidsequenz, die cotB, cotA, cotC und cotD des CS2-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer Z47800.
  • SEQ-ID-NR. 6 ist eine Nukleotidsequenz, die rns codiert, gemäß Genbank-Akzessionsnummer J04166.
  • SEQ-ID-NR. 7 ist eine Nukleotidsequenz des CS3-Operons gemäß GenBank-Akzessionsnummer X16944.
  • SEQ-ID-NR. 8 ist eine Nukleotidsequenz, die csaA, csaB, csaC, csaE und IS1 des CS4-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer AF296132.
  • SEQ-ID-NR. 9 ist eine Nukleotidsequenz, die csfA, csfB, csfC, csfE, csfF und csfD des CS5-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer AJ224079.
  • SEQ-ID-NR. 10 ist eine Nukleotidsequenz, die csvR codiert, gemäß Genbank-Akzessionsnummer X60106.
  • SEQ-ID-NR. 11 ist eine Nukleotidsequenz, die cssA, cssB, cssC und cssD des CS6-Operons codiert, gemäß GenBank-Akzessionsnummer U04844.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Eine Zelle der Erfindung kann von jeder bakteriellen Zelle abgeleitet sein, die in der Lage ist, ein ETEC-CS-Antigen auf ihrer Oberfläche zu exprimieren. Im Allgemeinen ist die Zelle von einem Bakterium abgeleitet, das einen Säugetierwirt auf oralem Weg infiziert. Die Zelle kann sich von einem Bakterium ableiten oder deszendieren, das eukaryotische Zellen befällt und in ihnen wächst und/oder Schleimhautoberflächen kolonisiert. Im Allgemeinen ist die Zelle gramnegativ, aber in einigen Ausführungsformen können grampositive Bakterien verwendet werden. Die Bakterie ist im Allgemeinen ein Pathogen.
  • Die verwendete bakterielle Zelle kann von der Gattung Escherichia, Salmonella, Shigella oder Vibrio sein. Vorzugsweise ist die Zelle der Erfindung eine E. coli-Zelle. Die vorliegende Zelle kann aus einem ETEC- oder einem nicht-ETEC-E. coli-Stamm hergestellt werden, der selbst keinerlei ETEC-CS-Antigene exprimiert.
  • Vorzugsweise ist die vorliegende Zelle von einem ETEC-Stamm abgeleitet oder deszendiert, der endogen ein ETEC-CS-Antigen, wie etwa CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 oder CS6 exprimiert. Die vorliegende Zelle kann zum Beispiel aus einem Wildtyp-ETEC-Isolat hergestellt werden. Alternativ kann die vorliegende Zelle aus einem ETEC-Stamm hergestellt werden, der selbst von einem Wildtyp-ETEC-Stamm oder nativen ETEC-Stamm abgeleitet ist. Die vorliegende Zelle kann zum Beispiel aus einem Stamm deszendiert werden, in dem ein spezielles Toxingen oder spezielle Toxingene mutiert oder deletiert wurden, oder der eine weitere abschwächende Mutation umfasst, oder der ein weiteres heterologes Antigen exprimiert, wie nachfolgend beschrieben. Ein Wildtyp-ETEC-Stamm kann aus einer menschlichen klinischen Probe unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden. Ein Beispiel für einen Standard-ETEC-Stamm ist H10407, der im ATCC unter der Katalognummer 35401 hinterlegt ist.
  • Eine Zelle der Erfindung kann zum Beispiel aus einem der ETEC-Stämme ACM2005, ACM2002, ACM2003, ACM2004, ACAM2007, ACAM2008, ACAM 2009 oder ACAM2012 hergestellt werden, die in den Tabellen 1 und 2 aufgelistet sind. Jeder der Stämme wurde bei Acambis Research Limited, Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT, Vereinigtes Königreich bei der Europäischen Sammlung von Zellkulturen (European Collection of Cell Cultures ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Akzessionsnummern für die hinterlegten Stämme sind in den Tabellen angegeben. Die Hinterlegungsnummern 01090302 bis 01090306 wurden am 3. September 2001 hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern 02082964 bis 02082968 wurden am 29. August 2002 hinterlegt. Weitere Informationen über Stammmerkmale sind in Tabelle 1 angegeben.
  • PTL003 (auch als ACM2005 bezeichnet, Hinterlegungsnr. 01090302) (Ref. 4, 31) wurde vom ETEC-Stamm E1392/75-2A (CS1/CS3, ST-negativ, LT-negativ) abgeleitet, durch targetiert abschwächende Deletion von drei weiteren Genen (aroC, ompC und ompF) (Tabelle 1). PTL003 wurde bereits in zwei klinischen Versuchen getestet und hat sich als sicher und immunogen erwiesen.
  • Stämme mit den Hinterlegungsnummern 01090303 bis 01090306 wurden in der UK-Patentanmeldung 0121998.9 beschrieben. Sowohl diese als auch die Stämme mit den Hinterlegungsnummern 02082964 bis 02082968 sind in der internationalen Patentanmeldung beschrieben, die Priorität vor der UK-Patentanmeldung 0121998.9 beansprucht, und von Acambis Research Limited am gleichen Tag eingereicht wurde, wie die vorliegende internationale Anmeldung. Die Inhalte dieser Anmeldung sind hier als Bezugsdokumente beigefügt. Jeder der Stämme wurde durch spezifisches Entfernen der bekannten Toxingene toxin-negativ gemacht.
  • Eine Zelle gemäß der Erfindung kann jede Kombination von ETEC-CS-Antigenen exprimieren, vorausgesetzt dass die Zelle drei oder mehrere ETEC-CS-Antigene exprimiert. Eine große Anzahl der CS-Antigene wurden identifiziert, wobei die vorherrschendsten CS1, CS2, CS3 (die Komponente von CFA/II) und CS4, CS5 und CS6 (die Komponente von CFA/IV) sind. Weitere Antigene beinhalten CS17, CS7, CS9, CS14, CS12, PCFO159, PCFO166. CFA/I (GenBank-Akzessionsnr. M55661) ist jedoch kein CS-Antigen im Sinne dieses Dokuments.
  • Vorzugsweise exprimiert eine Zelle der Erfindung mindestens ein CS-Antigen, selektiert aus ETEC CS1, CS2, CS3, CS4, CS5, CS6. Daher kann in einer Ausführungsform die vorliegende Zelle drei oder mehr CS-Antigene exprimieren, wobei das CS-Antigen aus CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 selektiert wird. Eine derartige Zelle kann drei, vier, fünf oder sechs der aufgelisteten CS-Antigene exprimieren. Eine Zelle kann die CS-Antigene in jeder Kombination exprimieren. Es ist besonders bevorzugt, dass eine Zelle der Erfindung eine die folgenden Kombinationen von Antigenen exprimiert:
    CS1, CS2 und CS3,
    CS4, CS5 und CS6,
    CS4, CS1 und CS3,
    CS1, CS5 und CS6.
  • Daher kann eine Zelle der Erfindung eine Mischung eines CFA-Proteins, zum Beispiel eine Mischung eines CFA/II- und CFA/IV-Proteins, umfassen.
  • Bakterielle Zellen gemäß der Erfindung beinhalten ACAM 2006-pCS4 (CS4, CS5, CS6), ACAM 2006-CS4 (CS4, CS5, CS6), ACAM2012-pCS4 (CS4, CS5, CS6), ACAM2012-CS4 (CS4, CS5, CS6), ACAM 2007-pCS1 (CS1, CS2, CS3), ACAM 2009-pCS5 (CS4, CS5, CS6), PTL003-pCS4 (CS1, CS3, CS4) und ACAM2006-pCS1 (CS1, CS5, CS6).
  • Der Stamm ACAM2012-CS4 wurde als ACAM2013 am 29. August 2002 von Acambis Research Limited, Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT, Vereinigtes Königreich bei der Europäischen Sammlung von Zellkulturen (European Collection of Cell Cultures ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Vereinigtes Königreich, in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt. Der Stamm erhielt die Akzessionsnr. 02082969 (Tabelle 2).
  • Im Allgemeinen exprimiert eine bakterielle Zelle gemäß der Erfindung ein CS-Antigen auf seiner Oberfläche, das typischerweise zu Fimbriae oder Pili assembliert wird. Eine Kandidatenzelle kann auf die Expression eines besonderen ETEC-CS-Antigens durch die im Fachgebiet bekannten Verfahren und die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren getestet werden. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform eine Suspension von Kandidatenzellen erwärmt, um die CS-Antigene zu extrahieren, und zentrifugiert. Der Überstand wird dann isoliert, einer Gel-Elektrophorese unterzogen und durch Western Blotting unter Verwendung antigen-spezifischer Antikörper oder direkte Proteinfärbung analysiert. Typischerweise wird als positive Kontrolle für Vergleichszwecke ein Stamm aufgenommen, der dafür bekannt ist, dass es das besondere Antigens exprimiert. Eine negative Kontrolle kann ebenfalls vorgenommen werden. Geeignete Verfahren sind den Fachleuten bekannt. Vorzugsweise ist ein Expressionslevel eines CS-Antigens in einer Zelle der Erfindung bei der Induzierung einer Immunantwort in einem Wirt wirksam, dem die Zelle verabreicht wurde, d. h. als eine Komponente einer immunogenen Zusammensetzung wie etwa einer Vakzine.
  • Typischerweise wird in einem Wildtyp-ETEC-Stamm ein CS-Antigen eines Operons von Genen exprimiert. Gewöhnlich beinhaltet ein Operon Gene für ein oder zwei strukturelle Proteine, ein Chaperon- und ein Usher-Protein. Die Chaperon- und Usher-Proteine erleichtern im Allgemeinen den Transport des Strukturproteins an die Oberfläche des Bakteriums für die Assemblierung zu Fimbriae. Ein Operon kann auf einem bakteriellen Chromosom (wie im Falle von CS4 und CS2 in einigen Stämmen) oder auf einem Plasmid mit niedriger Kopienzahl (wie im Falle von CS1, CS3, CS5 und CS6) untergebracht sein. Zusätzlich ist jedes Operon mit einem Regulatorgen verbunden, dessen Produkt die Expression der Operongene kontrolliert. Das Regulatorgen kann jedoch in einem gewissen Abstand vom Operon selbst untergebracht sein.
  • Das CS1-Operon (27) wird in 5A dargestellt und besteht aus vier Genen cooB, cooA, cooC und cooD (GenBank M58550, X62495 und X76908). Das Hauptpilinprotein ist durch cooA, mit cooC und cooD codiert, wodurch Transportfunktionen codiert werden. cooB ist für die Assemblierung erforderlich. Die Expression des Operongens wird durch ein weiteres Gen cfaD (GenBank M55609) reguliert.
  • Das CS2-Operon (17) besteht aus vier Genen, cotA, cotB, cotC, cotD (GenBank Z47800), wobei cotA das Hauptpilinprotein codiert. Die Transportfunktionen werden durch cotC und cotD codiert. Die Expression dieser Gene wird durch ein anderes separates Gen, rns (GenBank J04166), reguliert.
  • Die Sequenz des CS3-Operons (20) findet sich in der GenBank unter X16944. Das Operon beinhaltet cstA, das ein Chaperon-Protein codiert, cstB, das ein Protein mit einer Usher-Funktion codiert und cstH, das ein Strukturprotein codiert.
  • Die Struktur des CS4-Operons, das aus vier Genen csaA, csaB, csaC, csaE (Genbank AF296132) besteht, wird in 1A gezeigt. csaA codiert ein Chaperon, csaB codiert ein Hauptuntereinheitprotein, csaC codiert ein Usher-Protein und csaE codiert ein fimbriales Tip-Protein. Die Expression des CS4-Gens wird durch das cfaD-Gen (GenBank M55609) reguliert.
  • Das CS5-Operon (15) (Genbank AJ 224079) besteht aus sechs Genen, csfA, csfB, csfC, csfE, csfF und csfD. csfA codiert ein Hauptstrukturprotein, csfC codiert ein Transportprotein und csfD codiert ein Nebenstrukturprotein. Das Operon wird in 7A dargestellt. Die Regulierung der CS5-Operongene hängt von der Gegenwart von Gallensalzen ab. Die involvierten Gene können csvR (GenBank X60106) sein.
  • Die Sequenz des CS6-Operons (33, 35) ist in der GenBank unter der Nr. U04844 erhältlich. Das Operon beinhaltet die cssA- und cssB-Gene, die Strukturproteine und die cssC- und cssD-Gene codieren, die Transportproteine transportieren.
  • Die Sequenzen der oben genannten Operone und Gene, die oben durch ihre GenBank-Akzessionsnummer spezifiziert wurden, werden auch im vorliegenden Sequenzprotokoll vorgelegt, wie im Abschnitt „Kurze Beschreibung der Sequenzen" beschrieben.
  • Typischerweise exprimiert eine Zelle der Erfindung ausreichend Gene, einschließlich Struktur-, Transport- und Regulatorgene, um die Expression eines gegebenen ETEC-CS-Antigens auf den bakteriellen Oberflächen zu ermöglichen. Gewöhnlich wird das Antigen auf der Oberfläche Fimbriae oder Pili assembliert. Daher exprimiert die vorliegende Zelle für ein gegebenes CS-Antigen ein Strukturgen oder -gene und, wenn nötig, ein oder mehrere Gene, deren Produkte zum korrekten Transport zur und der Assemblierung auf der bakteriellen Oberfläche des Strukturproteins beitragen.
  • Jedes der oben genannten Gene, egal ob Struktur-, Transport- oder Regulatorgen kann für die vorliegende Erfindung nützlich sein. In einer Ausführungsform kann ein antigenes Struktur-, Transport- oder Regulatorprotein, das durch eine Zelle der Erfindung exprimiert ist, codiert werden durch:
    • (i) ein DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz eines Gens umfasst, das vorstehend durch die GenBank-Akzessionsnummer spezifiziert wurde oder im vorliegenden Sequenzprotokoll enthalten ist;
    • (ii) ein DNA-Molekül, das zum Komplement der Nukleotidsequenz in (a) hybridisiert; oder
    • (iii) ein DNA-Molekül, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das DNA-Molekül von (a) oder (b) codiert, das aber eine degenerierte Form des DNA-Moleküls von (a) oder (b) ist.
  • Ein Homolog der Polynukleotidsequenz von (a) kann in der Erfindung verwendet werden. Typischerweise hat ein Homolog mindest eine Identität von 40% mit der entsprechenden spezifizierten Sequenz, vorzugsweise von mindestens 60 oder 80% und mehr bevorzugt mindestens 90%, 95% oder 99 Sequenzidentität. Eine derartige Sequenzidentität kann über eine Region von mindestens 15, vorzugsweise über mindestens 30, zum Beispiel über mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr angrenzende Nukleotide vorhanden sein.
  • Verfahren zur Messung der Polynukleotidhomologie sind den Fachleuten gut bekannt. Zum Beispiel kann das UWGCG-Package, das das BESTFIT-Programm bereitstellt, verwendet werden, um die Homologie zu berechnen, z. B. mit dessen Standardeinstellungen (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387–395). Die PILEUP und BLAST-Algorithmen können ebenfalls verwendet werden, um die Homologie zu berechnen oder um Sequenzen aufzureihen (typischerweise mit deren Standardeinstellungen), zum Beispiel wie in Altschul (1993) J Mol Evol 36: 290–300 oder Altschul et al (1990) J Mol Biol 215: 403–10 beschrieben.
  • Ein Homolog hybridisiert typischerweise mit der entsprechenden spezifizierten Sequenz in einem Level, das signifikant über dem Hintergrund liegt. Das durch die Interaktion zwischen dem Homolog und der spezifizierten Sequenz generierte Signallevel ist typischerweise mindestens 10-fach, vorzugsweise mindestens 100-fach so intensiv wie die Hintergrundhybridisierung. Die Intensität der Interaktion kann zum Beispiel durch radioaktive Markierung der Sonde, z. B. mit 32P gemessen werden. Eine selektive Hybridisierung wird typischerweise unter Bedingungen von mittlerer oder hoher Stringenz erreicht, zum Beispiel mit 0,03 M Natriumchlorid und 0,003 M Natriumcitrat zwischen etwa 50°C bis etwa 60°C.
  • Das Homolog kann sich von der entsprechenden spezifizierten Sequenz durch mindestens 1, 2, 5, 10 oder mehr Substitutionen, Deletionen oder Insertionen über eine Region von mindestens 30, zum Beispiel von mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr angrenzenden Nukleotiden der Homologe unterscheiden. Daher kann sich das Homolog von der entsprechenden spezifizierten Sequenz durch mindestens 1, 2, 5, 10, 30 oder mehr Substitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheiden.
  • Ein homologes Strukturgen kann durch Expression des Gens in einem geeigneten Wirt getestet werden, und auf Kreuz- Reaktivität mit Antkörperspezifizität auf ein besonderes Antigen getestet werden. Ein homologes Transport- oder Regulatorgen kann auf die Fähigkeit getestet werden, die Aktivität des endogenen Transport- oder Regulatorgens in einer bakteriellen Zelle zu komplementieren.
  • Ein Transportgen kann zum Strukturgen oder den -genen mit dem oder denen es funktioniert endogen sein. Daher kann die vorliegende Zelle sowohl das Strukturgen oder die -gene und ein oder mehrere der Transportgene eines gegebenen CS-Operons umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Zelle der Erfindung ein vollständiges Operon für ein gegebenes CS-Antigen.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Zelle der Erfindung weniger als das ganze Operon für ein gegebenes CS-Antigen. Zum Beispiel kann eine Zelle der Erfindung das Strukturgen oder die -gene für ein gegebenen CS-Antigen ohne ein oder mehrere der endogenen Transportgene umfassen. In einer derartigen Zelle funktionieren ein oder mehrere heterologe Transportgene, um das Strukturgen an die Oberfläche der Zelle zu transportieren. Daher können zum Beispiel Struktur-CS1-Genprodukte durch die Aktion der Transportgene CS2 (cot C und cot D) an die Oberfläche transportiert werden und umgekehrt (17). Daher kann eine Zelle gemäß der Erfindung ein unvollständiges Operon für ein gegebenes CS-Antigen umfassen, vorausgesetzt, dass das Antigen auf der bakteriellen Oberfläche exprimiert ist. Zum Beispiel kann die Zelle, begleitet von einem oder mehreren heterologen, aber komplementären Transportgenen, das Strukturgen oder die -gene eines besonderen Operons exprimieren.
  • Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass die vorliegende Zelle ein CS-Antigen stabil exprimiert; eine Zelle, die eine stabile Antigenexpression aufweist, ist ein besserer Kandidat für eine ETEC-Vakzine. Wie oben beschrieben sind in nativen ETEC-Isolaten die CS2- und CS4-Operone im Allgemeinen auf dem bakteriellen Chromosom untergebracht und die CS1-, CS3-, CS5- und CS6-Operone werden im Allgemeinen von Plasmiden mit niedriger Kopienzahl getragen. Daher werden in Abwesenheit von spezifischen Selektionsmechanismen, endogene CS-Gene im Allgemeinen stabil gehalten und über viele Generation exprimiert. Die vorliegende Zelle umfasst im Allgemeinen eine oder mehrere heterologe Polynukleotidsequenzen, die ein oder mehrere CS-Antigene codieren. Derartige heterologe Polynukleotidsequenzen können in der Zelle auf einem Plasmid vorhanden sein oder können als Ergebnis eines Insertionsereignisses in einem bakteriellen Chromosom untergebracht sein.
  • Dort wo eine heterologe Polynukleotidsequenz von einem Plasmid getragen oder exprimiert wird, wird das Plasmid bevorzugt stabil gehalten. Eine stabile Erhaltung ist ebenso wünschenswert für ETEC-CS-tragende native Plasmide – dies kann bedeutsam werden, wenn zum Beispiel, ein natives Plasmid, wie nachfolgend beschrieben, zu Abschwächungszwecken manipuliert wird. Verfahren zur Verbesserung der Plasmidstabilität werden nachfolgend diskutiert.
  • Vorzugsweise ist ein heterologes Polynukleotid, das ein CS-Antigen codiert, zum Beispiel durch ein Rekombinationsereignis, im bakteriellen Chromosom positioniert. Eine chromosomale Stelle sorgt im Allgemeinen für eine stabilere Expression als eine Plasmidstelle und würde auch zu einem heterologen Operon führen, das in einer Kopienzahl vorhanden sein würde, die derjenigen ähnlich ist, die in Wildtyp-Stämmen auftritt. Wenn die Zelle durch Einführung eines heterologen CS-Antigens erhalten wurde, das ein Polynukleotid in einen ETEC-Stamm codiert, der ein CS-Antigen endogen exprimiert, dann beugt eine chromosomale Positionierung auch einer „Überlastung" mit zusätzlichen antigenen Proteinen vor, und minimiert die Interferenz mit der Regulation der Expression des endogenen antigenen Proteins.
  • In einem Wildtyp-ETEC-Stamm wird die Regulation der Expression eines CS-Operons häufig durch ein Gen bewirkt, das in einem gewissen Abstand von dem Strukturgen oder den -genen liegt. In der vorliegenden Zelle, kann die Expression eines heterologen CS-Antigens durch ein zelleigenes Regulatorgen, ein Homolog davon oder durch ein heterologes Regulatorgen reguliert werden. Wenn daher die vorliegende Zelle durch Einführung eines heterologen Polynukleotids in einen E. coli-Stamm erhalten wird, der ein ETEC-CS-Antigen endogen exprimiert, kann die Expression der heterologen Sequenz durch ein Regulatorgen reguliert werden, das mit dem endogenen CS-Operon verbunden ist. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, wird vorgeschlagen, dass wirtspezifische Regulatorproteine in der Lage sind, mit den Genen zu interagieren, die künstlich eingeführt und im Regulationsmodus verändert wurden. Wenn daher zum Beispiel CS4-Gene in einen CS5/CS6 exprimierenden E. coli-Stamm ohne das native CS4-Regulatorgen cfaD eingeführt werden, kann die Expression des CS4-Gens durch das endogene CS5-Regulatorgen reguliert werden, das von der Gegenwart von Gallensalzen abhängig ist. Wenn jedoch ein rns-Regulator (ein Homolog von cfaD) auch in diese Zelle eingeführt wird, wird die Expression des CS4-Gens unabhängig von Gallensalzen. Wenn umgekehrt CS5-Gene in einen CS4/CS6-Stamm ohne das native Regulatorgen eingeführt werden, kann die Expression der CS5-Gene durch das CS4-Regulatorgen cfaD reguliert werden.
  • In einer Ausführungsform kann es für die CS-Antigen-Expression in der vorliegenden Zelle bevorzugt sein, nicht von Gallensalz abhängig zu sein. Das kann zum Beispiel vorteilhaft sein, wenn eine Zelle der Erfindung in Vorbereitung der Verwendung als Vakzine mit einem CS-Antigen „vorbeladen" ist, da ein tierproduktfreies Medium verwendet werden kann, um die CS-Antigen Expression zu induzieren.
  • Eine Zelle gemäß der Erfindung wurde in der Natur nicht isoliert. Dementsprechend wird die vorliegende Zelle im Allgemeinen durch die Einführung eines Polynukleotids (z. B. DNA) erhältlich, das ein heterologes ETEC-CS-Antigen in einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle codiert.
  • Geeignete Wirtsstämme (oder Starterstämme), aus denen die vorliegende Zelle hergestellt werden kann, wurden oben beschrieben. Vorzugsweise ist der Wirtsstamm ein ETEC-Stamm, der ein ETEC-CS-Antigen endogen exprimiert. Insbesondere kann der Wirtsstamm CFA/II (beinhaltet CS1/CS3 und CS2/CS3) oder CFA/IV (beinhaltet CS4/CS6 oder CS5/CS6) exprimieren. In einer Ausführungsform wird der Wirtsstamm aus den hinterlegten Stämmen ACM2005, ACM2003, ACM2002, ACM2004, ACAM2007, ACAM2008, ACAM2009 oder ACAM2012 selektiert, die in den Tabellen 1 und 2 aufgelistet sind, oder Abkömmlingen dieser Zellen. Ein Abkömmling ist jede Zelle, die von der hinterlegten Zelle abgeleitet ist. Ein Abkömmling kann eine Zelle mit einer oder mehreren abschwächenden Mutationen beinhalten, wie jene die hier beschrieben sind. Ein Abkömmling kann eine Zelle beinhalten, die gentechnisch hergestellt wurde, um ein heterologes Antigen zu exprimieren, die ebenfalls hier beschrieben wird.
  • Im Allgemeinen umfasst das in den Wirtsstamm eingeführte Polynukleotid ein oder mehrere Strukturgene für ein CS-Antigen. Vorzugsweise beinhaltet das Polynukleotid das Strukturgen oder die -gene für mindestens ein Antigen, selektiert aus ETEC CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6. Die GenBank-Akzessionsnummern für diese Gensequenzen sind oben und in Tabelle 5 angegeben. Die Sequenzen, die jenen, die den unter den Akzessionsnummern eingetragenen entsprechen, sind in dem vorliegenden Sequenzprotokoll enthalten.
  • Das Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Zelle kann auch den Schritt der Einführung eines Polynukleotids in eine Zelle umfassen, die ein oder mehrere Transportgene (typischerweise Chaperon- oder Ushergene) umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Einführung eines Polynukleotids in eine geeignete Zelle, das ein oder mehrere Strukturgene für ein ETEC-CS-Antigen und ein oder mehrere komplementäre Transportgene umfasst. Alternativ können die Strukturgene und die Transportgene auf separaten Polynukleotiden vorhanden sein. Vorzugsweise wird ein Verfahren verwendet, das die Einführung eines Polynukleotids umfasst, das ein heterologes ETEC-CS-Operon umfasst. In einer weiteren Ausführungsform können Transportgene, die endogen zu einem ETEC-Wirtsstamm sind, auf einem Antigen der Zelle agieren, das ein heterologes Antigen beinhaltet, das dessen Progression an die Zelloberfläche unterstützt.
  • Wie bereits beschrieben, kann die Regulation der Expression eines heterologen ETEC-CS-Antigens in der vorliegenden Zelle durch ein Regulatorgen durchgeführt werden, das endogen oder bereits in dem Wirtsstammvorhanden ist. Alternativ oder zusätzlich kann das Verfahren zur Ableitung der vorliegenden Zelle den Schritt der Einführung in eine Zelle eines Polynukleotids umfassen, das ein geeignetes Regulatorgen umfasst. Ein Regulatorgen kann, wenn es auf diese Weise eingeführt wurde, auf dem gleichen oder einem anderen Polynukleotid des Strukturgens oder der -gene und/oder jedes Transportgens, die eingeführt werden, vorhanden sein. Typischerweise wird das Regulatorgen dasjenige sein, dass die Expression des betreffenden ETEC-CS-Antigens in einem nativen ETEC-Stamm oder einem Homolog davon reguliert. Daher umfasst das vorliegende Verfahren in einer Ausführungsform die Einführung eines Polynukleotids in eine geeignete Zelle, das ein heterologes ETEC-CS-Operon zusammen mit dessen nativen Regulatorgenen umfasst.
  • Ein Polynukleotid, das gemäß der vorliegenden Erfindung in eine Zelle eingeführt werden soll, kann jede geeignete Form annehmen. Typischerweise ist das Polynukleotid ein Plasmidvektor. Im Allgemeinen trägt das Polynukleotid einen selektierbaren Marker.
  • Das Polynukleotid kann ein oder mehrere Expressionskontrollelemente umfassen, wie etwa eine Promoter, Verstärker- oder Transkriptionsterminatorsequenz, die durchführbar mit einem Gen oder Genen verbunden ist, die exprimiert werden müssen. Zum Beispiel kann ein geeigneter Plasmidexpressionsvektor verwendet werden. Geeignete Vektoren sind den Fachleuten bekannt.
  • Vorzugsweise sollte ein Polynukleotid, das gemäß der Erfindung in eine Zelle eingeführt wird, zum Beispiel durch homologe Rekombination in das Chromosom der bakteriellen Zelle eingeführt werden. Verfahren die eine chromosomale Insertion bewirken, sind den Fachleuten bekannt. Das Polynukleotid kann zum Beispiel auf einem geeigneten Suizid-Vektor eingeführt werden. Zum Beispiel kann der hier beschriebene Suizid-Vektor pJCB12 verwendet werden.
  • Verfahren zur Einführung fremder DNA in prokaryotische Zellen sind den Fachleuten bekannt. Beispiele für geeignete Verfahren beinhalten Konjugation und Elektroporation. Transformante Kolonien können auf korrekte Aufnahme der heterologen Nukleinsäure unter Verwendung von Standardscreening- und Standardselektionsverfahren gescreent und ausgewählt werden. Selektierte Transformante können auf die Oberflächenexpression eines gegebenen ETEC-CS-Antigens unter Verwendung der oben beschriebenen Screeningverfahren getestet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorliegende Verfahren:
    • (i) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS4-Antigen codiert, in eine CS5/CS6-ETEC-Zelle; oder
    • (ii) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS1-Antigen codiert, in eine CS2/CS3-ETEC-Zelle; oder
    • (iii) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS5-Antigen codiert, in eine CS4/CS6-ETEC-Zelle; oder
    • (iv) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS4-Antigen codiert, in eine CS1/CS3-ETEC-Zelle.
  • Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass eine Zelle der Erfindung im Vergleich zu einer Wildtyp-ETEC-Zelle abgeschwächt wird. Daher hat die vorliegende Zelle typischerweise eine verringerte Virulenz, so dass sie keine mit ETEC verbundene Krankheit, wie etwa Diarrhöe auslöst, aber dennoch in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren. Das ist insbesondere der Fall, wenn die Zelle für die Verwendung in einer Vakzine vorgesehen ist, um eine mit ETEC verbundene Krankheit, wie etwa Diarrhöe zu bekämpfen. Die Verwendung einer abgeschwächten Zelle in einer derartigen Vakzine führt im Allgemeinen dazu, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein geimpftes Subjekt Nebenwirkungen, wie etwa Diarrhöe-Symptome verspürt, geringer ist.
  • Eine Zelle der Erfindung kann mit einer ganzen Reihe von Verfahren abgeschwächt werden, im Allgemeinen durch eine Art der Mutation. Zum Beispiel kann die Toxizität durch die Verwendung einer Zelle verringert werden, die die mit ETEC verbundenen Toxine nicht exprimiert oder diese nicht in einer funktionellen oder toxischen Form exprimiert. Alternativ oder zusätzlich kann die Abschwächung durch Mutation eines weiteren bakteriellen Gens entstehen, typischerweise, um deren Inaktivierung oder Deletion (z. B. durch Ersatz) zu bewirken).
  • Die Kolonisation eines Dünndarmwirts durch ETEC-Zellen ist von der Absonderung von Enterotoxinen begleitet. Zwei Arten, der in ETEC-Stämmen identifizierten Enterotoxine, sind das hitzelabile Toxin (LT) und das hitzestabile Toxin (ST). LT ist in der Struktur stark homolog mit einem Choleratoxin, einem Multiuntereinheitprotein mit der Form AB5 Die A- Untereinheit ist die aktive Komponente in dem Toxin, das funktioniert, um die Aktivität der Adenylatcyclase zu erhöhen. Diese wird über die B-Untereinheiten in die Wirtzellen geliefert, die sich an Ganglioside auf der Zelloberfläche binden. ST ist ein kleines (19 Aminosäuren), nicht immunogenes Polypeptid, das über eine Guanylatcyclase stimulierende Aktivität verfügt. Ferner wurde kürzlich demonstriert, dass ein großer Teil der ETEC-Stämme auch EAST1 produziert, ein hitzestabiles Toxin, das in Größe und Wirkungsweise ST gleicht, aber eine andere Sequenz hat, das ursprünglich in enteroaggregativen E. coli-Stämmen identifiziert wurde.
  • Daher exprimiert in einer Ausführungsform der Erfindung die Zelle im Allgemeinen keine funktionellen ETEC-Toxine, wie etwa LT, ST und EAST1. Eine derartige Zelle kann zum Beispiel toxinnegativer Stamm genannt werden. Die GenBank-Akzessionsnummern für diese Toxine sind in Tabelle 5 angegeben.
  • Die Abschwächung kann entstehen, weil die Zelle aus einer bakteriellen nicht-ETEC-Zelle abgeleitet ist oder hergestellt wurde, die weder natürlich noch endogen ein oder mehrere der ETEC-Toxine exprimiert. Alternativ kann die Zelle von einer ETEC-Zelle abgeleitet sein, die im Hinblick auf die ETEC-Toxine abgeschwächt ist. Ein derartiger ETEC-Stamm kann als Ergebnis einer spontanen Mutation, zum Beispiel bei einem Deletionsereignis, entstehen. Alternativ oder zusätzlich kann ein toxinnegativer Stamm unter Verwendung gentechnischer oder molekularbiologischer Techniken hergestellt werden.
  • Klinische Isolate, die aus einer epidemiologischen Langfriststudie erhalten wurden, die von Wissenschaftlern in der US-NAMRU3-Einrichtung in Kairo durchgeführt wurde, sind in Tabelle 3 aufgelistet. Eine Reihe dieser Isolate sind toxinnegativ im Hinblick auf mindestens eines der oben genannten Toxine. Einige dieser Isolate wurden verwendet, um, wie nachfolgend beschrieben, weiter abgeschwächte Stämme herzustellen.
  • Ein Beispiel eines spontanen toxinnegativen Stamms ist E1392/75-2A (CFA/II, ST-negativ, LT-negativ) (10) (Tabelle 1). Beispiele von ETEC-Stämmen, die manipuliert wurden, um die spezifische Entfernung aller bekannten Toxingene zu gewährleisten, sind jene mit den Akzessionsnummern 01090304, 1090305, 01090306 (jeweils abgeleitet von den Stämmen H, E, und J in Tabelle 3) und 02082964, 02082965, 02082966 und 02082968, wie oben beschrieben und in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Der hinterlegte Stamm 01090302 ist ebenfalls ein toxinnegativer Stamm.
  • Eine bakterielle Zelle der Erfindung kann aufgrund der Mutation eines weiteren Gens abgeschwächt werden. Die Abschwächung kann zum Beispiel durch Deletion oder Inaktivierung eines oder mehrer der folgenden Gene verursacht werden: aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, phoQ, surA, rfaY, dksA, hupA, invE und clpB. Bevorzugte Kombinationen der Gene beinhalten:
    • – mindestens ein aro-Gen (z. B. aroA, aroC, aroD oder aroE) und mindestens ein omp-Gen (z. B. ompC, ompF oder ompR);
    • – mindestens ein aro-Gen (z. B. aroA, aroC, aroD oder aroE) und das htrA-Gen;
    • – aroC, ompF und ompC.
  • Zum Beispiel wurden die Stämme PTL002 und PTL003 (Akzessionsnummer 01090302) vom oben genannten Stamm E1392/75-2A durch Mutation von aroC/ompR bzw. aroC/ompC/ompF abgeleitet.
  • Ferner ist es im Allgemeinen bevorzugt, dass alle antibiotischen Resistenzgene aus einer bakteriellen Zelle der Erfindung vor ihrer Verwendung in einer Vakzine entfernt werden. Bakterien, die aus wilden Stämmen isoliert werden, enthalten häufig antibiotische Resistenzgene, wie etwa Resistenzgene gegen Ampicillin, Streptomycin, Sulfamethoxazol, Kanamycin, Trimetheprim und Tetracyclin. Diese Gene können durch die Verwendung der hier beschriebenen Suizidvektoren und Verfahren oder durch Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, entfernt werden.
  • Wie oben gezeigt, kann die Abschwächung der vorliegenden bakteriellen Zelle aus einer oder mehreren Mutationen in dem bakteriellen Genom entstehen. Eine/mehrere Mutation/en, die der Expression eines Enterotoxins oder anderer Gene vorbeugt/vorbeugen, deletiert/deletieren oder inaktiviert/inaktivieren das Gen im Allgemeinen. Im Allgemeinen gibt es einen vollständigen Knock-out der Funktion der Gene. Dies kann entweder erreicht werden, indem die Synthese aller Polypeptide des Gens vollständig gehemmt wird, oder indem eine Mutation gemacht wird, die zu einer Synthese der nicht-funktionellen Polypeptide führt. Um die Synthese von Polypeptiden zu hemmen, kann entweder das gesamte Gen oder dessen 5'-Ende deletiert werden. Eine Deletion oder Insertion innerhalb der codierenden Sequenz eines Gens kann verwendet werden, um ein Gen zu erzeugen, dass nur nicht-funktionelle Polypeptide (z. B. Polypeptide, die nur die N-terminale Sequenz eines Wildtyp-Proteins enthalten) synthetisiert. Im Falle eines Toxingens, kann die Mutation das Genprodukt nicht-toxisch machen.
  • Eine Mutation ist im Allgemeinen eine nicht revertierende Mutation. Dies ist eine Mutation, die im Wesentlichen keine Reversion zurück zu dem Wildtyp zeigt, wenn die Bakterie als Vakzine verwendet wird. Derartige Mutationen beinhalten Insertionen und Deletionen. Insertionen und Deletionen sind vorzugsweise groß, typischerweise mindestens 10 Nukleotide lang, bis zu einer Länge des gesamten Gens oder der codierenden Sequenz, zum Beispiel von 10 bis 600 Nukleotiden. Vorzugsweise wird die gesamte codierende Sequenz oder das gesamte Gen deletiert.
  • Die Mutationen sind typischerweise ortsspezifisch. Sie können spezifisch oder selektiv zu dem Toxingen oder einem anderen Gen sein. Zum Beispiel im Falle der Deletion oder Inaktivierung des ST-Gens in einem CFA/I- oder CS5/CS6-Stamm, muss die Mutation spezifisch auf das ST-Gen targetiert sein, ohne das (eng verbundene) CFA/I-Gen, das CS5-Gen oder das CS6-Gen zu deletieren oder zu inaktivieren.
  • Eine Mutation kann durch die Verwendung eines Suizid-Vektors entstehen. Insbesondere kann der pJCB12-Suizid-Vektor verwendet werden. Dieser Vektor ist in der UK-Patentanmeldung Nr. 0121998.9 beschrieben und auch in der internationalen Patentanmeldung, die Priorität vor dieser UK-Anmeldung beansprucht und von Acambis Research am gleichen Tag eingereicht wurde wie die internationale Anmeldung. Die Inhalte dieser internationalen Anmeldung sind hier als Bezugsdokumente beigefügt. Der Vektor ermöglicht das spezifische und verlässliche Targeting und hat typischerweise eine Größe von weniger als 5 kb (zum Beispiel zwischen 2,5 und 5 kb oder zwischen 2,5 und 4 kb).
  • Eine abschwächende Mutation kann eingeführt werden durch die Verwendung eines Suizidvektors oder durch ein anderes den Fachleuten bekanntes Verfahren (26). Geeignete bekannte Verfahren beinhalten das Klonieren der DNA-Sequenz des Wildtypgens in einen Vektor, z. B. ein Plasmid, und die Insertion eines selektierbaren Markers in die klonierte DNA-Sequenz oder Deletion eines Teils der DNA-Sequenz, die zu dessen Inaktivierung führt. Eine Deletion kann, zum Beispiel durch Abschneiden der DNA-Sequenz unter Verwendung von Restriktionsenzymen, eingeführt werden, die an zwei Punkten in oder gerade außerhalb der codierenden Sequenz schneiden und Zusammenligieren der zwei Enden in der verbleibenden Sequenz. Alternativ, und jetzt gebräuchlicher, kann ein mutiertes Allel, in dem die flankierende Region eines Target-Gens separat amplifiziert und in einer separaten Overlap-PCR-Reaktion direkt verbunden wird, unter Auslassung der dazwischen liegenden Targetsequenz, konstruiert werden (31). Ein Plasmid, das die mutierte DNA-Sequenz trägt, kann in der Bakterie durch bekannte Techniken, wie etwa Elektroporation und Konjugation transformiert werden. Dann ist es durch geeignete Selektion möglich, eine Mutante zu identifizieren, in der die inaktivierte DNA-Sequenz sich in das Chromosom der Bakterie rekombiniert hat, und die Wildtyp-DNA-Sequenz durch homologe Rekombination nicht funktionell gemacht wurde.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung exprimiert die vorliegende Zelle ferner ein Antigen, das ist nicht durch die native Bakterie exprimiert (ein „heterologes Antigen"), zusätzlich zu einem ETEC-CS-Antigen. Dies ist besonders nützlich, wenn die Zelle in einer Vakzine verwendet werden soll, da die Gegenwart von zusätzlichen Antigenen die generierte Immunantwort verbessert. In dem Fall, in dem die Bakterie eine ETEC-Bakterie ist, kann das Antigen von einem anderen ETEC-Stamm sein, so dass die Vakzine Schutz gegen den anderen Stamm bereitstellt. Ferner kann die Bakterie gentechnisch verändert werden, um mehr als ein derartiges heterologes Antigen zu exprimieren, wobei die heterologen Antigene vom gleichen oder einem anderen Stamm sein können.
  • Ein heterologes Antigen kann ein vollständiges Protein oder ein Teil eines Proteins sein, das ein Epitop oder ein Fusionsprotein sein kann. Geeignete Antigene beinhalten nicht-toxische ETEC-Komponenten oder nicht-toxische Mutanten von E. coli LT (z. B. die B-Untereinheit und Mutanten der Untereinheit, deren Akzessionsnummern sind in Tabelle 5 angegeben), und LT-ST Fusionsproteine (1, 7–9)
  • Die DNA, die heterologe Antigene codiert, kann von einem Promoter exprimiert werden, der in vivo aktiv ist. Ein Promoter kann ein starker Promoter sein, wie etwa der tac-Promoter oder ein Derivat davon. Promoter, die ihre gute Wirkung gezeigt haben, sind der nirB-Promoter (6, 16), der htrA-Promoter (16), der pagC-Promoter (13) und der ssaH-Promoter (32). Für die Expression von Derivaten von LT, CT oder ST, könnte der Wildtyp-Promoter verwendet werden.
  • Wie angegeben, ist es bevorzugt, dass ein Plasmid, das ein heterologes Antigen exprimiert, in der vorliegenden Zelle stabil gehalten wird. Um dem Verlust eines Plasmids vorzubeugen, das ein heterologes Antigen exprimiert oder eines nativen Plasmids, kann dem Plasmid ein Element zugefügt werden, dass dessen Stabilität verbessert.
  • Es gibt eine Reihe bekannter, die „Toxin/Antitoxin"-Stabilität von Plasmiden bestimmender Systeme, zum Beispiel parDE (25) von Plasmid RP4 (2), und hok/sok (auch als parB von Plasmid R1 bekannt oder pndAB von Plasmid R483 (18, 19)), die verwendet werden können, um die Plasmidstabilität zu verbessern. Diese Systeme codieren zwei Funktionen: Ersten eine toxische Einheit, die Zellen inaktivieren würde, in denen sie exprimiert ist, die ein lange biologische Halbwertszeit hat, und zweitens eine antitoxische Einheit, die dieser Inaktivierung vorbeugt, aber eine kurze biologische Halbwertszeit hat. Im Falle, dass ein Plasmid, das diese Funktionen codiert, während der Teilung segregiert wird, wird die Tochterzelle, die das Plasmid nicht enthält, ihr Angebot von Antitoxin erschöpfen und durch den beständigeren Toxinanteil inaktiviert. Daher werden nur die Zelle in der wachsenden Population gehalten, die weiterhin das Plasmid beherbergen.
  • Ein weiteres System, das verwendet werden kann, um die Stabilität eines Plasmids in Übereinstimmung mit der Erfindung zu verbessern, ist ein Multimer-Resolutionssystem. Multimerresolutionssysteme verleihen Stabilität, indem sie Plasmidmultimere in Single-copy-Plasmide auflösen, und so die Gefahr verringern, dass freie Plasmid-Tochterzellen durch Zufallsegregation bei der Zellteilung generiert werden. Es wurden mehrere ortsspezifische Rekombinationssysteme identifiziert, die agieren, um Plasmidmultimere in Monomere aufzulösen. In Übereinstimmung mit einem derartigen System enthält das Plasmid, das stabilisiert werden soll, eine Erkennungsregion für eine ortsspezifische Rekombinase und die Wirtszelle enthält eine DNA-Sequenz, die eine ortsspezifische Rekombinase codiert. Die Rekombinase agiert auf der Erkennungsregion und leitet dadurch die saubere Segregation des Plasmids während der Zellteilung. Die Rekombinase kann auf dem zu stabilisierenden Plasmid oder im Chromosom der Wirtszelle codiert sein.
  • Die Rekombinase ist im Allgemeinen eine Resolvase. Beispiele für Resolvasen, die in der Erfindung verwendet werden, können die Cre-Rekombinase von Plasmid P1, das E. coli-XerC-(ArgR)-Protein, die D-Protein Rekombinase von Plasmid F, die ParA-Rekombinasen der Plasmide RP4 und RK2, die ortsspezifische Rekombinase von Plasmid R1, Resolvasen, die durch die Tn3-ähnlichen transponiblen genetischen Elemente und die Rsd-Resolvase des Salmonella-dublin-Virulenzplasmid codiert sind, beinhalten.
  • Die Erkennungselemente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können jene für die oben genannten Rekombinasen beinhalten. Alle Erkennungselemente, die von der benutzten ortsspezifischen Rekombinase erkannt werden, können verwendet werden. Geeignete Erkennungselemente beinhalten jene Stellen, die von XerC-ortsspezifischer Rekombinase erkannt werden, wie etwa der Stelle von cer im Plasmid ColE1 und der ähnlichen Stelle ckr im Plasmid ColK (29), der Stelle psi im Plasmid pSC101 und der ähnlichen Stelle cer im Plasmid pHS-2 von Shigella flexneri. Andere Erkennungselemente, die verwendet werden können, beinhalten die Stelle crs im Salmonella-dublin-Virulenzplasmid, die Stelle loxP im Plasmid P1, die Stelle rfs im F-Plasmid und die Stelle res im Tn3-ähnlichen transponiblen genetischen Element.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Rekombinase die Rsd-Resolvase, die über das crs- Erkennungselement agiert. Das Rsd/crs-System in der Patentanmeldung WO 02/28423 ausführlich beschrieben.
  • Eine Zelle gemäß der Erfindung ist für die Verwendung zur Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Medikaments, das auf bakterielle Infektionen targetiert ist, geeignet.
  • Typischerweise ist die Bakterie ETEC. Zum Beispiel können Zusammensetzungen, die die vorliegende Zelle beinhalten, gegen mit ETEC verbundene Krankheiten, wie etwa Diarrhöe verwendet werden. Im Allgemeinen umfasst die Zusammensetzung mindestens einen Zellstamm der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel. Die Zusammensetzung kann außerdem einen oder mehrere bakterielle Stämme oder Komponenten umfassen.
  • Jede der hier beschriebenen Zellen kann eine geeignete Zelle für die Inklusion in die Zusammensetzung sein. Im Allgemeinen ist die Zusammensetzung in der Lage, in einem Individuum eine Immunantwort gegen mindestens drei oder mehr CS-Antigene zu generieren, die in der Zelle exprimiert sind. Diese Fähigkeit kann durch Immunisierungsstudien getestet werden. Die Zusammensetzung kann zum Beispiel einem Tier, wie etwa einem Menschen verabreicht werden, und es können Tests gemacht werden für die Generierung eines Antikörpers oder einer T-Zellen-Antwort, die für drei oder mehr CS-Antigene spezifisch sind. Das nach der Verabreichung einer Zusammensetzung an ein Tier generierte Antiserum, kann im Hinblick auf dessen Fähigkeit evaluiert werden, entweder die Zelle, die die CS-Antigene exprimiert oder das purifizierte CS-Antigen, spezifisch zu binden. Danach kann das Tier einem Immuntest mit einem ETEC-Stamm unterzogen werden, um zu evaluieren, ob eine schützende Immunantwort vorhanden ist.
  • Vorzugsweise kann eine immunogene Zusammensetzung mindestens eine Immunantwort gegen CFA/I-, CFA/II- und CFA/IV-Stämme generieren. Diese immunogene Zusammensetzung umfasst vorzugsweise einen oder mehrere bakterielle Stämme gemäß der Erfindung, so dass jeder der oben genannten Antigene repräsentiert ist. Die Zusammensetzung kann einen oder mehrere Stämme umfassen. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der Erfindung:
    • (i) einen Stamm, welcher CS1, CS2 und CS3 exprimiert;
    • (ii) einen Stamm, welcher CS4, CS5 und CS6 exprimiert; und
    • (iii) einen Stamm, welcher CFA/I exprimiert.
  • Beispiele für CFA/I-Stämme beinhalten ACM2001 und ACAM2010, aufgelistet in Tabelle 2.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, ist die immunogene Zusammensetzung eine Vakzine. Zum Beispiel eine Vakzine gegen eine mit ETEC verbundene Krankheit, wie etwa Diarrhöe. Die Vakzine ist im Allgemeinen eine lebende abgeschwächte Vakzine, die einen oder mehrere lebende abgeschwächte bakterielle Stämme umfasst, von denen mindestens einer ein Zellstamm gemäß der Erfindung ist.
  • Traditionell musste, aufgrund der beschränkten Expression von CS-Antigenen durch ETEC-Zellen, eine wirksame Vakzine mindestens 5 bakterielle Stämme beinhalten. Durch die Bereitstellung der vorliegenden Zellen, stellt die vorliegende Erfindung jetzt jedoch eine Anti-ETEC-Vakzine bereit, die weniger als 5 Stämme – zum Beispiel 3 oder 4 Stämme – umfassen kann.
  • Die vorliegende Zusammensetzung oder Vakzine kann unter Verwendung bekannter Techniken zur Formulierung abgeschwächter bakterieller Zusammensetzungen oder Vakzine formuliert werden. Die Zusammensetzung oder Vakzine wird vorteilhafterweise für die orale Verabreichung zum Beispiel als getrocknetes, stabilisiertes Pulver zur Rekonstitution in einem geeigneten Puffer vor der Verabreichung, präsentiert. Die Rekonstitution wird vorteilhafterweise in einem Puffer mit einem geeigneten pH-Wert durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu gewährleisten. Um die abgeschwächten Bakterien und die Zusammensetzung oder Vakzine vor der Magensäure zu schützen, sollte bei jeder Verabreichung der Vakzine vorteilhafterweise ein Natriumhydrogencarbonatpräparat verabreicht werden. Alternativ wird die Zusammensetzung oder Vakzine in einer lyophilisierten verkapselten Form präsentiert.
  • Die Zusammensetzung oder Vakzine kann zur Behandlung, wie etwa zur Impfung eines Säugetierwirts, insbesondere eines menschlichen Wirts, verwendet werden. Eine Infektion, die durch einen Mikroorganismus, insbesondere durch ein Pathogen verursacht wird, kann daher durch die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Vakzine, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, targetiert werden oder ihr kann vorgebeugt werden. Die verwendete Dosierung kann letzten Endes nach Ermessen des Arztes erfolgen, wird aber von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich Größe und Gewicht des Wirts und Art der formulierten Zusammensetzung oder Vakzine. Ein Dosierung, die die orale Verabreichung von 107 bis 1011, z. B. von 108 bis 1010 Bakterien je Dosis umfasst, kann jedoch für einen 70 kg schweren erwachsenen menschlichen Wirt geeignet sein.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung.
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, sind die verwendeten Verfahren biochemische und molekularbiologische Standardtechniken (2, 26).
  • Materialien und Verfahren
  • Stämme
  • Diese Arbeit wurde unter Verwendung einer Reihe von klinischen Isolaten von ETEC durchgeführt. Stamm E1392/75-2A (9) wurde von der National Collection of Type Cultures and Pathogenic Fungi, Central Public Health Laboratories, Colindale, UK bereitgestellt. Dies ist eine spontane Toxinverlust-Variante von Stamm E1392, die ursprünglich in Hongkong isoliert wurde. Abschwächende Deletionen wurden in die Gene aroC, ompC und ompF bei Acambis, Vereinigtes Königreich eingeführt, um einen Vakzinstamm PTL003 (hinterlegter Stamm 01090302, Tabellen 1 und 2) (31) zu erzeugen. Die anderen Wildtyp-Stämme wurden am Naval Medical Research Unit 3 (NAMRU3), in Kairo, Ägypten von Patienten mit Diarrhöe isoliert. Toxingene wurde aus diesen Stämmen deletiert und abschwächende Deletionen wurden bei Acambis, Vereinigtes Königreich (UK-Patentanmeldung 0121998.9) in die Gene aroC, ompC und ompF eingeführt. Die in den Beispielen verwendeten Stämme, ihre Genotypen/Phänotypen und gegebenenfalls die Akzessionsnummern für die hinterlegten Stämme sind in den Tabellen 1 und 2 beschrieben.
  • In den Beispielen werden außerdem drei Laborstämme von E. coli verwendet, die das pir-Gen auf dem Chromosom tragen. Es sind dies SY327λpir (23), SM10λpir (28) und DH5αλpir (P Barrow, Institute for Animal Health, Compton).
  • Wachstum der Stämme
  • Alle für die Erhaltung und das Wachstum von Stämmen während der Vakzinentwicklung verwendeten Medien wurden aus zertifizierten tierfreien Komponenten hergestellt. Die LB-Grundmedien bestanden aus 10 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl. Agar (15 g/l) und Antibiotika wurden wie erforderlich zugefügt. CFA-Agar wurde für die Analyse der Vakzinstämme verwendet und bestand aus10 g/l Agar, 10 g/l Sojapepton, 1,5 g/l Hefeextrakt, 0,005% MgSO4, 0,0005% MnCl2 und 0,15% Gallensalzen.
  • Herstellung der CS-Proteine durch Wärmeentzug
  • Die Stämme wurden über Nacht in LB-Medien mit den erforderlichen Antibiotika bei 37°C unter Schütteln gewachsen. Ein 10 μl-Aliquot wurde dann auf einer 15 ml CFA-Agarplatte, die gegebenenfalls Antibiotika enthält, verteilt. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert bis ein konfluenter Rasen erreicht wurde. Die Bakterien wurden dann von der Platte in 0,5 ml PBS geschabt. 10 μl dieser Zellsuspension wurde 1 ml PBS zugefügt und die OD600 wurde gemessen (OD600 von 1 = 1 × 109 Zellen/ml). Ein Aliquot der Zellsuspension, die 109 Zellen enthält wurde bei 13000 rpm 5 Min. lang zentrifugiert und das Pellet wurde in 10 μl PBS resuspendiert. Die Probe wurde 10 Min. lang auf 65°C erhitzt und dann bei 13.000 rpm 5 Min lang zentrifugiert. Es wurde ein Überstand erhalten und 10 μl 2× Novex Tris-Gly Probenpuffer (Invitrogen), der 2 μl 1 M DTT enthält, zugefügt. Die Proben wurden 5 Min. lang auf 95°C erhitzt und dann mittels SDS-PAGE auf 14% Novex Tris-Gly-Gelen (Invitrogen) analysiert, gefolgt von direkter Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) oder von Immun-Blotting.
  • Nachweis von Proteinen mittels Western Blot
  • Die Proben wurden auf 14% Novex Tris-Gly-Gelen bei 125 V der Elektrophorese unterzogen bis die Farbfront etwa 0,5 cm von dem Boden des Gels entfernt war. SeeBlue Plus2-Marker (Invitrogen) wurden als Molekülgewichtstandards verwendet. Der Transfer auf 0,45 μm Cellulosenitratmembran (LC2001, Invitrogen) wurde 1 Stunde lang bei 25 V, gemäß den Herstellerangaben (XCell II Blot Modul EI 9051 Bedienungsanleitung, Invitrogen) durchgeführt. Nach dem Transfer wurde die Membran 1 Stunde lang unter Verwendung von PBST (Sigma P-3813, 0,01 M Phosphatpuffersalzlösung (0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl) mit 0,05% Tween pH 7,4) und 5 Marvel-Magermilchpulver blockiert. Die Membran wurde vier Mal gewaschen (jeweils 10 Min.) in PBST, die 1% Marvel- Magermilchpulver enthält. Der Blot wurde 1 Stunde lang mit Primärantikörper in PBST/1% Marvel-Magermilchpulver inkubiert und dann wie zuvor vier Mal gewaschen. Der Blot wurde 1 Stunde lang mit Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat, Sigma A4914) in PBST/1% Marvel-Magermilchpulver inkubiert und dann wie zuvor vier Mal und zwei Mal nur in PBST gewaschen. Der Blot wurde unter Verwendung des Pierce Super Signal West Pico-Reagens gemäß den Herstellerangaben entwickelt und für mehrere Zeitabschnitte einem Röntgenstrahlenfilm exponiert.
  • Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)
  • Wenn nicht anders beschrieben, wurden zwei Arten von Polymerase-Kettenreaktionen gebildet: Reaktionen, um die DNA-Fragmente für die Klonierung zu amplifizieren und Reaktionen, um Plasmide/Stämme zu screenen und zu analysieren. Um die Fragmente für die Klonierung zu erhalten, wurde das High-Fidelity-Enzym Pfu Turbo (Stratagene) verwendet, gemäß den Protokollen, die in der Bedienungsanleitung #039001b dargestellt sind. Um Klone zu screenen und das rns-Gen zu klonieren, wurde Taq-Polymerase (Invitrogen, Katalognummer 10342-020) gemäß den Herstellerangaben verwendet.
  • Oligonukleotide
  • Die Sequenzen für die Oligonukleotide, zum Beispiel für die Primere, die in den Beispielen verwendet werden, sind in Tabelle 4 angegeben.
  • Beispiel 1 – Herstellung eines CS4-, CS5-, CS6-Stamms (CS4 exprimiert in einem CS5/CS6-Stamm)
  • 1.1 Klonieren des CS4-Operons
  • Die Sequenz des CS4-Operons wurde in der Genbank (Referenznummer AF296132) publiziert. Die computergestützte Restriktionsanalyse dieser Sequenz (unter Verwendung des VectorNTi-Programms, Version 7, Informax) offenbarte zwei BglII-Stellen, eine (Stelle (a)) im ersten Gen des Operons (csaA) und eine (Stelle (b)) stromabwärts zum letzten Gen im Operon (csaE) (1A). Daher könnte der größte Teil des Operons mittels Restriktionsverdauung unter Verwendung dieser BglII-Stellen kloniert werden, wodurch alle PCR-bezogenen Fehler vermieden werden. Es war jedoch notwendig, die 5'-Region des Operons mittels PCR-Amplifikation zu klonieren, da es keine geeigneten Restriktionsorte gab, die ein direktes Klonieren erlauben würden. Zwei PCR-Primere (Primer 47151 und Primer 47152) wurden verwendet, um das csaA-Gen bis zu und einschließlich der BglII-Stelle zu amplifizieren, wobei eine chromosomale DNA vom Stamm WS2252-A (CS4/CS6, Tabelle 1) als Matrize verwendet wurde. Der Vorwärts-Primer, Primer 47151 führte einen SalI-Restriktionsort stromaufwärts des csaA-Gens ein, während der Rückwärts-Primer, Primer 47152, eine SphI-Stelle stromabwärts der BglII-Stelle einführte. Diese Stellen wurden verwendet, um das 723 bp PCR-Produkt in den stabile Vektor mit einer geringen Kopienzahl pACYC184 ((5) zu klonieren; geliefert von NEB, 1B), der auch mit SalI und SphI verdaut wurde. Diese Vektor wurde pACYC-csaA (1C) genannt. In diesem Konstrukt wird Stelle (a) in 1A erhalten und kann für die Klonierung des langen Fragments des CS4-Operons (zwischen den Stellen (a) und (b)) verwendet werden.
  • Daher wurde ein weiterer Anteil der chromosomalen DNA von Stamm WS2252-A mit BglII verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die DNA-Fragmente von etwa 5 kb wurden von dem Gel unter Verwendung eines QIAquick Gelextraktionskit isoliert und mit pACYC-csaA ligiert, das mit BglII verdaut und mit Kälberdarmphosphathase (CIP) behandelt worden war. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um das E. coli XL10 Gold KanR zu transformieren und die transformierten Kolonien wurden auf Agar-Platten selektiert, die Chloramphenicol enthalten. Kolonien mit Plasmiden, die die 3'-Region des CS4-Operons in der korrekten Orientierung enthalten, wurden durch PCR unter Verwendung von Primer 47151 und Primer 47150 nachgewiesen, die innerhalb von csaC (1A) binden. Korrekte Plasmide, die das vollständige CS4-Operon enthalten, wurden pACYC-CS4 (1D) genannt.
  • 1.2 Expression von CS4
  • 1.2.1 Expression von CS4 aus dem Plasmid pACYC-CS4
  • Das Plasmid pACYC-CS4 wurde verwendet, um zwei Stämme zu transformieren: 'Stamm K' ist ein Derivat des CS4/CS6-Stamms, das spontan sein CS4-Gen verloren hat, so dass es nur CS6 exprimiert; ACAM2006 ist ein abgeschwächtes, toxinnegatives Derivat von WS2773-E, ein CS5/CS6-ETEC-Stamm. Die Stämme wurden als Stamm K-pCS4 bzw. ACAM2006-pCS4 bezeichnet und auf Chloramphenicol erhalten.
  • CS-Proteine wurden mittels Wärmeentzug aus Stamm K-pCS4 und ACAM2006-pCS4 purifiziert, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben. Zum Vergleich wurden der Stamm WS-2252A, ein CS4/CS6-Stamm und ACAM2006 auf gleiche Weise analysiert. Nach dem Erhitzen der Proben für 5 Min. auf 95°C wurden sie mittels Elektrophorese auf 14% Tris-Gly-Polyacrylamidgelen (Novex) analysiert. Die Bänder wurden mittels Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) (2A) oder mittels Western Blot visualisiert unter Verwendung CS4-spezifischer Antikörper (2B), wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben.
  • Das CS4-Antigen wurde eindeutig in dem Kontrollstamm WS-2252A nachgewiesen und auch in Stamm K-pCS4, wodurch angezeigt wurde, dass das klonierte Operon intakt und funktionsfähig war. CS4 wurde jedoch weder in ACAM2006 noch in ACAM2006-pCS4 nachgewiesen. Es schien wahrscheinlich zu sein, dass diese Disparität auf die Gegenwart verschiedener Regulatormechanismen in den Stämmen K und ACAM2006 zurückzuführen war. Das cfaD-Genprodukt, ein Protein, das in Stamm K, jedoch nicht in ACAM2006 vorhanden ist, reguliert normalerweise das CS4-Operon. Die Expression des CS5-Operon ist kaum verstanden. Das csvR-Gen wurde aus einem anderen CS5/CS6-Stamm isoliert und ist zu 87% homolog zu cfaD. Das Proteinprodukt kann die Aktivität von cfaD funktionell ersetzen, um die CFA/I-Expression zu vermitteln, seine Rolle bei der Expression von CS5 ist jedoch unklar (11, 14). CS5-Biosynthese unterscheidet sich von der Expression von CS1, CS2, CS3, CS4 und CS6 ebenfalls darin, dass Gallensalze für die Herstellung von Fimbriae notwendig sind. Es wurde spekuliert, dass es nötig sein könnte, Gallensalze dem CFA-Agar zuzufügen, der für das Wachstum von ACAM2006-pCS4 verwendet wird, um die Expression des CS4-Operons zu stimulieren. CS-Proteine wurden mittels Wärmeentzug aus den Stämmen ACAM2006, ACAM2009 (ein abgeschwächtes Derivat von WS2252A) und ACAM2006-pCS4 purifiziert, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben. Die Proben wurden mittels Elektrophorese auf 14% Tris-Gly-Polyacrylamidgelen (Invitrogen) analysiert und die Bänder wurden mittels Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) oder mittel Western Blot visualisiert, unter Verwendung von CFA/IV-spezifischen Antikörpern, wie im Abschnitt „Materialen und Verfahren" beschrieben. In Gegenwart von Gallensalzen wurden gute Mengen von CS4 und CS5 im CFA-Präparat von ACAM2006-pCS4 (2C und D) nachgewiesen, wodurch angezeigt wurde, dass ein Regulatorprotein in ACAM2006 vorhanden ist, möglicherweise csvR, das CS4-Operon aktivieren und die Expression induzieren kann CS6 wurde in ACRM2006-pCS4 ebenfalls nachgewiesen. Obwohl die Level dieser Antigene niedrig waren, gleichen sie jenen, die in CS5/CS6-Stämmen wie etwa ACAM2006 gesehen wurden. Folglich haben wir bewiesen, dass es möglich war, alle drei CFA/IV-CS-Proteine innerhalb eines einzigen Stammes zu exprimieren.
  • Eine Gallensalz-abhängige Regulation sollte in vivo in einem Vakzinstamm gut wirken, in dem bei der Expression von CS- Proteinen erwartet wird, das in einer natürlichen Infektion Gesehene zu imitieren. Es kann jedoch möglich sein, das Muster der Regulation durch Einführung eines anderen Regulators, wie etwa rns oder cfaD (rns ist homolog zu cfaD) zu verändern. Um das zu untersuchen, wurde ein rns-Gen aus Stamm E1392-2A mittels PCR unter Verwendung der PrimereRNS-03 und RNS-04 isoliert. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Taq-Polymerase amplifiziert, die einen 'A'-Überhang hinterlässt und die Verwendung des Klonierungsvektors pGEM-T Easy (Promega) für die Klonierung erlaubt. Das PCR-Konstrukt wurde gemäß den Herstellerangaben in den Vektor geklont, um das Plasmid pGEM-rns zu erzeugen. Das Plasmid wurde mittels Elektroporation und Selektion auf Medien, die Ampicillin und Chloramphenicol enthalten, in ACAM2006-pCS4 eingeführt. CS-Proteine wurden aus Zellen präpariert, die in CFA-Medien ohne Gallensalze gewachsen waren, und die Proben wurden mittels SDS-PAGE auf 14% Tris-Gly-Gelen (Novex) analysiert, gefärbt mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). Eine Expression von CS4, CS5 und CS6, die nicht von der Gegenwart der Gallensalze abhängig war, wurde in beobachtet (2E). Jedoch hatte die Menge an CS5 in den Zellen eine deletierende Wirkung auf das Level an CS4 in der Zelle, verglichen mit der Induktion mittels Gallensalzen in Abwesenheit von rns (wie in 2C und 2D gezeigt). Die Verwendung eines Plasmids mit niedriger Kopienzahl für die Expression von rns hätte diese Wirkung möglicherweise verringern können. Daher könnte die Regulation der CS-Proteine in den Vakzinstämmen durch die Einführung anderer Regulatorproteine verändert werden.
  • 1.2.2 Chromosomale Expression
  • CS4- und CS2-Operone sind normalerweise auf dem Chromosom in Wildtyp-Stämmen zu finden und die anderen CS-Operone sind auf Plasmiden mit einer geringen Kopienzahl angesiedelt. Um Plasmidstabilitätsprobleme zu überwinden und um einen Stamm zu erzeugen, der für die Verwendung als Vakzine geeignet ist, war es wünschenswert, das CS4-Operon in das Chromosom von ACAM2006 zu einzuführen. Das würde außerdem dazu führen, dass das Operon in einer ähnlichen Kopienzahl vorhanden ist, wie in Wildtyp-Stämmen gesehen, und es wurde gehofft, dass dies einer 'Überlastung' mit zusätzlichem CS-Protein vorbeugen würde. Eine exzessive CS4-Proteinexpression könnte zur Abschwächung des Stamms führen und/oder die Expression des endogenen CS-Proteins stören.
  • 1.2.2.1 Konstruktion des Targetingvektors
  • Die Klonierungsstrategie für die chromosomale Insertion wird in 3 ausführlich beschrieben. Der Suizidvektor pJCB12 (12) wurde für die Einführung des Operons in das Chromosom verwendet. Dieses Plasmid enthält den R6K-Startpunkt und kann nur in Stämmen verbreitet werden, die λpir enthalten (21). In diesem Fall wurden pJCB12 und dessen Derivate im E. coli-Stamm DH5αλpir verbreitet. Es wurde entschieden, das Operon in den ompC-Genort von ACAM2006 einzuführen. Da das ompC-Gen selbst bereits aus diesem Stamm deletiert wurde, wurden dessen flankierenden Regionen 5' und 3'verwendet, um das CS4-Operon in die korrekte Stelle zu targetieren.
  • Dieser erste Schritt der Klonierungsstrategie umfasste die individuelle Amplifizierung der ompC-flankierenden Regionen 5' und 3' und des csaA-Gens mittels PCR (Schritt 1, 3A). Die Primere 47173 und 47174 wurden verwendet, um die stromaufwärts flankierende Region des ompC-Gens zu amplifizieren und die Primere 47177 und 47178 wurden verwendet, um die stromabwärts Region des ompC-Gens zu amplifizieren. Chromosomale DNA von ACAM2006 wurde als Matrize verwendet. Ein 721bp-Fragment, einschließlich der 5'-Region des CS4-Operons, bis zu und einschließlich der BglII-Stelle im csaA-Gen, wurde unter Verwendung der Primere 47175 und 47176 und unter Verwendung von chromosomaler DNA von WS-2252A als Matrize amplifiziert. Die Primere 47174 und 47175 enthielten verlängerte Sequenzen, so dass die 3'-Sequenz des PCR-Produkts der stromaufwärts ompC flankierenden Region und das 5'-Ende des csaA-PCR-Produkts komplementäre Sequenzen enthielten. Dadurch konnten die beiden Fragmente mittels Overlap-Extension-PCR unter Verwendung der Primere 47173 und 47176 (Schritt 2, 3A) zusammengefügt werden. Auf ähnliche Weise enthielten die Primere 47176 und 47177 verlängerte Sequenzen, so dass die 3'-Sequenz des csaA PCR-Produkts und die 5'-Sequenz der PCR-Produkt der flankierenden Region stromabwärts -ompC, komplementäre Sequenzen enthielten. Dadurch konnte das ompC-csaA-Fragment mit der stromabwärts ompC flankierenden Region mittels Overlap-Extension-PCR unter Verwendung der Primere 47173 und 47178 fusioniert werden (Schritt 3, 3A).
  • Das ompC-csaA-ompC-Fragment enthielt die BamHI-Stelle an den 5'- und 3'-Enden, eingeführt durch die Primere 47173 und 47178. Diese Stellen wurden verwendet, um das ompC-csaA-ompC-Fragment in die BglII-Stelle von pJCB12 zu klonieren, wobei sowohl die BamHI- und die BglII- Erkennungssequenzen zerstört wurden (Schritt 4, 3A). Dieses Plasmid wurde pJCB12-ompC-csaA-ompC genannt. Das bedeutete, dass die BglII-Stelle in dem csaA-Gen nun einmalig war und für die Klonierung des Rests des CS4-Operons verwendet werden konnte. Aus diesem Grund wurde die verbleibende 3'-Region des CS4-Operons von pACYC-CS4 mittels Verdauung mit BglII entfernt und in den BglII-Restriktionsort innerhalb des csaA-Gens eingeführt (Schritt 5, 3A). Rekombinante Plasmide mit dem csaBCE-Fragment in der korrekten Orientierung wurden mittels PCR-Screening unter Verwendung der Oligos 47105 und RGK01 identifiziert. Damit war die Konstruktion des Suizidvektors für das Targeting des CS4-Operons in den ompC-Genort abgeschlossen und das Plasmid erhielt den Namen pJCB12-ompC-CS4-ompC.
  • 1.2.2.2 Insertion des CS4-Operons in das Chromosom
  • pJCB12-ompC-CS4-ompC wurde verwendet, um den konjugationsfähigen, tetracyclinsensitiven E. coli-Stamm SM10λpir (23) zu transformieren. ACAM2006 wurde durch Transformation mit dem Plasmid pACYC184 (5) tetracyclinresistent gemacht. Der Stamm SM10λpir-pJCB12-ompC-CS4-ompC wurde mit ACAM2006-TetR mittels 'Kreuzstreichen' auf LB-Agarplatten konjugiert. Eine 2 cm große quadratische Fläche wurde dicht mit einem Stamm ausgestrichen und dann mit dem anderen Stamm senkrecht dazu überstrichen. Nach einem Wachstum über Nacht bei 37°C wurden die Zellen abgeschabt und auf Agarplatten verteilt, die Chloramphenicol und Tetracyclin enthielten. Transkonjugante, in die pJCB12-ompC-CS4-ompC eingeführt wurde in das Chromosom von ACAM2006-TetR, bildeten Kolonien, während keiner der Ausgangsstämme auf dieser Antibiotika-Kombination wachsen konnte. Die homologe Rekombination des CS4-Operons in die korrekte Stelle (d. h. den ompC-Genort) wurde durch PCR, unter Verwendung der Oligos 4732 und 47105, bestätigt.
  • Nachdem das CS4-Operon in den ompC-Genort targetiert worden war, war es notwendig, die Klone zu selektieren, an denen die Vektorsequenzen entfernt worden waren, aber das CS4-Operon war in dem Chromosom verblieben. pJCB12 enthält das Saccharasegen, das den Zellen Toxizität verleiht, die auf Saccharose wachsen, folglich wurden korrekt targetierte Transkonjuganten in einem Medium gewachsen, das 5 Saccharose enthält, um auf den Verlust des Suizidvektors zu selektieren. Nur Stämme, aus denen der Suizidvektor entfernt wurde, konnten wachsen. Die Entfernung der Vektorsequenz würde bedeuten, dass das Chloramphenicol-Resistenzgen ebenfalls verloren wäre, daher wurden die saccharoseresistenten Kolonien weiter gescreent, um zu überprüfen, ob sie chloramphenicolsensitiv wären. Die chloramphenicolsensitiven, saccharoseresistenten Kolonien wurden mittels PCR gescreent, um die Klone zu identifizieren, in denen das CS4-Operon im ompC-Genort (Primere 4732 und 47105) zurückgehalten wurde. Ein Stamm, indem das CS4-Operon korrekt eingeführt war, wurde selektiert und ACAM2006-CS4 genannt.
  • 1.2.2.3 Expression von CS4 vom chromosomalen Genort
  • ACAM2006-CS4 wurde über Nacht auf Platten gewachsen, die LB-Agar, CFA-Agar oder CFA-Agar plus 0,15% Gallensalze enthielten. Die CS-Proteine wurden mittels Wärmeentzug präpariert, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben. Ähnliche Präparate wurden zum Vergleich aus ACAM2006 hergestellt. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE auf 14% Tris-Gly-Polyacrylamidgelen (Novex) analysiert, die Bänder wurden mittels Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) oder mittels Western Blot (4A und B) visualisiert. Die Blots wurden mit Kaninchen-CS4-, -CS5- und -CS6-spezifischen Antikörpern und einem Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat (Sigma A4914) gefärbt, wie im Abschnitt „Materialen und Verfahren" beschrieben.
  • Niedrige Level von CS6 wurden bei ACAM2006 und ACAM2006-CS4 nachgewiesen, wenn die Stämme entweder mit oder ohne Gallensalzen gewachsen wurden, obwohl etwas höhere Level nachgewiesen wurden, wenn Gallensalze vorhanden waren. CS5 wurde in beiden Stämmen nachgewiesen, aber nur, wenn dem Agar Gallensalze zugefügt worden waren. CS4 war nur in ACAM2006-CS4 vorhanden, und nur in Gegenwart von Gallensalzen.
  • Daher wurde ein Stamm erzeugt, in dem CS4, CS5 und CS6 alle in guten Levels exprimierten. Wie bei Plasmid pACYC-CS4 gezeigt, hat sich die Kontrolle der CS4-Expression zur Gallensalzabhängigkeit hin verschoben, ähnlich dem, was natürlich bei der CS5-Expression festgestellt wurde. Diese Art von Regulation sollte in einem Vakzinstamm gut wirken, in dem CS-Proteine in vivo induziert werden. Es ist jedoch möglich, das Muster der Regulation durch Einführung eines anderen Regulators, wie etwa rns oder cfaD zu verändern (Abschnitt 1.2.1).
  • ACAM2006 und ACAM2006-CS4 tragen ein P2-ähnliches bakteriophages Genom im Chromosom (Abschnitt 1.2.1). Ein großer Teil dieses Genoms wurde aus beiden Stämmen deletiert, um deren Tauglichkeit als Komponenten einer Vakzine zu erhöhen. Diese Deletion hat die Expression von CS4, CS5 oder CS6 nicht beeinträchtigt. Der bakteriophagen-deletierte ACAM2006-Stamm ist ACAM2012 (hinterlegter Stamm mit der Akzessionsnummer 020282968). Stamm ACAM2012-CS4 (ACAM2013) wurde mit der Akzessionsnummer 02082969 hinterlegt, wie oben beschrieben.
  • Beispiel 2 – Herstellung eines CS1-, CS2-, CS3-Stamms (CS1 exprimiert in einem CS2/CS3-Stamm)
  • 2.1 Klonierung des CS1-Operons.
  • Die Gene des CS1-Operons von ETEC wurden sequenziert (Genbank Akzessionsnummern M58550, X62495, X76908). Diese Sequenzen wurden in das vollständige Operon (cooB, cooA, cooC, cooD) kompiliert und die Restriktionsorte wurden unter Verwendung des VectorNTi-Programms, Version 7 (Informax) analysiert (5A). Es wurden zwei Stellen identifiziert, die für die Klonierung des intakten Operons mittels Restriktionsverdauung geeignet sind: EcoRV stromaufwärts von cooB, und BglII stromabwärts von cooD. Die vom CS1/CS3-Stamm E1392/75-2A (Tabelle 1) purifizierte Plasmid-DNA wurde mit EcoRV und BglII verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente von ungefähr 6,6 kb wurden aus dem Gel unter Verwendung des QIAquick Gelextraktionskits isoliert. Dies war die korrekte Größe für das CS1-Operon, wie aus den kompilierten Genbank-Sequenzen vorhergesagt. Die 6,6 kb-Fragmente wurden in den Klonierungsvektor pACYC184 ligiert ((5); geliefert von NEB, 1B), der mit EcoRV und BamHI verdaut worden war. Die ligierten Kolonien wurden verwendet, um E. coli K12 zu transformieren und die Kolonien wurden auf Agarplatten selektiert, die Chloramphenicol enthielten.
  • Korrekte Konstrukte wurden mittels Verdauung mit HindIII oder HindIII/SphI identifiziert. Dieses Konstrukt wurde pACYC-CS1 (5B) genannt.
  • 2.2 Plasmidexpression
  • Stamm ACAM2007, ein abgeschwächter CS2/CS3-Stamm wurde mit pACYC-CS1 mittels Elektroporation transformiert. Dieser Stamm wurde ACAM2007-pCS1 genannt. Die Stämme PTL003 (CS1/CS3), ACAM2007 und ACAM2007-pCS1 wurden auf CFA-Agarplatten verteilt und CFA-Proteine wurden mittels Wärmeentzug präpariert, wie im Abschnitt „Materialen und Verfahren" beschrieben. Die Proben wurden mittels Elektrophorese auf 14% Tris-Gly-Polyacrylamidgelen analysiert. Um die CS2- und CS3-Proteine mit ungefähr jeweils 15,3 und 15,1 kDa zu resolvieren, wurden Gele in einer Länge von 14 cm verwendet. CS-Proteine wurden mittels Western Blot nachgewiesen, (6) mit Kaninchen-CFA/II-spezifischen Antikörpern gefärbt, (die CS1, CS2 und CS3 erkennen) und wie in den Abschnitten „Materialien und Verfahren" beschrieben, entwickelt.
  • CS1 und CS3 wurden in PTL003 nachgewiesen, CS2 und CS3 wurden in ACAM2007 nachgewiesen und CS1, CS2 und CS3 wurden in ACAM2007-pCS1 nachgewiesen. Folglich haben wir bewiesen, dass es möglich ist, drei CFA/II-Antigene in einem einzigen Stamm zu exprimieren.
  • 2.3 Chromosomale Insertion
  • Ein CS2/CS3-Stamm, der CS1 exprimiert, kann eine Komponente einer ETEC-Vakzine bilden, sogar wenn das CS1-Operon auf einem stabilen Plasmid getragen wird, für eine erhöhte Stammstabilität wäre es jedoch wünschenswert, das CS1-Operon in das Chromosom des Stamms einzufügen. Es könnte eine ähnliche Strategie wie jene, die in Abschnitt 1.2.2 für den CS4/CS5/CS6-Stamm beschrieben ist, oder eine andere, den Fachleuten bekannte Technik, verwendet werden.
  • Beispiel 3 – Herstellung eines CS4-, CS5-, CS6-Stamms (CS5 exprimiert in einem CS4/CS6-Stamm)
  • 3.1 Klonierung des CS5-Operons.
  • Die Sequenz des CS5-Operons wurde publiziert (Genbank AJ224079). Die computergestützte Restriktionsanalyse dieser Sequenz (unter Verwendung von Vector NTi, Version 7, Informax) offenbarte eine AgeI-Stelle stromaufwärts des ersten Gens des Operons (csfA) und eine XmaI-Stelle stromabwärts des letzten Gens des Operons (csfD) (7A). Diese Stellen waren geeignet für die Klonierung des intakten Operons mittels Restriktionsverdauung, wobei alle PCR-bezogene Fehler vermieden wurden. Der 'Überhang', der mittels Verdauung mit AgeI generiert wurde, ist komplementär zum XmaI-Überhang, folglich könnte das Fragment direkt in den XmaI-Schnittvektor kloniert werden. Der Vektor pACYC184 enthielt jedoch keine XmaI-Stelle und erforderte so eine gewisse Modifikation (7B). Ungefähr 276 bp von pACYC184 von der einzigen BamHI-Stelle an Position 3961 zur einzigen SalI-Stelle an Position 4237 wurde unter Verwendung von Primer 47180 und Primer 47182 amplifiziert. Sowohl die BamHI- als auch die SalI-Stellen wurden erhalten, und Primer 47182 führte außerdem eine neue XmaI-Stelle 5' der SalI-Stelle ein. Das 295 bp-PCR-amplifizierte-DNA-Fragment wurde mit SalI und BamHI verdaut und in pACYC184 kloniert, der ebenfalls mit SalI und BamHI verdaut worden, und daher eine neue und einzige XmaI-Stelle in den Vektor eingeführt hat. Dieser Vektor wurde pACYC-XmaI (7B) genannt.
  • Die Plasmid-DNA wurde vom Stamm WS2773-E (CS5/CS6) isoliert und ein Abschnitt wurde mit AgeI und XmaI verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die DNA-Fragmente von etwa 7 kb wurden von dem Gel unter Verwendung eines QIAquick Gelextraktionskit (QIAgen) isoliert, und mit pACYC-XmaI ligiert, das ebenfalls mit XmaI verdaut worden war, und mit alkalischer Kälberdarmphosphathase (CIP) behandelt worden war. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um das E. coli XL10 Gold KanR zu transformieren und die Kolonien wurden auf Agar-Platten selektioniert, die Chloramphenicol enthalten. Die Kolonien wurden mittels PCR mit den Primeren 47168 und 47167 auf Plasmide gescreent, die das CS5-Operon enthalten. Die Orientierung wurde unter Verwendung der Primere 47180 und 47168 bestimmt. Ein korrektes Plasmid wurde pACYC-CS5 genannt (7C).
  • 3.2 Plasmidexpression
  • Stamm ACAM2009, ein abgeschwächter CS4/CS6-Stamm, wurde mit pACYC-CS5 mittels Elektroporation transformiert, und der Stamm wurde ACAM2009-pCS5 genannt.
  • Die Stämme ACAM2009 und ACAM2009-pCS5 wurden auf CFA-Ag0arplatten verteilt, die 0,15% Gallensalze enthielten und die CFA-Proteine würden wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben, purifiziert. Die Proben wurden mittels SDS PAGE auf 14% Tris-Gly-Gelen (Novex) analysiert und die Bänder wurden mittels Western Blot (8A) visualisiert. Die Blots wurden mit Kaninchen-CFA/IV-spezifischen Antikörpern gefärbt, die CS4, CS5 und CS6 nachweisen und Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat (Sigma A4914). Alle drei CS-Proteine (CS4, CS5 und CS6) wurden in Stamm ACAM2009-pCS5 in Gegenwart von Gallensalzen nachgewiesen. Um zu bestimmen, ob die Gallensalze für die CS5-Expression notwendig sind oder nicht (wie in natürlichen CS5/CS6-Stämmen), wurden ACAM2006, ACAM2009 und ACAM2009-pCS5 auf Agarplatten mit oder ohne Gallensalze verteilt und die CFA-Proteine wurden, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" beschrieben, purifiziert. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Western Blotting, unter Verwendung CFA/IV-spezifischer Antikörper (8B). Wie erwartet wurde CS5 in ACAM2006 nur exprimiert, wenn Gallensalze in den Medien vorhanden waren, während CS4 in ACAM2009 sowohl mit als auch ohne Gallensalze in den Medien vorhanden war. In ACAM2009-pCS5 waren sowohl CS4 als auch CS5 unabhängig von der Gegenwart von Gallensalzen in dem CFA-Agar vorhanden. Vermutlich ist der cfaD-Regulator, der in ACAM2009 vorhanden ist und die Expression von CS4 auf Gallensalz-unabhängige Art kontrolliert, ebenfalls in der Lage, die Expression von CS5 zu regulieren.
  • 3.3 Chromosomale Insertion
  • Ein CS4/CS6-Stamm, der CS5 exprimiert, kann eine Komponente einer ETEC-Vakzine bilden, sogar wenn das CS5-Operon auf einem stabilen Plasmid getragen wird, für eine erhöhte Stammstabilität wäre es jedoch wünschenswert, das CS5-Operon in das Chromosom des Stamms einzufügen. Es könnte eine ähnliche Strategie, wie die in Abschnitt 1.2.2 beschriebene, oder eine andere den Fachleuten bekannte Technik, verwendet werden.
  • Beispiel 4 – Andere Stammkombinationen
  • Wir wollten wissen, ob die Expression von CS-Proteinen in den Stämmen durch den CFA-Typ beschränkt ist, wäre es zum Beispiel möglich, CFA/II-Proteine innerhalb eines CFA/IV-Stamms zu exprimieren? Um dies zu untersuchen, wurden Plasmide verwendet, die klonierte CS-Operone tragen, um die ETEC-Stämme verschiedener CFA-Typen zu transformieren.
  • 4.1 Koexpression von CFA/II und CFA/IV
  • pACYC-CS4 (Abschnitt 1.1) wurde verwendet, um PTL003 zu transformieren (ein abgeschwächter CS1/CS3-Stamm, Tabelle 1), um PTL003-pCS4 zu erzeugen. PTL003, PTL003-pCS4 und ACAM2009 (ein abgeschwächter CS4/CS6-Stamm) wurde auf CFA-Agarplatten verteilt und CS-Proteine wurden wie in Abschnitt „Materialen und Verfahren" beschrieben, purifiziert". Die Proben wurden mittels Elektrophorese auf 14% Tris-Gly-Gelen (Novex) analysiert und die Bänder wurden mittels Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) visualisiert (9). CS1 und CS3 wurden in PTL003 nachgewiesen und CS4 wurde in ACAM2009 nachgewiesen. In PTL003-pCS4 waren CS1, CS3 und CS4 vorhanden. Dies zeigte an, dass es möglich ist, CFA/II- und CFA/IV-Antigene in einem einzigen Stamm zu exprimieren.
  • 4.2 Vergleichsbeispiel: Koexpression von CFA/I und CFA/IV
  • Um zu testen, ob die mehrfache Expression von CS-Proteinen in einem einzigen Stamm durch den CFA-Typ eingeschränkt ist, wurde pACYC-CS4 (Abschnitt 1.1) verwendet, um Stamm ACAM2010 (einen abgeschwächten CFA/I-Stamm) zu transformieren, um ACAM2010-pCS4 zu erzeugen. ACAM2010, ACAM2010-pCS4 und WS-2252A (CS4/CS6) wurde auf CFA-Agarplatten verteilt und CFA-Proteine wurden wie in Abschnitt „Materialen und Verfahren" beschrieben, purifiziert". Die Proben wurden mittels Elektrophorese auf 14% Tris-Gly-Gelen (Novex) analysiert und die Bänder wurden mittels Färbung mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) oder mittels Western Blot, unter Verwendung von CS4- und CFA/I-spezifischen Kaninchen-Antikörpern visualisiert (10). CFA/I wurde in ACAM2010 nachgewiesen und CS4 wurde in WS-2252A nachgewiesen. In Stamm ACAM2010-pCS4 waren sowohl CFA/I als auch CS4 vorhanden. Dies zeigte an, dass es möglich ist, zwei verschiedene CFA-Antigene in einem einzigen Stamm zu exprimieren.
  • Beispiel 5 Einführung mehrfacher genetischer Mutationen in bakterielle Vakzinstämme
  • Dieser Abschnitt beschreibt die Generierung eines neuartigen Suizidvektorplasmids, pJCB12, und dessen Verwendung für die Einführung von Mutationen in chromosomal- oder plasmidcodierte Genorte. Die Herstellung und die Verwendung von pJCB12 ist beschrieben in der UK-Patentanmeldung 0121998.9 und in der internationalen Patentanmeldung, die Priorität vor der UK-Patentanmeldung 0121998.9 beansprucht, und von Acambis Research Limited am gleichen Tag wie die vorliegende internationale Anmeldung eingereicht wurde. Die Inhalte dieser internationalen Anmeldung sind als Bezugsdokumente beigefügt.
  • Suizidvektorplasmide, wie etwa pDM4 (24), pJCB12, pCVD442 (12) und andere, können verwendet werden, um definierte genetische Konstrukte in spezifische Targets im bakteriellen Genom einzuführen. Das Plasmid pJCB12 ist ein neuer optimierter Suizidvektor, basierend auf dem zuvor konstruierten Suizidvektor pDM4. Das definierte genetische Konstrukt, das in das bakterielle Genom eingeführt werden soll, kann eine Deletionsmutation eines spezifischen Gens sein, oder eine komplexere Struktur, wie zum Beispiel eine Insertion eines Gens innerhalb eines anderen, und von einem ausgewählten Promoter von innerhalb des Konstrukts exprimiert sein. Im Allgemeinen werden die Enden dieses Konstrukts aus Nukleotidsequenzen bestehen, die abgeleitet sind von der Region des zu targetierenden Gens.
  • Die Suizidvektoren pDM4 und pJCB12 besitzen eine Reihe von Schlüsselkomponenten (vgl. 11 und 12):
    Ein Replikationsstartpunkt, der die Replikation des Vektors in einigen Bakterienstämmen leitet, aber nicht in allen, ist oriR6K. oriR6K ist der Replikationsstartpunkt, abgeleitet vom natürlich auftretenden Plasmid R6K. Dieser Startpunkt erfordert für die Replikation das R6K pir-Gen, das in Suizidvektoren nicht vorhanden ist. Es sind drei Labor-E. coli-Stämme erhältlich, die das pir-Gen auf ihrem Chromosom tragen, und das sind SY327λpir, SM10λpir und DH5αλpir. Alle drei dieser Stämme können verwendet werden, um pDM4, pJCB12 und deren Derivate zu verbreiten.
    Ein Transferstartpunkt, der den Konjugationstransfer des Vektors von einem bakteriellen Stamm zum anderen leitet, ist mobRP4. mobRP4 ist der Transferstartpunkt des natürlich auftretenden Plasmids RP4. Dieses erlaubt den Konjugationstransfer von pDM4 und pJCB12 und deren Derivaten zu bakteriellen Empfängerstämmen. Um zu funktionieren, müssen für mobRP4 die Gene, die die RP4-Transferfunktionen codieren, in der bakteriellen Spenderzelle vorhanden sein. Der Labor-E.-coli-Stamm SM10λpir trägt diese Gene auf seinem Chromosom, und so kann dieser Stamm als Spenderstamm für pDM4, pJCB12 und dessen Derivate verwendet werden.
    Ein Gen, das ein Produkt codiert, dass für bakterielle Zellen toxisch ist, wenn die Zellen unter bestimmten Bedingungen gewachsen werden, ist sacB. sacB codiert für Lävansaccharase, die ein Produkt herstellt, das für gramnegative Bakterien toxisch ist, wenn sie auf Saccharose gewachsen werden.
    Ein selektierbarer Marker ist cat. cat codiert für Chloramphenicol-Acetyltransferase und verleiht dem antibakteriellen Chloramphenicol Resistenz.
    Eine Mehrfachklonierungsstelle (MCS), d. h. eine Stelle in die definierte genetische Konstrukte für die Einführung in eine bakterielle Empfängerzelle kloniert werden können.
  • Der -Suizidvektor pJCB12 ist eine modifizierte Version von pDM4, in der ein Großteil der intergenischen und nicht funktionellen DNA entfernt wurde. Folglich gibt es bei der Verwendung dieses Suizidvektors sehr viel weniger Möglichkeiten für ein fehlerhaftes Targeting. Während pDM4 ungefähr 7 kb groß ist, ist pJCB12 nur 3 kb groß, behält aber alle Schlüsselkomponenten. Insbesondere hat die mobRP4-Region von pJCB12 lediglich 0,15 kb, und die IS1-ähnlichen Nukleotidsequenzen wurden aus der sacB-Region entfernt. Diese Modifikationen sind besonders vorteilhaft, wenn ETEC-Stämme manipuliert werden, die im Allgemeinen viele Plasmide beherbergen, die als unerwünschte Targets der homologen Rekombination mit Komponenten des Suizidvektors agieren können. Des Weiteren erlaubt die geringere Größe von pJCB12 eine leichtere In-vitro-Manipulation und eine leichtere Konstruktion von Derivaten, da kleinere DNA-Moleküle zusammenligieren und sich effizienter in E.-coli-Wirte transformieren, wodurch sie die Chancen verbessern, Derivate mit der korrekten Konstruktion zu erhalten. Die geringere Größe erlaubt außerdem eine größere Effizienz bei der Einführung der Konstrukte in Empfängerbakterien mittels Transformation eher als mittel Konjugation.
  • Der Labor-E. coli-Stamm SM10λpir kann verwendet werden, um pJCB12 und dessen Derivate zu den bakteriellen Empfängerstämmen mittels Konjugation zu transferieren, weil er die tra-Funktionen des Plasmids RP4 hat, die in sein Chromosom eingefügt sind. Jedoch zeigt Stamm SM10λpir relative niedrige Transformationshäufigkeiten. Aus diesem Grund würde Stamm DH5αλpir normalerweise für die Konstruktion von pJCB12-Derivaten verwendet werden, und sobald die Derivate der korrekten Konstruktion identifiziert worden wären, würden diese zu SM10λpir für die Einführung in Empfängerstämme mittels Konjugation transferiert.
  • Konstruktion des Suizidvektors pJCB12
  • Der Suizidvektor pJCB12 wurde mittels mehrerer Runden von Overlap-Extension-PCR (30, 13), unter Verwendung von pDM4-Plasmid-DNA als Matrize konstruiert. Anfänglich wurden vier Fragmente aus pDM4 mittels PCR amplifiziert, unter Verwendung der 'High-Fidelity-DNA-Polymerase, Pfu TurboTM. Diese waren das oriR6K-Fragment, amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 4714 und 4715; das mobRP4-Fragment, amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 4716 und 4717; und das cat-Gen wurde in zwei Teilen amplifiziert, unter Verwendung der Oligonukleotide 4718 mit 4719 und 4720 mit 4721. Dies wurde gemacht, um einen EcoRI-Restriktionsort der Enzyme innerhalb der cat-Gens zu entfernen. Das oriR6K-Fragment und das mobRP4 wurden dann in einer Overlap-Extensions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide 4714 und 4717 verbunden. Ebenso wurden die cat-Fragmente unter Verwendung der Oligonukleotide 4718 und 4721 verbunden. Diese zwei resultierenden Fragmente wurden in einer finalen Overlap-Extensions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide 4717 und 4718 verbunden. Das resultierende PCR-Produkt wurde ligiert und in SY327λpi r-Zellen transformiert und die Transformanten wurden auf L-Agar selektiert, das mit Chloramphenicol von 20 mg/ml angereichert war. Transformante, die Plasmide der korrekten Größe beherbergen, wurden erhalten und eine dieser, genannt pDM4A7, wurde für die weitere Manipulation ausgewählt.
  • In diesem Schritt, sind die oriR6K- und cat-Komponenten des Plasmids pDM4A7 eindeutig funktionell. Um jedoch zu bestätigen, dass der mobRP4-Genort funktionell war, wurde das Plasmid pDM4A7 in den Stamm SM10λpir transformiert. Diese Transformanten wurden auf L-Agar gesammelt, das mit Chloramphenicol von 15 mg/ml und Naladixinsäure von 5 mg/ml angereichert war. Dieses L-Agar wurde mit Zellen des Stammes SY327λpir „kreuzgestrichen". Während Chloramphenicol diese bakteriellen Zellen selektiert, die pDM4A7 beherbergen, selektiert Nalidixinsäure nach SY327λpir. Nach der Inkubation über Nacht, wuchsen viele Kolonien, wo die Stämme „kreuzgestrichen" waren, aber nirgendwo anders auf der Platte wuchs etwas, womit bestätigt wurde, dass pDM4A7 aus Stamm SM10pir mobiliserbar ist und dass der mobRP4-Genort funktionell ist.
  • Das Plasmid pDM4A7 wurde dann mit EcoRI verdaut, mit with Pfu TurboTM-DNA-Polymerase behandelt und ligiert, um die EcoRI-Restriktionsort der Enzyme zu entfernen, um das Plasmid pDM4A7EcoRI zu generieren. Ein kurzes HindIII-Fragment von pDM4, das die Mehrfachklonierungsstelle beinhaltet, wurde dann ligiert in pDM4A7EcoRI, verdaut mit HindIII. Die Ligationsreaktion wurde in SY327λpir transformiert und die Transformanten auf L-agar selektiert, das mit 20 mg/ml Chloramphenicol angereichert ist.
  • Das Oligonukleotid R6K-01 hybridisiert innerhalb des kurzen HindIII-Fragments von pDM4, das die Mehrfachklonierungsstelle beinhaltet. Folglich wurden die Transformanten mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide R6K-01 und 4720 gescreent, um jene zu identifizieren, die das gewünschte Plasmidkonstrukt beherbergen. Eine Reihe derartiger Transformanten wurden identifiziert, und eine dieser, genannt pDM4A7E, wurde für die weitere Manipulation ausgewählt.
  • Plasmid pDM4A7E trägt drei EcoRI-Stellen sehr nahe beieinander auf dem kurzen HindIII-Fragment von pDM, die die Mehrfachklonierungsstelle beinhaltet. Die zwei sehr kurzen EcoRI-Fragmente von pDM4A7E wurden folglich mittels Verdauung mit EcoRI entfernt, gefolgt von Ligation. Die resultierte in einem pDM4A7E-Derivat, das nur eine EcoRI-Stelle besitzt, welche pJCB10 genannt wurde. Die Region von pJCB10, die oriR6K beinhaltet und die MCS wurden amplifiziert, unter Verwendung der Oligonukleotide 4715 und 4917 und die Nukleotidsequenzbestimmungen für einen Teil dieses Fragments wurden unter Verwendung von Oligonukleotid 4917 durchgeführt Dies präsentierte uns eine Nukleotidsequenz über der MCS, die vorher unbekannt war.
  • Das sacB-Gen wurde unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase und der Oligonukleotide 4722 und 4723 amplifiziert. Das 1,6 kb-Product wurde mit dem Plasmidvektor pPCR-ScriptTM (Stratagene) ligiert und in E. coli XL10 GoldTM Zellen (Stratagene) transformiert. Es wurden Transformanten erhalten und die Funktionalität des sacB-Gens wurde bestätigt durch plattieren der Klone auf L-agar und 5% Saccharose-Agar. Ein Konstrukt zeigte gutes Wachstum auf L-Agar, und keines auf dem 5%-Saccharose-Agar, und wurde daher als Quelle für das sacB-Gen ausgewählt. Das sacB-Gen wurde dann von diesem Klon, unter Verwendung der Restriktionsenzyme PstI verdaut, wobei diese Stellen in die Oligonukleotide 4722 und 4723 zu diesem Zweck eingebaut wurden, und mit pJCB10 ligiert, das ebenfalls mit PstI verdaut worden war. Die Kolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 4716 und 4766 überprüft, wobei ein Produkt der erwarteten Größe (~1700 bp) geerntet wurde. Wieder wurde die Funktionalität des Gens durch plattieren der Klone auf L-Agar und 5% Saccharose-Agar bestätigt Ein Konstrukt wuchs auf dem L-Agar, aber nicht auf dem 5% Saccharose-Agar. Die Sequenzierung dieses Konstrukts unter Verwendung der Oligonukleotide 4716 bzw. 4766, gab die Orientierung des sacB-Gens an. Diese Konstrukt wurde pJCB12 genannt.
  • Verwendungsprinzip von pJCB12
  • Sobald ein definiertes genetisches Konstrukt in pJCB12 ligiert worden ist, um ein pJCB12-Derivat zu ergeben, wird das Plasmid in den Empfängerstamm, wie etwa einen ETEC-Stamm transferiert. Dies kann gemäß den Verfahren erfolgen, die den Fachleuten gut bekannt sind, entweder mittels Konjugation von dem pJCB12-Wirtsstamm SM10λpir, oder mittels Transformation des purifizierten pJCB12-Derivats direkt in den Empfängerstamm.
  • Transkonjugante oder Transformante werden auf bakteriologischen Wachstumsmedien selektiert, die mit dem antibiotischen Chloramphenicol angereichert sind. Da der Suizidvektor pJCB12 nicht in der Lage ist, sich in Abwesenheit des pir-Gens zu replizieren, werden alle Transkonjugante oder Transformante, die wachsen, im Allgemeinen aus der Fusion des pJCB12-Derivats mit einem anderen Replikon mittels homologer Rekombination resultieren.
  • Um den definierten Mutationsprozess völlig zu optimieren, kann eine neuartiger Ansatz gewählt werden, um die Transformanten oder Transkonjuganten unter Verwendung der PCR zu screenen, um jene zu identifizieren, in denen das pJCB12-Derivat die gewünschte Region des Genoms targetiert hat. Hierfür wurde ein Oligonukleotid designed, das innerhalb der pJCB12-Nukleotidsequenzen hybridisiert, die an die MCS angrenzen, wo das definierte genetische Konstrukt eingeführt wurde. Das andere Oligonukleotid wurde designed, um zur Region des Genoms zu hybridisieren, das targetiert werden soll, angrenzend zu, aber außerhalb des definierten genetischen Konstrukts. Transformante oder Transkonjugante, die positiv sind, werden unter Verwendung dieser PCR, das pJCB12-Derivat, auf die korrekte Region des Genoms (vgl. 14) targetiert haben.
  • Sobald die korrekten Rekombinanten identifiziert wurden, müssen die Derivate isoliert werden, in denen der pJCB12-Vektor verloren ging. Derartige Derivate können selektiert werden, indem das bakteriologische Wachstumsmedium mit 5 Saccharose angereichert wird. Diese Saccharose-Selektion kann effizienter gemacht werden, indem ein modifiziertes L-Medium verwendet wird, in dem der Inhaltsstoff NaCl nicht vorhanden ist, und das mit 5% Saccharose angereichert ist. Unter diesen Bedingungen ist das sacB-Gen von pJCB12 toxisch, und nur Derivate, in denen das sacB-Gen verloren ging, werden wachsen. Dieses Ereignis geschieht wieder mittels homologer Rekombination und hat eine ganze Reihe von Ergebnissen. Erstens, ein Reversionsereignis wird dazu führen, dass es in der targetierten Region bleibt wie es war. Zweitens kann die homologe Rekombination in dem definierten genetischen Konstrukt dazu führen, mit der targetierten Region ausgetauscht zu werden, was dazu führt, dass das definierte Konstrukt in die Target-Region eingebaut wird. Wenn des Weiteren die targetierte Region Teil eines Plasmids ist, wie etwa bei vielen der Toxingene der ETEC-Stämme, dann können zwei weitere Ereignisse auftreten. Diese sind, drittens, ein undefiniertes spontanes Deletionsereignis, das zu einem Verlust eines Teils der targetierten Region führt, das sich über die Grenzen des definierten genetischen Konstrukts hinaus ausbreiten kann, und, viertens, den Verlust des gesamten Plasmids, ein Ereignis, das mit dem Begriff „spezifisches Curing von Plasmiden" beschrieben wird.
  • Das Testen der saccharoserestistenten Derivate mittels PCR kann die gewünschten Rekombinaten identifizieren. Hierfür werden Oligonukleotide verwendet, die an jedem Ende der targetierten Region und außerhalb des definierten genetischen Konstrukts hybridisieren. Wenn das PCR-Produkt die gleiche Größe hat wie vor der Einführung des pJCB12-Derivat-Konstrukts, dann ist ein Reversionsereignis aufgetreten. Wenn zum Beispiel das genetisch definierte Konstrukt eine Deletionsmutation ist, dann sollte das PCR-Produkt kleiner als zuvor und von vorhersehbarer Größe sein. Spezifisches Curing von Plasmiden und undefinierte spontane Deletion wird normalerweise dazu führen, dass kein PCR-Produkt entsteht oder dass nicht-spezifische Produkte von unerwarteter Größe bei dieser Art von PCR-Reaktion auftreten.
  • Zusammenfassend kann der Vektor pJCB12 (oder ein anderer ähnlicher Vektor der Erfindung) in einem Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle verwendet werden, in der ein Targetgen (z. B. ein Toxingen, wie etwa ST, LT oder EAST1 oder ein chromosomales Gen, wie etwa ein omp- oder aro-Gen) deletiert, inaktiviert oder ersetzt wird, dessen Verfahren das Transferieren des Vektors in eine bakterielle Zelle, die das Targetgen enthält, und das Selektieren nach einer Zelle, in der das Targetgen deletiert, inaktiviert oder ersetzt wurde, umfasst. Die Selektion kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Mehrschrittverfahrens gemäß der folgenden Beschreibung:
    • – Selektion nach einer Zellkolonie, die den selektierbaren Marker enthält. Wenn die Zelle, in die der Vektor transferiert wurde, eine ist, die die Replikation des Vektors vom Replikationsstandort aus nicht unterstützt, identifiziert die Selektion für eine solche Zellkolonie Zellen, in denen der Vektor in ein zelluläres Replikon eingebaut wurde;
    • – Durchführung der PCR- zur Selektion einer Zelle, in der der Vektor korrekt das Targetgen targetiert hat, worin eine der in der PCR verwendeten Primere zur Vektorsequenz hybridisiert, die an die Klonierungsstelle angrenzt, und der andere zu einer Stelle in der zellulären DNA hybridisiert, die an das Targetgen angrenzt. Eine positive PCR zeigt an, dass der Vektor das Targetgen targetiert hat.
    • – Die Selektion nach einer Zelle, deren Vektorsequenz verloren ging, mittels Wachsen der Zelle unter Bedingungen, die die Gencodierung eines Produkts wirksam machen, dass für Zellen toxisch ist, wenn sie unter definierten Bedingungen gewachsen werden. Das Überleben einer Zelle zeigt an, dass die Vektorsequenz verloren ging. In dem Fall, in dem das Gen, das das toxische Produkt codiert sacB ist, kann die Zelle in einem Medium gewachsen werden, dass mit Saccharose angereichert ist, und das kein NaCl enthält; das Produkt von sacB ist toxisch, wenn die Zellen in diesem Medium gewachsen werden.
    • – Schließlich kann die PCR unter Verwendung von Primeren durchgeführt werden, die an Positionen außerhalb, und angrenzend zu jedem Ende des Targetgens hybridisieren, wobei ein PCR-Produkt, das kleiner ist als das Produkt, das von einer Wildtypzelle erhalten wird, eine Deletionsmutation anzeigt.
  • Zum Beispiel erfolgte in der vorliegenden Studie im Allgemeinen Folgendes:
    Bakterielle Konjugationen wurden durchgeführt durch Mischen von Spender- und Empfänger-ETEC-Stämmen auf L-Agar und Inkubation bei 37°C zwischen 3 und 18 Stunden. Das bakterielle Wachstum wurde in eine L-Nährlösung abgeschabt und auf L-Agarplatten plattiert, die mit Chloramphenicol und anderen geeigneten Antibiotika angereichert waren, um die ETEC-Stämme zu selektieren (Streptomycin für Stamm B, Tetracyclin für andere ETEC-Stämme), die das pJCB12-Derivat eingebaut hatten.
  • Zur Identifikation der korrekt targetierten Rekombinanten, Transkonjuganten oder Transformanten, die durch das Wachstum auf dem L-agar erhalten wurden, das mit Chloramphenicol angereichert ist, gefolgt von der Einführung des pJCB12-Derivat-Konstrukts, wurden mittels PCR getestet, um jene zu identifizieren, in denen der gewünschte Genort targetiert worden war. Hierfür hybridisiert eines der Oligonukleotide innerhalb der pJCB12-Nukleotidsequenzen, die an die Mehrfachklonierungsstelle (MCS) angrenzen, wo das definierte genetische Konstrukt eingeführt wurde. Das andere Oligonukleotid hybridisert mit dem Genom, das an das definierte genetische Konstrukt angrenzt, aber außerhalb liegt. In einer derartigen PCR zeigt die Generierung eines Fragments an, dass sich die Bindestellen für die jeweiligen Oligonukleotide verbunden haben, was nur geschehen kann, wenn das pJCB12-Derivat die korrekte Region des Genoms targetiert hat.
  • pJCB12 wurde aus den Transkonjuganten mittels Wachstum in Gegenwart von 5% Saccharose entfernt. Transkonjugante oder Transformante, die das pJCB12-Derivat auf die korrekte Region des Genoms targetieren, wurden dann auf frischen L-Agar gestrichen, der mit Chloramphenicol und anderen geeigneten Antibiotika angereichert war, um die ETEC-Stämme zu selektieren (vgl. oben), und bei 37 C inkubiert, damit die Kolonien wachsen können. Es wurden dann L-Nährlösungs-Kulturen gewachsen, die von diesen frischen Platten beimpft wurden. Die Zellen aus diesen Kulturen wurden geerntet, in 5% Saccharose-Nährlösung resuspendiert und über Nacht inkubiert vor dem Plattieren von Verdünnungsreihen auf 5 Saccharose-Agar, um die Rekombinanten zu selektieren, in denen das pJCB12-Derivat entfernt wurden. Die beimpften Saccharose-Agarplatten wurden dann über Nacht inkubiert, und die resultierenden Kolonien mittels PCR, unter Verwendung relevanter Oligonukleotide, getestet, um die Mutanten zu identifizieren.
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    TABELLE 2
    Figure 00610001
    TABELLE 3
    Figure 00620001
    Figure 00630001
    Figure 00640001
    Figure 00650001
    TABELLE 5 GENBANK AKZESSIONSNUMMERN FÜR SEQUENZDATEN
    EAST1 (astA) AF143819
    ST (estA) M18346
    LT-A (eltA) V00275
    LT-B (eltB) M17874
    CFA/I Operon M55661
    CS1 Operon M58550
    X62495
    X76908
    CS2 Operon Z47800
    CS3 Operon X16944
    CS4 Operon AF296132
    CS5 Operon AJ224079
    CS6 Operon U04844
    cfaD M55609
    csvR X60106
    rns J04166
    parDE RK2 L05507
    sacB X02730
    oriR6K M65025
    mobRP4 X54459
    cat V00622
  • Literaturverzeichnis
    • 1. Aitken and Hirst (1993) Vaccine 11(2), 227–233.
    • 2. Ausubel et al; Current Protocols in Molecular Biology. 1995: John Wiley & Sons Inc.
    • 3. Burkardt, H. J., G. Riess, and A. Puhler, Relationship of group P1 plasmids revealed by heteroduplex experiments: RP1, RP4, R68 and RK2 are identical. J Gen Microbiol, 1979. 114 (2): p. 341–8.
    • 4. Chatfield WO 99/49026
    • 5. Chang A. C. and Cohen S. N. (1978) Journal of Bacteriology 134(3): 1141–1156
    • 6. Charles WO 92/15689
    • 7. Chong et al (1998) Vaccine 16, 732–740.
    • 8. Cieplak et al (1995) Journal of Biol. Chem. 270(51), 30545–30550.
    • 9. Clements (1990) Infect. & Immun. 58(5), 1159–1166.
    • 10. Cravioto, A. 1980, PhD Thesis, University of London, London, United Kingdom.
    • 11. de Haan L. A., Willshaw, G. A., Van der Zeijst B. A. and Gaastra W. (1991) FEMS Microbiol Lett 67 (3): 341–346
    • 12. Donnenberg, M. S. and J. B. Kaper, Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect Immun, 1991. 59(12): p. 4310–7.
    • 13. Dunstan, S., Simmons, C. and Strugnell, R. Use of in-vivo regulated promoters to to deliver antigens from attenuated Salmonella typhimurium. Infection and Immunity (1999) 67, 5133–5141.
    • 14. Duthy T. G., Staendner L. H., Manning P. A. and Heuzenroeder M. W., (1999) Journal of Bacteriology 181(18): 5847–5851.
    • 15. Duthy et al (2001) Microbial Pathogenesis 31: p 115–129
    • 16. Everest, P., et al., Expression of LacZ from the htrA, nirB and groE promoters in a Salmonella vaccine strain: influence of growth in mammalian cells. FEMS Microbiol Lett, 1995. 126(1): p. 97–101.
    • 17. Froehlich, B. J., A. Karakashian, H. Sakellario and J. R. Scott, Genes for CS2 Pili of Enterotoxigenic Escherichia coli and their Interchangeability with those for CS1 Pili. Infection and Immunity, 1995 63(12): p. 4849–4856.
    • 18. Gerdes, K., P. B. Rasmussen, and S. Molin, Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(10): p. 3116–20.
    • 19. Gerdes, K., et al., The hok killer gene family in gramnegative bacteria. New Biol, 1990. 2(11): p. 946–56.
    • 20. Jalajakumari M. B. et al (1989) Molecular Microbiology 3(12): 1685–1695.
    • 21. Kolter R. et al (1978) Cell 15: 1199–1208.
    • 22. Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(259): p. 680–5.
    • 23. Miller, V. L. and J. J. Mekalanos, Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81(11): p. 3471–5.
    • 24. Milton, D. L., et al., Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. J Bacteriol, 1996. 178(5): p. 1310–9.
    • 25. Roberts, R. C., A. R. Strom, and D. R. Helinski, The parDE operon of the broad-host-range plasmid RK2 specifies growth inhibition associated with plasmid loss. J Mol Biol, 1994. 237(1): p. 35–51.
    • 26. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. 1989: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
    • 27. Scott J. R. et al (1992) Molecular Microbiology 6(3): 293–300
    • 28. Simon, R., U. Priefer, and A. Puhler, A broad host range mobilisation system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Bio/Technology, 1983. 1: p. 784–791.
    • 29. Summers et al, Mol. Genet. Genes., 201(2): 334–338.
    • 30. Tao, B. Y. and K. C. P. Lee, Mutagenesis by PCR, in PCR Technology: current innovations, H. G. Griffin and A. M. Griffin, Editors. 1994, CRC Press, Inc.: Boca Raton, Florida. p. 69–83.
    • 31. Turner, A. K., et al., Construction and characterization of genetically defined aro omp mutants of enterotoxigenic Escherichia coli and preliminary studies of safety and immunogenicity in humans. Infect Immun, 2001. 69(8): p. 4969–79.
    • 32. Valdivia, R. and Falkow, S. Fluorescence-based isolation of bacterial genes expressed within host cells. Science (1997), 277, 2007–2011.
    • 33. Willshaw G. A. et al (1988) Fems Microbiol Lett 49: 473–478
    • 34. Wolf, M. K. Occurrence, Distribution and Association of O and H Serogroups, Colonisation Factor Antigens and Toxins of Enterotoxigenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews, 1997 10(4): p 569–584.
    • 35. Wolf M. K. et al (1997) Fems Microbiol Lett 148(1): 35–42.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00700001
  • Figure 00710001
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Claims (28)

  1. Bakterielle Zelle, welche drei oder mehr Coli-Oberflächen-(CS)-Antigene exprimiert.
  2. Zelle nach Anspruch 1, welche eine E. coli-Zelle ist.
  3. Zelle nach Anspruch 2, welche eine enterotoxigene E. coli-(ETEC)-Zelle ist.
  4. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die CS-Antigene ETEC-CS-Antigene sind, ausgewählt aus CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6.
  5. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche exprimiert: (a) CS1, CS2 und CS3; (b) CS4, CS5 und CS6; oder (c) CS1, CS3 und CS4.
  6. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche abgeschwächt ist durch Deletion oder Inaktivierung eines Gens.
  7. Zelle nach Anspruch 6, welche abgeschwächt ist durch Deletion oder Inaktivierung von einem oder mehreren von aroA, aroC, aroD, aroE, pur, htrA, ompC, ompF, ompR, cya, crp, phoP, phoQ, surA, rfaY, dksA, hupA, invE und clpB.
  8. Zelle nach Anspruch 7, welche abgeschwächt ist durch Deletion oder Inaktivier-ung von (a) mindestens einem aro-Gen und mindestens einem omp-Gen; (b) mindestens einem aro-Gen und dem htrA-Gen; oder (c) jedem von aroC, ompF und ompC.
  9. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche nicht eines oder mehrere von hitzestabilem Toxin (ST), hitzelabilem Toxin (LT) oder EAST1 exprimiert.
  10. Zelle nach Anspruch 9, welche erhältlich ist: (a) durch einem Methode, umfassend die Deletion vom gesamten oder eines Teils des ST-Gens mit einem Suizid-Vektor; oder (b) mittels einer Methode, umfassend die positionsgerichtete Deletion oder Inaktivierung der LT-Gens und/oder des EAST1-Gens.
  11. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche nicht ein Antibiotikaresistenzgen exprimiert.
  12. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche außerdem ein heterologes Antigen zusätzlich zu den drei oder mehr CS-Antigenen exprimiert.
  13. Zelle nach Anspruch 12, wobei das heterologe Antigen ist: (a) ein E. coli-Antigen; oder (b) eine nicht-toxische Komponente oder Form von LT.
  14. Zelle nach Anspruch 13, wobei die nicht-toxische Komponente von LT die B-Untereinheit ist.
  15. Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche erhältlich ist durch eine Methode, umfassend die Einführung eines Polynukleotids, das ein heterologes CS-Antigen codiert, in eine bakterielle Zelle.
  16. Zelle nach Anspruch 15, wobei das Polynukleotid das Operon des heterologen CS-Antigens umfasst.
  17. Zelle nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Methode das Einführen eines Polynukleotids, das ein regulatorisches Protein codiert, in die Zelle umfasst.
  18. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin die Codierungssequenz für das heterologe CS-Antigen: (a) auf einem stabilen Plasmid in der Zelle getragen wird; oder (b) in das bakterielle Chromosom der Zelle inseriert ist.
  19. Bakterielle Zelle, wie hinterlegt unter der Zugriffsnummer 02082969 bei der ECACC.
  20. Vakzine gegen Diarrhoe, umfassend eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 19 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel.
  21. Vakzine gegen Diarrhoe, umfassend bakterielle Zellen, die zusammen alle von DFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 und CS6 exprimieren, wobei die Vakzine weniger als fünf Bakterienstämme umfasst.
  22. Vakzine nach Anspruch 21, welche drei Bakterienstämme umfasst.
  23. Vakzine nach Anspruch 22, welche umfasst: (i) einen Stamm, welcher CS1, CS2 und CS3 exprimiert; (ii) einen Stamm, welcher CS4, CS5 und CS6 exprimiert; und (iii) einen Stamm, welcher CFA/I exprimiert.
  24. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder eine Vakzine nach einem der Ansprüche 20 bis 23 für die Verwendung bei einer Methode zur Impfung gegen Diarrhoe.
  25. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 19 für die Herstellung eines Medikaments zur Impfung gegen Diarrhoe.
  26. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 19, welches das Einführen eines Polynukleotids, das ein heterologes CS-Antigen codiert, in eine bakterielle Zelle umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, worin das Polynukleotid das Operon des heterologen CS-Antigens umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, welches umfasst: (i) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS4-Antigen codiert, in eine CS5/CS6-ETEC-Zelle; oder (ii) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS1-Antigen codiert, in eine CS2/CS3-ETEC-Zelle; oder (iii) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS5-Antigen codiert, in eine CS4/CS6-ETEC-Zelle; oder (iv) Einführen eines Polynukleotids, das ETEC-CS4-Antigen codiert, in eine CS1/CS3-ETEC-Zelle.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US7468269B2 (en) * 2003-02-26 2008-12-23 University Of Massachusetts Reagents for recombinogenic engineering and uses thereof
GB0325494D0 (en) * 2003-10-31 2003-12-03 Sbl Vaccin Ab Expression system
EP1543836A1 (de) * 2003-12-17 2005-06-22 Berna Biotech AG Rekombinante Stamm von Vibrio cholerae und Impfstoff, der diesem Stamm enthält
WO2005113827A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THESECRETARY OF THE ARMY, Walter REED ARMY INSTITUTE OF RESEARCH Construction of live attenuated shigella vaccine strains that express cfa/i antigens (cfab and cfae) and the b subunit of heat-labile enterotoxin (ltb) from enterotoxigenic e. coli
EP1855718B1 (de) * 2005-01-11 2016-10-12 The United States of America as represented by The Secretary of The Navy Donor Strang komplementierte Adhesine als immunogen gegen Escherichia coli.
US9328150B2 (en) 2005-01-11 2016-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Recombinant polypeptide construct comprising multiple enterotoxigenic Escherichia coli fimbrial subunits
FR2890859B1 (fr) * 2005-09-21 2012-12-21 Oreal Oligonucleotide d'arn double brin inhibant l'expression de la tyrosinase
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli
CN101378780A (zh) * 2006-02-01 2009-03-04 Sbl疫苗公司 重组细菌中的肠产毒性大肠杆菌定居因子(cf)抗原
CN101688211A (zh) * 2007-07-02 2010-03-31 克鲁塞尔瑞典公司 用于表达肠产毒性大肠杆菌定居因子(cf)抗原的杂合操纵子
US9410157B2 (en) 2010-07-30 2016-08-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Systems and methods for the secretion of recombinant proteins in gram negative bacteria
US9273103B2 (en) * 2011-09-12 2016-03-01 Scandinavian Biopharma Holding Ab Method for increasing ETEC CS6 antigen presentation on cell surface and products obtainable thereof
US9452205B2 (en) * 2012-09-24 2016-09-27 Montana State University Recombinant Lactococcus lactis expressing Escherichia coli colonization factor antigen I (CFA/I) fimbriae and their methods of use
US10500261B2 (en) 2014-11-05 2019-12-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthetic antigen constructs against campylobacter jejuni
WO2016073773A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthetic antigen constructs against campylobacter jejuni
CN105063073A (zh) * 2015-09-16 2015-11-18 中国科学院南海海洋研究所 一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用
CA3095914A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 University Of Maryland, Baltimore Enhanced shigella-enterotoxigenic e. coli multi-valent vaccine

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58146596A (ja) * 1982-02-25 1983-09-01 Takeda Chem Ind Ltd 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途
US4935364A (en) * 1983-03-04 1990-06-19 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio cholerae and products thereof
GB8730037D0 (en) 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
SE9100556D0 (sv) 1991-02-26 1991-02-26 Holmgren Jan Preparation and use of formalin-killed colonization-factor-antigen (cfa)-expressing e coli organisms for vaccination against enteric infection/diarrhea caused by enterotoxigenic e coli bacteria in humans
WO1992015689A1 (en) 1991-03-05 1992-09-17 The Wellcome Foundation Limited Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria
US7118758B1 (en) * 1997-01-24 2006-10-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Transformed bacteria producing CS6 antigens as vaccines
US6019982A (en) * 1994-08-26 2000-02-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant
US6682729B1 (en) * 1995-05-03 2004-01-27 University Of Maryland, Baltimore Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same
US7404961B2 (en) * 1996-08-02 2008-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Peptides responsive to antibodies against consensus peptide of the CS4-CFA/I family proteins
GB9806449D0 (en) * 1998-03-25 1998-05-27 Peptide Therapeutics Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
SE9801852D0 (sv) 1998-05-26 1998-05-26 Sbl Vaccin Ab Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use
SE515285C2 (sv) 1998-12-18 2001-07-09 Sbl Vaccin Ab Oralt vaccin mot diarré
WO2001019998A1 (en) * 1999-09-15 2001-03-22 Mogam Biotechnology Research Institute Novel detoxified mutants of escherichia coli heat-labile enterotoxin
MXPA02010407A (es) * 2000-04-20 2003-05-23 Univ Maryland Aislamiento y caracterizacion del operante csa (etec-cs4-pili) y metodos para su uso.
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli
US20120064114A1 (en) * 2008-10-21 2012-03-15 Emergent Product Development United Kingdom Use of e. coli surface antigen 3 sequences for the export of heterologous antigens
US9327019B2 (en) * 2009-06-30 2016-05-03 Stc.Unm Attenuated enterohemorrhagic E. coli-based vaccine vector and methods relating thereto

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003022306A3 (en) 2003-06-26
WO2003022307A1 (en) 2003-03-20
ATE308992T1 (de) 2005-11-15
AU2002321644B2 (en) 2008-03-13
GB0121998D0 (en) 2001-10-31
US20110200638A1 (en) 2011-08-18
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US7951361B2 (en) 2011-05-31
WO2003022306A2 (en) 2003-03-20
ATE308991T1 (de) 2005-11-15
DE60207278T3 (de) 2011-05-05
AU2002321652B2 (en) 2008-04-10
ES2256515T3 (es) 2006-07-16
DK1425037T3 (da) 2006-03-27
DE60207277D1 (de) 2005-12-15
EP1425038A1 (de) 2004-06-09
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US7943122B2 (en) 2011-05-17
DE60207278D1 (de) 2005-12-15
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EP1425038B1 (de) 2005-11-09
CA2460025A1 (en) 2003-03-20
DK1425038T4 (da) 2010-12-13

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