DE69737323T2

DE69737323T2 - Adhesin aus Helicobacter pylori, welches an Blutgruppenantigene bindet

Info

Publication number: DE69737323T2
Application number: DE69737323T
Authority: DE
Inventors: Thomas Boren; Anna Arnqvist; Staffan Normark; Dag Ilver; Huddinge Sjukhus Lennart HAMMARSTRÖM
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: JP2001503606A; AU3199997A; US6709656B1; WO1997047646A1; EP0909272A1; AU726429B2; JP4112011B2; CA2257826C; US20040234529A1; EP0909272B1; US20080187541A1; ATE353337T1; ES2281914T3; CA2257826A1; NZ333250A; US7271251B2; DE69737323D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zur Prävention, Behandlung und Diagnose von Infektionen, die durch Helicobacter pylori ausgelöst werden. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide und Antikörper, die in Vakzinen für die Behandlung und Prävention pathologischer Infektionen nützlich sind, die durch Helicobacter pylori-Stämme ausgelöst werden. Die vorliegende Erfindung betrifft spezifisch ein bakterielles Blutgruppenbindungsadhesin (BAB-Adhesin). Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynukleotide, die für die rekombinante Produktion der Polypeptide nützlich sind und für eine Verwendung in Immunisierungstherapien. Zusätzlich betrifft sie Polypeptide, Antikörper und Polynukleotide, die für den Nachweis der Bakterien verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin neue Immunglobuline, die eine spezifische Aktivität auf eine Blutgruppenbindungsadhesin ausüben, das von Helicobacter pylori exprimiert wird und ihre Verwendung. Die vorliegende Erfindung ist für die Behandlung und Prävention von Helicobacter pylori induzierten Infektionen im Gastrointestinaltrakt nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Helicobacter pylori ist ein Auslöser für die saure peptische Erkrankung und die Gegenwart dieses Organismus steht in hoher Korrelation zu der Entwicklung von Magenadenokarzinom. Es wurde kürzlich gezeigt, daß eine bakterielle Adheränz an die Epithelauskleidung des menschlichen Magens durch fukosylierte Blutgruppenantigene vermittelt wird.
Die Forschung der letzten Zeit hat sich auf die Rolle von Helicobacter pylori bei der Entwicklung von Geschwüren in der Magenmukosa fokussiert. Kürzliche Feststellungen zeigen einen starken Zusammenhang zwischen H. pylori und chronischer, aktiver Gastritis und Magengeschwüren. Weiterhin scheint eine starke Korrelation zwischen ventrikulärem Krebs und Magengeschwüren zu bestehen. Eine traditionelle Behandlung von Magengeschwüren hat eine Magenresektion, die Verabreichung von Wismutzusammensetzungen, die Verabreichung von H₂-Blockern und die Verabreichung von pH-Puffern involviert, um nur einige Beispiele zu nennen.
Kürzlich wurden verschiedene Behandlungsformen durch die Verabreichung von Antibiotika supplementiert. Ein Problem bei gegenwärtig bekannten Behandlungen ist das Risiko eines Fehlschlagens der Behandlung. Weiterhin entwickeln nicht nur Mikroorganismen eine Antibiotikaresistenz sondern die verabreichten Antibiotika bringen das natürliche Gleichgewicht gutartiger Mikroben die den Intestinaltrakt kolonisieren häufig durcheinander. Dies führt zu Durchfall und anderen Zeichen von intestinalem Unbehagen zusätzlich zu einer Destabilisation der gutartigen Flora im Verdauungstrakt. Andere Behandlungen, z.B. H₂-Blocker benötigen häufig eine lebenslange Medikation um das Wiederauftreten der Erkrankung zu verhindern.
Das Vorstehende macht zusammen mit der Tatsache, daß H. pylori sehr weit verbreitet unter Menschen ist – gemäß einer konservativen Schätzung sind ungefähr 60 % aller erwachsenen Menschen in den Industrieländern infiziert – die Diagnose, Prävention und Behandlung von H. pylori-Infektionen zu einer dringenden Aufgabe.
Weiterhin unterstreicht die Tatsache, daß es in Entwicklungsländern häufig an Ressourcen zur konventionellen Behandlung von Magengeschwüren fehlt die Wichtigkeit der Auffindung neuer Wege für die Behandlung und Prävention von H. pylori-induzierten Infektionen. Es ist aus vielen Gründen offensichtlich, daß eine Erkrankungsprävention mit Vakzinen eine vorzugsweise Ausführungsform ist. Ein Vakzin würde eine einfach verabreichbare und ökonomische prophylaktische Behandlungsvorschrift gegen H. pylori-Infektionen bereitstellen. Ein effektives Vakzin gegen H. pylori fehlt nichtsdestotrotz zum gegenwärtigen Zeitpunkt.
Stand der Technik
H. pylori kolonisiert die menschliche Magenmukusa in einem Gleichgewicht zwischen einer Adheränz an die epithelialen Oberflächenmukosazellen und der mukösen Schichtauskleidung des Magenepithels. Sobald die Infektion stattgefunden hat, scheinen die Bakterien lebenslang eine Kolonie zu bilden. Eine Anhaftung an die Epithelauskleidung schützt die Bakterien vor den antimikrobiellen Wirkungen des sauren Magensafts des Magenlumens wie auch vor physikalischen Kräften wie einer Peristaltik. Für ein Überleben in dieser feindlichen ökologischen Nische hat H. pylori eine Batterie von Virulenzfaktoren entwickelt (siehe Clyne M., Drumm B., Cell envelope characteristics of Helicobacter pylori: their role in adherence to mucosal surface and virulence. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1. Dez. 1966; 16(2): 141-55); wie zum Beispiel die Produktion des Enzyms Uresse, das die Mikroumgebung um die Bakterien abpuffert und polare Flagellen um eine hohe Motilität sicherzustellen, ein notwendiges Charakteristikum in einer ökologischen Nische, wo der Umsatz der mukösen Schicht sich im Bereich von Stunden bewegt. Eine Untergruppe von H. pylori-Stämmen erzeugt das vakuolisierende Cytotoxin VacA und das Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA.
Die Anhaftung ist für die Kolonisierung der Epithelauskleidung essentiell und die Bakterien exprimieren Oberflächen-assoziierte Adhäsionsmoleküle, die spezifisch Kohlenhydrate oder Proteinrezeptoren auf den Zelloberflächen oder der mukösen Auskleidung erkennen. Die Spezifität dieser Wechselwirkung in Kombination mit der genetisch regulierten Rezeptorverteilung führt zu einem begrenzten Bereich von Zelllinien und Geweben, die für die Kolonisierung zur Verfügung stehen. Etliche putative Rezeptorstrategien wurden für H. pylori beschrieben, wie zum Beispiel Hämagglutinin-Sialinsäure, sulfatierte Glycokonjugate und Sulfatide. Kürzlich wurde die fukosylierten Blutgruppenantigene H-1 und Lewis^b beschrieben (Borén et al., Science, 262, 18921993), die eine spezifische Adheränz von H. pylori an die Menschen- und Rhesusaffen-Magenoberflächen-mukösen Zellen in situ vermitteln. Die H-1- und Lewis^b-Antigene sind Teil von Blutgruppenantigenen, die die Blutgruppe 0 im ABC-System definieren. Ein kürzliches Dokument zielt auf die Identifikation eines Adhesins von H. pylori ab, das an etliche Blutgruppenantigene bindet, einschließlich Lewis^b. (Alkout A.M., Blackwell C.C. Weir D.M. Poxton I.R. Elton R.A., Luman W., Palmer K., Isolation of a cell surface component of Helicobacter pylori that binds H type 2, Lewis(a) and Lewis(b) antigens. Gastroenterology April 1997; 112(4): 1179-87). Ein 61-Kilodalton-Protein wurde eluiert.
Oberflächenexprimierte Proteine sind häufig Konstituenten der äußeren Membran. Die äußere Membran hat eine strukturelle Rolle und wirkt als selektive Barriere, wobei sie bestimmt, was in die Zelle eintritt und welche Moleküle sezerniert werden. Eine Klasse äußerer Membranproteine werden Porine genannt und erzeugen hydrophile Poren durch die äußere Membran wo spezifische Metaboliten wie zum Beispiel Zuckermoleküle diese überqueren können. Kürzlich wurde über das Auffinden einer Anzahl äußerer Membranproteine bei H. pylori berichtet, wobei für diese vorgeschlagen wurde, daß sie eine Familie von Porin-Proteinen bilden.
Das BAB-Adhesin wurde früher identifiziert und es wurde gezeigt, daß es auf der bakteriellen Oberfläche von H. pylori lokalisiert ist (siehe Prioritätsanmeldung SE 9602287-6). Es wurde gezeigt, daß die Blutgruppen bindungsaktivität pH-abhängig war und die gegenwärtigen Erfinder präsentieren Beweise, daß die Bindungsaffinität an den Lewis^b-Rezeptor eine hohe Gleichgewichtskonstante aufweist. Für die Reinigung des BAB-Adhesins wurde ein vernetzt markiertes Rezeptorkonjugat verwendet um den spezifischen Transfer von Biotin an die Adhesine auf der bakteriellen Oberfläche zu vermitteln. Danach konnte das Biotin-markierte Adhesin durch Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen extrahiert werden. Die Bestimmung der aminoterminalen Aminosäuresequenz des gereinigten BAB-Adhesins zeigt Homologien zu äußeren Membranproteinen von H. pylori-Porinen.
Intensive Untersuchungen waren auf die immunologische Behandlung und Prävention von H. pylori-induzierten Infektionen gerichtet. Die EP 0 484 148 (Ando & Nakamura) beschreibt ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention einer oberen Gastrointestinalerkrankung bei Säugern, wobei das Verfahren die orale Verabreichung einer effektiven Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen bedürftigen Patienten umfaßt, umfassend anti-Helicobacter pylori-polyklonale Immunglobuline und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Beschreibung beschäftigt sich weiter mit der Kombination dieser Behandlung mit einer Verabreichung von Antibiotika. Als Verfahren zur Erzeugung der polyklonalen Antikörper beschreibt EP 0 484 148 die Isolation und Reinigung von Anti-H.-pylori-Immunglobulinen aus den Seren und der Milch von Säugern. H. pylori selbst wurde im Magen von Kühen, Ziegen, Schafen, Schweinen oder Pferden gemäß EP 0 484 148 nicht angetroffen, jedoch wurde angenommen, daß diese Tierarten kolonisierende Mikroorganismen mit Antigen-Determinanten aufweisen, die zu denen von H. pylori ähnlich sind, da sie Immunglobuline aufweisen, die mit Stämmen von H. pylori kreuzreagieren, die beim Menschen angetroffen werden. Vorzugsweise werden gemäß EP 0 484 148 große Säuger, zum Beispiel schwangere Kühe mit ganzen Zellen von H. pylori immunisiert und die Immunglobuline darauffolgend aus der Milch oder dem Colostrum extrahiert. Bei den Immunisierungsexperimenten wurden NCTC-Stamm 11362 und das klinische Isolat H. pylori Nr. 153 verwendet um die Produktion von Immunglobulinen auszulösen. Andererseits wurde der NCTC-Stamm 11637 für Analysezwecke verwendet. Es wird beansprucht, daß die Immunisierung einen Anti-H.-pylori-Titer in der Milch in einer derartigen Größenordnung ergibt, daß tägliche Dosen von 0,01-0,1 g/Tag Immunglobulinzusammensetzung für eine erfolgreiche Therapie ausreichen. Das beanspruchte Intervall von 0,01-0,1 g/Tag wurde jedoch nicht durch die von Ando & Nakamura präsentierten Experimente gestützt und so derartig niedrige Dosen haben sich bis jetzt in klinischen Tests als nicht effizient erwiesen. Die aktuell in den Beispielen 5 und 7 verwendeten Dosen liegen bei einem Größenordnungsbereich von 1 g/Tag, d.h. dem 10-fachen der Obergrenze des gegebenen Intervalls. Weiterhin ist es sehr unwahrscheinlich, daß unspezifische Immunglobulinmischungen wie die von Ando & Nakamura hergestellten in den beanspruchten Dosierungen effektiv sein würden, da ähnliche Dosen gegen andere gastrointestinale Pathogene nicht effektiv sind. Die simultane Verabreichung von Antibiotika, die in der Beschreibung extensiv diskutiert wird, unterstreicht die Unzulänglichkeit der offenbarten Immunglobuline.
Auch EP 0 469 359 (Cordle & Schaller) beschreibt die Immunisierung von Säugern, vorzugsweise schwangeren Kühen mit Formalin-getöteten H. pylori-Bakterien (ATCC-Stamm 26695). Anti-H.-pylori-polyklonale-Antikörper wurden isoliert und aus der Milch gereinigt und schließlich an Ferkel in Mengen von ungefähr 0,5 g Immunglobulinen 3-mal täglich verabreicht. Die Ergebnisse wurden durch eine Bestimmung der Zahl von Biopsieproben bewertet, die für Gram-negative Bakterien nach dem Versuch positiv waren. Die Gram-negativen Bakterien wurden bei 78 % der Ferkel angetroffen, die mit Nicht-Immunnährstoff gefüttert wurden, aber nur (Sic!) bei 35 % der Ferkel, denen Nährstoff verabreicht wurde, enthaltend sogenannte spezifische Anti-H.-pylori-Antikörper.
Anti-H.-pylori-Antikörper, die effektiv sind, um eine Aggregation von H. pylori auszulösen wurden so oral als Behandlungsvorschrift und Prävention von H. pylori-induzierten Infektionen im Gastrointestinaltrakt verabreicht. Nichtsdestotrotz ist es wie auch in EP 0 484 148 festgehalten immer noch nicht klar, wie viele antigene Determinanten auf der Oberfläche von H. pylori vorliegen. Das Auftreten einer breiten Varietät von H. pylori-Stämmen macht die praktische Effizienz jeder polyklonalen immunologischen Therapie gemäß dem Stand der Technik fragwürdig. Eine Immunisierung unter Verwendung ganzer Bakterien wird immer eine hohe polyklonale Immunreaktion mit einem niedrigen Niveau an Antikörpern gegen eine gegebene antigene Determinante auslösen. Dies wird z.B. durch die von Cordle & Schaller präsentierten Ergebnisse unterstrichen, wobei obwohl die Zahl an Helicobacter-positiven Biopsien reduziert war, eine vollständige Heilung durch die Behandlung gemäß ihrer Erfindung nicht erhalten wurde.
Es ist bemerkenswert, daß die für eine orale Prophylaxe oder Therapie benötigte Immunglobulindosis noch nicht klar definiert wurde. Bei einem normalen menschlichen Erwachsenen werden ungefähr 5 g IgA erzeugt und an den Oberflächen täglich sezerniert. Offensichtlich sind Dosierungen in dieser Größenordnung ökonomisch und praktisch für eine groß angelegte Therapie oder Prophylaxe ungeeignet. In Studien im Hinblick auf die Wirkung von oralen Immunglobulinen auf eine Rotavirusinfektion wurden tägliche Dosierungen in einem Intervall von 600 bis 9000 mg in klinischen Tests untersucht. Eine erfolgreiche Intervention wurde auch berichtet, wenn H. pylori und kryptosporidiale Infektionen bei täglichen Verabreichungen von 3 bis 15 g Immunglobulin von immunisierten Kühen behandelt wurden (Hammarström et al., Immunol. Rev. 139 (1994), 43-70). Allgemein gesprochen deuten alle Studien bis jetzt auf eine Notwendigkeit einer Verwendung hoher Immunglobulindosen hin, wenn man eine aktuelle Infektion bekämpfen will. Der Bedarf an spezifischeren Immunglobulinpräparationen, die die Verwendung geringerer Dosierungen ermöglichen würden, ist daher dringend.
Um die Potenz einer immunologischen Behandlungsvorschrift für die Behandlung und Prävention von H. pylori zu maximieren ist es von großer Wichtigkeit eine spezifisch konservierte antigene Determinante zu finden, die eine zentrale Rolle für die Pathogenität von H. pylori spielt. Die Verwendung einer solchen Antigen-Determinante würde es ermöglichen hochspezifisch und therapeutisch effiziente neue polyklonale und/oder monoklonale Immunglobulinpräparationen zu erzeugen.
Zusammenfassung der Erfindung
Das obige Problem der Bereitstellung spezifischer, kosteneffizienter und therapeutisch überlegener Immunglobulinpräparationen für die Behandlung und Prävention von H. pylori wurde nun durch die Zusammensetzung gemäß der beigefügten Patentansprüche gelöst. Die vorliegenden Erfinder haben nun überraschend gezeigt, daß hochspezifische und therapeutisch effiziente polyklonale und/oder monoklonale Immunglobulinpräparationen durch die Immunisierung eines Tiers mit einem Adhesin-Protein, das für H. pylori spezifisch ist, bereitgestellt werden können. Das Adhesin-Protein ist bereits in den Priotitätsanmeldungen SE 9602287-6 und SE 9701014-4 charakterisiert, die hier in ihrer Gesamtheit in bezug genommen werden. Die Erfindung wird nun im näheren Detail unter Bezugnahme auf die beigefügten nicht-begrenzenden Figuren und Beispiele beschrieben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die weitere Reinigung und Kennzeichnung der H. pylori-Blutgruppenantigenbindungs-(BAB)-Adhesins, um die Entwicklung von Verfahren und Materialien für die spezifische und selektive Diagnose und Behandlung von H. pylori-induzierten Infektionen und verwandten Erkrankungen zu ermöglichen und die Entwicklung der Verfahren und Materialien. Eine weitere und entsprechend wichtige Aufgabe war die Bestimmung der DNA-Sequenzen der Gene, die an der Expression dieses Proteins beteiligt sind. Diese Aufgaben wurden durch das in Anspruch 1 angegebene Protein erfüllt, die in den Ansprüchen 12 und 13 offenbarte DNA und die in den darauffolgenden Ansprüchen spezifizierten Verfahren und Materialien. Die DNA-Sequenzen wie ursprünglich eingereicht sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt und offenbaren die babA- bzw. die babB-Sequenzen. Die vollständige Proteinsequenz ist in Tabelle 4 offenbart.
Beschreibung der Figuren
1A illustriert die bakterielle Bindung an lösliche Blutgruppenantigene. H. pylori-Stämme wurden mit ¹²⁵I-markierten Blutgruppenantigenglucokonjugaten inkubiert und die gebundene ¹²⁵I-Aktivität wurde gemessen (Merke: Abwesenheit von Blutgruppenantigenbindung gezeigt für die Stämme MO19 und 26695).
1B illustriert einen Rezeptor-Displacement-Assay. Der Stamm CCUG 17875 wurde zunächst mit 10 ng ¹²⁵I-markierten Le^b-Antigen-Glucokonjugat inkubiert und der Komplex wurde dann (1 h) mit einem Überschuß an markierten Le^b oder Le^a Glycokonjugat Antigen ausgesetzt, bevor die 125_I- Aktivität im bakteriellen Pellet gemessen wurde. Konzentrationen eines nichtmarkierten Glycokonjugats reichten von 50 ng bis 8 μg und C) zeigt die Ergebnisse einer Scatchard-Analyse der H. pylori Leb-Antigeninteraktion. Die bakterielle Bindung an das Leb-Glycokonjugat wurde gegen eine Affinitätskonstante (Ka)-Wert von 8 × 10^–10 M^–1 titriert (13).
2: Obere Reihe: Prävalenz des BabA-Adhesins in der bakterielleen Population. Zellen des. Stamms CCUG 17875 wurden mit biotinyliertem Le^b (A) oder Le^b (B) Glycokonjugat inkubiert. Gebundenes biotinyliertes Lewis-Konjugat wurde mit FITC-markiertem Streptavidin (grüne Fluoreszenz) nachgewiesen und die Bakterien wurden mit Propidiumiod (Rot-Fluoreszenz) gegengefärbt. Untere Reihe: Lokalisierung des BabA-Adhesins. Für eine Elektronenmikroskopie (15) wurden Zellen des Stamms CCUG 17875 mit biotinyliertem Le^b (C) oder Le^a (D) inkubiert.
3 zeigt die Charakterisierung des Molekulargewichts des BabA-Adhesins durch Verwendung einer Rezeptor-Overlay-Analyse (A, B) und eine Rezeptor-affinitätsgerichtetes Affinitätstagging von BabA (C).
4 zeigt ein Rezeptoraktivitäts-gerichtetes Affinitätstagging und Proteinreinigung des BabA-Adhesins.
5 zeigt die translatierten Aminosäuresequenzen für die BabA- und BabB-Gene, korrespondierend zu der N-terminalen Domäne des BabA-Adhesins.
6 zeigt die prozentuale Inhibition der H. pylori-Bindung an ¹²⁵I-markierte Lewis-b-Antigene für unterschiedliche Präparationen als Funktion des Antikörpertiters.
7 zeigt einen Western-Blot-Nachweis des BabA-Adhesins durch die unterschiedlichen Antikörperpräparationen.
8 zeigt vier Western-Blot-Analysen von H. pylori-Proteinen durch die unterschiedlichen Antikörperpräparationen.
Beschreibung der Erfindung
Das Blutgruppenbindungsadhesin, BabA, wurde nun biochemisch gekennzeichnet und durch ein neues Verfahren gereinigt, das Rezeptoraktivitätsgerichtete Affinitäts-Tagging (Retagging). Zwei Gene, BabA und BabB erwiesen sich als für zwei unterschiedliche aber sehr ähnliche Proteine codierend. Die vorliegende Erfindung umfaßt so ein neues Blutgruppenbindungsadhesin gemäß Anspruch 1 und der derauffolgenden Ansprüche. Die DNA-Sequenzen sind in den Tabellen 2 (babA) und 3 (babB) offenbart. Die Proteinsequenz ist in Tabelle 4 offenbart. Die Erfindung beinhaltet auch jede pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Adhesin-Protein und/oder Fraktionen davon. Beispiele für solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind beispielsweise Medikamente für die Prävention oder Behandlung von Helicobacter pylori-induzierter Gastritis, Magen- und Duodenumgeschwüren und Magenadenokarzinom. Optional umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich pharmazeutisch akzeptable Exzipientien.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung das BAB-Adhesin-Gen oder die -Gene zur Expression eines Adhesin-Proteins gemäß der Erfindung. Ein neues Verfahren für die Isolierung und Reinigung der Adhäsion wird beschrieben. Die offenbarten Gene werden so betrachtet, daß sie als Kassettensystem funktionieren, wobei der Organismus zwischen diesen alterniert um eine Immunität des Wirts zu vermeiden. Es ist sehr wahrscheinlich, daß Homologien der offenbarten Sequenzen existieren und zusätzlich die Kassettenfunktion in anderen Stämmen von H. pylori supplementieren. Außerdem können Gene, die zu einer Homologie der ersten 40 Aminosäuren oder Gene korrespondieren, korrespondierend zu einer Homologie der letzten ungefähr 300 Aminosäuren so funktionieren. Es ist weiterhin sehr wahrscheinlich, daß Helicobacter pyloris dazu in der Lage ist, zwischen etlichen Genen zu wechseln, ähnlich den offenbarten Genen in einem sogenannten Kassettensystem.
Die Erfindung umfaßt zusätzlich monospezifische Antiseren, die unter Verwendung des neuen Adhesin-Proteins und/oder immunologisch wirksamer Fraktionen davon erzeugt wurden. Diese monospezifischen Antiseren werden vorzugsweise gemäß irgendeinem geeigneten konventionellen Verfahren zur Produktion monospezifischer Antiseren in vitro oder in vivo erzeugt, zum Beispiel durch Inokulation eines geeigneten Tiers. Solche Verfahren sind für den Fachmann auf dem Gebiet üblich. Antikörper, die in einem geeigneten Tier oder in dem zu behandelnden Patienten erzeugt wurden, können darauffolgend lokal, zum Beispiel oral an einen Patienten verabreicht werden.
Die Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung der monospezifischen Antiseren für die Herstellung eines Testkits für die quantitative oder qualitative Bestimmung von Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamen Fraktionen davon in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten.
Die Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung des Adhesin-Proteins oder der korrespondierenden DNA für die Herstellung eines Vakzins und/oder für die Herstellung von Zusammensetzungen für diese Verwendungen. Die DNA der Erfindung kann für eine Immunisierungstherapie und für die Herstellung der Zusammensetzungen für eine solche Therapie verwendet werden. Vorzugsweise werden bei einer Immunisierungstherapie, wobei die Zusammensetzung oral an einen Patienten verabreicht wird, das Adhesin-Protein, immunologisch effektive Fraktionen davon oder die DNA in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten immunstimulierenden Mittel verabreicht. Beispiele für solche Mittel beinhalten die folgenden, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Choleratoxin und/oder Derivate davon, wärmelabile Toxine wie zum Beispiel E. coli-Toxin und ähnliche Mittel. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin konventionelle und pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien beinhalten, die für den Fachmann auf dem Gebiet der Immunisierungstherapie bekannt sind. Vorzugsweise wird in einer Immunisierungstherapie unter Verwendung der erfinderischen DNA die DNA vorzugsweise intramuskulär verabreicht, wobei die DNA in geeignete Plasmidträger eingebaut wird. Ein zusätzliches Gen oder Gene die ein geeignetes Immunstimulans codieren, können vorzugsweise in dasselbe Plasmid inkorporiert werden.
Die Immunisierungstherapien sind nicht auf die oben beschriebenen Verabreichungswege begrenzt, sondern können natürlich an eine der folgenden Verabreichungswege angepaßt werden: Oral, nasal, subkutan und intra muskulär. Insbesondere sind die oralen und nasalen Verabreichungsverfahren vielversprechend, insbesondere für Immunisierungen im großen Umfang.
Die vorliegenden Erfinder haben überraschend dargestellt, daß hochspezifische und therapeutisch effiziente polyklonale und/oder monoklonale Immunglobulinpräparationen durch die Immunisierung eines Tiers mit einem Adhesin-Protein oder Fraktionen davon, die spezifisch für H. pylori sind, bereitgestellt werden können. Wenn eine Immunisierung gegen H. pylori betrachtet wird, ist es bemerkenswert, daß die Infektion bekanntlich lebenslang anhält, trotz einer kräftigen Immunreaktion der Magenmukosa. Eine erhöhte lokale Produktion von IgA in der Mukosa ist nicht notwendigerweise genug und die Verabreichung monospezifischer Antikörper, die gegen einen zentralen Virulenzfaktor gerichtet sind, wie zum Beispiel dem Adhesin gemäß der vorliegenden Erfindung könnte einen effektiveren Ansatz bilden.
Die Bezeichnung "Immunisierung" betrifft hier ein Verfahren zur Induktion eines kontinuierlichen hohen Antikörperniveaus und/oder einer zellulären Immunreaktion. Die Bezeichnung "Tier" bedeutet hier vorzugsweise jedes Mitglied des Subphylums Vertebrata, einer Division, die alle Tiere einschließlich den Säugern beinhaltet, die durch segmentierte knöchrige oder knorpelige Wirbelsäulen gekennzeichnet sind. Alle Vertebraten haben ein funktionales Immunsystem und reagieren auf Antigene durch die Erzeugung von Antikörpern. Die Bezeichnung "Protein" wie hier verwendet bezeichnet ein natürlich auftretendes Polypeptid und die Bezeichnung "Polypeptid" wird hier in ihrer breitesten Bedeutung verwendet, d.h. sie bezeichnet jedes Aminosäurepolymer (Dipeptid oder länger), das durch Peptidbindungen verbunden ist. Dementsprechend umfaßt die Bezeichnung "Polypeptid"-Proteine, Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoga, Muteine, Fusionsproteine und ähnliches. Die Bezeichnung "Antikörper" wie in diesem Kontext verwendet, beinhaltet einen Antikörper, der zu irgendeiner immunologischen Klasse gehört, wie zum Beispiel die Immunglobuline A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse ist nichtdestotrotz Immunglobulin A (IgA), da es sich um das Hauptimmunglobulin handelt, das durch das sekretorische System von Warmblütern erzeugt wird. Im unteren Colostrum kann jedoch die Hauptantikörperklasse IgGl sein.
Borén et al. haben kürzlich ein Lewis^b-Bindungsprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 73500 Da isoliert und gekennzeichnet (siehe die Prioritätsanmeldungen SE 9602287-6 und SE 9701014.4, die hier in ihrer Gesamtheit in bezug genommen werden). Es wird angenommen, daß dieses Adhesin-Protein eine konservierte Struktur aufweist und für pathogene Stämme von H. pylori spezifisch ist. Das Protein ist für mindestens einen der H. pylori-Stämme spezifisch, die in der folgenden Gruppe beinhaltet sind: CCUG 17875, NCTC 11637, A5, P466, G109, G56, Ba 185, Ba 99, 931 und 932.
Dieses Adhesin-Protein oder immunologisch wirksame Fraktionen davon sind dadurch gekennzeichnet, daß die folgende Aminosäuresequenz beinhaltet ist:
EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.
Die folgende DNA-Sequenz ist in der DNA zur Expression des Adhesin-Proteins oder immunologisch wirksamer Fraktionen davon beinhaltet:
5'-GAAGACGACGGCTTTTACACAAGCGTAGGCTATCAAATCGGT GAAGCCGCTCAAATGGTA-3'
Die Immunglobulinzusammensetzung der Erfindung wird durch Immunisierung eines schwangeren Säugers erzeugt, vorzugsweise einer Kuh oder eines anderen geeigneten Haustiers mit dem Lewis^b-Bindungsadhesinprotein oder immunologisch wirksamer Fraktionen davon. Das Adhesin-Protein oder immunologisch wirksame Fraktionen davon wird/werden vorzugsweise intramuskulär oder subkutan dem gewählten Tier optional zusammen mit geeigneten Adjuvantien injiziert. Beispiele für solche Adjuvantien beinhalten Immunstimulierungsmittel wie zum Beispiel das Choleratoxin und/oder Derivate davon, hitzelabile Toxine wie zum Beispiel E. coli-Toxin und ähnliche, konventionelle Mittel wie zum Beispiel klassische Adjuvantien einschließlich mineralischen und pflanzlichen Ölen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Folgend auf die Behandlung durch Immunisierung, umfassend eine notwendige Menge von Dosierungen, einschließlich sogenannter Booster-Dosierungen über eine ausreichende Zeitspanne für eine optimale Immunglobulinexpression werden Milch oder Seren von dem Tier gesammelt. Vorzugsweise wird das Kuh-Colostrum, das besonders hoch an Immunglobulinen ist, gesammelt. Die spezifische Immunglobulinfraktion gemäß der vorliegenden Erfindung wird dann auf konventionelle Weise abgetrennt und gereinigt, z.B. einschließlich einer Abtrennung von Fetten, einer Proteinpräzipitation und einer Konzentration durch Ultrafiltration.
Gemäß einem anderen Verfahren zur Erzeugung der Immunglobulinzusammensetzung der Erfindung wird ein Vogel, vorzugsweise ein Huhn oder ein anderer geeigneter Hausvogel mit dem Lewis^b-Bindungsadhesinprotein oder immunologisch effektiven Fraktionen davon immunisiert. Das Adhesin-Protein oder Fraktionen davon wird vorzugsweise intramuskulär oder subkutan in den gewählten Vogel optional zusammen mit geeigneten Adjuvantien injiziert.
Beispiele für solche Adjuvantien beinhalten immunstimulierende Mittel wie zum Beispiel Choleratoxin und/oder Derivate davon, hitzelabile Toxine wie zum Beispiel E. coli-Toxin und ähnliche, konventionelle Mittel wie zum Beispiel klassische Adjuvantien einschließlich mineralischen und pflanzlichen Ölen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Folgend auf die Behandlung durch Immunisierung, umfassend eine notwendige Menge von Dosierungen, einschließlich sogenannter Booster-Dosierungen über eine ausreichende Zeitspanne für eine optimale Immunglobulinexpression werden Eier oder Seren von dem Tier gesammelt. Vorzugsweise wird das Eigelb, das besonders hoch an Immunglobulinen ist, gesammelt. Die spezifische Immunglobulinfraktion gemäß der vorliegenden Erfindung wird dann auf konventionelle Weise abgetrennt und gereinigt, z.B. einschließlich einer Proteinpräzipitation und einer Ultrafiltration. Alternativ kann das Eigelb, das von hohem Nährwert zusätzlich zu einem hohen Titer an spezifischen Antikörpern ist, gemäß der vorliegenden Erfindung als solches verabreicht werden.
Gemäß einem bevorzugten Herstellungsverfahren wird ein monoklonales Immunglobulin durch Etablieren transgener Tiere erzeugt. Solche transgenen Tiere können aus der folgenden Gruppe von Arten gewählt werden: Säuger, z.B. Kuh, Ziege und Kaninchen und Vögel: z.B. Huhn, Ente und Truthahn. Der besonders bevorzugt verwendete Säuger ist die Kuh und der besonders bevorzugte Vogel ist das Huhn. Eine weitere Entwicklung transgener Tiere wie zum Beispiel Mäuse und Ratten könnte ebenfalls neue Möglichkeiten eröffnen. Die Wahl des Tiers wird natürlich durch die Verfügbarkeit und eine lokale Adaptation bestimmt.
Beispielsweise wird ein Grundstock transgener Tiere, die an die lokalen Bedingungen angepaßt sich, lokal gehalten z.B. in Dörfern in Entwicklungsländern um als lokale Einheiten zur Erzeugung der Immunglobuline für die orale Verabreichung zu dienen. Beispielsweise sind transgene Kühe, Ziegen oder Hühner für diesen Zweck geeignet und vorzugsweise werden Hühner verwendet. Der Verbrauch der Milch oder vorzugsweise der Eier, die durch die transgenen Tiere erzeugt werden, kann dabei helfen, gegenwärtig sehr schwierige infektiöse Erkrankungen, zum Beispiel durch H. pylori ausgelöste Erkrankungen, auszulöschen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper unter Verwendung des Hybridom-Verfahrens erzeugt werden. Das Hybridom-Verfahren ist dem geübten Arbeiter auf dem Gebiet der Biochemie wohlbekannt und wird z.B. in Galfre, G. and Milstein C., Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures (Methods in Enzymology, 73:3-46, 1981) beschrieben. Ein geeignetes Wirtstier wird mit dem Lewis^b-Bindungsadhesinprotein oder Fraktionen davon immunisiert. Nach der Immunisierung wird das Tier geopfert, Milzzellen gesammelt und mit Zellen von einer neoplastischen Zelllinie fusioniert, vorzugsweise Myelomzellen. Durch Auswahl der Wachstumsbedingungen können die erfolgreich fusionierten Hybridomzellen gewählt werden. Die durch die Hybridomzelllinie erzeugten monoklonalen Antikörper können dann oral in einer Vorschrift für eine Behandlung und/oder Prävention von H. pylori-Infektionen verabreicht werden.
Vorzugsweise werden die polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper vor der Verabreichung gereinigt und noch bevorzugter mit pharmazeutisch geeigneten Trägern oder Adjuvantien vermischt. Beispiele für geeignete Träger sind Salzlösung, pharmazeutisch annehmbare Fette, Öle, Kohlenhydrate und Proteine. Der Träger oder die Träger ist/sind vorzugsweise so gewählt, daß die Löslichkeit und Absorption des Immunglobulins in der Mukosa-Schichtauskleidung des Magens erhöht wird. Unter Verwendung geeigneter Adjuvantien kann die Stabilität, therapeutische Effizienz und der Nährwert der Zusammensetzung verbessert werden. Um die Stabilität bei Lagerung zu verbessern, kann die Immunglobulinzusammensetzung lyophilisiert werden. Unabhängig von der exakten Präparation und/der Formulierung ist es von zentraler Wichtigkeit eine Denaturierung der Immunglobuline zu verhindern.
Die höhere Spezifität, die von den Immunglobulinpräparationen der polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung ausgeübt wird, ermöglicht es, wesentlich niedrigere Dosierungen im Vergleich mit den gegenwärtig verwendeten zu verwenden und so die Kosten zu senken und die Verfügbarkeit der Behandlung zu verbessern. Die Verwendung der spezifischen monoklonalen Antikörper kann es möglich machen die Dosierungen weiter zu erniedrigen. Die Dosierungen sind in allen Fällen eine Funktion des Antikörpertiters der Präparation. Ein hoher Titer ermöglicht natürlich die Verwendung niedriger Dosierungen.
Eine Immunglobulinpräparation der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden: ein Tier wird mit einem Lewis^b-Bindungsadhesinprotein oder Fraktionen davon immunisiert, exprimiert von Helicobacter pylori, die Immunglobulinfraktion wird aus Exkreten des Tiers isoliert und darauf gereinigt. Die gereinigte Immunglobulinzusammensetzung wird mit geeigneten Trägern und Adjuvantien vermischt um eine Immunglobulinpräparation für die Prävention oder Behandlung von H. pylori-Infektionen zu bilden. In den Fällen, in denen der Antikörpertiter ausreichend hoch ist und die anderen Bestandteile der Immunglobulinzusammensetzung, isoliert aus dem Tier harmlos sind, beispielsweise im Fall von Colostrum von immunisierten Kühen oder Eigelb von immunisierten Hühnern gibt es immer die Option der Verabreichung von Colostrum oder Eigelb an den Patienten ohne weitere Behandlung des Colostrums oder des Eigelbs.
Die erfindungsgemäße Immunglobulinzusammensetzung wird vorzugsweise oral an den Patienten in der kleinsten therapeutischen oder prophylaktisch effektiven Dosis verabreicht. Gegenwärtig werden Dosen in einem Intervall von 0,1 bis 1000 mg/Tag, vorzugsweise in einem Intervall von 0,1 bis 100 mg/Tag betrachtet. Die gewählten Dosierungen hängen natürlich von dem Antikörpertiter der fraglichen Präparation ab. Die exakten Dosierungen und die Behandlungsvorschrift können durch den für den Patienten der mit Helicobacter infiziert ist verantwortlichen Arzt gewählt werden. Routineexperimente und spätere, mit steigender Erfahrung über dieses Verfahren, empirische Informationen werden genügen um die benötigte Menge zu etablieren. Es können multiple Dosierungen je nach Bedarf verwendet werden um das gewünschte Niveau einer therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Immunglobulinpräparationen können auch, da sie von nachteilen Nebenwirkungen frei sind und im wesentlichen keine Überdosierungsgefahr darstellen, prophylaktisch oder therapeutisch von einer Person ohne medizinische Überwachung eingenommen werden.
Eine therapeutische Wirkung kann außer bei dem spezifischen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit mindestens zwei Fab-Fragmenten des Antikörpers erreicht werden. Diese Ausführungsform ist vom Umfang der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform werden avirulente Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien als Expressionssysteme für den erfindungsgemäßen spezifischen Antikörper verwendet. Ein "avirulenter Mikroorganismus" in diesem Kontext ist ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit dazu aufweist, ein infiziertes Individuum zu kolonisieren und sich zu replizieren, jedoch nicht zu Erkrankungssymptomen führt, die mit virulenten Stämmen derselben Organismenart assoziiert sind. Die in dem GRAS (Generally Regarded As Safe)-Konzept inhärente Definition kann hier angewandt werden. Ein GRAS-Organismus ist zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, unter der Voraussetzung, daß der Organismus den Antikörper externalisiert oder für diese Wirkung modifiziert werden kann. Die Bezeichnung "Mikroorganismus" wie hier verwendet beinhaltet Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze. Vorzugsweise werden die Bakterien als Expressionssysteme verwendet, zum Beispiel Bakterien der Gattung Lactobacillus, Streptococcus oder Enterobacteriaceae. Das oben erwähnte Expressionssystem kann in vitro für die Erzeugung des spezifischen Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden oder gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Mikroorganismen, die das Expressionssystem bilden, dem Patienten direkt verabreicht werden. Die Mikroorganismen können als solche geerntet und verabreicht werden, werden jedoch vorzugsweise mit einem geeigneten Träger vermischt, mit einem geeigneten Nahrungsmittel vermischt, lyophilisiert, verkapselt oder auf jede andere konventionelle Weise behandelt, die für die Zufuhr lebensfähiger Mikroorganismen zum Gastrointestinaltrakt verwendet wird.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform werden avirulente Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien als Expressionssysteme für das spezifische Adhesin-Protein der vorliegenden Erfindung verwendet. Ein "avirulenter Mikroorganismus" in diesem Zusammenhang ist ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit dazu aufweist, ein infizierte Individuum zu kolonisieren und sich zu replizieren jedoch nicht zu Erkrankungssymptomen führt, die mit virulenten Stämmen derselben Organismenart assoziiert sind. Die in dem GRAS (Generally Regarded As Safe)-Konzept inhärente Definition kann hier angewandt werden. Ein GRAS-Organismus ist zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, unter der Voraussetzung, daß der Organismus das Adhesin-Protein externalisiert oder für diese Wirkung modifiziert werden kann. Die Bezeichnung "Mikroorganismus" wie hier verwendet beinhaltet Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze. Vorzugsweise werden die Bakterien als Expressionssysteme verwendet, zum Beispiel Bakterien der Gattung Lactobacillus, Streptococcus oder Enterobacteriaceae. Das oben erwähnte Expressionssystem kann in vitro für die Erzeugung des spezifischen Adhesins gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden oder gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Mikroorganismen, die das Expressionssystem bilden, dem Patienten direkt verabreicht werden. Die Mikroorganismen können als solche geerntet und verabreicht werden, werden jedoch vorzugsweise mit einem geeigneten Träger vermischt, mit einem geeigneten Nahrungsmittel vermischt, lyophilisiert, verkapselt oder auf jede andere konventionelle Weise behandelt, die für die Zufuhr lebensfähiger Mikroorganismen zum Gastrointestinaltrakt verwendet wird.
Die exakten Dosierungen und die Verabreichungsbehandlungsvorschrift der Mikroorganismen können durch den Arzt gewählt werden, der für den mit Helicobacter pylori infizierten Patienten verantwortlich ist. Routineexperimente und spätere, mit steigender Erfahrung über dieses Verfahren, empirische Informationen werden genügen um die benötigte Menge zu etablieren. Es können multiple Dosierungen je nach Bedarf verwendet werden um das gewünschte Niveau einer therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen avirulenten Mikroorganismen, die den Antikörper oder das Adhesin-Protein gemäß der Erfindung exprimieren, können auch, da sie von nachteilen Nebenwirkungen frei sind und im wesentlichen keine Überdosierungsgefahr darstellen, prophylaktisch oder therapeutisch von einer Person ohne medizinische Überwachung eingenommen werden. Ein bevorzugter Träger bei dieser spezifischen Anwendung ist ein Nahrungsmittel, z.B. ein fermentiertes Produkt, z.B. fermentiertes Getreide oder ein Milchprodukt.
Die Erzeugung der vorher erwähnten Expressionssystem und der noch früher erwähnten Verfahren zur Erzeugung von Hybridomen und transgenen Tieren können Schritte beinhalten, die rekombinante DNA-Verfahren involvieren. Rekombinante DNA-Techniken sind nun ausreichend wohlbekannt und weitverbreitet um sie als Routine zu betrachten. In sehr allgemeinen und breiten Ausdrücken bestehen rekombinante DNA-Techniken aus der Übertragung eines Teils des genetischen Materials von einem Organismus in einen zweiten Organismus, so daß das übertragene genetische Material ein permanenter Teil des genetischen Materials des Organismus wird, auf den er übertragen wurde. Verfahren um dies zu erreichen sind wohlbekannt und die Auswahl der spezifischen Verfahren zum Erhalt bestimmter Ziele, wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen beschrieben, fallen unter den Umfang der Erfindung.
Es ist möglich, daß H. pylori allein oder zusammen mit verwandten langsam wirkenden Bakterien an der Genese und der Verschlechterung anderer chronischer entzündlicher Erkrankungen im Gastrointestinaltrakt beteiligt ist. Es ist für den geübten Profi klar, wie die vorliegende Erfindung modifiziert werden muß, wobei sie im Umfang der Ansprüche liegt, um eine Nützlichkeit für die Behandlung oder Prävention solcher Erkrankungen zu erreichen. Beispiele für solche Erkrankungen sind die Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, eine Sarcoidose, eine Wegener-Granulomatose und andere vaskulitische Störungen wie auch verschiedene Neoplasmen, einschließlich Karzinom den Kolons, des Pankreas und der Prostata.
Beispiele
Der H. pylori-Stamm CCUG 17875 wurde von CCUG Göteborg, Schweden, erhalten. Der Stamm A5, ein Magengeschwürisolat von Astra Arcus, Södertälje, Schweden. Die Stämme P466 und MO19 wurden früher beschrieben (Borén et al., Science, 262, 1892 (1993)). Der Stamm 26695 stammt von Dr. K.A. Esten, The Ohio State University und sein Genom wurde kürzlich von TIGR, Rockville, Maryland, USA sequenziert. Das Panel von 45 H. pylori klinischen Isolaten stammt von dem University Hospital in Uppsala, Schweden. Die Bakterien wurden bei 37°C in 10 % CO₂ und 5 % O₂ 48 h gezüchtet.
Alle verwendeten Blutgruppen-Antigen-Glycokonjugate, d.h. semisynthetische Glucoproteine, konstruiert durch Konjugation gereinigter fucosylierte Oligosaccharide mit Serumalbumin stammten von IsoSep AB, Tullinge, Schweden. Der RIA wurde gemäß Falk et al. (Meth. Enzymol. 236, 353, 1994) mit einigen Modifikationen durchgeführt; die H-1-, Leb-, Lea-, H-2-, Le^x- und Le^y-Glycokonjugate waren durch das Chloramin T-Verfahren ¹²⁵I-markiert worden. 1 ml Bakterien (A600=OD 0,10) wurde mit 300 ng ¹²⁵I-markiertem Konjugat (d.h. einem Überschuß an Rezeptoren) 30 min in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,5 % Albumin, 0,05 % Tween 20 (BB-Puffer) inkubiert. Nach der Zentrifugatio wurde die ¹²⁵I-Aktivität im bakteriellen Pellet durch gamma-Szitillationszählungen gemessen.
In dieser Studie charakterisierten und identifizierten die gegenwärtigen Erfinder zunächst biochemisch das H. pylori-Blutgruppen-Antigen-Bindungsadhesin, BabA. H. pylori-Stämme wurden im Hinblick auf ihre Bindung an lösliche ¹²⁵I-markierte fucosylierte Blutgruppenantigene analysiert (1A). Die Bindung dieser Stämme an die löslichen Blutgruppen-Antigene korrelierte zur Adheränz in situ. Die Prävalenz der Blutgruppen-Antigenbindung (BAB)-Aktivität wurde unter 45 klinischen H. pylori-Isolaten bewertet und die Majorität der Isolate, 71 %, exprimieren Leb-Antigen-Bindungseigenschaften (Daten nicht dargestellt). Demgegenüber bindet keiner der Referenzstämme (1A) oder die Stämme von dem Panel 45 klinischer Isolate binden an die Le^a-, H-2-, Le^x- oder Le^y-Antigene. Dieser Ergebnisse unterstützen unsere früheren Feststellungen einer hohen Rezeptorspezifität für die Le^b- und H-1-Blutgruppenantigene und demonstrieren die hohe Prävalenz der BAB-Aktivität unter den klinischen Isolaten.
Basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit von Virulenzfaktoren wie zum Beispiel dem Cytotoxin-assoziierten Gen A (CagA) und dem vacuolisierenden Cytotoxin A (VacA) werden H. pylori-Stämme als Typ I- oder Typ II-Stämme klassifiziert. H. pylori-Isolate von Patienten mit Duodenumgeschwüren exprimieren besonders häufig die VacA- und CagA-Proteine, d.h. Typ I-Stämme. Per Definitionen exprimieren Typ II-Stämme keinen dieser Marker. 21 klinische Isolate, die früher für die Expression von CagA und VacA definiert wurden, wurden auf Leb-Antigenbindungseigenschaften analysiert. Eine Expression von CagA erwies sich als mit einer bakteriellen Bindung an das Le^b-Antigen korrelierend (Tabelle 1). Das CagA-Gen gehört zu einer 40 kb-Pathogenizitätsinsel, die Komponenten der Sekretions- und Transportsysteme codiert. Diese Feststellungen könnten eine funktionelle Unterhaltung zwischen der cag-Pathogenizitätsinsel und dem BabA-Adhesin-Gen für eine korrekte Präsentation des BabA-Adhesin-Proteins in der bakteriellen äußeren Membran anzeigen.
Um BabA weiter zu kennzeichnen, bestimmten die gegenwärtigen Erfinder die Affinitätskonstante (K_a) zwischen BabA und dem Le^b-Antigen. Da die K_a-Werte auf Gleichgewichtsbedingungen basieren (13), haben die vorliegenden Erfinder zunächst die Wechselwirkung durch Durchführung einer Rezeptordisplacement-Analyse analysiert. H. pylori CCUG 17875 (positiv für die Le^b Bindung, 1A) wurde zunächst mit ¹²⁵I-markiertem Le^b-Glycokonjugat inhibiert. Dann wurde nicht-markiertes Le^b-Glycokonjugat in einer Verdünnungsreihe zugeführt. Das nicht-markierte Le^b-Konjugat versetzte das gebundene ¹²⁵I-markierte Le^b-Glycokonjugat effizient (1B). Die Ergebnisse demonstrieren, daß der gebildete Rezeptor-Adhesinkomplex sich in einem echten Gleichgewichtszustand befindet. Ein äquivalenter Überschuß an Le^a-Glycokonjugat dissoziierte den Le^b-BabA-Komplex und verifizierte die hohe Rezeptorspezifität (1B). Der K_a-Wert für den Le^b-BabA-Komplex des Stamms CCUG 17875 wurde mit Le^b-Glycokonjugat in Konzentrationen von 10 ng bis 260 ng/ml titriert und es wurde bestimmt daß er eine hohe Affinität aufwies, nahe an 1 × 10¹⁰ M^–1 (1C). Die Zahl an Le^b-Glycokonjugatmolekülen, gebundenen an BabA auf der bakteriellen Zelloberfläche wurde als bei ungefähr 500/Zelle liegend geschätzt. Diese Zahl ist ähnlich der Zahl von Fimbrienorganellen auf der Oberfläche von E. coli (14). Für das BabA-Adhäsin basieren die Berechnungen jedoch auf der Annahme, daß die Vielzahl von bakteriellen Zellen in dem Versuch eine gleiche Zahl an Adhesin-Molekülen mit Le^b-Antigenbindungseigenschaften zeigen. Tabelle 1: BAB-Aktivität unter H. pylori Typ I- und Typ II-Stämmen
Um die Prävalenz von BabA in der bakteriellen Population zu bestimmen wurde der Stamm CCUG 17875 mit Le^b und Le^a-Antigenen inkubiert und die bakterielle Bindungsaktivität wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie (2, obere Reihe) sichtbar gemacht. Die Analysen demonstrieren die hohe Prävalenz der BabA-Bindungsaktivität in der bakteriellen Population an das Le^b-Antigen (2A, Grünfärbung) und das vollständige Fehlen einer Bindung an das Le^a-Antigen (2B, rote Gegenfärbung).
Als nächstes wurde die Lokalisierung und Dichte von BabA auf den bakteriellen Zelloberflächen durch Immunogold-Elektronenmikroskopie untersucht. Die Le^b-Bindungsaktivität des Adhesins lokalisierte Goldteilchen an die bakterielle äußere Membran (2C). Individuelle bakterielle Zellen zeigten eine gleiche Zahl von Goldteilchen (Daten nicht dargestellt). Wenn das Le^b-Antigen durch das Le^a-Antigen ersetzt wurde (dem die Rezeptoraktivität fehlte) wurden keine Goldteilchen nachgewiesen (2D).
Das Molekulargewicht von BabA wurde durch eine Rezeptor-Overlay-Analyse gekennzeichnet. Ein Proteinextrakt des Stamms CCUG 17875 wurde auf SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Membran geblottet. Die Membran wurde mit biotinyliertem Le^b-Glycokonjugat inkubiert, gefolgt von einem Nachweis mit Streptavidin und einer erhöhten Chemilumineszenz. Die BabA-Adhesinaktivität korrespondiert zu einer einzelnen 74 kDa-Bande (3A). Die 40 kDa-Bande ist vermutlich eine endogene Peroxidase-Aktivität, da sie unabhängig von dem Le^b-Konjugat-Overlay angefärbt wird (Spur 3). BabA war sehr hitzestabil und konnte einige Aktivität nach Erhitzung auf 97°C wiedergewinnen (3A, Spur 2). Das Panel von Stämmen zeigte dasselbe Molekulargewicht von BabA (3B).
Um BabA zu reinigen, wurde eine neue Technik entwickelt, das Rezeptoraktivitäts-gerichtete Affinitäts-Tagging (ReTagging). Multifunktionale Vernetzungsmittel mit radioaktiv markierten Donor-Tags wurden bereits früher für einer Rezeptorligandencharakterisierung verwendet. Die Verwendung von Affinitäts-Donor-Tags, wie zum Beispiel Biotinresten, präsentiert auf flexiblen Spacerstrukturen, fügt jedoch eine neue Dimension zur Anwendbarkeit der Vernetzungstechnologie bei. Ein Affinitäts-Tag, Biotin, wird auf das Adhesin-Protein durch die Rezeptoraktivität übertragen und wird für die weitere Identifizierung und die Affinitätsreinigung des Adhesinteils der Wechselwirkung durch Streptavidin übertragen (4A, B).
Ein multifunktionales Vernetzungsmittel mit einer Biotin-Donor-Hantel wurde an das Le^b-Glycokonjugat angehaftet. Die Rezeptoraktivität des Le^b-Glycokonjugats dirigierte, darauffolgend das Zielbiotin-Tag des BabA-Adhesin-Proteins (4A, B). Nach der Vernetzung wurde das bakterielle Protein von den Stämmen A5, P466 und CCUG 17875 auf SDS-PAGE aufgetrennt. Ein Immunnachweis mit Streptavidin demonstrierte ein Biotin-Tag-Protein mit einem Molekulargewicht von 74 kDa (3C) (28). Diese Ergebnisse stützen die Schätzungen des Molekulargewichts der vorherigen Overlay-Analysen (3B). Der Stamm MO19, dem die Le^b-Antigen-Bindungseigenschaften fehlen (3B) (1A) war auch in diesem Satz von Analysen negativ für eine Bindung (3C).
Die hohe Spezifität des ReTagging-Verfahrens stellte ein Verfahren zur Reinigung des Adhesinproteins bereit. Die Stämme CCUG 17875 und A5, die beide das BabA-Adhesin exprimieren (1A) wurden durch das ReTagging-Verfahren unter Verwendung von Vernetzer-markierten Le^b-Rezeptorkonjugat als Biotindonor verarbeitet. Nach der Vernetzung wurden die Bakterien in SDS-Probenpuffer suspendiert. Strepavidin-beschichtete magnetische Kügelchen wurden darauffolgend zu den löslich gemachten Proteinen zugefügt und Biotin-markiertes BabA wurde extrahiert (4C). Die N-terminalen 20 Aminosäuresequenzen der BabA-Adhesine der Stämme CCUG 17875 (Australien) und A5 (Schweden) erwiesen sich als identisch, was ein biologisch konserviertes Protein anzeigte (5). Kürzlich wurde eine Reihe von äußeren Membranproteinen von H. pylori charakterisiert. Diese Proteine, HopA-E sind homolog in ihren N-terminalen Sequenzen zu BabA (17), was möglicherweise ein Motiv was einen gemeinsamen Sekretionsmechanimus anzeigt. Das Biotin-Tag BabA-Adhesin wurde mehr als 3000-fach aus dem Zellextrakt gereinigt und der Ertrag wurde als 20 % berechnet. Basierend auf den Daten von Scatchard-Plots wurde das Niveau an erhältlichem BabA-Adhesin jedoch ungefähr 5-mal höher liegen, d.h. ungefähr 1 mg Adhesin/750 mg bakterielles Protein, was nichtsdestotrotz der Grund für das hohe Signal-zu-Hintergrundverhältnis sein könnte (3B). Die Reinigung von BabA über des ReTagging-Verfahren zeigt das Potential dieser Technik für eine Reinigung von Lectinen in komplexen Rezeptor-Ligandeninteraktionen an, wie zum Beispiel der Selectinfamilie von Zelladhäsionsmolekülen.
Um das Gen zu klonieren, das BabA codiert, wurde die N-terminale 20-aa-Sequenz für eine Konstruktion degenerierter Primer verwendet (18). Zwei Klonsätze wurden identifiziert, die beide unterschiedliche aber sehr ähnliche Proteine codieren. Beide Gene codieren für Proteine mit fast identischen N-terminalen Domänen und identischen C-terminalen Domänen, was die Identifizierung des funktionalen BabA-Gens schwierig macht (5). Um das korrespondierende Gen zu identifizieren wurde das BabA-Adhesin in großem Umfang durch ReTagging gereinigt. Dies stellte genug Protein für eine verlängerte aminoterminale Sequenz bereit. 41 Aminosäuren wurden identifiziert und diese Rest diskriminierten unzweifelhaft zwischen den beiden Genen durch Unterschiede in aa-Positionen 28, 35, 37, 38 und 41 (5). Das Gen, das BabA codierte, wurde als babA bezeichnet und korrespondierte zu einem basischen Protein mit einem pI von 9,4 und einem Molekulargewicht von 78 kDa, d.h. einem leicht höheren Molekulargewicht als dem aus den SDS-PAGE-Analysen vorhergesagten (3). Das andere Gen, babB, korrespondierend zu einem Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 75,5 kDa. Im Gegensatz zu babA enthält das babB-Gen ein vorhergesagtes Translations-Initiationscodon (5). Dies könnte die Existenz eines dritten bab-Gens in dem Genom oder Mechanismen für Rekombinationsaktivitäten anzeigen. Interessanterweise wurden die bab-Gene auch in Stämmen nachgewiesen, denen die Lewis^b-Bindungseigenschaften fehlten (Daten nicht dargestellt). Es wurde gezeigt, daß Genkassettensysteme antigene Variationen in Neisseria gonorrhoeae unterstützen (19). Eine andere Möglichkeit wäre die Gegenwart ähnlicher Gene, die für Adhesine codieren mit Unterschieden in einem Rezeptorspezifität/Wirtsgewebetropismus (20). Gen-Inaktivierungsexperimente, die auf bab-Gene abzielen, könnten das Verständnis dieser komplexen Genorganisation unterstützen.
Immunisierungsexperimente mit Adhesinen von Bordetella Pertussis (21) zeigen das Potential von äußeren Membranproteinen zur Wirkung als Vakzinkandidaten (diskutiert in Ref. 22). In einem Mausmodell für eine persistente H. pylori-Infektion erwies sich eine orale Immunisierung mit H. pylori-Antigenen als schützend gegen eine H. pylori-Infektion (10). Ergebnisse von Tiermodellen sind jedoch schwierig für menschlich spezifische Pathogene zu bewerten, wie zum Beispiel H. pylori und Polio-Virus. Für Polio wurde ein Tiermodell geschaffen indem der Virusrezeptor in transgenen Mäusen exprimiert wurde (23). Eine ähnliche Strategie wurde für H. pylori verwendet. Eine transgene Maus wurde durch Verwendung einer 1,3/4-Fucosyltransferase konstruiert, die die Synthese von menschlichem spezifischen Le^b-Antigen im Gastrointestinaltrakt (24) antreibt. Die Lewis^b-Maus kann für die Bewertung der Rolle des BabA-Adhesins als Kolonisierungs/Virulenzfaktor und zusätzlich für die Bewertung von BabA als Vakzinkandidat gegen Säure peptische Erkrankung und Magenadenokarzinom nützlich sein.
In der gegenwärtigen Studie wurde die ReTagging-Technik für die Reinigung des Adhesinteils der mikrobiellen Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung verwendet. Durch Verwendung eines gereinigten Adhesin/Lectin-Proteins könnte die ReTagging-Technik zusätzlich für weitere Studien des Rezeptorteils der Interaktion verwendet werden. Eine Identifizierung der biologisch aktiven Rezeptorstruktur, die Leb-Oligosaccharide trägt, würde bei dem Verständnis der Mechanismen helfen, die eine chronische H. pylori-Infektion stützen.
Eine Inhibition der H. pylori-Bindung an ein ¹²⁵I-markierte Lewis^b-Antigen durch Präparationen wird graphisch präsentiert, als Funktion der Antikörperkonzentration (mg/ml) in 6: 1 ml Aliquots von H. pylori-Bakterien (A₆₀₀ = CD 0,10) wurden mit Verdünnungsreihen von Antikörperpräparationen in 0,01-10 mg/ml für 2 Stunden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,5 % Albumin, 0,05 % Tween 20 präinkubiert. Dann wurden 500 ng ¹²⁵I-markiertes Konjugat (d.h. ein Überschuß der Rezeptorstruktur) zugefügt und 30 Minuten inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde die ¹²⁵I- Aktivität im bakteriellen Pellet durch gamma-Szintillationszählung gemessen. Die verwendeten Lewis^b-Blutgruppen-Antigen-Glycokonjugate, d.h. semisynthetische Glycoproteine, konstruiert durch Konjugation gereinigter fukosylierter Oligosaccharide an Serumalbumin stammten von IsoSep AB, Tullinge, Schweden.
Ein Western-Blot-Nachweis für das BabA-Adhesin durch die unterschiedlichen Antikörperpräparationen wird in 7 dargestellt. Ein Molekulargewichtsregenbogenmarker (2 μl) von Amersham, Buckinghamshire, England, wurde in SDS-Probenpuffer gelöst (Spur 1). Ungefähr 100 ng gereinigtes BabA-Adhesin (ungefähr 74 kDa mit Abbauprodukt von ungefähr 55 kDa) wurde in SDS-Probenpuffer gelöst (Spur 2). SDS-gelöste Proteinextrakte vom Stamm CCUG 17875 wurden hergestellt, indem das bakterielle Pellet, korrespondierend zu 0,15 ml Bakterien (A₆₀₀ = OD 0,10) durch SDS-Probenpuffer gelöst wurde (Spur 3). Die 3 Proteinproben wurden dann 5 Minuten bei 100°C gekocht. Die Proteine wurden auf SDS-PAGE getrennt und auf eine PVDF-Membran für eine Western-Blot-Immunanalyse übertragen. Fünf Sätze PVDF-Membranen wurden hergestellt. Die PVDF-Membranen wurden über Nacht mit 4 % menschlichen Seren/Plasma blockiert/inkubiert, in phosphatgepufferter Salzlösung von einem Patienten ohne H. pylori-Infektion, d.h. ohne Serumantikörper gegen H. pylori. Die Membran wurde dann in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,5 % Albumin, 0,05 % Tween 20 gewaschen, gefolgt von einer Zugabe der Antikörperpräparationen. Die Membranensätze wurden mit den folgenden 5 Antikörperpräparationen inkubiert: 1) gepoolte menschliche Seren von H. pylori-infizierten Patienten, verdünnt 1:500, 2) Hühnerantikörper (positiv) 1 mg/ml verdünnt 1:100x, 3) Rinder I-Präparation von Antikörpern, 1 mg/ml verdünnt 1:100x. 4) Rinder II-Präparation von Antikörpern, 1 mg/ml verdünnt 1:100x. 5) Rinder III-Präparation von Antikörpern, 1 mg/ml verdünnt 1:100 x (angegeben in der Figur). Diese Antikörper wurden mit der Membran für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von extensiven Waschungen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,05 % Tween-20, gefolgt von einer Zugabe von sekundärem anti-menschlichen, anti-Huhn- und anti-Rind-Antikörpern, markiert mit HRP-Peroxidase (von DAKO, Dänemark), alle 1:2000-mal verdünnt. Die Membranen wurden 1 Stunde inkubiert, gefolgt von extensiven Waschungen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,05 % Tween 20. Die Membranen wurden mit verstärkter Chemolumineszenz (ECL) von Amersham entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, daß die antigene Reaktion gegen das Adhesin in den Rinderpräparationen stark verstärkt ist. Diese Feststellung wird auch durch die Inhibitionsdaten in 6 gestützt.
Western-Blot-Analysen von H. pylori-Proteinen durch die unterschiedlichen Antikörperpräparationen sind in 8 dargestellt. Zwei klinische Isolate (1-2) von Dr. Lars Engstrand, Department of Clinical Microbiology and Cancerepidemiology, University Hospital, Uppsala, Schweden und der Stamm CCUG 17875 (3) von Culture Collection, University of Göteborg, Department of Clinical Bacteriology, Göteborg, Schweden und Stamm 52 (4) von Prof. Torkei Wadström, Dept. Medical Microbiology, Lunds University, wurden für die SDS-PAGE-Elektrophorese hergestellt. Bakterielle Pellets, korrespondierend zu 0,15 ml Bakterien (A₆₀₀ = OD 0,10) wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und 5 Minuten auf 100°C erwärmt. Die Proteine wurden auf SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen für eine Western-Blot-Immunanalyse übertragen. Die Western-Blot-Analysen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, d.h. die Membransätze wurden mit den folgenden 4 Antikörperpräparationen inkubiert: 1) gepoolte menschliche Seren von H. pylori-infizierten Patienten, verdünnt 1:500. 2) Hühner-Antikörper (positiv) 1 mg/ml verdünnt 1:100x, 3) Rinder I-Präparation von Antikörpern, 1 mg/ml verdünnt 1:100x, 4) Rinder III-Präparat von Antikörpern, 1 mg/ml verdünnt 1:100x (angegeben in der Figur). Diese Antikörper wurden mit der Membran für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von extensiven Waschungen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,05 % Tween 20, gefolgt von einer Zugabe von sekundären anti-menschlichen, anti-Huhn- und anti-Rind-Antikörpern, markiert mit HRP-Peroxidase (von DAKO, Dänemark), alle 1:2000x verdünnt. Die Membranen wurden 1 Stunde inkubiert, gefolgt von extensiven Waschungen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 0,05 % Tween 20. Die Membranen wurden mit verstärkter Chemolumineszenz (ECL) von Amersham entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Hühner-Antikörper und die Rinderpräparationen fast identisch gegen alle vier Stämme reagieren, was konservierte Eigenschaften bei Stämmen von unterschiedlichem geographischen Ursprung anzeigt.
Obwohl die Erfindung im Hinblick auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, die die beste Ausführungsformen, die den Erfindern gegenwärtig bekannt sind, bilden, solte verstanden werden, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen für einen üblichen Fachmann auf dem Gebiet offenbar sein würden ohne sich vom Umfang der Erfindung zu entfernen, der in den hier beigefügten Ansprüchen dargestellt ist.
Literaturliste

1. J. R. Warren, I. Lancet, 1273, 1983, B. Marshall, I. Lancet, 1273, 1983.
2. A. Dubois, Emerging Infectious Diseases 1, 79 (1995).
3. M. J. Glaser, Sci., Amer. 2, 92 (1996).
M. J. Blaser, Trends Micorbiol. 7, 255 (1993), E. E. Kirschner und M.J. Blaser, J. Theor. Biol. 176, 281 (1995).
5. P. Falk, T. Goren und S. Mormark, Meth. Enzymol. 236, 353 (1994).
6. D. G. Evans, D.J. Evans Jr., J. J. Moulds und D.Y. Graham, Infect. Immun. 56, 2896 (1988), S. Hirmo, M. Utt, M. Ringner und T. Wadström, FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 10, 301 (1995), T. Saitoh et al., FEBS Lett. 282, 385 (1991).
7. T. Boren, P. Falk, K. A. Roth, G. Larson und S. Normark, Science, 262, 1892 (1993), P. Falk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2035 (1993).
8. H. pylori-Stamm CCUG 17875 wurde erhalten von CCUG Göteborg, Schweden. Stamm A5, ein gastritisches Ulcus-Isolat kam von Astra Arcus, Södertälje, Schweden. Stämme P466 und MO19 wurden zuvor beschrieben (7). Stamm 26695 kam von Dr. K.A. Eaton, The Ohio State University und sein Genom wurde kürzlich sequenziert durch The Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, Maryland (J.F. Tomb et al., Abstract 3B: 0,59, IX International Workshop an Gastroduodenal Pathology and Helicobacter pylori, Kopenhagen, Dänemark 1996). Das Panel der 45 klinischen Isolate von H. pylori kam von the University Hospital in Uppsala, Schweden. Die Bakterien wurden bei 37°C in 10 % CO₂ und 5 % O₂ für 48 h gezüchtet.
9. Alle verwendeten Blutgruppen-Antigenglycokonjugate, d.h. semisynthetische Glycoproteine, konstruiert durch die Konjugation von gereinigten fucosylierten Oligosacchariden an Serumalbumin (7,25) stammten von IsoSep AB, Tullinge, Schweden. Der RIA wurde gemäß Ref. 26 mit einigen Modifikationen durchgeführt; Die H-1-, Le^b-, Le^a-, H-2-, Le^x- und Le^y-Glycokonjugate waren durch das Chloramin-T-Verfahren mit ¹²⁵I markiert. 1 ml Bakterien (A₆₀₀=OD 0,10) wurde mit 300 ng ¹²⁵I-markiertem Konjugat (d.h. einem Überschuss an Rezeptoren) 30 Minuten in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), 0,5% Albumin, 0,05% Tween-20 (BG-Puffer) inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde die ¹²⁵I-Aktivität im Bakterienpellet durch gamma-Scintillationszählung gemessen.
10. A. Covacci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5791 (1993), M. Marchetti et al., Science 267, 1655 (1995).
11. S. Censini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14648 (1996).
12. Z. Xiang et al., Infect. Immun. 63, 94 (1995).
13. A. G. Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 600 (1949).
14. O. Mol und B. Oudega, FEMS Microbiol. Reviews, 19, 25 (1996).
15. Confocal-Mikroskopie wurde auf einem Nikon/Multiprobe 2001-Apparat (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) durchgeführt. Die Elektronenmikroskopie wurde auf einem JEOL 100 CX-Apparat durchgeführt.
16. J. Brunner, Trends in Cell Biol. 6, 154 (1996), J. D. Bleil und P.M. Wassarman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5563 (1990).
17. M. M. Exner, P. Doig, T. J. Trust und R.E.W. Hancock, Infect. Immun. 63, 1567 (1995), P. Doig, M. M. Exner, R.E.W. Hancock und T.J. Trust, J. Bacteriol. 177, 5447 (1995).
18. Die BabA N-terminale Sequenzanalyse wurde verwendet, um degenerierte Oligonukleotide herzustellen, die in einer PCR verwendet wurden, um ein amplifiziertes Fragment von dem Chromosom des babA-Gens zu erhalten. Ein 59 bp-Fragment wurde identifiziert und als Sonde zum Screening einer Low-Copy-Plasmid(pACYC184)-Bibliothek einer Sau3A teilverdauten chromosomalen DNA von Stamm-CCUG 17875 verwendet.
19. P. Hagblom, E. Segal, E. Billyard und M. So, Nature 315, 156 (1985), R. Haas und T.F. Meyer, Cell, 44, 107 (1986).
20. A. B. Jonsson, D. Ilver, P. Falk, J. Pepose und S. Normark, Mol. Microbiol. 13, 403 (1994), N. Strömberg, P. O. Nyholm, I. Pascher und S. Normark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9340 (1991).
21. A. Kimura, K.T. Mountzouros, D.A. Relman, S. Falkow, J. L. Cowell, Infect. Immun. 58, 7 (1990).
22. T. Boren und P. Falk, Sci. Amer. Sci. & Med. 4 (1994), L. S. Tompkins und S. Falkow, Science 267, 1621 (1995).
23. R. B. Ren et al., Cell 63, 353 (1990).
24. P. G. Falk, L. Bry, J. Holgersson und J. I. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1515 (1995).
25. P. D. Reye, Nature Biotechnology, 2, 155 (1996).
26. P. Falk, T. Boren, D. Haslam, M.G. Caparon, Meth. Cell Biol. 45, 161 (1994).
27. Die Zellextrakte wurden in SDS-Probenpuffer ohne Mercaptoethanol hergestellt und 10 Minuten auf 37°C oder 97°C vor Auftrennung auf SDS-PAGE erhitzt. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran geblottet. Die Membran wurde mit 1 μg/ml biotinyliertem Le^b-Glycokonjugat oder biotinyliertem Albumin (Negativkontrolle) über Nacht inkubiert, markiert wie beschrieben in Ref. 7. Nach einem Waschen in PBS/0,05 % Tween-20 wurden die durch BabA-Bande gebundenen biotinylierten Strukturen durch HRP-Streptavidin mit einer Sonde untersucht und unter Verwendung von ECL-Reagentien nachgewiesen (Amersham, Buckinghamshire, England).
28. Die bakterielle Suspension wurde mit Le^b-Glycokonjugat inkubiert, wozu eine Sulfo-SBED-Vernetzer (Pierce, Rockville, IL) durch den N-Hydroxysuccinimidester (NHS) gemäß den Angaben des Herstellers konjugiert worden war. Die Arylazid-Vernetzergruppe wurde durch UV-Bestrahlung (360 nm) aktiviert. Die Bakterien wurden mit PBS, pH 7,6, 0,05 % Tween-20 und Proteaseinhibitoren (EDTA) und Benzamidin unter reduzierenden Bedingungen mit 50 mM Dithiothreitol (DTT) gewaschen. Die bakteriellen Proteine wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt und das Biotin-Tag-BabA-Protein wurde durch Immunonachweis nachgewiesen (PVDF-Membran/HRP-Streptavidin und ECL) (3C).
29. Die Stämme CCUG 17875 und A5 wurden zunächst durch Vernetzung und DTT-Behandlung wie oben unter (28) angegeben verarbeitet, gefolgt von einem Löslichmachen in SDS-Probenpuffer. Das Biotin-Tag-BabA-Protein wurde dann mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen (Advanced Magnetics Inc., Cambridge, MA) extrahiert. Die Kügelchen wurden in SDS-Probenpuffer gekocht und die gebundenen Proteine eluiert und alkyliert. Die Proteinpräparation wurde weiter durch präparative SDS-PAGE (Prep-Cell 491, BioRad, Hercules, CA) fraktioniert. Fraktionen mit dem Biotin-Tag-Protein, d.h. die BabA-Fraktionen wurden durch Immunonachweis unter Verwendung von Streptavidin/ECL identifiziert. Die gesammelte BabA-Präparation wurde dann auf SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die BabA-Bande wurde ausgeschnitten und das BabA-Protein N-terminal unter Verwendung eines Procise^TM 494-Instruments (Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert.

Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 4 Ausrichtung translatierter Sequenzen der babA- und babB-Gene
Tabelle 4 (Fortsetzung) Ausrichtung translatierter Sequenzen der babA- und babB-Gene
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes und gereinigtes bakterielles Blutgruppenantigen bindendes (BAB) Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben aus Helicobacter pylori-Arten, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Protein oder besagte immunologisch wirksamer Teil desselben spezifisch an fucosylierte Lewis^b- und H-1-Blutgruppenantigen-Glycokonjugate bindet und besagtes Protein ein Molekulargewicht von 70 bis 77 kDa des ungeteilten Proteins aufweist, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), und die folgende Aminosäuresequenz beinhaltet: EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Protein weniger als 20 % bakterielle Proteinverunreinigungen enthält.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die folgende Aminosäuresequenz: EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV in einer aminoterminalen Position befindet.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das ungeteilte Protein ein durch SDS-PAGE bestimmtes Molekulargewicht von 73 bis 75 kDa aufweist.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das unfraktionierte Protein ein durch SDS-PAGE bestimmtes Molekulargewicht von 73,5 kDa aufweist.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Protein spezifisch für mindestens einen der in folgender Gruppe enthaltenen Helicobacter pylori-Stämme ist: CCUG 17875, NCTC 11637, A5, P466, G109, G56, Ba 185, Ba 99, 931 und 932.
Adhesin-Protein oder immunologisch wirksamer Teil desselben nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Protein spezifisch für alle in folgender Gruppe enthaltenen Helicobacter pylori-Stämme ist: CCUG 17875 und A5.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7 beinhaltet, wahlweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen.
DNA zur Expression eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach einem der Ansprüche 1 – 7.
DNA zur Expression eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Sequenz enthält: 5'-GAAGACGACGGCTTTTACACA GCGTAGGCTATCAAATCGGTGAAGCCGCTCAAATGGTA-3'.
DNA zur Expression eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Sequenz enthält:
DNA zur Expression eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Sequenz enthält:
Monospezifische Antisera, hergestellt unter Verwendung eines reinen Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung monospezifischer, nach Anspruch 13 hergestellter Antisera für quantitative oder qualitative Invitro-Bestimmungen von Adhesin-Protein in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten. Test Kit, der monospezifische, nach Anspruch 13 hergestellte Antisera in Kombination mit herkömmlichen Markern und Reagenzien beinhaltet.
Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung einer Helicobacter pylori-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine wirksame Menge eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7 beinhaltet.
Verwendung eines Adhesin-Proteins oder eines immunologisch wirksamen Teils desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion, von Magengeschwüren und/oder säurebedingten peptischen Erkrankungen beim Menschen.
Verwendung von DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion, von Magengeschwüren und/oder säurebedingten peptischen Erkrankungen beim Menschen.
Immunoglobulinpräparat, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Präparat eine spezifische Aktivität gegenüber einem an Lewis^b bindenden Adhesin-Protein oder einem immunologisch wirksamen Teil desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Antikörper eine spezifische Aktivität gegenüber einem an Lewis^b bindenden Adhesin-Protein oder einem immunologisch wirksamen Teil desselben nach einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Antikörper durch eine Kultur lebensfähiger Mikroorganismen in einem DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 12 enthaltenden Expressionssystem exprimiert wird, worin besagter Mikroorganismus bzw. -organismen allgemein als sicher anerkannt ("GRAS") und genetisch verändert ist/sind, um besagten Antikörper zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus Bakterien der Arten Lactobacillus, Streptococcus und Enterobacteriacea ausgewählt ist.
Verwendung eines Immunoglobulinpräparats nach Anspruch 19 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion beim Menschen.
Verwendung eines Immunoglobulinpräparats nach Anspruch 19 zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Magengeschwüren und/oder säurebedingten peptischen Erkrankungen.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 20 oder 21 zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion beim Menschen.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 20 oder 21 zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Magengeschwüren und/oder säurebedingten peptischen Erkrankungen.
Verwendung einer Kultur lebensfähiger Mikroorganismen in einem Expressionssystem, worin besagter Mikroorganismus bzw. -organismen allgemein als sicher anerkannt ("GRAS") und genetisch verändert ist/sind, um einen Antikörper nach Anspruch 20 oder 21 zu exprimieren, zur Herstellung eines oral einzunehmenden Präparats zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter-Infektion beim Menschen.