DE69922937T2

DE69922937T2 - Lactobacilli, die aggregations und mucin bindende gene als traeger von vakzinen enthalten

Info

Publication number: DE69922937T2
Application number: DE69922937T
Authority: DE
Inventors: Ivan Casas; Hans Jonsson; Bo Mollstam; Stefan Roos
Original assignee: Biogaia Biologics AB
Current assignee: Biogaia Biologics AB
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2019-03-17
Also published as: AU3049699A; ES2237094T3; US6100388A; CA2323634A1; WO1999047657A2; ATE286130T1; EP1066375B1; DE69922937D1; EP1066375A2; AU767143B2; WO1999047657A3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von transformierten Lactobacillus Spezien und in einem besonderen Beispiel Lactobacillus reuteri (L. reuteri) als Impfstoffübertragungsvehikel.
Transformierte L. reuteri sind dafür bekannt, dass sie auf ihrer Zelloberfläche ein Epitop eines Antigens exprimieren, dass von einem pathogenen Organismus erhalten wurde, oder dieses ausscheiden. In einer Ausführungsform ist ein Gen (agg), das für ein Aggregationsprotein kodiert und/oder ein Gen (muc), das für ein Mucinbindeprotein kodiert, mit einem Gen fusioniert, das für exogenes Antigen kodiert, und wird verwendet, um Lactobacilli zu transformieren. Das exogene Antigen, das an ein Aggregationsprotein oder ein Mucinbindeprotein angehaftet ist, wird auf der Oberfläche der Zelle exprimiert, oder aus dieser in dessen Umgebung ausgeschieden. Lactobacilli, insbesondere L. reuteri sind hoch effektiv darin, die Mucosa anzustreben, sowie den Gastrointestinaltrakt, oder nasale Passagen, und wenn sie wie hierin beschrieben transformiert sind, sind sie wirksam darin, eine gewünschte Immunantwort gegen das präsentierte Antigen in dem Wirtstier hervorzurufen.
Hintergrund der Erfindung
Milchsäurebakterien sind seit langem als Konservierungsstoffe für Nahrungsmittel, so wie fermentierte Milch, Fleisch, Fisch, Gemüse und Käse und in Tiernahrungsmitteln bekannt. Es ist bekannt, dass fermentierte Nahrungsmittel günstige Wirkungen auf die menschliche Darmumgebung besitzen. Lactobacillus Spezies sind ebenso als Probiotica nützlich, Mikroorganismen, die günstige Wirkungen im Darm haben, und die die Gesundheit fördern, wenn sie aufgenommen werden.
Impfstoffe, die oral übergeben werden, sind bequemer als die gewöhnlicherweise verwendeten parenteralen Übertragungssysteme, insbesondere dann, wenn die Impfstoffe einer großen Anzahl an Menschen oder Tieren in weniger industrialisierten Ländern verabreicht werden müssen. Frühere Versuche, orale Impfstoffe zu entwickeln, haben pathogene Organismen, so wie Salmonella Spezien, als Antigenträger für orale Immunisierung verwendet. Jedoch, sogar wenn diese Pathogene abgeschwächt werden, können sie eine Gefahr dadurch darstellen, dass sie zur Pathogenizität zurückkehren und können so für das Wirtstier schädlich sein. Milchsäurebakterien im allgemeinen und Lactobacillus Spezien insbesondere, besitzen gewisse Eigenschaften, die sie zu attraktiven Kandidaten für die Verwendung bei der oralen Impfung werden lassen. Diese Eigenschaften des Lactobacillus beinhalten die Hilfsstoffaktivität, mucosale adhesive Eigenschaften und eine niedriger intrinsische Immunogenizität. Sie werden allgemein als sicher angesehen (GRAS), da sie in der endogenen Darmflora des Tieres vorhanden sind und werden kommerziell bei der Produktion von Joghurt, kultivierten Milcharten und anderen Nahrungsmitteln verwendet. Lactobacillus Spezies sind dafür bekannt, dass es schwierig ist, sie mit genetischer Information zu transformieren. Diejenigen Arten, die nicht in der Lage sind, transformiert zu werden, werden Recalzitranten genannt.
Der Gastrointestinaltrakt von Tieren ist ein komplexes Ökosystem, das eine geschätzte Zahl von 300 bis 500 Spezien von Mikroorganismen enthält. Trotz intensiver Forschung über 100 Jahre auf dem Gebiet der intestinalen Mikrobiologie verbleibt viel, dass über diese Mikroorganismen gelernt werden muss. Komplexe Zwischenbeziehungen existieren unter unterschiedlichen Mikroorganismusspezien und zwischen anwesenden Mikroorganismen und deren Wirte.
Ein wichtiger Faktor, der die Verwendbarkeit von Lactobacillusspezies als ein Impfstoffübertragungsvehikel betrifft, ist deren Fähigkeit, sich an die Epithelialzellen des Tieres anzuhaften, das geimpft werden soll. Wissen über die Struktur und die Art der Expression der oberflächenbezogenen Proteine von Lactobacillus, die darin involviert sind, an die mucosalen Gewebe anzuhaften und/oder die in die extracellulären Matrix involviert sind, ist wichtig für den Entwurf eines wirksamen Impfsystems. Anhaftungsfaktoren können für die vernünftige Antigenpräsentation kritisch sein, damit rekombinante Stämme von Milchsäurebakterien mukosale IgA- und/oder Serum IgG-Antworten auf das exprimierte Antigen in einem Wirt hervorrufen.
Lactobacilli sind grampositive, nicht-sporenbildende Stäbchen. Sie sind wichtige Mitglieder der normalen menschlichen oralen, gastrointestinalen und genitalen Flora und sind für Menschen und Tiere nicht pathogen. Lactobacilli einschließlich L. reuteri wurden in dem Gastrointestinaltrakt aller Säugetiere gefunden, die bis zum jetzigen Zeitpunkt studiert worden sind (Mitsuoka, 1992) einschließlich Menschen, Schweinen, Hühnern, Rindern, Hunden, Mäusen, Ratten und Hamstern. Die Allgegenwart von Lactobacillus Spezien in dem Säugetiergastrointestinaltrakt, kombiniert mit deren Fähigkeit, mukosale Rezeptoren zum Ziel zu nehmen und an sie anzuhaften, lassen sie zu nützlichen Organismen als Vektoren für das Impfen eines Wirts gegen einen breiten Bereich von Pathogenen werden.
Auch wenn viele infektiöse Mittel Zugang zu dem Körper durch Kolonialisieren von mukosalen Oberflächen erhalten, wurden sehr wenige Infektionen, die durch diese Mittel hervorgerufen worden sind, effektiv unter Verwendung von mukosaler, d.h. oraler Immunisierung vermieden (Wells et al. "Lactic acid bacteria as vaccine delivery vehicles", Antonie van Leeuwenhoek 70:317, Kluwer Academic Publishers, 1996). Eine Oralimmunisierung ist aufgrund der Einfachheit und der niedrigen Kosten der Impfstoffübertragung, -lagerung und -verabreichung sehr wünschenswert. Ein wirksames Übertragungsvehikel oder ein wirksamer Übertragungsorganismus sollte einer sein, der normalerweise in dem Gastrointestinaltrakt des Wirtsorganismus vorhanden ist und muss genau die mukosalen Orte der Infektion zum Ziel nehmen und an die mukosale Oberfläche anhaften. Lactobacilli besitzen diese beiden Eigenschaften. Ein nützliches Impfstoffübertragungsvehikel muss zusätzlich in der Lage sein, Antigene von Interesse in ausreichend hohen Spiegeln zu exprimieren, um erfolgreich den Wirt zu immunisieren, und darf für den Wirt nicht pathogen sein.
Vorangegangene Arbeit auf dem Gebiet der oralen Impfung war auf die Entwicklung von modifizierten pathogenen Bakterien als Antigenübertragungsvehikel gerichtet (Stocker, U.S. Patent Nr. 4,837,151, Auxotropic Mutants of Several Strains of Salmonella; Clements et al., U.S. Patent Nr. 5,079,165, Avirulent Strains of Samonella; Charles et al. U.S. Patent Nr. 5,547,664, Live-attenuated Salmonella). Man vermutet, dass die Wirksamkeit dieser Bakterien als Impfstoffe von deren Fähigkeit abhängt, in den Wirt einzudringen, von deren Fähigkeit zu überleben und sich zu multiplizieren und von den entsprechenden Niveaus der Antigenexpression in vivo. Es ist jedoch unklar, ob pathogene Stämme, die ausreichend abgeschwächt sind, um gegenüber dem Empfänger keine Gefahr darzustellen, deren Fähigkeit beibehalten, in Zielgebiete einzudringen, sich zu multiplizieren und entsprechende Antigenniveaus zu exprimieren (Wells et al.). Dieses hat die vorliegenden Erfinder dazu geführt, die Verwendung von Milchsäurebakterien, Lactobacilli und insbesondere L. reuteri zu untersuchen, die so modifiziert worden sind, dass sie exogene Antigene exprimieren.
Leer et al. (W095/35389) offenbaren ein Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren in Mikroorganismen, einschließlich Mikroorganismen, so wie Lactobacillus und Bifidobakteriumspezies, die schwierig zu transformieren oder zu transfizieren sind. Das Verfahren von Leer et al. basiert auf limitierter Autolyse, bevor die Transformation durchgeführt wird.
Die publizierte PCT-Anmeldung PCT/NL96/00409 offenbart Verfahren zum Screenen von pathogenen Bakterien, insbesondere Milchsäurebakterien der Arten Lactobacillus und Bifidobakterium, hinsichtlich deren Fähigkeit, an spezifischen mukosale Rezeptoren anzuhaften. Das Verfahren umfasst das Screenen für Anhaftungsfaktoren, die auf diesen nicht pathogenen Bakterien gefunden werden, die strukturell mit Virulenzfaktoren einiger pathogenen Mikroorganismen verwandt sind. Ein Expressionsvektor ist ebenso offenbart, der eine Expressionspromotersequenz, eine Nucleinsäuresequenz und Sequenzen umfasst, die die Ribosomerkennung und die Translationsfähigkeit erlauben. Diese Referenz zeigt auf, dass verschiedene Lactobacillus-Stämme so transformiert werden können, dass sie heterologe Genprodukte einschließlich Proteinen von pathogenen Bakterien exprimieren können.
Die orale Verabreichung von rekombinanten L. lactis wurde verwendet, um lokale IgA und/oder Serum-IgG-Antikörperantworten auf ein exprimiertes Antigen hervorzurufen (Wells et al.). Dieses zeigt an, dass in L. lactis exprimierte heterologe Proteine antigene Antworten in einem Wirtsorganismus hervorrufen können. Jedoch lehrt weder diese Referenz noch irgend eine andere Referenz des Standes der Technik, daß L. reuteri, eine Art mit insbesondere wünschenswerten eigenen Eigenschaften der Anstrebung der Mukosa und der Anhaftung daran, mit heterologer DNA transformiert werden kann, und die fremde Proteine auf der Oberfläche der L. reuteri-Zelle exprimieren kann oder diese durch die Zelle ausscheiden kann. Der Stand der Technik offenbart oder suggeriert die Transformation von Lactobacillus mit dem aggregierendem Gen agg oder dem Mucinbindegen muc, wie hierunter ausgeführt, nicht.
Das U.S. Patent Nr. 5,413,960 von Dobrogosz lehrt ein Verfahren zum Erhalten des Antibiotikums β-Hydroxypropionaldehyd oder Reuterin, welches gegen sowohl Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien aktiv ist, durch Kultivieren von L. reuteri unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Glycerin oder Glyceraldehyd. U.S. Patent Nr. 5,352,586, ebenso von Dobrogosz, beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von L. reuteri-Stämmen, die das Antibiotikum Reuterin produzieren. In beiden Patenten werden die Antibiotikumproduzierenden L. reuteri-Stämme durch deren Fähigkeit identifiziert, das Wachstum von empfänglichen Mikroorgansismen in der Gegenwart von Glycerin oder Glycerinaldehyd inhibieren. Diese Referenzen stellen ein Verfahren zum Erhalten von L. reuteri-Stämmen zur Verfügung, die das Antibiotikum Reuterin ausscheiden, dass nützlich bei der Behandlung von Infektionen ist, die durch verschiedene pathogene Mikroorgansismen hervorgerufen werden.
U.S. Patent Nr. 5,439,678 beansprucht ein Verfahren zum zur Verfügungstellen eines Probiotikums für ein Tier, welches das Füttern des Tieres mit L. reuteri umfasst. Der Begriff "Probiotikum" betrifft aufgenommene Mikroorganismen, die in einem Wirt leben können und positiv zu der Gesundheit des Wirtes und zu dessen Wohlbefinden beitragen. Diese Patente suggerieren oder offenbaren jedoch nicht die Verwendung von L. reuteri als Impfstoffübertragungsvehikel.
Heng, N.C.K. et al. (Cloning and Expression of an Endo-1,3-1,4-β-Glucanase Gene from Bacillus macerans in Lactobacillus reuteri, Appl. and Environ. Microbiol, 3336-3340, Aug. 1997) beschreiben das Klonieren, die Expression und die Ausscheidung eines heterologen Gens, abgeleitet von einer anderen bakteriellen Spezies in einem Stamm von L. reuteri, der aus dem Gastrointestinaltrakt stammte. Die Autoren glauben, dass dies die erste Demonstration der Expression eines Gens von heterologer Herkunft in L. reuteri ist. Heng et al. waren ebenso in der Lage, die Ausscheidung von L. reuteri des Genproduktes β-Glukanase zu demonstrieren, was anzeigte, dass die heterologen Sekretionssignale durch die L. reuteri-Zellen erkannt wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
In breitester Hinsicht offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Impfen eines Tieres durch Verabreichen rekombinanter Lactobacilli an das Tier, die so transformiert worden sind, dass sie heterologe Antigene exprimieren. Ein besonderes Beispiel verwendet rekombinante L. reuteri als Impfstoffübertragungsvehikel, welche so modifiziert wurden, dass sie ein Epitop exprimieren, dass von enterotoxigenen Eschericha coli (E. coli) oder von enteropathogenen E. coli abgeleitet sind. Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Entdeckung von Genen, die für die Produktion von Proteinen verantwortlich sind, die für die Aggregation von individuellen Zellen und für das Binden an Mucin sorgen. Die Sequenz für ein Gen (agg), das die Anhaftung durch das Kontrollieren der Aggregation in Lactobacillus vereinfacht, ist offenbart. Die Teilsequenz für ein Gen (muc), die das Binden an Mucin verstärkt, ist ebenso offenbart.
Mucin ist eines von verschiedenen Mucoproteinen, die bei der Ausscheidung aus mukosalen Membranen auftreten. Die mukosalen Membranen sind reich an mukosalen Drüsen, welche die Körperpassagen eines Tieres und Körperhöhlen, welche direkt oder indirekt mit der Umwelt kommunizieren, säumen. Mucus ist die zähflüssige schleimige Sekretion, die normalerweise reich an Mucinen ist, und wird von mukosalen Membranen produziert, welche es befeuchtet und schützt. Repräsentativ für die Gewebe, die mukosale Membranen enthalten, für die die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung wirksam darin sind, Infektionen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, beinhalten die Nasopharynx (nasale Passagen), Pharynx, Esophagus, Magen, Dünndarm und Dickdarm.
Ein Verfahren wird zum Transformieren von Lactobacilli mit genetischer Information für ein exogenes Epitop zur Verfügung gestellt, welches von einem pathogenen Organismus abgeleitet ist, kombiniert mit zusätzlichen Kopien eines Lactobacillus agg- und/oder muc-Gens und zum Exprimieren der kodierten Proteine entweder auf der Zelloberfläche oder durch Ausscheiden der Proteine aus der Zelle. Die rekombinanten Lactobacilli, die agg und ein exogenes Antigen und/oder muc und ein exogenes Antigen exprimieren, werden dann als Impfstoff verwendet, um einen Schutz gegen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen, die durch das Donorpathogen verursacht werden. Beispiele für das Verfahren werden unter Verwendung von L. reuteri zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Lactobacillusarten, die in der Lage sind, konsistent und akkurat Zielorte auf der Mukusa des Wirts zu erreichen und an ihnen anzuhaften, und dort hererologe antigene Proteine zu exprimieren, die von pathogenen Organismen und von anderem biologischem Material abgeleitet sind.
E. coli sind Gram-negative, nicht sporenbildende Stäbchen, die in großen Zahlen im Gastrointestinaltrakt von Menschen und Tieren vorhanden sind. Einige E. coli-Stämme verursachen Gastroenteritis, vermittelt durch hitzelabile und hitzestabile Enterotoxine, umfassend sowohl Endotoxine, die integrale Bestandteile der Zellwand sind als auch Exotoxine, die durch die bakterielle Zelle ausgeschieden werden. Ausgeschiedenes Toxin wird durch Ganglioside an dem Bürstensaum der Epithelialzellen des Dünndarms adsorbiert. Die Gene für beide Arten der Toxine sind auf Plasmiden angeordnet. Die Plasmide, die die Gene für die Enterotoxine tragen, tragen ebenso Gene, die die Synthese von spezifischen Oberflächen-Antigen steuern, die für das Anhaften von E. coli an Intestinalepithelialzellen wesentlich sind, so wie diejenigen, die als K88 bekannt sind, die aus Schweine-E.colis isoliert wurden. Nucleinsäuresonden wurden verwendet, um Toxingene zu detektieren. Die maximale Virulenz ist verbunden mit spezifischen adhesiven Fimbriae, haarartigen Projektionen auf der bakteriellen Zelloberfläche. Die primäre Funktion von Fimbriae ist es, die Anhaftung der bakteriellen Zelle an andere Bakterien, an Säugetierzellen oder an harte und weiche Oberflächen zu vermitteln. Dies ist eine wesentliche Eigenschaft der Pathogenese solcher Mikroorgansimen.
Sowohl Gastroenterititis, produziert durch enterotoxigene E. coli als auch Kindheitsdiarrhö, verursacht durch enteropathogene Stämme von E. coli sind hauptsächlich in unterentwickelten Ländern vorhanden. Ein sicherer und wirksamer Impfstoff wäre extrem nützlich bei dem Vorbeugen und bei dem Behandeln von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden.
Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung umfasst die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie, um Expressionsvektoren herzustellen, die für die zelluläre Aggregation (agg) und/oder für das verstärkte Binden an Mucin (muc) kodieren, und DNA, die für einen antigenen Virulenzfaktor kodiert, der von einem pathogenen Mikroorganismus erhalten wurde, das Einführen des Expressionsvektors in Zellen einer Lactobacillus-Art und das Auswählen von transformierten Zellen, die das vollständige oder einen Teil eines heterologen Proteins auf einen hohem Niveau exprimieren. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verabreichung von solchen transformierten Lactobacillus-Zellen an ein Tier, um eine Immunantwort in dem Tier auf einem Niveau und für eine Dauer zu provozieren, die wirksam das Tier gegen eine Infektion durch die pathogenen Mikroorganismen impfen wird. Die vorliegende Erfindung sorgt optional für die Verabreichung von Antibiotika an das Empfängersäugetier, anschließend an die Verabreichung der transformierten Mikroorganismen, um die transformierten Mikroorganismen in den geimpften Wirt auszurotten.
Verfahren um Herstellen von lebenden Impfstoffen aus transformierten Lactobacillusspeziesstämmen sind ebenso offenbart. Die Impfstoffe werden nützlich sein, um einen tierischen Wirt zu impfen, der gegenüber einer Erkrankung hervorgerufen durch verschiedene pathogene Mikroorganismen, so wie Bakterien und Viren, empfänglich ist, und ebenso um eine gewünschte immunologische Antwort auf andere biologische Materialien hervorzurufen. Transformierte Lactobacilli dienen als Träger für Antigene, um so eine immunologische Antwort in dem Wirt hervorzurufen. Transformierte Lactobacilli können dabei als Impfstoffübertragungssysteme an ein Tier, das einen Bedarf an einer Impfung hat, dienen. Die heterologen Antigene, die auf der Oberfläche exprimiert werden, oder die in die Umgebung der Lactobacilli abgegeben werden, werden einen Schutz für den Wirt zur Verfügung stellen.
Ein L. reuteri-Stamm wird ebenso zur Verfügung gestellt, welcher ein Antigen eines pathogenen Mikroorganismus als ein Ergebnis des Einführens einer Expressionskassette in L. reuteri-Zellen exprimiert, wobei die Expressionskassette DNA-Sequenzen umfasst, die für das Antigen unter Kontrolle von Regulationsbereichen kodiert, die durch L. reuteri-Zellen erkannt werden.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Impfen eines Tieres mit lebenden, nicht virulenten Impfstoffen zur Verfügung gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Identifizieren und Auswählen von Stämmen von nicht-pathogenen Mikroorganismen, so wie Lactobacilli, die die gewünschten Eigenschaften zum Anstreben und Anhaften an mukosales Gewebe aufzeigen; (b) Identifizieren und Auswählen dieser Stämme von nicht-pathogenen Mikroorganismen, so wie Lactobacilli, die zusätzlich das Potential aufzeigen, fremde Proteine zu exprimieren; (c) Identifizieren und Isolieren des Gens oder der Gene, das/die für antigenes Protein/antigene Proteine aus einem pathogenen Mikroorganismus oder aus anderem biologischem Material kodieren; (d) Einfügen der Gene aus Schritt (c) in eine angemessene Expressionskassette oder in ein Konstrukt, das Regulationsbereiche enthält, die durch einen Wirtsmikroorganismus erkannt werden, der in den Schritten (a) und (b) identifiziert wurde, und der Gene agg und/oder muc; (e) Transferieren der Expressionskassette in Zellen des Wirtsmikroorganismus, um einen transformierten Organismus zu bilden; (f) Auswählen und wachsen lassen der transformierten Zellen, die auf ihrer Zelloberfläche antigene Proteine exprimieren können, für die die inserierten Gensequenzen kodieren, und (g) Kombinieren der modifizierten Zellen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern und Hilfsstoffen, um einen Impfstoff für die orale, nasale oder eine andere direkte Übertragung an mukosale Oberflächen zur Verfügung zu stellen. Ein zusätzlicher Schritt in dem offenbarten Verfahren ist es, Antibiotika zu verwenden, um die transformierten Mikroorganismen nach der Kolonialisierung auszurotten.
Ein anderer Aspekt er Erfindung betrifft die Isolation, das Sequenzieren und die Expression eines Gens, agg, identifiziert in Lactobacilli, das die Fähigkeit der Zellen reguliert, in situ zu aggregieren. Ebenso offenbart ist die Isolation und das teilweise Sequenzieren eines Gens, muc, und dessen exprimimiertes Protein, das die Fähigkeit eines Mikroorganismus erhöht, an die Mukosa eines Tiers anzuhaften.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet bedeutet der Begriff "Tier" Säugetiere und Vögel, wobei Menschen die Tierart von größtem Interesse sind. Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet bedeutet der Begriff "L. reuteri" jeglichen Lactobacillus-Mikroorganismus, der gemäß dem Verfahren, das in U.S. Patent Nr. 5,352,586 ausgeführt ist, als L. reuteri identifiziert wurde. Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet bedeuteten die Bezeichnungen "transformierte Lactobacilli" oder "transformierte L. reuteri" Lactobacilli oder L. reuteri, in welche fremde Gene eingeführt worden sind, die für antigene Produkte kodieren. Transformierte L. reuteri oder andere ähnlich transformierten Bakterien, insbesondere andere Lactobacillus-Spezies, können in der Form einer Kapsel, einer Tablette, eines Joghurts, einer Lösung oder ähnlichem verabreicht werden. Adäquate Dosierungen um transformierte Bakterien in der normalen Flora eines Tieres zu etablieren, um eine Impfung zu bewirken, befinden sich innerhalb der Begabung des Fachmanns. Alle Ausführungsformen der Erfindung erfordern die Verwendung von lebensfähigen transformierten nicht-virulenten Bakterien, insbesondere Lactobacilli, und besonders bevorzugt L. reuteri als derjenige Organismus, welcher für die Produktion von antigenen Produkten in dem Tierkörper an den Orten sorgt, die eine Immunantwort hervorrufen.
Vaccine gemäß der Erfindung werden aus lebenden Bakterien hergestellt, vorzugsweise Lactobacilli und besonders bevorzugt L. reuteri, die so transformiert worden sind, dass sie Antigene von Mikroorganismen exprimieren, die für den Wirt pathogen sind. Die transformierten Bakterien, welche als Wirte für die Expression des Antigens dienen, können das Antigen in dem Cytoplasma exprimieren, welches dann zu der äußeren Membran des Mikroorganismus überführt werden kann, oder ausgeschieden werden kann, um Immunogene für eine immunologische Antwort durch den tierischen Wirt hervorzurufen. Durch die Verwendung von lebenden nicht-virulenten Bakterien als Träger für ein Immunogen kann dem Immunsystem ein stark angestrebter Stimmulus zur Verfügung gestellt werden. Das Antigen, welches in den nicht-virulenten Bakterien-Wirt eingeführt wird, kann von verschiedenen Quellen stammen, so wie pathogene Bakterien, Viren, Fungi, Protozoa oder andere biologische Materialien.
Das Antigen-Gen kann für Umschlagproteine, Kapsidproteine, Oberflächenproteine oder Toxine, so wie Exotoxine oder Enterotoxine kodieren. Das Antigen-Gen kann ebenso Enzyme oder andere Proteine spezifizieren, die für die Synthese eines Polysaccharids oder eines Oligosaccharids erforderlich sind. Die Antigen-Gene werden auf konventionelle Art und Weise isoliert, unter Verwendung von Sonden, bei denen wenigstens ein Teil der Aminosäuresequenz oder der Nucleinsäuresequenz bekannt ist. Repräsentativ für die Antigen-Gene, die beim Transformieren der Lactobacilli nützlich sind, sind diejenigen, die die Enterotoxine von enterotoxigenen oder enteropathogenen E. coli oder Vibrio Cholera-Stämmen spezifizieren; die HBsAG, Oberflächen-, Umschlag-, oder Kapsid-Proteine von T. cruzi B. Pärtussis, Streptococci, Haemophilus, Neisseria, Pseudonomas, Pasteurella, Chlamyida, Adenovirus, Astrovirus, Herpesvirus, Myxovirus, Retrovirus, Rotavirus und ähnliches. Das Antigen-Gen kann ebenso ein Enzym spezifizieren, das für die Synthese von Polysacchariden, z. B. Meningococus Capsular Polysaccharid, oder für die Modifikation eines Oligosaccharids oder Polysaccharids des Wirtsmikroorganismus erforderlich ist. Die vorangehende Liste ist beispielhaft und keine vollständige Liste der möglichen Quellen von genetischer Information, die durch die offenbarten Verfahren transferiert werden können.
Beispielsweise werden Stämme von L. reuteri, die konsistent und akkurat mukosale Oberflächen anstreben und an ihnen anhaften und dadurch die potentielle Nützlichkeit als Vehikel für die Präsentation von fremden Antigenen gegenüber der Mukosa demonstrieren, und, wenn gewünscht, andere genetische Informationen, in L. reuteri unter Verwendung von Molekularbiologietechniken, die im Stande der Technik bekannt sind, eingeführt.
Lactobacillos reuteri (L. reuteri) ist eine kürzlich bestimmte Lactobacillusart. Einige Stämme dieser Art wurden vorher als Lactobabcillus fermentum identifiziert. L. reuteri ist eine symbiotischer Anwohner des Gastrointestinaltraktes von Menschen, Schweinen und anderen Tieren. Der Neotypstamm von L. reuteri ist DSM20016 (ATCC Nr. 53609). Dieser Stamm und andere Stämme, einschließlich L. reuteri 1063 (ATCC Nr. 53608) sind für die Öffentlichkeit bei der American Type Culture Collectaion (Rockville, Maryland) erhältlich und wurden dort unter dem Budapest Treaty vom 17. April 1987 hinterlegt.
Einige Lactobabcillus-Arten sind als Recalcitranten bekannt, da es schwierig ist, sie unter Verwendung von bekannten Techniken zu transferieren. Verschiedene Verfahren zum Transformieren von L. reuteri wurden offenbart. Ein Verfahren zum Transformieren von L. reuteri ist in einer Internationalen Anmeldung beschrieben, die unter PCT 95/NL00215 (WO95/35389) von Leer et al. publiziert wurde. Das Verfahren von Leer et al. erfordert das Aussetzen von L. reuteri gegenüber limitierter Autolyse während oder vor dem Transformationsverfahren. Limitierte Autoylse wird durch Inkubieren des Mikroorganismus in einem Elektroporationspuffer mit niedriger Molarität enthaltend einen osmotischen Stabilisator, im Allgemeinen bei einem pH-Wert von zwischen 4 und 8 und bei einer Temperatur von unter 37°C, bevorzugter zwischen 0 und 10°C, ausgeführt.
Ein Verfahren für die Konstruktion von Vielzweckplasmidvektoren und Expressionsvektoren für Milchsäurebakterien ist in PCT/NL95/9135 von Nederlandse Organisatie vor Toegpast Natuurwetenschappelijk Oderzoek (TNO) offenbart. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Vektoren zu konstruieren, die für die Einfügung, für die Stabilerhaltung und für die effiziente Expression von fremden Genen in bakteriellen Milchsäurearten, einschließlich Lactobacilli verwendet werden können. Die Modifikation dieses Verfahrens ermöglicht es, dass Lactobacilli herologe Antigene exprimiert, ausscheidet und auf der Zelloberfläche exponiert und dabei als ein wirksamer Impfstoff in seinem Zielgebiet funktioniert.
Der Expressionsvektor, der in der vorliegenden Patentanmeldung offenbart ist, umfasst eine Expressionspromotorsequenz, die eine Nukleinsäuresequenz steuert, die für ein heterologes antigenes Protein oder Polypetptid oder alternativ für zusätzliche Kopien eines nativen Lactobabcillus-Gens, so wie agg oder muc, deren Expression wünschenswerterweise verstärkt werden soll, kodiert. Eine 5'-nicht-translatierte Nukleinsäuresequenz, die die Minimalsequenz umfasst, die für die Ribosomerkennung und RNA-Stabilisierung erforderlich ist, gefolgt durch ein Translationsinitiierungscodon geht der kodierenden Nukleinsäuresequenz voran.
Es ist wichtig, dass Stämme, die für die Transformation ausgewählt werden, nicht nur die Fähigkeit haben, die insertierten Gene, die für fremde Proteine kodieren, zu exprimieren, sondern sie müssen außerdem effizient an die angestrebten mukosalen Membranen anhaften, um als Impfstoffübertragungsvehikel wirksam zu sein. Daher wurden Lactobacilli-Zellen ausgewählt, die Adhäsionsfaktoren effizienter exprimieren.
Das Protokoll zum Entwickeln von Lactobacilli-Stämmen, insbesondere von L. reuteri-Stämmen, mit verbesserten Adhäsionsfaktoren umfasst die folgenden Schritte:

(1) Isolieren und Charakterisieren von Genen, die in die Synthese und die Ausscheidung von Adhäsionsfaktoren in Lactobacilli involviert sind;
(2) Auswählen oder Konstruieren von Stämmen, die Gene enthalten, die in Adhäsionsfaktoren mit verbesserten Eigenschaften resultieren;
(3) Demonstrieren der Fähigkeit von Stämmen mit verbesserten Adhäsionsfaktoren, pathogene Bakterien von mukosalen Rezeptoren zu vertreiben und dadurch mit der Adhäsion dieser pathogenen Bakterien zu interferieren.

Das Protokoll zum Herstellen eines Impfstoffes gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

(1) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Stämmen, die wünschenswerte Eigenschaften zum Anstreben und Anhaften an mukosales Gewebe wirksam aufzeigen;
(2) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Stämmen, die zusätzlich das Potential aufzeigen, heterologe Proteine zu exprimieren;
(3) Identifizieren und Isolieren der Gene oder des Gens, das/die für antigenes Protein/antigene Proteine von Interesse in einem pathogenen Mikroorganismus oder in anderem biologischen Material kodieren;
(4) Fusionieren der Gene aus Schritt (3) mit einem Gen agg, das für Information zur bakteriellen Aggregation kodiert und/oder einem Gen muc, das für Information für das bakterielle Binden an Mucine kodiert;
(5) Insertieren der fusionierten Gene in einen entsprechenden Expressionsvektor, der Regulationsbereiche enthält, die durch Lactobacilli erkannt werden;
(6) Transferieren des Expressionsvektors in die ausgewählten Lactobacilluszellen;
(7) Auswählen und Wachsen lassen transformierter Lactobacillius-Zellen, die replizieren können und die antigene Determinanten auf der Zelloberflächen exprimieren können, für die die insertierten Gensequenzen kodieren;
(8) Kombinieren der transformierten Lactobacilli mit pharmazeutischen Trägern, um einen Impfstoff für die orale, nasale oder eine andere direkte Übertragung an muccosales Gewebe zu bilden:
(9) Verabreichen des Impfstoffs an einen Menschen oder einen anderen tierischen Empfänger.

Beispiel 1
Verstärkung der Aggregation
Die Fähigkeit, multizelluläre Aggregate zu bilden, wurde für eine Anzahl von bakteriellen Spezies berichtet. Dieses Phänomen wird entweder als Autoaggregation beschrieben, wenn es Bakterien desselben Stammes beinhaltet, oder als Coaggregation, wenn unterschiedliche bakterielle Stämme involviert sind. Beide Aggregationsarten wurden für Lactobabacillus-Spezies beschrieben. Es wurde vorgeschlagen, dass Autoaggregation und Coaggregation wichtig für die Fähigkeit der Bakterien sind, Kolonien zu bilden und dadurch die Entfernung von intestinalen Pathogenen zu bewirken. In Lactobacilli wurde eine Verbindung zwischen Aggregation und genetischem Austausch gezeigt. Es wurde berichtet, dass ein 32kD-Aggregationspromotionsfaktor in L. plantarum immunologisch mit einem Protein ähnlicher Größe crossreaktiv ist, das die Aggregation in Lactobacilli vermittelt.
Dieses Experiment ist auf ein kloniertes und sequenziertes Gen von L. reuteri gerichtet, das für ein 60 kD-Protein kodiert, das die Aggregation vermittelt. Die Einfügung von zusätzlichen Kopien des Gens in einen L. reuteri Stamm hat das Aggregationsverhalten bemerkenswert verstärkt. Es wurde herausgefunden, dass das sequenzierte Gen eine ausgedehnte Sequenzhomologie zu einer großen Familie von ATP-abhängigen RNA-Helicasen aufweist. Es wurde in dieser Arbeit demonstriert und es ist hierin offenbart, dass die Autoaggregation von L. reuteri die Aktivität eines Proteins mit ausgedehnter Homologie zu RNA-Helicasen involviert.
Materialien und Verfahren
Bakterielle Stämme und Wachstumsbedingungen
Bei diesem Experiment wurde ein Stamm von Lactobacilli, bekannt als L. reuteri 1063, verwendet, um das Gen für ein 60 kD-Protein zu isolieren, welches die Aggregationsaktivität in vitro und in vivo zeigt. Die L. reuteri-Stämme 1063 und 1068 wurden vorher aus dem Dünndarm eines Schweines isoliert. L. reuteri DSM 20016 wurde von der „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen", Göttingen, Deutschland, erhalten. E. coli LE 392 wurde als Lambda (λ)-Wirtsstamm verwendet, und E. coli TG1 als Wirtsstamm beim Subklonieren und Exprimieren des rekombinanten Proteins. L. reuteri wurden auf Man-Rogosa-Sharpe (MRS)-Agar oder in MRS-Nährlösung (Oxoid, Ltd., Basingstoke, England) wachsen gelassen. Die Platten wurden in anaeroben Dosen unter CO₂ und N₂-Atmosphäre (GasPak System, BBL; Cockeysville, MD, USA) bei 37°C inkubiert. E. coli-Nährlösungkulturen wurden bei 37°C in Luria-Bertani (LB)-Nährlösung auf einem Rotationsschüttler oder auf LB-Agar wachsen gelassen. Wurden Antikörper für die Auswahl verwendet, waren die Konzentrationen: 50 μg/ml Ampicillion (Amp) und 8 μg/ml Chloramphenicol (Cm) für sowohl E. coli als auch für Lactobacilli.
Proteine und Reagenzien
L. reuteri-Stamm 1063 wurde in 500 ml MRS-Nährlösung wachsen gelassen, und die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 10.000 x g geerntet. Das verbrauchte Kulturmedium wurde dialysiert und anschließend lyophilisiert. Die Bakterien wurden wiederholt mit 500 ml Portionen destilliertem Wasser gewaschen, bis die Autoaggregationsaktivität verloren war. Die Waschlösungen wurden ebenso dialysiert und lyophilisiert. Antiserum gegen eine Mischung aus hochmolekulargewichtigen (MW)-Fraktionen des verbrauchten Nährmediums und der Waschlösungen wurden in einem Kaninchen gezogen. Das Kaninchen wurde mit den Proteinen immunisiert, und ihm wurden 3 Musterdosen in zweiwöchigen Intervallen verabreicht. Das Tier wurde acht Wochen nach der ersten Immunisierung geopfert.
Um das Antiserum spezifischer gegen den Aggregationsfaktor zu machen, wurde es gegen den nicht-aggregierenden L. reuteri-Stamm 1068 adsorbiert. Die Bakterien wurden in 200 ml MRS 16 Stunden lang wachsen gelassen und zwei mal in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei pH 7,3, angereichert mit 0,05 Tween 20 (PBST), gewaschen. Die Zellen wurden dann in 20 ml PBST suspendiert. Ein Milliliter Antiserum wurde mit einem Milliliter bakterieller Suspension vermischt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Nach Zentrifugation wurde das adsorbierte Antiserum durch einen 0,2 μm-Filter steril filtriert. Die IgG-Fraktion von dem adsorbierten Antiserum wurde auf ProteinA-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt.
Konstruktion und Screening einer λ-Bibliothek
L. reuteri-Stamm 1063 wurde in 100 ml MRS-Nährlösung wachsen gelassen, und DNA wurde gemäß Axelsonn und Lindgren (1987) extrahiert. Die DNA wurde teilweise mit Sau3A verdaut und in Lambda EMBL3 BamHI-Arme legiert. Das Verpacken in Phagenpartikel wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt (Promega, Madison, WI, USA). Nach der Infektion von E. coli LE392 wurden die resultierenden Plaques mit der IgG-Fraktion des Antiserums (Roos et al., FEMS, Microbiology Letters, 144:33-38, 1996) gescreent.
Affinitätsaufreinigung von rekombinantem Protein
Die IgG-Fraktion des Antiserums wurde an CnBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt. Positive λ-Klone aus dem Screenverfahren wurden verwendet, um λ-Lysate in großem Maßstab herzustellen (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982). Die Lysate wurden zentrifugiert und auf Sepharose, gekoppelt mit der IgG-Fraktion, angewendet. Die Säule wurde mit PBS gewaschen, bis A₂₈₀ der gesammelten Fraktionen den Ausgangszustand erreicht hatte. Die adsorbierten Proteine wurden mit 1 M HAc eluiert. Nach der Neutralisierung mit 1 M Tris-Base wurden die eluierten Proteine zwei mal gegen ein großes Volumen destilliertes Wasser dialysiert. Das Proteinmaterial wurde dann lyophilisiert und in PBS gelöst.
Aggregationsassay
Das affinitätsaufgereinigte Protein unterschiedlicher rekombinanter Klassen wurde hinsichtlich der Fähigkeit überprüft, L. reuteri in vivo zu aggregieren. L. reuteri 1063 wurde in 10 ml MRS 16 Stunden lang wachsen gelassen. Die Bakterien wurden 5-mal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen, was in einem Verlust der Aggreation resultierte. Die Bakterien wurden in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert und 10 μl der bakteriellen Suspension wurde mit 1 μl affinitätsaufgereinigtem Protein auf einem Mikroskopobjektträger gemischt. Das Auftreten von Aggregaten innerhalb einer Minute wurde als ein positives Testergebnis gewertet.
Subklonieren und Isolation von positiven Klonen
DNA von λ-Klon 105:2 wurde isoliert und in separaten Reaktionen mit EcoRI, HindIII, PstI, SalI und ScaI gespalten. Das Material aus den unterschiedlichen Spaltungen wurde zusammengeführt, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um blunt ends zu generieren, und dann in den pUCl8-Vektor legiert, der mit SmaI gespalten war. Der Ligationsmix wurde in E. coli TG1-Zellen elektroporiert, und die resultierenden Klone wurden auf LA-Platten ausgewählt, zu denen Amp zugesetzt war, und mit der IgG-Fraktion des Antiserums gescreent. Plasmide von positiven Klonen wurden mit dem Wizard Minipreps DNA Aufreinigungssystem (Promega) aufgereinigt und durch Restriktionsenzymanalyse und Sequenzieren charakterisiert.
Einführung des Agg-Gens in L. reuteri-Stämme
Ein Vektor mit breitem Wirtsbereich, pVS2, (von Wright et al., Applied Environ. Microbiol 53:1584-1588, 1987) enthaltend ein Chloramphenicolresistenzgen, wurde mit HindIII gespalten, und blunt ends durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase generiert. Ein 2450 pb BglII-Fragment aus chromosomaler DNA wurde ebenso mit T4 DNA-Polymerase behandelt und danach in einen einzelnen Cla1-Ort in pVS2 ligiert. Dieses Konstrukt wird pAGG1 genannt. Der Ligationsmix wurde in E. coli TG1-Zellen elektroporiert, und Transformanden wurden auf Platten mit Chloramphenicol (Cm) ausgewählt und mit der IgG-Fraktion gescreent. Das Plasmid aus einem positiven Klon wurde in L. reuteri DSM 20016 und Stamm 1068 gemäß dem Verfahren von Ahrné et al. (Current Microbiology 24: 199-205) elektroporiert, und Transformanden wurden auf MRS-Platten mit Chloramphenicol ausgewählt. Um einen in vivo Effekt des Gens zu erkennen, wurden die resultierenden Klone in 10 ml MRS angereichert mit Cm für 16 Stunden bei 37°C wachsen gelassen.
DN-Sequenzieren und Analyse der Sequenz
Die Sequenzierung wurde durch das Dideoxy-Verfahren unter Verwendung von ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) mit kommerziellem Standard und customisierten Sequenzprimern durchgeführt. Die Sequenzierproben wurden auf der automatischen Sequenziermaschine ABI 373 (Perkin-Elmer) analysiert. Die PC/GENE DNA und das Protein Data Handling Package wurde für die Analyse der DNA und für die davon abgeleitete Proteinsequenz verwendet.
SDS-Page and Western Blotting
SDS-PAGE und Western Blot-Analysen wurden mit dem PhastSystem (Pharmycia) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt, und die Proteine wurden auf einer Protran BA85-Nitrocellulose-Membran (Schleicher and Schüell, Dassel, Deutschland) durch die Fusion bei 65°C für 45 Minuten geblottet. Das Blockieren der Membranen, die Inkubationen mit der IgG-Fraktion und dem HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper wurde gemäß Roos et al., 1996, ausgeführt. Die Membranen wurden schließlich mit 4-Chlor-1-Naphtol als Substrat entwickelt.
Resultate
Das agg-Gen des L. reuteri-Stammes 1063 wurde kloniert, und es wurde herausgefunden, dass es sich auf einem 2450 bp chromosalem BglII-Fragment befindet. Wie oben beschrieben, wurde Antiserum gegen extrazelluläre und Zelloberflächen-Proteine vom L. reuteri-Stamm 1063 gezogen und wurden verwendet, um eine λ-Bibliothek, die von demselben Stamm generiert wurde, zu screenen. Eine große Anzahl von Klonen wurde identifiziert, die mit dem Antiserum reaktiv waren. Eine weitere Untersuchung der rekombinanten Proteine, die durch diese Klone exprimiert wurden, zeigte, dass sie drei unterschiedliche Klassen darstellten, wie durch das Bandenmuster in der Western Blot Analyse eingeschätzt wurde. Repräsentative Beispiele der unterschiedlichen Klassen der Klone wurden verwendet, um rekombinantes Protein zu produzieren, welches anschließend auf der immobilisierten IgG-Fraktion derselben Antisera, die bei dem initialen Screen verwendet wurden, affinitätsaufgereinigt wurden. Eine Klasse der Klone exprimierte ein 60 kD-Protein, das die Aggregation bei einem Objekträgerexperiment förderte. Subklonieren der DNA von einem dieser Klone, λ105:2, in einen Plasmidvektor erlaubte die Identifizierung von Klonen, die mit den Antiseren reagierten und die eine Proteinbande derselben Größe wie der λ-Klon exprimierten. Einer dieser Klone, bezeichnet LrAg7, enthielt ein 3,4 kb HindIII-Fragment. Weitere Deletionen und Subklonierungen erlaubten die Identifikation eines 2450 bp chromosomalen BglII-Fragmentes, das für das verantwortliche Protein kodierte.
Die Sequenzanalyse des BglII-Fragmentes ergab einen offenen Leserahmen von 1491 Nukleotiden (nt) kodierend für ein Polypeptid, das 497 Aminosäuren mit einer vorhergesagten molekularen Masse von 56 kD enthielt. Ein Ribosombindeort und weiter strangaufwärts mögliche Transkriptionsinitierungssignale gehen dem Initierungcodon TTG voran. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wurde für Homologiesuchen in den Datenbanken verwendet, und eine ausgedehnte Sequenzähnlichkeit zu der großen Familie der DEAD-Box-Helicasen wurde gefunden. Die beste Übereinstimmung ergab sich mit einem Bacillus subtilis-Protein, von dem vorausgesagt wurde, dass es sich hierbei um eine ATP- abhängige RNA-Helikase handelt. Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für das agg-Gen werden zur Verfügung gestellt, wie durch 37 C.F.R. §1.821 bis §1.825 vorgesehen und sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 1 identifiziert.
Um zu etablieren, dass das agg-Gen tatsächlich für ein Protein mit einem aggregierendem Effekt in vivo kodiert, wurde das BglII-Fragment in den Vektor pVS2 mit breitem Wirtsbereich kloniert, und das Konstrukt wurde in L. reuteri eingeführt. Das Gen wurde in L. reuteri 1063 eingeführt, welche einen aggregierenden Phänotyp haben. Die transformierten Mikroorganismen zeigten eine bemerkenswert verstärkte Aggregation auf, verglichen mit den nativen Mikroorganismen.
BEISPIEL II
Verwendung des agg-Gens in einem Genfusionsystem zur Expression und zur Sekretion von fusionierten Proteinen
Unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken, wie beschrieben in Beispiel I, wurden Expressionsvektoren, die heterologe Gene von Interesse enthielten, hergestellt und in Lactobacilluszellen inseriert, die die Fähigkeit gezeigt haben, Proteine zu exprimieren, für die inserierte Gene kodieren.
Fusion des agg-Gens an das Gen für K88ab fimbriae:
Das agg-Gen von dem L. reuteri-Stamm 1063 wurde kloniert und es wurde herausgefunden, dass es auf einem 2450 bp langem chromosomalen BglII-Fragment angeordnet ist, wie in Beispiel I beschrieben. Dieses BglII-Fragment der chromosomalen DNA wurde in einen einzelnen ClaI-Ort des Plasmidvektors pVS2 (von Wright et al., 1987) kloniert. Vor der Legation wurde das chromosomale Fragment und der Vektor mit T4 DNA Polymerase behandelt, um blunt ends herzustellen (Maniatis et al., 1982). Diese Konstrukt, pAGG1, wurde an Position 1622 mit Cla1 gespalten, um ein lineares Molekül herzustellen.
Das Gen, das für die K88ab fimbriae von E. coli kodiert, wurde durch Gaastra, W. et al., identifiziert (The nucleotide sequence of the gene encoding the K88ab protein subunit of porcine entertoxic Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 12:41-46, 1981); und durch Bakker et al. charakterisiert (Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae. Mol. Microbiol. 6(2): 247-255, 1992). PCR wurde verwendet, um ein geeignetes und nützliches Fragment des K88ab-Gens zu identifizieren. Die PCR-Primer, die verwendet wurden, waren wie folgt:
5'-AAATCGATGCCTGGATGACTGGTGAT-3'; und
5'-AAATCGATTRGGCAGCAGAAACAACAGT-3'.
Standard PCR-Verfahren (Ehrlich, H.A. und Arnheim, N., Annu Rev. Genet. 26:479-506, 1992) wurden verwendet, um ein 705 bp-Produkt zu erhalten. Das PCR-Produkt wird mit ClaI gespalten und in PaGG1 legiert, der ebenfalls mit ClaI gespalten wurde. Das resultierende Konstrukt wird in E. coli TG1-Zellen elektrotransformiert, und die resultierenden Transformanden wurden analysiert, um Klone zu identifizieren, die die fusionierten Gene enthalten. Ein identifizierter Klon wird durch Sequenzieren identifiziert, und wird als pKRGG1 bezeichnet.
Einführung des Fusionsgenkonstruktes pKAGG1 in L. reuteri
Das Konstrukt pKAGG1, das ein Fusionsprotein exprimiert, das aus einem Teil des AGG-Proteins von L. reuteri und einem Teil der K88ab fimbriae von E. coli besteht, wird in die L. reuteri-Stämme 1063 und 1068 unter Verwendung des Verfahrens von Ahrne et al. (Ahrne, S., Molin, G., und Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiol. Vol. 24, 199-205, 1992) elektrotransformiert. Die Transformanden wurden auf Agarplatten isoliert, die 10 mcg/ml Erythromycin enthalten. Die Produktion von Fusionsprotein wird unter Verwendung von Antikörpern gegen entweder das agg-Protein und/oder unter Verwendung von Antikörpern gegen die K88ab fimbriae detektiert.
Unter Verwendung der Methodologie der vorliegenden Erfindung werden Gene, die für Enterotoxine kodieren, die durch enterotoxigene und enteropathogene E. coli-Stämme ausgeschieden werden, an das agg-Gen von L. reuteri fusioniert und in eine Expressionskassette inseriert, die eine entsprechende Promotersequenz und andere Regulationsbereiche aufweist, die durch L. reuteri-Zellen erkannt werden. Die Kassette wird dann in L. reuteri-Zellen transferiert, von denen bestimmt wurde, dass sie in der Lage sind, die insertierten Gene zu exprimieren. Zellen, die erfolgreich transformiert wurden und die die insertierten Gene exprimieren, wie durch die Gegenwart der E. coli Antigene auf der Zelloberfläche angezeigt, werden zur immunologischen Bewertung ausgewählt. L. reuteri-Zellen, die E. coli Antigene exprimieren, werden in einem geeignetem pharmazeutischen Träger oder einem Nahrungsmittelprodukt, so wie Milch oder Joghurt, angeordnet, und als ein Impfstoff an Säugetiere übergeben, die für die Infektion durch toxische E. coli-Stämme empfänglich sind. Geimpfte und nicht geimpfte Säugetiere werden mit lebenden Enterotoxigenen E. coli (ETEC) herausgefordert, und hinsichtlich der anschließenden Infektion bewertet, um zu bestimmen, ob die Antigen-exprimierende Lactobacilli eine schützende Immunität verliehen haben.
Das beschriebene Verfahren kann mit einer breiten Vielfalt von pathogenen Organismen durchgeführt werden, für welche Gene für antigene Faktoren durch Transformieren von entsprechenenden Genen in kompetente L. reuteri oder andere Lactobacilli erhältlich sind, und die entweder das agg-Gen oder ein homologes Gen haben. Lactobacilli, insbesondere L. reuteri sind bevorzugte Wirte für den Plasmid, der die fusionierten Gene enthält, jedoch können die Verfahren auch verwendet werden, um andere bakterielle Arten zu transformieren. Das Verfahren kann ebenso so modifiziert werden, dass die fusionierten Gene direkt in das Wirtschromosom eingefügt werden, an Stelle der Einfügung in einen Plasmidvektor.
BEISPIEL III
Die Verwendung des agg-Gens in einem Genfusionssystem, das in das Chromosom einer Empfängerzelle integriert wird
Unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken, die in Beispielen I und II beschrieben sind, werden Expressionsvektoren, die heterologe Gene von Interesse enthalten, und hergestellt wurden, in L. reuteri-Zellen eingeführt und in das Chromosom der Zelle integriert.
Das agg-Gen und das K88-Gen von E. coli, die in den Beispielen I und II beschrieben sind, wurden in einen temperaturempfindlichen Shuttlevektor kloniert, pJRS233, dessen Konstruktion in Perez-Casal et al. (Molec. Microbiol. 8(5):809-819, 1993) beschrieben ist. Der Vektor pJRS233 wurde aus einem temperaturempfindlichen Plasmid gebildet, hier gezeigt durch Maguin et al. (New Thermosensitive Plasmid for Gram-Positive Bacteria, J. Bacteriol. 174:5633-5638, 1992), so dass er bei Temperaturen unterhalb von 35°C in Milchsäurebakterien stabil ist. Der ClaI-Ort in pJRS233 wurde initial mit ClaI gespalten, wodurch dieser Ort zerstört wurde, dann mit T4-Polymerase behandelt und erneut legiert. Das BglII-Fragment mit dem agg-Gen, beschrieben in Beispiel I, wurde in den BamHI-Ort eines modifizierten pJRS233 kloniert, und das PCR-Fragment des K88-Gens, beschrieben in Beispiel II, wurde in den ClaI-Ort kloniert. Das resultierende Konstrukt, das sowohl das agg- als auch das K88-Gen enthält, wird pAGGts1 genannt.
Das Plasmid pAGGts1 wurde in L. reuteri 1063 elektrotransformiert. Die Integration des Plasmids in das Chromosom von L. reuteri wurde erreicht durch eine Modifikation des Verfahrens von Bhowmik et al. (J. Bact., pp. 6341-6344, Oct. 1993). Das Konstrukt pAGGts1 ist ein temperaturempfindliches Integrationsplasmid, das in Lactobacillisspezien, einschließlich L. reuteri eingeführt und propagiert werden kann. Nach der Einfügung des Plasmids wurden die Bakterien bei 46°C propagiert, einer nicht permissiven Temperatur, um die Replikation des Plasmids abzustellen und um Klone auszuwählen, bei welchen das Konstrukt in das Chromosom eingefügt wurde. Klone, bei welchen das native Gen und der Vektor deletiert wurden, wurden, wie durch Bhowmik et al. beschrieben, isoliert.
BEISPIEL IV
Identifikation eines Gens, muc, und dessen Protein, das das Binden and Mucin verstärkt
Um Lactobacilli-Stämme mit starken adhesiven Eigenschaften weiter zu identifizieren, wurde Arbeit ausgeführt, um ein Gen und dessen exprimiertes Protein zu identifizieren, das das Binden an intestinale Zelloberflächenproteine, die Mucine genannt werden, verstärken würde. Hierin wurde ein Protein gefunden, und offenbart, das größer als 200 kD ist, das das Binden von L. reuteri an Mucin verstärkt. Subklonieren und Sequenzieren identifizierte das Muc-Gen.
Materialien und Verfahren
Bei diesem Experiment wurde der 1063-Stamm von L. reuteri verwendet, um die 200 kD Proteine zu isolieren, die für das Binden an Mucine sorgen. Die bakteriellen Stämme, Wachstumsbedingungen, Reagenzien, die Konstruktion und das Sreenen der λ-Bibliothek und die Affinitätsaufreinigung des rekombinanten Proteins wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt. Das Mucin-bindende Protein wurde aus dem Kulturmedium isoliert, wie hierin beschrieben.
Western Blotting: Ausgeführt, wie in Beispiel I beschrieben. Primäre Antikörper (p108) gezogen gegen das Mucus bindende Protein wurden aus einem Kaninchen aufgereinigt, in das die ursprüngliche Lösung des Kulturmediums und die Wasserwaschung von Stamm 1063 injiziert wurde.
Mucinbindeassay: Teilweise aufgereinigtes Mucin aus Schweinemagen, erhalten von Sigma (St. Louis, Mo.) wurde in einem Carbonatpuffer bei pH 9,7 mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml suspendiert. 200 μl der Lösung wurde in Microtiter-Wells pipettiert und wurden dort zur Beschichtung bei 37°C für ungefähr 3 Stunden belassen. Die Wells wurden durch die Hinzufügung von 200 μl PBS 1% Tween20 bei Raumtemperatur für eine Stunde blockiert und dann 3-mal mit PBST 0,5% Tween20 (PBST) gewaschen. Bakterien wurden in MRS über Nacht bei 37°C wachsen gelassen und dann gewaschen und in PBST resuspendiert. Die optische Dichte (OD) der bakteriellen Zellen wurden bei 600 nm in einem Beckman DU650 Spectrophotometer gemessen und auf OD 0,5 eingestellt. 150 μl der bakteriellen Suspension wurde dreifach in Wells geladen und bei 37°C für ungefähr 2 Stunden inkubiert. Die Wells werden 3-mal gewaschen, und 200 μl/Well 1%SDS, 0,2MNaOH wurden hinzugefügt, und es wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach vorsichtigem Mixen wurden 50 μl entnommen, um die Menge der gebundenen Bakterien zu messen.
Inhibierungsassay: Die affinitätsaufgereinigten Proteine aus den unterschiedlichen λ-Klonen wurden in dem Mucinbindeassay getestet. Vor der Hinzufügung der Bakterien zu den Wells wurden 10 μl einer Lösung des aufgereinigten Proteins mit A₂₈₀=0,1 hinzugefügt. Die Proteine wurden 30 Minuten in den Wells inkubiert, bevor die Bakterien ohne jegliches Waschen des Wells hinzugefügt wurden. Die Menge der gebundenen Bakterien wurden mit einer Probe ohne die Hinzufügung von Protein verglichen, und ebenso mit einer Probe mit der Hinzufügung einer gleichen Menge Ovalbumin (Sigma). Alle Proben wurden dreifach analysiert.
Subklonieren: DNA des λ-Klons 1208:21 wurde isoliert, subkloniert, und positive Klone wurden isoliert, wie in Beispiel I beschrieben.
DNA-Sequenzieren und Analyse der Sequenz
Das Sequenzieren wurde durch das Dideoxyverfahren unter Verwendung von Abi PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) mit kommerziellen Standard und customisierten Sequenzierprimern ausgeführt. Die Sequenzierproben wurden auf der automatischen Sequenziermaschine ABI 373 (Perkin-Elmer) analysiert. Die PC/GENE DNA und das Protein Data Handling Package wurde für die Analyse der DNA und der abgeleiteten Proteinsequenz verwendet.
SDS-Page wurde ausgeführt, wie in Beispiel I beschrieben.
Resultate
Southern Blott: Es wurde herausgefunden, dass das muc-Gen in dem L. reuteri-Stamm 1063 vorhanden war.
Western Blott: Mucin-bindendes Protein wurde lediglich in dem Kulturmedium und nicht in der Wasserwaschung gefunden.
Das muc-Gen des L. reuteri-Stammes 1063 wurde kloniert, und es wurde herausgefunden, dass es auf einem 6,2 kb EcoRI-Fragment angeordnet ist. Wie in Beispiel I beschrieben, wurden unterschiedliche Klassen von Klonen gefunden, als die λ-Bibliothek mit dem Antiserum gescreent wurde. Eine Klasse der Klone exprimierte ein <200kDa-Protein, das die Adhäsion der Bakterien an Mucin förderte. Subklonieren der DNA von einem dieser Klone, λ108:21, in einen Plasmidvektor erlaubte die Identifikation von Klonen, die mit dem Antiserum reagierten und die eine Proteinbande exprimierten, die dieselbe Größe des λ-Klons aufwies. Einer dieser Klone, bezeichnet als LrMu3, enthielt ein 6,2 kb EcoRI-Fragment. Die Sequenzanalyse des EcoRI-Fragmentes ergab einen offenen Leserahmen, vor dem ein Ribosombindeort und die möglichen Transkriptionsinitierungssignale angeordnet waren. Die Nucleotidsequenzen und die Aminosäuresequenzen für das Muc-Gen wurden teilweise bestimmt. Ihnen wurde die Bezeichnung Seq ID Nr. 2 in dem Sequenzprotokoll zugewiesen. Rekombinante Formen von Stämmen, die ein Gen exprimieren, das die zelluläre Aggregation fördert, agg, und ein Gen, dass die Anhaftung an Mucin vermittelt, muc, ebenso wie exprimierende fremde Antigene auf der Zelloberfläche werden als nützlich dargestellt, um zu impfen und somit den Wirt gegen Infektionen durch pathogene Mikroorganismen zu schützen, dessen Gen oder Gene insertiert wurden.
Industrielle Anwendbarkeit
Während die gesundheitlichen Vorteile der Impfung gegen gastrointestinale Pathogene klar sind, stellt das Auffinden von sicheren und wirksamen Impfstoffen herausfordernde Probleme dar. Die offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren zur Impfung eines Tieres mit einem Mikroorganismus zur Verfügung, der Gene enthält, die für die Produktion von Proteinen verantwortlich sind, die für die Aggregation von individuellen Zellen und/oder für das Binden an Mukosazellen und/oder an den Mukus zu Verfügung und der transformiert werden kann, so dass er fremde Antigene exprimiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren, dass hierin beschrieben und beansprucht ist, kann in der pharmazeutischen und in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, um Impfstoffe gegen pathogene Mikroorganismen oder anderes biologisches Material herzustellen. Der Impfstoff kann durch ein Tier in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufgenommen werden, oder er kann zu Milch oder Milchprodukten, so wie Joghurt, hinzugefügt werden. Der Impfstoff kann ebenso nasal oder durch eine andere direkte Verabreichung an mukosales Gewebe und/oder an den Mukos verabreicht werden. Die Impfung eines Tieres mit transformierten Lactobacilli, vorzugsweise L. reuteri, wie hierin beschrieben, dient dazu, Krankheiten zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, die immunologisch mit der Mukosa des Wirts verbunden sind.
Während gewisse repräsentative Ausführungsformen hierin ausgeführt worden sind, werden Fachleute leicht anerkennen, dass Modifikationen daran gemacht werden können, ohne hierbei vom Geist oder Umfang der Erfindung abzuweichen.
Sequenzprotokoll

Claims

Gen, agg, aus Lactobacillus reuteri, kodierend für ein 60 kD Protein, das die bakterielle Aggregation vermittelt, mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1.
Aminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1.
Gen, muc, aus L. Reuteri, kodierend für ein 200 kD Protein, das das Binden an Mucin verstärkt, mit einer DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.
Gen gemäß Anspruch 3, wobei das Mucin in den nasalen Passagen oder in dem Gastrointestinaltrakt eines Tieres vorhanden ist.
Aminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2.
Verfahren zum Exprimieren von heterologen antigenen Proteinen und Peptiden auf der Oberfläche einer Lactobacillus-Zelle, umfassend die Schritte (a) Fusionieren eines heterologen Gens in einem angemessenen Leserahmen mit einer DNA-Segenz, die für ein Gen, agg, mit einer DNA-Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, oder für ein Gen muc, mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2, einer Lactobacillus-Spezies kodiert, wobei die Gene operabel mit einem geeigneten Promoter verbunden sind; und (b) Transformieren von geeigneten Lactobacillus-Wirtszellen mit einem Hybridplasmid-Vektor, der ein Fusionsgen umfaßt, das in (a) hergestellt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Wirt Lactobacillus reuteri ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das heterologe Gen von einem pathogenen Mikroorganismus abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das heterologe Gen für ein antigenes Protein oder Peptid kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Hybridvektor, der das Fusionsgen enthält, in das Chromosom der transformierten Wirtszelle integriert ist.
Nicht-virulente bakterielle Spezies, die ein heterologes antigenes Protein oder Peptid exprimiert, was das Ergebnis des Einführens einer Expressionskassette in Zellen von nichtvirulenten Spezies ist, wobei die Expressionskassette DNA-Sequenzen umfaßt, die für das heterologe antigene Protein oder Peptid und ein Lactobacillus-Gen, ausgewählt aus der Grupe bestehend aus agg, mit einer DNA-Sequenz wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1 und muc mit einer DNA-Sequenz wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2 kodieren, unter der Kontrolle von Regulationsregionen, die durch Zellen von nichtvirulenten Spezies erkannt werden.
Nicht-virulente bakterielle Spezies gemäß Anspruch 11, wobei die Spezies Lactobacillus ist.
Nicht-virulente Spezies gemäß Anspruch 12, wobei die Spezies Lactobacillus reuteri ist.
Lactobacillus-Spezies gemäß Anspruch 12, wobei das heterologe antigene Protein oder Peptid von einem pathogenen Mikroorganismus abgeleitet ist.
Lactobacillus-Spezies gemäß Anspruch 12, wobei das heterologe Protein oder Peptid von irgendeinem anderen biologischen Material abgeleitet ist.
Verwendung einer Spezies modifizierter Lactobacilli erhalten durch die Schritte: (a) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Spezies, die wünschenswerte Charakteristika zum Targeting und zum Anhaften an mukosales Gewebe aufzeigen; (b) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Stämmen, die zusätzlich das Potenzial zeigen, heterologe Proteine oder Peptide zu exprimieren; (c) Identifizieren und Auswählen des Gens oder der Gene, die für heterologe Proteine oder Peptide kodieren, die von einem pathogenen Mikroorganismus oder von anderem biologischen Material abgeleitet sind; (d) Fusionieren der Gene aus Schritt (c) mit einem Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus agg mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1, und muc, mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2, in eine entsprechende Expressionskassette, die Regulationsregionen enthält, die durch Lactobacilli erkannt werden; (e) Transferieren der Expressionskassette in ausgewählte Lactobacilli-Zellen, um transformierte Lactobacilli zu bilden; (f) Auswählen und Wachsenlassen von transformierten Lactobacilli-Zellen, die replizieren können und auf der Zelloberfläche antigene Proteine exprimieren können, für die die inserierten Gen-Sequenzen kodieren; für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das heterologe Protein oder Peptid ein Vakzin ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 und 17, wobei die modifizierten Lactobacilli-Zellen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern kombiniert werden, um ein Vakzin zu bilden.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das Vakzin für orale Administration vorgesehen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Lactobacilli L. reuteri sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20 zum Vorbeugen oder Behandeln von Infektionen von mukosen Membranen von Säugetieren durch pathogene Mikroorganismen.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die mukosen Membranen der Säugetiere im nasalen Trakt, in der Nasopharynx, in der Pharynx, im Esophagus, im Magen, im Dünndarm und im Dickdarm angeordnet sind.
Eine Zusammensetzung, umfassend modifizierte Lactobacilli, erhalten durch die Schritte: (a) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Spezies, die wünschenswerte Charakteristika zum Targeting und zum Anhaften an mukosalem Gewebe aufzeigen; (b) Identifizieren und Auswählen von Lactobacilli-Stämmen, die zusätzlich das Potenzial aufzeigen, heterologe Proteine zu exprimieren; (c) Identifizieren und Isolieren des Gens oder der Gene, die für heterologe antigene Proteine oder Peptide kodieren, die von einem pathogenen Mikroorganismus oder von anderem biologischen Material abgeleitet sind; (d) Fusionieren der Gene aus Schritt (c) mit einem Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus agg mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1, und muc, mit einer DNA-Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2, in eine entsprechende Expressionskassette, enthaltend regulatorische Regionen, die durch Lactobacilli erkannt werden; (e) Transferieren der Expressionskassette in ausgewählte Lactobacilli-Zellen, um transformierte Lactobacilli zu bilden; (f) Auswählen und Wachsenlassen von transformierten Lactobacilli-Zellen, die replizieren können und auf der Zelloberfläche antigene Proteine exprimieren, für die die inserierten Gen-Sequenzen kodieren.