DE60036555T2

DE60036555T2 - Polypeptidfragmente mit einem c-terminalen teil von katalase aus helicobacter

Info

Publication number: DE60036555T2
Application number: DE60036555T
Authority: DE
Inventors: Christopher Vincent Box Hill DOIDGE; Elizabeth Ann Eltham WEBB; Linda Joy Glen Huntly ROTHEL; Philip Sutherland SUTTON; Stuart Hazell
Original assignee: CSL Ltd; University of New South Wales
Current assignee: CSL Ltd; University of New South Wales
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: HK1047960A1; EP1222255A4; EP1222255A1; CA2387392A1; DE60036555D1; JP2003512048A; WO2001029198A1; EP1222255B1; AUPQ347199A0; US7786260B1; ATE374246T1; NZ518772A; HK1047960B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft generell Helicobacter-Antigene. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Polypeptidfragmente von Helicobacter-Katalase, insbesondere Helicobacter pylori-Katalase und die Verwendung dieser Fragmente zur Behandlung und Prävention einer Gastroduodenalerkrankung, die mit einer H. pylori-Infektion in Verbindung steht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Helicobacter pylori ist ein Bakterium, das die Magenauskleidung (oder Magenschleimhaut) von vielleicht der Hälfte der Weltbevölkerung infiziert. Spiralförmige Organismen wurden zu ersten Mal 1906 in humaner Magenschleimhaut mikroskopisch beobachtet. Jedoch wurde H. pylori erst 1982 erfolgreich kultiviert. Die Infektion mit dem Organismus ist üblicherweise chronisch und sie führt zu einer fortgesetzten Entzündung der Magenschleimhaut. Die Infektion ist häufig symptomlos. Jedoch entwickelt ein Teil von infizierten Personen in Verbindung mit anderen Cofaktoren in der Folge Folgeerscheinungen, die eine peptische Ulzeration des Magens oder Zwölffingerdarms, Magenadenokarzinome und Magenlymphome umfassen. Untersuchungen zur Behandlung von peptischem Ulkus zeigten, dass die Heilung einer H. pylori-Infektion mit einer dramatischen Verringerung der Rückfallrate dieser üblicherweise chronischen Erkrankung verbunden ist. Eine Langzeitinfektion mit H. pylori führt zur Entwicklung von chronisch-atrophischer Gastritis, die seit langem als Vorstufenläsion bei der Entwicklung von Magen krebs bekannt ist. Daher verknüpften eine Zahl von Untersuchungen eine vorhergehende H. pylori-Infektion mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Magenkrebs. Daher hat das Beseitigen einer vorhandenen Infektion und die Verhinderung einer neuen Infektion mit diesem Organismus das Potential, das Auftreten von Erkrankungen, die zu beträchtlicher Morbidität und Mortalität führen, signifikant zu verringern (in Helicobacter pylori Biology and Clinical Practice. 1993. Hrsg. C. Stewart Goodwin und Bryan W. Worsley, veröffentlicht von CRC Press, Halter et al. 1992, Yale J. Biol. Med., 65: 625-638).
Eine Infektion mit H. pylori ist schwierig zu behandeln. Derzeitige experimentelle Therapien zur Behandlung der Infektion weisen Probleme mit der Wirksamkeit und signifikante Grade nachteiliger Wirkungen auf. Klinisch stehen keine prophylaktischen Maßnahmen zur Verfügung. Eine Lösung für sowohl die Prävention als auch die Behandlung einer H. pylori-Infektion wäre die Entwicklung einer immunogenen Zubereitung, die als Immuntherapeutikum bestehende Infektionen behandelt und als Vakzin die Etablierung neuer oder rezidivierender Infektionen verhindert. Eine derartige Zubereitung müsste wirksame Immunantworten auf Schutzantigene induzieren, während die Induktion von Antworten auf Eigenantigene oder andere potentiell schädliche Immunantworten vermieden wird. Dies kann durch Identifizieren der spezifischen schützenden Komponente oder Komponenten und die Formulierung von immuntherapeutischen oder Vakzinzubereitungen, die eine derartige Komponente bzw. Komponenten enthalten, erreicht werden.
Die Identifizierung derartiger schützender Komponenten eines Organismus wird häufig unter Verwendung eines Tiermodells der Infektion erreicht. Anfangs stand kein Tiermodell für eine humane H. pylori-Infektion zur Verfügung. Jedoch wurde ein derartiges Modell unter Verwendung eines nahe verwandten Organismus, H. felis, und von spezifischen pathogenfreien (SPF) Mäusen entwickelt (Lee et al., 1990, Gastroenterology, 99: 1316-1323). Dieser Organismus ist zur Besiedelung der Magenschleimhaut von SPF-Mäusen fähig, wo er eine chronische Infektion mit vielen der Merkmale einer H. pylori-Infektion bei Menschen etabliert. Eine H. felis-Infektion in diesen Mäusen induziert eine chronische Gastritis und eine erhöhte Immunantwort. Wie im Falle von Menschen ist diese Antwort zum Heilen der Infektion nicht wirksam.
Das obige Modell wurde verwendet, um zu belegen, dass eine orale Behandlung von mit H. felis infizierten Mäusen mit einer Zubereitung, die zerstörte H. pylori-Zellen und Choleratoxin als Mucosa-Adjuvans enthält, eine signifikante Zahl der infizierten Mäuse heilen kann (Doidge et al., 1994, Lancet 343 (i): 914-915). Es ist wahrscheinlich, dass dieser Effekt durch eine Immunantwort auf kreuzreaktive Antigene, die jede der nahe verwandten Helicobacter-Arten besitzt, vermittelt wird. Zwei derartige kreuzreaktive Antigene wurden von Doidge et al. ( WO 95/33482 ) als die Mikroorganismenenzyme Urease (Clayton et al., 1990, Nucleic Acid Res., 18 (2): 362) und Katalase (Westblom et al., 1992, Eur. J. of Clin. Microbiol. Infekt. Dis., 11: 522-526) identifiziert.
Vor kurzem wurde ein H. pylori (Sydney-Stamm)/Maus-Modell einer humanen H. pylori-Infektion durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt und verwendet, wobei festgestellt wurde, dass Katalase, insbesondere rekombinante Katalase, Verwendbarkeit als schützendes Antigen aufweist. Jedoch kann trotz dieser ermutigenden Erkenntnis Helicobacter-Katalase aufgrund von dessen hoher Homologie mit humaner Katalase und dem damit verbundenen Potential, eine Autoimmunerkrankung zu induzieren, nicht ernsthaft als Kandidat eines therapeutischen Vakzins betrachtet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der unerwarteten Entdeckung eines C-terminalen Bereichs einer Helicobacter-Katalase, dem signifikante Aminosäuresequenzidentität mit humaner Katalase fehlt und der eine schützende oder therapeutische Immunantwort gegen Helicobacter-Arten auslösen kann. Auf der Basis dieser spärlichen Sequenzidentität mit humaner Katalase wird für diesen C-terminalen Bereich angenommen, dass er ein signifikant verringertes Potential zum Bewirken einer Autoimmunerkrankung aufweist.
Daher wird in einem Aspekt der Erfindung ein isoliertes Polypeptid zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt bereitgestellt, wobei das Polypeptid weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit humaner Katalase aufweist und einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase mit weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit einem entsprechenden C-terminalen Bereich von humaner Katalase, wobei der C-terminale Bereich die in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, oder eine Variante mit mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
Vorzugsweise ist die Helicobacter-Katalase eine Helicobacter pylori-Katalase.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt bereit, wobei diese ein Polypeptid der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst.
Günstigerweise umfasst die Zusammensetzung ferner ein Adjuvans. Vorzugsweise ist das Adjuvans ein Mucosa-Adjuvans.
Günstigerweise umfasst die Zusammensetzung ferner mindestens ein zusätzliches Immunogen.
In einem weiteren Aspekt erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung eines Immunogens bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, wobei das Immunogen ein Polypeptid gemäß der Erfindung ist.
Das Medikament kann zur intranasalen oder intragastralen Verabreichung formuliert sein.
In einem weiteren Aspekt ist Gegenstand der Erfindung eine Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, wobei diese einen Vektor umfasst, der ein Immunogen exprimiert, wobei das Immunogen ein Polypeptid der Erfindung ist.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung die Verwendung einer Zubereitung gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid mit Codierung für ein Polypeptid gemäß der Erfindung bereit, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz umfasst.
Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid die in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Sequenz oder eine Polynucleotidvariante derselben.
In einer Ausführungsform weist die Polynucleotidvariante mindestens 60 Sequenzidentität mit dem in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid auf oder die Polynucleotidvariante ist zur Hybridisierung mit dem durch SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz fähig.
In einem weiteren Aspekt ist ein Merkmal der Erfindung ein Vektor, der ein Polynucleotid mit Codierung für ein Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst, wobei das Polynucleotid funktional mit einem regulatorischen Polynucleotid verknüpft ist.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die das Polynucleotid oder den Vektor gemäß der Erfindung enthält.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes Polypeptid bereitgestellt, das durch Expression des Polynucleotids der Erfindung in einer Wirtszelle hergestellt wird.
In einem noch weiteren Aspekt erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung eines Immunogens zur Produktion eines antigenbindenden Moleküls, das spezifisch an einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase bindet, wobei das Immunogen ein Polypeptid gemäß der Erfindung ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Diagnostizierung einer Infektion von Patienten durch Helicobacter, das umfasst:

– Inkontaktbringen einer biologischen Probe von einem Patienten mit einem Antigen, wobei das Antigen ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist; und
– Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Komplexes zwischen dem Antigen und Helicobacter-spezifischen Antikörpern in der Probe, wobei das Vorhandensein des Komplexes eine Infektion des Patienten durch Helicobacter anzeigt.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung des Polypeptids gemäß der Erfindung zur Diagnostizierung einer Infektion von Patienten durch Helicobacter ex vivo.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines immunogenen Fragments des Polypeptids gemäß der Erfindung bereit, wobei das Verfahren umfasst:

– Produzieren eines Fragments des Polypeptids,
– Verabreichen des Fragments an einen Säuger und
– Detektieren einer Immunantwort in dem Säuger, wobei die Antwort die Produktion von Elementen, die spezifisch an Helicobacter binden und eine schützende und/oder therapeutische Wirkung gegenüber einer Helicobacter-Infektion aufweisen, umfasst.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Western-Blot von Zellextrakten, die ein rekombinantes Polypeptid, das einen C-terminalen Bereich von 134-aa von H. pylori-Katalase umfasst, enthalten und mit dem monoklonalen Antikörper CA5-8B8-1F3, der gegen H. pylori-Katalase voller Länge gebildet wurde, inkubiert wurden. Jede Bahn enthielt 20 μl einer Vollzellensuspension mit A₆₀₀ = 4. ER, E. coli ER1793; a, E. coli-Kreuzreaktivität; I, induzierte Expression; b, mögliches Dimer; U, nichtinduzierte Expression; c, Katalasefragment (17kDa).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. Definitionen
Falls nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie sie einem Fachmann üblicher Erfahrung auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, üblicherweise geläufig ist. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der praktischen Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind bevorzugte Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die im folgenden angegebenen Ausdrücke im folgenden definiert.
Die hierin verwendeten Artikel "ein" und "eine" bezeichnen ein oder mehr als ein (d. h. mindestens ein) grammatikalisches Objekt des Artikels. Beispielsweise bedeutet "ein Element" ein Element oder mehr als ein Element.
Der Ausdruck "etwa" wird hierin so verwendet, dass er Sequenzen bezeichnet, die bis zu 30%, vorzugsweise bis zu 20% und noch besser bis zu 10% in Bezug auf die Länge einer Referenzsequenz variieren.
"Amplifikationsprodukt" bezeichnet ein Nucleinsäureprodukt, das durch Nucleinsäureamplifikationstechniken erzeugt wurde.
"Antigenbindendes Molekül" bedeutet ein Molekül, das Bindungsaffinität für ein Zielantigen aufweist. Selbstverständlich erstreckt sich dieser Ausdruck auf Immunglobu line, Immunglobulinfragmente und nicht von einem Immunglobulin abgeleitete Proteingerüste, die antigenbindende Aktivität zeigen.
"Abgeschwächte virale Wirte" bedeuten virale Vektoren, die entweder von Natur aus im wesentlichen avirulent sind oder dazu gemacht wurden.
Der hier verwendete Ausdruck "biologische Probe" bezeichnet eine Probe, die ausgehend von einem Patienten extrahiert, unbehandelt, behandelt, verdünnt oder konzentriert sein kann. Günstigerweise ist die biologische Probe aus der Gruppe von Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, Schweiß, Aszites, Peritonealflüssigkeit, Synovia, Fruchtwasser, Liquor, einer Hautbiopsie und dgl. ausgewählt.
Durchgängig in dieser Beschreibung sind, falls es nicht der Kontext anders erfordert, die Worte "umfassen", "umfasst" und "umfassend" so zu verstehen, dass sie den Einschluss einer angegebenen Stufe oder eines angegebenen Elements oder einer Gruppe von Stufen oder Elementen, jedoch nicht den Ausschluss einer anderen Stufe oder eines anderen Elements oder einer Gruppe von Stufen oder Elementen beinhalten.
"Entspricht" oder "entsprechend" bedeutet (a) ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die im wesentlichen identisch mit oder komplementär zu einer gesamten Referenzpolynucleotidsequenz oder einem Bereich derselben ist, oder eine Aminosäuresequenz, die identisch mit einer Aminosäuresequenz in einem Peptid oder Protein, codiert ist; oder (b) ein Peptid oder Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen identisch mit einer Sequenz von Aminosäuren in einem Referenzpeptid oder -Protein ist.
"Derivat" bedeutet ein Polypeptid, das von der Basissequenz durch eine Modifikation, beispielsweise durch Konjugation oder Komplexierung mit anderen chemischen Einheiten oder durch posttranslationale Modifikationstechniken, die einschlägig bekannt sind, abgeleitet ist. Der Ausdruck "Derivat" umfasst in dessen Umfang auch Änderungen, die gegenüber einer Stammsequenz gemacht wurden, die Additionen oder Deletionen umfassen, die funktional äquivalente Moleküle ergeben. Daher umfasst der Ausdruck Derivat Moleküle, die eine Immunantwort gegenüber Helicobacter und vorzugsweise H. pylori auslösen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet die Phrase "löst/lösen eine Immunantwort aus" die Fähigkeit von dem im vorhergehenden genannten Polypeptid, immunogenen Fragment oder einer Variante, in einem Säuger, dem diese verabreicht werden, eine Immunantwort hervorzurufen, wobei die Antwort die Produktion von Elementen, die spezifisch an Helicobacter binden und/oder eine schützende oder therapeutische Wirkung gegenüber einer Helicobacter-Infektion ergeben, umfasst.
"Homologie" bezeichnet die Prozentsatzzahl von Aminosäuren, die identisch sind oder konservative Substitutionen gemäß der Definition in der folgenden Tabelle A darstellen. Homologie kann unter Verwendung von Sequenzvergleichsprogrammen, wie GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395), bestimmt werden. Auf diese Weise können Sequenzen einer ähnlichen oder im wesentlichen verschiedenen Länge gegenüber den hierin angegebenen durch Einfügen von Lücken in das Alignment verglichen werden, wobei derartige Lücken beispielsweise durch den von GAP verwendeten Vergleichsalgorithmus bestimmt werden.
"Hybridisierung" wird hierin verwendet, um die Paarung kom plementärer Nucleotidsequenzen zur Bildung eines DNA-DNA-Hybrids oder DNA-RNA-Hybrids zu bezeichnen. Komplementäre Rasensequenzen sind die Sequenzen, die durch die Basenpaarungsregeln verwandt sind. In DNA paart A mit T und C mit G. In RNA paart U mit A und C mit G. Im Hinblick darauf bezeichnen die hierin verwendeten Ausdrücke "passen" und "passen nicht" das Hybridisierungspotential gepaarter Nucleotide in komplementären Nucleinsäuresträngen. Passende Nucleotide hybridisieren effizient, beispielsweise das oben genannte klassische A-T- und G-C-Rasenpaar. Nichtübereinstimmungen sind andere Kombinationen von Nucleotiden, die nicht effizient hybridisieren.
"Immunogenes Fragment" bedeutet ein Fragment eines Stammpolypeptids voller Länge, wobei dieses Fragment eine Immunantwort gegenüber Helicobacter und vorzugsweise gegenüber H. pylori auslöst. Beispielsweise muss im Falle eines immunogenen Fragments eines Polypeptids nach SEQ ID NO: 2 oder 4 das Polypeptidfragment eine Immunantwort, vorzugsweise eine schützende oder therapeutische Immunantwort gegenüber einer Helicobacter-Infektion auslösen. Der hier verwendete Ausdruck "immunogenes Fragment" umfasst Deletionsmutanten und kleine Peptide, beispielsweise mindestens sechs, vorzugsweise mindestens 8 und noch besser mindestens 20 fortlaufende Aminosäuren, die antigene Determinanten oder Epitope umfassen. Mehrere derartige Fragmente, beispielsweise mit Codierung für B- und/oder T-Zellepitope, können miteinander verbunden sein. Peptide dieses Typs können durch die Anwendung von Standardtechniken für rekombinante Nucleinsäure erhalten oder unter Verwendung herkömmlicher Flüssig- oder Festphasensynthesetechniken synthetisiert werden. Beispielsweise kann auf eine Lösungssynthese oder Festphasensynthese gemäß der Beschreibung in beispielsweise Kapitel 9 mit dem Titel "Peptide Synthesis" von Atherton und Shepard, das in der Veröffentlichung mit dem Titel "Synthetic Vac cines", herausgegeb*en von Nicholson und veröffentlicht von Blackwell Scientific Publications, verwiesen werden. Alternativ können Peptide durch Verdau eines Polypeptids der Erfindung mit Proteinasen, wie endoLys-C-, endoArg-C-, endoGlu-C- und Staphylococcus-V8-Protease produziert werden. Die verdauten Fragmente können durch beispielsweise Hochleistungsflüssigchromatographie(HPLC)techniken gereinigt werden.
"Immunologisch wirksame Menge" bedeutet im Kontext der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion die Verabreichung dieser Menge an einen individuellen Wirt entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe, die zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion wirksam ist. Die wirksame Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden oder zu immunisierenden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums, der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, eine Immunantwort (einschließlich einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort) auszulösen, dem gewünschten Schutzgrad, der Formulierung des Vakzins, der Feststellung der medizinischen Situation und anderen relevanten Faktoren. Es wird angenommen, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
"Isoliert" bedeutet ein Material, das substantiell oder im wesentlichen von Komponenten, die es normalerweise in dessen nativem Zustand begleiten, frei ist. Beispielsweise bezeichnet ein hierin verwendetes "isoliertes Polynucleotid" ein Polynucleotid, das von den Sequenzen, die es in einem natürlich vorkommenden Zustand flankieren, gereinigt ist, beispielsweise ein DNA-Fragment, von dem die Sequenzen, die normalerweise an das Fragment angrenzen, entfernt sind.
Der Ausdruck "ohne wesentliche Aminosäuresequenzidentität" bedeutet eine Aminosäuresequenz, die weniger als 70%, vorzugsweise weniger als 60%, noch günstiger weniger als 50% und noch besser weniger als 40% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz aufweist. Das Vergleichsfenster umfasst vorzugsweise die gesamte Länge der Aminosäuresequenz. Daher bezeichnet die hierin verwendete Phrase "ein Bereich von Helicobacter-Katalase ohne wesentliche Aminosäuresequenzidentität mit humaner Katalase" einen Bereich einer Helicobacter-Katalase, der weniger als 70%, vorzugsweise weniger als 60%, noch günstiger weniger als 50% und noch besser weniger als 40% Sequenzidentität mit einem entsprechenden C-terminalen Bereich von humaner Katalase aufweist.
"Erhalten aus" bedeutet, dass eine Probe, beispielsweise ein Nucleinsäureextrakt, aus einer speziellen Quelle des Wirts isoliert oder abgeleitet wurde. Beispielsweise kann der Nucleinsäureextrakt aus direkt aus dem Wirt isoliertem Gewebe erhalten werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" bezeichnet ein Polymer, das aus einer Mehrzahl von Nucleotideinheiten (Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide oder verwandte Strukturvarianten oder synthetische Analoga derselben), die über Phosphodiesterbindungen (oder verwandte Strukturvarianten oder synthetische Analoga derselben) verknüpft sind, besteht. Daher bezeichnet der Ausdruck "Oligonucleotid" typischerweise zwar ein Nucleotidpolymer, bei dem die Nucleotide und Verknüpfungen zwischen diesen von Natur aus auftreten, doch ist klar, dass der Ausdruck in dessen Umfang auch verschiedene Analoga umfasst, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Peptidnucleinsäuren (PNAs), Phosphoramidate, Phosphorothionate, Methylphosphonate, 2-O-Methylribonucleinsäuren und dgl. umfassen. Die exakte Größe des Moleküls kann in Abhängigkeit von der speziellen Anwendung variieren. Ein Oligonucleotid ist typischerweise von ziemlich kurzer Länge, allgemein etwa 10 bis 30 Nucleotide, doch kann der Ausdruck Moleküle beliebiger Länge bezeichnen, obwohl der Ausdruck "Polynucleotid" oder "Nucleinsäure" typischerweise für große Oligonucleotide verwendet wird.
"Funktional verknüpft" bedeutet, dass transkriptional und translational regulatorische Nucleinsäuren relativ zu einem ein Polypeptid codierenden Polynucleotid derart positioniert sind, dass das Polynucleotid transkribiert und das Polypeptid translatiert wird.
Der Ausdruck "Patient" bezeichnet Patienten humaner Herkunft oder anderen tierischen Ursprungs und er umfasst jedes Individuum, das unter Verwendung der Verfahren der Erfindung untersucht oder behandelt werden soll. Jedoch ist klar, dass "Patient" nicht impliziert, dass Symptome vorhanden sind.
"Pharmazeutisch akzeptabler Träger und/oder pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel" bedeutet einen festen oder flüssigen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel oder eine Verkapselungssubstanz, die bei topischer oder systemischer Verabreichung sicher verwendet werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Polynucleotid" oder "Nucleinsäure" bezeichnet mRNA, RNA, cRNA, cDNA oder DNA. Der Ausdruck bezeichnet typischerweise Oligonucleotide von einer größeren Länger als 30 Nucleotide.
Die Ausdrücke "Polynucleotidvariante" und "Variante" bezeichnen Polynucleotide, die wesentliche Sequenzidentität mit einer Referenzpolynucleotidsequenz zeigen, oder Poly nucleotide, die mit einer Referenzsequenz unter stringenten Bedingungen, die im folgenden definiert sind, hybridisieren. Daher bezeichnet eine "Polynucleotidvariante" oder "Variante" ein Polynucleotid, dessen Sequenz sich von einem Referenzpolynucleotid durch die Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einem Nucleotid unterscheidet. Beispielsweise ist einschlägig klar, dass bestimmte Änderungen, die Mutationen, Additionen, Deletionen und Substitutionen umfassen, an einem Referenzpolynucleotid durchgeführt werden können, wodurch das veränderte Polynucleotid die biologische Funktion oder Aktivität des Referenzpolynucleotids beibehält. Die Ausdrücke "Polynucleotidsequenzvariante" und "Variante" umfassen ferner natürlich vorkommende Allelvarianten.
Die Ausdrücke "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar derart verwendet, dass sie ein Polymer von Aminosäureresten und Varianten und synthetische Analoga derselben bezeichnen. Daher gelten diese Ausdrücke für Aminosäurepolymere, in denen eine oder mehrere Aminosäurereste eine synthetische, nicht natürlich vorkommende Aminosäure, beispielsweise ein chemisches Analogon einer entsprechenden, natürlich vorkommenden Aminosäure, sind, sowie natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
Der Ausdruck "Polypeptidvariante" bezeichnet ein Polypeptid, dessen Sequenz sich von einem Referenzpolypeptid durch Substitution von mindestens einer Aminosäure unterscheidet. Beispielsweise ist einschlägig klar, dass einige Aminosäuren in andere mit in weitem Umfang ähnlichen Eigenschaften ohne Änderung der Natur der Aktivität eines Referenzpolypeptids (konservative Substitutionen), wie im folgenden beschrieben ist, geändert werden können. Daher umfassen die hierin verwendeten Polypeptidvarianten Polypeptide, die eine Immunantwort gegenüber Helicobacter und vorzugsweise H. pylori auslösen.
"Primer" bedeutet ein Oligonucleotid, das bei Paarung mit einem DNA-Strang die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts in Gegenwart eines geeigneten Polymerisationsmittels initiieren kann. Der Primer ist für eine maximale Effizienz bei der Amplifikation vorzugsweise einsträngig, doch kann er alternativ doppelsträngig sein. Ein Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart des Polymerisationsmittels zu starten. Die Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, die die Anwendung, die zu verwendende Temperatur, Templatreaktionsbedingungen, andere Reagentien und die Quelle von Primern umfassen. Beispielsweise enthält in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz der Oligonucleotidprimer typischerweise 15 bis 35 oder mehr Nucleotide, obwohl er weniger Nucleotide enthalten kann. Primer können große Polynucleotide sein, beispielsweise aus etwa 200 Nucleotiden bis zu mehreren Kilobasen oder mehr. Primer können derart gewählt werden, dass sie "im wesentlichen komplementär" zu der Sequenz auf dem Templat, mit der sie hybridisieren sollen und die als Ort zur Initiation der Synthese dienen soll, sind. "Im wesentlichen komplementär" bedeutet, dass der Primer im wesentlichen komplementär zur Hybridisierung mit einer Zielnucleotidsequenz ist. Vorzugsweise enthält der Primer keine Nichtübereinstimmungen mit dem Templat, an das er hybridisieren soll, jedoch ist dies nicht wesentlich. Beispielsweise können nicht-komplementäre Nucleotide am 5'-Ende des Primers angebracht werden, wobei der Rest der Primersequenz zum Templat komplementär ist. Alternativ können nicht-komplementäre Nucleotide oder eine Strecke nicht-komplementärer Nucleotide in einen Primer eingefügt werden mit der Maßgabe, dass die Primersequenz ausreichend Komplementarität mit der Sequenz des Templats, mit der sie hybridisieren soll, aufweist und dadurch ein Templat zur Synthese des Verlängerungsprodukts des Primers bildet.
"Sonde" bezeichnet ein Molekül, das an eine spezifische Sequenz oder Teilsequenz oder eine andere Einheit eines anderen Moleküls bindet. Falls nicht anders angegeben, bezeichnet der Ausdruck "Sonde" typischerweise eine Polynucleotidsonde, die an eine andere Nucleinsäure, die häufig als die "Zielnucleinsäure" bezeichnet wird, durch komplementäre Basenpaarung bindet. Sonden können Zielnucleinsäuren ohne vollständige Sequenzkomplementarität mit der Sonde in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen binden. Sonden können direkt oder indirekt markiert sein.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinantes Polynucleotid" bezeichnet ein Polynucleotid, das in vitro durch die Manipulation von Nucleinsäure zu einer Form, die normalerweise in der Natur nicht gefunden wird, gebildet wurde. Beispielsweise kann das rekombinante Polynucleotid in der Form eines Expressionsvektors sein. Allgemein umfassen derartige Expressionsvektoren transkriptional und translational regulatorische Nucleinsäure, die funktional mit der Nucleotidsequenz verknüpft ist.
"Rekombinantes Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid, das unter Verwendung von Gentechniken, beispielsweise durch die Expression eines rekombinanten Polypeptids, hergestellt wurde.
Ausdrücke, die zur Beschreibung von Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden oder Polypeptiden verwendet werden, umfassen "Referenzsequenz, "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "Prozentsatz der Sequenzidentität" und "substantielle Identität". Eine "Referenzsequenz" weist eine Länge von mindestens 6, jedoch häufig 15 bis 18 und oft mindestens 25 Monomereinheiten, die Nucleo tide und Aminosäurereste umfassen, auf. Da zwei Polynucleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. nur einen Bereich bzw. Teil der vollständigen Polynucleotidsequenz), die zwischen den zwei Polynucleotiden ähnlich ist, und (2) eine Sequenz, die zwischen den zwei Polynucleotiden unterschiedlich ist, umfassen können, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden typischerweise durch Vergleichen von Sequenzen der zwei Polynucleotide über ein "Vergleichsfenster" zur Identifizierung und zum Vergleich lokaler Bereiche mit Frequenzähnlichkeit durchgeführt. Ein "Vergleichsfenster" bezeichnet ein Begriffssegment von typischerweise 12 fortlaufenden Resten, das mit einer Referenzsequenz verglichen wird. Das Vergleichsfenster kann Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) von etwa 20% oder weniger im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen. Ein optimales Alignment von Sequenzen zur Alignierung eines Vergleichsfensters kann durch computergestützte Implementierungen von Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) oder durch Inspektion und das beste Alignment (d. h. das zur Homologie mit dem höchsten Prozentsatz über das Vergleichsfenster führt), das nach einem der verschiedenen gewählten Verfahren erzeugt wurde, durchgeführt werden. Verwiesen werden kann auch auf die BLAST-Programmfamilie beispielsweise gemäß der Offenbarung bei Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Eine detaillierte Diskussion von Sequenzanalyse findet sich in der Unit 19.3 von Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Kapitel 15.
Der hier verwendete Ausdruck "Sequenzidentität" bezeichnet das Ausmaß, in dem Sequenzen auf Nucleotid-Nucleotid-Basis oder Aminosäure-Aminosäure-Basis über ein Vergleichsfenster identisch sind. Daher wird ein "Prozentsatz der Sequenzidentität" durch Vergleichen von zwei optimal alignierten Sequenzen über das Vergleichsfenster, Bestimmen der Zahl von Positionen, an denen eine identische Nucleinsäurebase (beispielsweise A, T, C, G, I) oder ein identischer Aminosäurerest (beispielsweise Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys und Met) in beiden Sequenzen auftritt, wobei die Zahl passender bzw. übereinstimmender Positionen erhalten wird, Dividieren der Zahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster (d. h. die Fenstergröße) und Multiplizieren des Ergebnisses durch 100 berechnet, wobei der Prozentsatz der Sequenzidentität erhalten wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll "Sequenzidentität" den "Übereinstimmunsprozentsatz" bedeuten, der durch das DNASIS-Computerprogramm (Version 2.5 für Windows; erhältlich von Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Kalifornien, USA) unter Verwendung von Standardnichteinhaltungen, die in dem die Software begleitenden Referenzhandbuch verwendet werden, berechnet wird.
Die hierin verwendete "Stringenz" bezeichnet die Temperatur- und Ionenstärkebedingungen und das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein bestimmter organischer Lösemittel während Hybridisierungs- und Waschverfahren. Je höher die Stringenz, desto höher ist der Grad der Komplementarität zwischen immobilisierten Zielnucleotidsequenzen und den markierten Sondenpolynucleotidsequenzen, die nach dem Waschen an dem Target bzw. der Zielsequenz hybridisiert verbleiben.
Der hier verwendete Ausdruck "stringente Bedingungen" bezeichnet Temperatur- und Innenbedingungen, unter denen nur Nucleotidsequenzen mit einer hohen Häufigkeit komplementärer Basen hybridisieren. Die erforderliche Stringenz ist abhängig von der Nucleotidsequenz und sie hängt von den verschiedenen Komponenten, die während der Hybridisierung vorhanden sind, ab. Allgemein werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 10 bis 20 °C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Innenstärke und einem definierten pH-Wert sind. T_m ist die Temperatur (unter definierter Innenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% einer Zielsequenz an eine komplementäre Sonde hybridisiert.
"Im wesentlichen avirulent" bedeutet ein Virus, dessen Infektivität zerstört ist. Idealerweise wird die Infektivität des Virus zerstört, ohne die Proteine, die die Immunogenität des Virus tragen, zu beeinflussen.
Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen rein" beschreibt eine Verbindung, beispielsweise ein Peptid, die von Komponenten, die sie von Natur aus begleiten, abgetrennt ist. Typischerweise ist eine Verbindung im wesentlichen rein, wenn mindestens 60%, noch günstiger mindestens 75%, noch besser mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 99% des gesamten Materials (bezogen auf das Volumen, das Nass- oder Trockengewicht oder als Molprozent oder Molenbruch) in einer Probe die interessierende Verbindung sind. Reinheit kann durch jedes geeignete Verfahren, beispielsweise im Falle von Polypeptiden durch Chromatographie, Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse, ermittelt werden. Eine Verbindung, beispielsweise ein Polypeptid, ist auch im wesentlichen gereinigt, wenn sie im wesentlichen frei von von Natur aus damit verbundenen Komponenten ist, wenn sie von den nativen kontaminierenden Stoffen, die sie in deren natürlichem Zustand begleiten, abgetrennt ist.
"Zielantigen" bedeutet ein Antigen, das mit einer Helicobacter-Infektion, für die eine Behandlung oder Diagnose gesucht wird, in Verbindung steht.
"Vektor" bedeutet ein Nucleinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA-Molekül, das beispielsweise von einem Plasmid, einem Bakteriophagen oder einem Pflanzenvirus, in die eine Nucleinsäuresequenz insertiert oder kloniert werden kann, abgeleitet ist. Ein Vektor enthält vorzugsweise eine oder mehrere singuläre Restriktionsstellen und er kann zur autonomen Replikation in einer definierten Wirtszelle, die eine Zielzelle oder ein Zielgewebe oder eine Vorläuferzelle oder ein Vorläufergewebe derselben umfasst, sein oder in das Genom des definierten Wirts derart integrierbar sein, dass die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Entsprechend kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, beispielsweise ein lineares oder geschlossenes zirkuläres Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom, sein. Der Vektor kann beliebige Mittel, um die Selbstreplikation sicherzustellen, enthalten. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom integriert wird und zusammen mit dem Chromosom bzw. den Chromosomen, in die er integriert wurde, repliziert wird. Ein Vektorsystem kann einen einzigen Vektor oder ein einziges Plasmid, zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte, in das Genom der Wirtszelle einzuführende DNA enthalten, oder ein Transposon sein. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle, in die der Vektor eingeführt werden soll, ab. Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker, beispielsweise ein Antibiotikumresistenzgen, das zur Selektion geeigneter Transformanten verwendet werden kann, umfassen. Beispiele für derartige Resistenzgene sind dem Fachmann geläufig.
2. Polypeptide der Erfindung
2.1 Polypeptide des C-terminalen Bereichs von Helicobacter-Katalase
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt bereit, wobei das Polypeptid weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit humaner Katalase aufweist und einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase mit weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit einem entsprechenden C-terminalen Bereich von humaner Katalase, wobei der C-terminale Bereich die in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, oder eine Variante mit mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Helicobacter-Katalase eine Helicobacter pylori-Katalase. Beispielsweise kann der C-terminale Bereich den Bereich von etwa Rest 358 bis etwa Rest 505 der H. pylori-Katalase voller Länge des Stamms RU-1, der unter der Hinterlegungsnummer AAC16068 der GenPept-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) offenbart ist, umfassen. In diesem Fall umfasst der C-terminale Bereich vorzugsweise die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz. SEQ ID NO: 2 entspricht einem 134-aa-Fragment des H. pylori-Katalase voller Länge des Stamms RU-1, das Rest 372 bis Rest 505 der oben genannten H. pylori-Katalase voller Länge umspannt. Vorzugsweise umfasst der Cterminale Bereich die in SEQ ID NO: 4 angegebene Sequenz, die einem 134-aa-Fragment einer Katalase voller Länge des H. pylori-Stamms HP921023 entspricht.
2.2 Identifizierung immunogener Fragmente
Immunogene Fragmente können nach jedem geeigneten, einschlägig bekannten Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise kann ein geeignetes Verfahren das Herstellen eines Fragments eines Polypeptids nach SEQ ID NO: 2 oder 4, das Verabreichen des Fragments an einen Säuger und das Detektieren einer Immunantwort in dem Säuger umfassen. Eine derartige Antwort umfasst die Produktion von Elementen, die spezifisch an Helicobacter binden und/oder eine schützende oder therapeutische Wirkung gegenüber einer Helicobacter-Infektion ergeben.
Vor dem Testen eines speziellen Fragments auf Immunreaktivität in dem obigen Verfahren kann eine Vielzahl von Vorhersageverfahren verwendet werden, um abzuleiten, ob ein spezielles Fragment verwendet werden kann, um einen Antikörper, der mit dem nativen Antigen eine Kreuzreaktion eingeht, zu erhalten. Diese Vorhersageverfahren können auf aminoterminalen oder carboxyterminalen Sequenzen, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Kapitel 11.14 von Ausubel et al. (1994-1998, aaO) beruhen. Alternativ können diese Vorhersageverfahren auf Vorhersagen der Hydrophilie, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Kyte und Doolittle (1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132) und Hopp und Woods (1983, Mol. Immunol. 20: 493-489), oder Vorhersagen der Sekundärstruktur, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Choo und Fasman (1978, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276) beruhen.
Generell ergeben Peptidfragmente, die aus 10 bis 15 Resten bestehen, optimale Ergebnisse. Mit Peptiden, die bis zu 6 Resten klein waren oder bis zu 20 Resten groß waren, wurde erfolgreich gearbeitet. Derartige Peptidfragmente können dann chemisch an ein Trägermolekül, wie Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA), beispielsweise gemäß der Beschreibung in den Kapiteln 11.14 und 11.15 von Ausubel et al. (1994-1998, aaO) gekoppelt werden. Jedoch ist klar, dass größere Peptide zum Auslösen einer zellulären Immunantwort günstig sein können.
Die Peptide können zur Immunisierung eines tierischen Lebewesens wie beispielsweise oben diskutiert verwendet werden. Antikörpertiter gegenüber dem nativen oder einem Stammpolypeptid, aus denen das Peptid gewählt wurde, können dann durch Radioimmunoassay oder ELISA beispielsweise gemäß der Beschreibung in den Kapiteln 11.16 und 114 von Ausubel et al. (1994-1998, aaO) bestimmt werden.
Antikörper können dann aus einem geeigneten biologischen Fluidum des tierischen Lebewesens durch Ammoniumsulfatfraktionierung oder durch Chromatographie, wie einschlägig bekannt ist, gereinigt werden. Beispielprotokolle zur Antikörperreinigung sind in den Kapiteln 11.11 und 11.13 von Ausubel et al. (1994-1998, aaO) angegeben. Die Immunreaktivität des Antikörpers gegenüber dem nativen oder Stammpolypeptid kann durch jedes geeignete Verfahren, das, ohne hierauf beschränkt zu sein, Western Blot, enzymgekoppelten Immunosorptionsassay (ELISA) und Radioimmunoassay (RIA) umfasst, bestimmt werden.
2.3 Polypeptidvarianten
Die Erfindung betrachtet ferner Polypeptidvarianten eines C-terminalen Bereichs von Helicobacter-Katalase oder einem Fragment desselben gemäß der Erfindung, wobei die Varianten eine Immunreaktion gegen Helicobacter und vorzugsweise gegen H. pylori auslösen. Allgemein sind Varianten mindestens 75%, noch günstiger mindestens 80%, vorzugsweise mindes tens 85% und noch besser mindestens 90% homolog zu einem natürlichen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase, der beispielsweise in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegeben ist. Vorzugsweise zeigen Varianten mindestens 60%, noch günstiger mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, noch besser mindestens 80%, noch bevorzugter mindestens 85%, schließlich noch bevorzugter mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität mit einem Polypeptid, das beispielsweise in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegeben ist. Im Hinblick darauf umfasst das Vergleichsfenster vorzugsweise etwa die volle Länge des Polypeptids oder immunogenen Fragments.
Günstigerweise ergeben die Polypeptidvarianten der Erfindung eine Kreuzreaktion mit einem Epitop einer Helicobacter-Katalase, vorzugsweise einem Epitop eines C-terminalen Bereichs einer Helicobacter-Katalase oder sie ahmen dieses immunologisch nach. Daher können Polypeptidvarianten gemäß der Erfindung an ein antigenbindendes Molekül binden, das auch an ein Epitop einer Helicobacter-Katalase, vorzugsweise ein Epitop im C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase bindet.
Geeignete Polypeptidvarianten können durch Kombination einer Verbindung, von der angenommen wird, dass sie eine Variante ist, mit mindestens einem antigenbindenden Molekül, das an den C-terminalen Bereich oder ein immunogenes Fragment bindet, identifiziert werden. Wenn ein Konjugat, das die Verbindung und das antigenbindende Molekül umfasst, gebildet wird, ist dies ein Anzeichen dafür, dass diese Verbindung eine Variante des im vorhergehenden genannten Cterminalen Bereichs oder immunogenen Fragments ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Polypeptidvariante durch Kombination eines modifizierten Polypeptids, dessen Sequenz von dem Stammpolypeptid durch Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einer Aminosäure verschieden ist, mit mindestens einem antigenbindenden Molekül, das an den C-terminalen Bereich oder das immunogene Fragment bindet, und Detektieren eines Konjugats, das das modifizierte Polypeptid und das antigenbindende Molekül umfasst, identifiziert werden. Wenn das Konjugat detektiert wird, ist dies ein Anzeichen dafür, dass das modifizierte Polypeptid die Variante ist.
2.3.1 Assayformate
Jede geeignete Technik zur Bestimmung der Bildung des Konjugats kann verwendet werden. Beispielsweise kann das antigenbindende Molekül in herkömmlichen Immunoassays verwendet werden. Derartige Immunoassays können, ohne hierauf beschränkt zu sein, Radioimmunoassays (RIAs), enzymgekoppelte Immunosorptionsassays (ELISAs) und immunchromatographische Techniken (ICTs), die dem Fachmann geläufig sind, umfassen. Beispielsweise kann verwiesen werden auf Coligan et al. ("CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY", John Wiley & Sons, Inc., 1995-1997), worin eine Vielzahl von Immunoassays beschrieben sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Im Hinblick darauf zieht die Erfindung jeden Immunoassay, der das Vorhandensein eines Konjugats, das hierin beschrieben ist, detektieren kann, in Betracht. Beispielsweise können Immunoassays kompetitive und nichtkompetitive Assays, die auf dem Gebiet bekannt sind, umfassen. Derartige Immunoassays können in Lösung oder mindestens teilweise auf festen Trägern, beispielsweise Mikrotiterplatten, Polystyrolperlen, Nitrocellulosemembranen, Glasfasermembranen, Immunchromatographiestreifen und dgl., durchgeführt werden. Die zwei üblichsten Formate für Immunoassays sind kompetitive und nichtkompetitive (Sandwich-) Formate.
Bei einem kompetitiven Format ist ein antigenbindendes Molekül, wie ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, an einen festen Träger gebunden. Dieser Antikörper ist günstigerweise zum Binden eines Polypeptids nach SEQ ID NO: 2 oder 4 oder eines immunogenen Fragments derselben fähig. Die Lösung eines Antigens, das markiert ist, um eine Detektion zu ermöglichen, (beispielsweise ein markiertes Polypeptid oder immunogenes Fragment) wird mit nichtmarkiertem Antigen (beispielsweise einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie eine Variante ist) um den Festphasenantikörper konkurrieren gelassen. Das Ausmaß, in dem das markierte Antigen an die feste Phase gebunden ist oder in der Lösungsphase detektiert wird, kann als Maß des Vorhandenseins des Konjugats verwendet werden.
In einem nichtkompetitiven oder Sandwichformat ist ein polyklonaler oder vorzugsweise monoklonaler Antikörper an einen festen Träger gebunden. Ein derartiger Antikörper ist günstigerweise zur Bindung eines Polypeptids nach SEQ ID NO: 2 oder 4 oder eines immunogenen Fragments derselben fähig. Im Falle eines polyklonalen Antikörpers, der an den festen Träger gebunden ist, wird die Probe, die das vermutete Antigen (d. h. eine Verbindung, von der vermutet wird, dass sie die Variante ist) enthält, mit der festen Phase in Kontakt kommen gelassen, damit das Antigen an den Antikörper auf der festen Phase bindet. Typischerweise wird die Probe nach einer Inkubationsstufe von der festen Phase abgetrennt, wobei diese dann gewaschen und in Gegenwart eines zusätzlichen polyklonalen Antikörpers, der markiert wurde, um eine Detektion zu ermöglichen, inkubiert wird. Anschließend wird der nichtgebundene markierte Antikörper von der festen Phase abgetrennt und die Menge des markierten Antikörpers in entweder der Lösungsphase oder in einem Antikörper/Antigen/Antikörper-Sandwich an die feste Phase gebunden als Maß des Vorhandenseins des Konjugats bestimmt. Im Falle eines nichtkompetitiven Formats unter Verwendung monoklonaler Antikörper wird typischerweise ein Paar monoklonaler Antikörper verwendet, wobei der eine an den festen Träger gebunden ist und der andere markiert ist, um eine Detektion zu ermöglichen. Die Verwendung von monoklonalen Antikörperpaaren, die verschiedene Epitopstellen auf einem Antigen erkennen, ermöglicht die gleichzeitige Durchführung von immunometrischen Assays, bei denen die Inkubationen mit Antigen und markiertem Antikörper die Zwischenstufen früherer Verfahren nicht erfordern.
Alternativ kann eine Festphasendetektion des Konjugats durch Immunoaffinitätschromatographie, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Coligan et al. (aaO, insbesondere Kapitel 9.5) und Ausubel et al. ("CURRENT PROTOCOLS IN MOLE-CULAR BIOLOGY", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, insbesondere Kapitel 10.11), durch Immunblotting, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Ausubel et al. (aaO, in Kapitel 10.8), oder durch Immunpräzipitation, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Ausubel et al. (aaO, in Kapitel 10.16), bestimmt werden.
Lösungsphase-Immunoassays werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. Beispielsweise kann die Detektion des Konjugats in Lösung unter Verwendung von Durchflusszytometrieanalyse, beispielsweise gemäß der Beschreibung in H. M. Shapiro ("PRACTICAL FLOW CYTOMETRY", 3. Auflage, Wiley-Liss, New York, 1995), durchgeführt werden.
2.3.2 Verfahren zur Herstellung von Polypeptidvarianten
2.3.2.1 Mutagenese
Polypeptidvarianten gemäß der Erfindung können entweder rational oder über etablierte Verfahren der Mutagenese (siehe beispielsweise J. D. Watson et al., "MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE", vierte Auflage, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Kalifornien, 1987) identifiziert werden. Signifikanterweise erfordert ein Zufallsmutageneseansatz keine a-priori-Information über die zu mutierende Gensequenz. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass er den Wunsch nach einer speziellen Mutante auf der Basis von deren Funktion festlegt und daher keine Kenntnis, wie oder warum das erhaltene mutierte Protein eine spezielle Konformation angenommen hat, erfordert. Tatsächlich ist die Zufallsmutation von Zielgensequenzen ein Ansatz, der zur Gewinnung von mutierten Proteinen mit gewünschten Eigenschaften verwendet wird (R. Leatherbarrow, 1986, J. Prot. Eng. 1: 7-16; J. R. Knowles, 1987, Science 236: 1252-1258; W. V. Shaw, 1987, Biochem. J. 246: 1-17; J. A. Gerit 1987, Chem. Rev. 87: 1079-1105). Alternativ können, wenn eine spezielle Sequenzänderung gewünscht wird, Verfahren der positionsspezifischen Mutagenese verwendet werden. Daher können derartige Verfahren zur selektiven Änderung von nur den Aminosäuren des Proteins, von denen angenommen wird, dass sie wichtig sind, verwendet werden (C. S. Craik, 1985, Science 228: 291-297; Cronin et al., 1988, Biochem. 27: 4572-4579; Wilks et al., 1988, Science 242: 1541-1544).

Variante Peptide oder Polypeptide infolge rationaler oder etablierter Verfahren der Mutagenese oder kombinatorischer Chemie, die hierin im folgenden beschrieben sind, können konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen. Beispiele für konservative Substitutionen in einem immunogenen Polypeptid oder Polypeptidfragment gemäß der Erfindung können nach der folgenden Tabelle durchgeführt werden: TABELLE A

Ursprünglicher Rest	Beispiele für Substitutionen
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Wesentliche Änderungen der Funktion werden durch die Wahl von Substitutionen, die weniger konservativ als die in Tabelle A angegebenen sind, durchgeführt. Andere Ersetzungen sind nicht-konservative Substitutionen und relativ wenige von diesen können toleriert werden. Allgemein sind die Substitutionen, die wahrscheinlich die größten Änderungen in den Eigenschaften eines Polypeptids hervorrufen, diejenigen, in denen (a) ein hydrophiler Rest (beispielsweise Ser oder Thr) einen hydrophoben Rest (beispielsweise Ala, Leu, Ile, Phe oder Val) ersetzt oder durch diesen ersetzt wird; (b) ein Cystein oder Prolin einen beliebigen anderen Rest ersetzt oder durch diesen ersetzt wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette (beispielsweise Arg, His oder Lys) einen elektronegativen Rest (beispielsweise Glu oder Asp) ersetzt oder durch diesen ersetzt wird oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette (beispielsweise Phe oder Trp) einen mit einer kleineren Seitenkette (beispielsweise Ala, Ser) oder ohne Seitenkette (beispielsweise Gly) ersetzt oder durch diesen ersetzt wird.
Welche geeignete Varianten bilden, kann durch herkömmliche Techniken bestimmt werden. Beispielsweise können Nucleinsäuren mit Codierung für ein Polypeptid nach einer von SEQ ID NO: 2 oder 4 oder einem Fragment derselben unter Verwendung von entweder Zufallsmutagenese, beispielsweise Verwendung von Transposon-Mutagenese, oder positionsspezifischer Mutagenese, die beispielsweise hierin in Abschnitt 3.2 beschrieben ist, mutiert werden.
2.3.2.2 Peptidbibliotheken, die durch kombinatorische Chemie produziert wurden
Eine Zahl leichter kombinatorischer Technologien kann zur Synthese von Molekülbibliotheken immenser Vielfalt verwendet werden. Im vorliegenden Fall können Varianten eines immunogenen Polypeptids, vorzugsweise eines immunogenen Polypeptidfragments gemäß der Erfindung unter Verwendung derartiger Technologien synthetisiert werden. Varianten können anschließend unter Verwendung der in Abschnitt 2.3.1 beschriebenen Verfahren gescreent werden.
Vorzugsweise werden kombinatorische Bibliotheken löslicher synthetischer Peptide (SPCLs) produziert, die den Vorteil des Arbeitens mit freien Peptiden in Lösung bieten, wodurch die Einstellung der Peptidkonzentration zur bequemen Anpassung an ein spezielles Assaysystem möglich ist. SPCLs werden günstigerweise als Hexamere hergestellt. Im Hinblick darauf ist bekannt, dass der größte Teil von Bindungsstellen vier bis sechs Reste umfasst. Cystein wird vorzugsweise aus den Gemischpositionen ausgeschlossen, um die Bildung von Disulfiden und schwer zu definierenden Polymeren zu vermeiden. Beispiele für Verfahren zur Herstellung von SPCLs sind bei Houghten et al. (1991, Nature 354: 84-86; 1992, BioTechniques 13: 412-421), Appel et al. (1992, Immunomethods 1: 17-23) und Pinilla et al. (1992, BioTechniques 13: 901-905; 1993, Gene 128: 71-76) offenbart.
Die Herstellung kombinatorischer Bibliotheken synthetischer Peptide kann entweder tert-Butyloxycarbonyl (t-Boc)- oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Chemien (siehe Kapitel 9.1 von Coligan et al., aaO; Stewart und Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill; und Atherton und Sheppard 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford) unter Verwendung von vorzugsweise, jedoch nicht ausschließlich einem von zwei verschiedenen Ansätzen verwenden. Der erste dieser Ansätze, der günstigerweise als "splitprocess-recombine"- oder "split synthesis"-Verfahren bezeichnet wird, wurde zum ersten Mal von Furka et al. (1988, 14th Int. Congr. Biochem., Prag, Tschechoslowakei 5: 47; 1991, Int. J. Pept. Protein Res. 37: 487-493) und Lam et al. (1991, Nature 354: 82-84) beschrieben und später von Eichler et al. (1995, Medicinal Research Reviews 15 (6): 481-496) und Balkenhohl et al. (1996, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2288-2337) im Überblick behandelt. Kurz gesagt umfasst das split synthesis-Verfahren die Aufteilung einer Mehrzahl fester Träger, wie Polymerperlen, in n gleiche Fraktionen, die repräsentativ für die Zahl von für jede Stufe der Synthese verfügbaren Aminosäuren (beispielsweise 20 L-Aminosäuren) sind, die Kopplung einer einzelnen jeweiligen Aminosäure an die einzelnen Polymerperlen einer entsprechenden Fraktion und dann das sorgfältige Zusammenmi schen der Polymerperlen aller Fraktionen. Dieses Verfahren wird für insgesamt x Zyklen wiederholt, wobei eine stochastische Sammlung von bis zu N^x verschiedenen Verbindungen produziert wird. Die so produzierte Peptidbibliothek kann mit einem geeignet markierten monoklonalen Antikörper gescreent werden. Bei der Detektion werden einige der positiven Perlen zur Sequenzierung zur Identifizierung des aktiven Peptids ausgewählt. Ein derartiges Peptid kann anschließend von den Perlen abgespalten werden und unter Verwendung des gleichen Antikörpers zur Identifizierung der am stärksten aktiven Peptidsequenz getestet werden.
Der zweite Ansatz, das chemische Verhältnisverfahren, bereitet gemischte Peptidharze unter Verwendung eines empirisch festgelegten speziellen Verhältnisses von Aminosäuren, das den äquimolaren Einbau der einzelnen Aminosäuren in jeder Kopplungsstufe ergibt, her. Jede Harzperle enthält ein Gemisch von Peptiden. Das ungefähr äquimolare Vorhandensein kann durch Aminosäureanalyse festgestellt werden (Dooley und Houghton, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10811-10815; Eichler und Houghton, 1993, Biochemistry 32: 11035-11041). Vorzugsweise wird die Bibliothek synthetischer Peptide auf Polyethylenstäben oder -stiften als fester Träger produziert, beispielsweise gemäß der Offenbarung bei Geysen et al. (1986, Mol. Immunol. 23: 709-715). Ein Beispiel für eine Peptidbibliothek dieses Typs kann aus Octapeptiden bestehen, in denen die dritte und vierte Position durch jede der 20 Aminosäuren festgelegt sind, wobei die verbleibenden sechs Positionen als Gemische vorhanden sind. Diese Peptidbibliothek kann durch die Formel Ac-XXO₁O₂XXXX-S_s, worin S_s der feste Träger ist, dargestellt werden. Peptidgemische verbleiben auf den Stiften, wenn sie gegen ein lösliches Rezeptormolekül getestet werden.
2.3.2.3 Polypeptid- oder Peptidbibliotheken, die durch Pha gendisplay produziert werden
Die Identifizierung von Varianten kann auch durch die Verwendung eines Phagendisplay-Proteinligand-Screeningsystems durchgeführt werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Lowman et al. (1991, Biochem. 30: 10832-10838), Markland et al. (1991, Gene 109: 13-19), Roberts et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 2429-2433), G. P. Smith (1985, Science 228: 1315-1317), Smith et al. (1990, Science 248: 1126-1128) und Lardner et al. ( US-Patent 5 223 409 ). Allgemein umfasst dieses Verfahren die Expression eines Fusionsproteins, in dem der gewünschte Proteinligand an den N-Terminus eines Virushüllproteins (beispielsweise das M13 Gene III-Hüllprotein oder lambda-Hüllprotein) fusioniert ist.
In einer Ausführungsform wird eine Phagenbibliothek technisch derart verändert, dass sie neue Peptide innerhalb der Phagenhüllproteinsequenzen zeigt. Neue Peptidsequenzen werden durch Zufallsmutagenese von Genfragmenten mit Codierung für ein immunreaktives Polypeptidfragment unter Verwendung von fehlerhafter PCR oder durch eine In-vivo-Mutation durch E. coli-Mutatorzellen erzeugt. Die neuen Peptide, die auf der Oberfläche des Phagen gezeigt werden, werden mit einem antigenbindenden Molekül, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragment gegen das spezielle immunogene Polypeptid oder Polypeptidfragment, auf dem die neuen Peptidsequenzen beruhen, in Kontakt gebracht. Phagen, die ein Hüllprotein mit Peptiden, die zur Bindung an derartige Antikörper fähig sind, zeigen, werden durch eine derartige Behandlung immobilisiert, während alle anderen Phagen weggewaschen werden können. Nach der Entfernung von nichtgebundenem Phagen kann der gebundene Phage amplifiziert werden und die DNA mit Codierung für deren Hüllproteine sequenziert werden. Auf diese Weise kann die Aminosäure sequenz des eingebetteten Peptids oder Polypeptids abgeleitet werden.
2.3.2.4 Rationale Arzneistoffgestaltung
Varianten von natürlich vorkommenden immunogenen Polypeptiden oder Polypeptidfragmenten gemäß der Erfindung können auch unter Verwendung der Prinzipien von herkömmlicher oder rationaler Arzneistoffgestaltung erhalten werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Andrews et al. (In: "PROCEEDINGS OF THE ALFRED BENZON SYMPOSIUM", Band 28, S. 145-165, Munksgaard, Kopenhagen, 1990), A. McPherson (1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-24), Hol et al. (In: "MOLECULAR RECOGNITION: CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PROBLEMS", S. M. Roberts (Hrsg.); Royal Society of Chemistry; S. 84-93, 1989), W. G. J. Hol (1989, Arzneim-Forsch. 39: 1016-1018), W. G. J. Hol (1986, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25: 767-778).
Gemäß den Verfahren herkömmlicher Arzneistoffgestaltung werden die gewünschten Variantenmoleküle durch Zufallstests von Molekülen, deren Strukturen ein mit der Struktur eines "nativen" immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments gemäß der Erfindung gemeinsames Attribut aufweisen, erhalten. Der quantitative Beitrag, der sich durch die Änderung in einer speziellen Gruppe eines Bindungsmoleküls ergibt, kann durch Ermitteln der Fähigkeit zur Konkurrenz oder Kooperationsfähigkeit zwischen dem nativen immunogenen Polypeptid oder Polypeptidfragment und der vermutlichen Polypeptidvariante bestimmt werden.
In einer Ausführungsform einer rationalen Arzneistoffgestaltung ist die Polypeptidvariante derart gestaltet, dass sie das Attribut der stabilsten dreidimensionalen Konformation eines immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments gemäß der Erfindung teilt. Daher kann die Variante derart gestaltet werden, dass sie chemische Gruppen besitzt, die auf eine so ausreichende Weise orientiert sind, dass ionische, hydrophobe oder van der Waals-Interaktionen bewirkt werden, die ähnlich den durch das immunogene Polypeptid oder Polypeptidfragment gezeigten sind. Bei einem zweiten Verfahren einer rationalen Gestaltung wird die Fähigkeit eines speziellen immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments, ein "Atmen" der Konformation durchzuführen, ausgenutzt. Dieses "Atmen" – das vorübergehende und reversible Einnehmen einer unterschiedlichen Molekülkonformation – ist ein bekanntes Phänomen und es beruht auf der Temperatur, thermodynamischen Faktoren und der katalytischen Aktivität des Moleküls. Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments erleichtert eine derartige Beurteilung. Die Beurteilung der natürlichen Konformationsänderungen eines immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments ermöglicht die Erkennung potentieller Gelenkstellen, potentieller Stellen, an denen Wasserstoffbrückenbindungen, ionische Bindungen oder van der Waals-Bindungen aufgrund des Atmens des Moleküls gebildet oder entfernt werden können und dgl. Dieses Erkennen ermöglicht die Identifizierung der zusätzlichen Konformationen, die das immunogene Polypeptid oder Polypeptidfragment einnehmen kann, und es ermöglicht die rationale Gestaltung und Produktion von Immunmimetika, die derartige Konformationen teilen.
Das bevorzugte Verfahren zur Durchführung einer rationalen immunmimetischen Gestaltung verwendet ein Computersystem, das eine Darstellung der dreidimensionalen Struktur des immunogenen Polypeptids oder Polypeptidfragments bilden kann (beispielsweise diejenigen, die unter Verwendung von RIBBON (J. Priestle, 1988, J. Mol. Graphics 21: 572), QUANTA (Polygen), InSite (Biosyn) oder Nanovision (American Chemical Society) erhalten wurden). Derartige Analysen sind beispielsweise bei Hol et al. (In: "MOLECULAR RECOGNITION: CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PROBLEMS", aaO, W. G. J. Hol (1989, aaO) und W. G. J. Hol (1986, aaO) angegeben.
Anstelle derartiger direkter vergleichender Beurteilungen von vermutlichen Polypeptidvarianten können Screeningassays zur Identifizierung derartiger Moleküle verwendet werden. Derartige Assays nutzen vorzugsweise die Fähigkeit der Variante, an ein antigenbindendes Molekül zu binden, gemäß der Beschreibung in Abschnitt 2.3.1.
2.4 Polypeptidderivate
Bezugnehmend auf geeignete Derivate der Erfindung umfassen derartige Derivate Aminosäuredeletionen und/oder -additionen an einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase oder eines Fragments derselben oder eine Variante von diesen, wobei die Derivate eine Immunantwort gegen Helicobacter und vorzugsweise gegen H. pylori auslösen. "Additionen" von Aminosäuren können eine Fusion der Polypeptide, immunogenen Fragmente und Polypeptidvarianten der Erfindung mit anderen Polypeptiden oder Proteinen umfassen. Beispielsweise ist klar, dass die Polypeptide, immunogenen Fragmente oder Varianten in größere Polypeptide eingebaut werden können und ebenfalls erwartet werden kann, dass derartige größere Polypeptide eine Immunantwort gegen Helicobacter und vorzugsweise gegen H. pylori auslösen.
Die Polypeptide, immunogenen Fragmente oder Varianten der Erfindung können mit einem weiteren Protein, das beispielsweise nicht von dem ursprünglichen Wirt abgeleitet ist, fusioniert werden. Das weitere Protein kann die Reinigung des Fusionsproteins unterstützen. Beispielsweise kann ein Polyhistidin-Tag oder ein Maltose-Bindungsprotein in dieser Hinsicht gemäß der späteren detaillierten Beschreibung ver wendet werden. Alternativ kann es eine Immunantwort, die gegen Helicobacter wirksam ist, hervorrufen oder eine Immunantwort gegen ein anderes Pathogen hervorrufen. Andere mögliche Fusionsproteine sind diejenigen, die eine immunmodulatorische Antwort hervorrufen. Spezielle Beispiele für derartige Proteine umfassen Protein A oder Glutathion-S-transferase (GST).
Andere von der Erfindung in Betracht gezogene Derivate umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Modifikation von Seitenketten, den Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren und/oder deren Derivaten während der Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsynthese und die Verwendung von Vernetzern und andere Verfahren, die den Polypeptiden, Fragmenten und Varianten der Erfindung Konformationsbeschränkungen auferlegen.
Beispiele für Seitenkettenmodifikationen, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen Modifikationen von Aminogruppen, beispielsweise durch Acylierung mit Essigsäureanhydrid; Acylierung von Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid und Tetrahydrophthalsäureanhydrid; Amidierung mit Methylacetimidat; Carbamoylierung von Aminogruppen mit Cyanat; Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5-phosphat und anschließende Reduktion mit NaBH4; reduktive Alkylierung durch Reaktion mit einem Aldehyd und anschließende Reduktion mit NaBH₄; und Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulphonsäure (TNBS).
Die Carboxylgruppe kann durch Carbodiimidaktivierung über eine O-Acylisoharnstoff-Bildung und anschließende Derivatisierung zu beispielsweise einem entsprechenden Amid modifiziert werden.
Die Guanidingruppe von Argininresten kann durch Bildung von heterocyclischen Kondensationsprodukten mit Reagentien wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert werden.
Sulfhydrylgruppen können durch Verfahren wie eine Perameisensäureoxidation zu Cysteinsäure; die Bildung von Quecksilberderivaten unter Verwendung von 4-Chlorquecksilber(II)phenylsulfonsäure, 4-Chlorquecksilber(II)benzoat, 2-Chlorquecksilber(II)-4-nitrophenol, Phenylquecksilberchlorid und anderen Quecksilberverbindungen; die Bildung gemischter Disulfide mit anderen Thiolverbindungen; eine Reaktion mit Maleimid, Maleinsäureanhydrid oder einem anderen substituierten Maleimid; Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder Iodacetamid; und Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH-Wert modifiziert werden.
Tryptophanreste können beispielsweise durch Alkylierung des Indolrings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulfonylhalogeniden oder durch Oxidation mit N-Bromsuccinimid modifiziert werden.
Tyrosinreste können durch Nitrierung mit Tetranitromethan unter Bildung eines 3-Nitrotyrosinderivats modifiziert werden.
Der Imidazolring eines Histidinrests kann durch N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat oder durch Alkylierung mit Iodessigsäurederivaten modifiziert werden.

Beispiele zur Einarbeitung von nichtnatürlichen Aminosäuren und Derivaten während einer Peptidsynthese umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verwendung von 4-Aminobuttersäure, 6-Aminohexansäure, 4-Amino-3-hydroxy-5-phenylpentansäure, 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, tert-Bu tylglycin, Norleucin, Norvalin, Phenylglycin, Ornithin, Sarcosin, 2-Thienylalanin und/oder D-Isomeren von Aminosäuren. Eine Liste von nichtnatürlichen Aminosäuren, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, ist in Tabelle B angegeben. TABELLE B

Nicht-übliche Aminosäure	Nicht-übliche Aminosäure
α-Aminobuttersäure	L-N-Methylalanin
α-Amino-α-methylbutyrat	L-N-Methylarginin
Aminocyclopropan-carboxylat	L-N-Methylasparagin
Aminoisobuttersäure	L-N-Methylasparaginsäure
Aminonorbornyl-carboxylat	L-N-Methylcystein
Cyclohexylalanin	L-N-Methylglutamin
Cyclopentylalanin	L-N-Methylglutaminsäure
L-N-Methylisoleucin	L-N-Methylhistidin
D-Alanin	L-N-Methylleucin
D-Arginin	L-N-Methyllysin
D-Asparaginsäure	L-N-Methylmethionin
D-Cystein	L-N-Methylnorleucin
D-Glutamat	L-N-Methylnorvalin
D-Glutaminsäure	L-N-Methylornithin
D-Histidin	L-N-Methylphenylalanin
D-Isoleucin	L-N-Methylprolin
D-Leucin	L-N-Methylserin
D-Lysin	L-N-Methylthreonin
D-Methionin	L-N-Methyltryptophan
D-Ornithin	L-N-Methyltyrosin
D-Phenylalanin	L-N-Methylvalin
D-Prolin	L-N-Methylethylglycin
D-Serin	L-N-Methyl-tert-butylglycin
D-Threonin	L-Norleucin
D-Tryptophan	L-Norvalin
D-Tyrosin	α-Methyl-aminoisobutyrat
D-Valin	α-Methyl-γ-aminobutyrat
D-α-Methylalanin	α-Methylcyclohexylalanin
D-α-Methylarginin	α-Methylcyclopentylalanin
D-α-Methylasparagin	α-Methyl-α-naphthylalanin
D-α-Methylaspartat	α-Methylpenicillamin
D-α-Methylcystein	N-(4-Aminobutyl)glycin
D-α-Methylglutamin	N-(2-Aminoethyl)glycin
D-α-Methylhistidin	N-(3-Aminopropyl)glycin
D-α-Methylisoleucin	N-Amino-α-methylbutyrat
D-α-Methylleucin	α-Naphthylalanin
D-α-Methyllysin	N-Benzylglycin
D-α-Methylmethionin	N-(2-Carbamyldiyl)glycin
D-α-Methylornithin	N-(Carbamylmethyl)glycin
D-α-Methylphenylalanin	N-(2-Carboxyethyl)glycin
D-α-Methylprolin	N-(Carboxymethyl)glycin
D-α-Methylserin	N-Cyclobutylglycin
D-α-Methylthreonin	N-Cycloheptylglycin
D-α-Methyltryptophan	N-Cyclohexylglycin
D-α-Methyltyrosin	N-Cyclodecylglycin
L-α-Methylleucin	L-α-Methyllysin
L-α-Methylmethionin	L-α-Methylnorleucin
L-α-Methylnorvalin	L-α-Methylornithin
L-α-Methylphenylalanin	L-α-Methylprolin
L-α-Methylserin	L-α-Methylthreonin
L-α-Methyltryptophan	L-α-Methyltyrosin
L-α-Methylvalin	L-N-Methylhomophenylalanin
N-(N-(2,2-Diphenylethyl-carbamylmethyl)glycin	N-(N-(3,3-Diphenylpropylcarbamylmethyl)glycin
1-Carboxy-1-(2,2-diphenylethylamino)cyclopropan

Die Erfindung erstreckt sich auch auf die kovalente Modifikation eines Polypeptids, Fragments oder einer Variante gemäß der Erfindung mit Dinitrophenol, um diese in Menschen immunogen zu machen.
Ebenfalls betrachtet wird die Verwendung von Vernetzern, um beispielsweise 3D-Konformationen der Polypeptide oder immunogenen Fragmente oder Varianten der Erfindung zu stabilisieren, unter Verwendung von homobifunktionalen Vernetzern, wie bifunktionale Imidoester mit (CH₂)_n-Abstandsgruppen mit n = 1 bis n = 6, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester und heterobifunktionelle Reagentien, die üblicherweise eine aminoreaktive Einheit wie N-Hydroxysuccinimid und eine für eine andere Gruppe spezifische reaktive Einheit, wie eine Maleimido- oder Dithioeinheit oder Carbodiimid, enthalten. Ferner können Peptide konformationsmäßig beschränkt werden, beispielsweise durch die Einführung von Doppelbindungen zwischen C_α- und C_β-Atomen von Aminosäuren, durch Einbau von C_α- und N_α-Methylaminosäuren und durch die Bildung cyclischer Peptide oder Analoga durch Einführung kovalenter Bindungen, beispielsweise die Bildung einer Amidbindung zwischen den N- und C-Termini zwischen zwei Seitenkette oder zwischen einer Seitenkette und dem N- oder C-Terminus der Peptide oder Analoga. Beispielsweise kann verwiesen werden auf: Marlowe (1993, Biorganic & Medicinal Chemistry Letters 3: 347-44), der eine Peptidcyclisierung an einem TFA-Harz unter Verwendung von Trimethylsilyl(TMSE)ester als orthogonale Schutzgruppe beschreibt; Pallin und Tam (1995, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 2021-2022), die die Cyclisierung ungeschützter Peptide in wässriger Lösung durch Oximbildung beschreiben; Algin et al. (1994, Tetrahedron Letters 35: 9633-9636), die die Festphasensynthese von cyclischen Kopf-Schwanz-Peptiden über eine Lysinseitenketteverankerung offenbaren; Kates et al. (1993, Tetrahedron Letters 34: 1549-1552), die die Produktion cyclischer Kopf-Schwanz-Peptide durch dreidimensionale Festphasenstrategie beschreiben; Tumelty et al. (1994, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1067-1068), die die Synthese cyclischer Peptide ausgehend von einem irrmobilisierten aktivierten Zwischenprodukt beschreiben, wobei die Aktivierung des immobilisierten Peptids mit einer intakten N-Schutzgruppe durchgeführt wird und die anschließende Entfernung zur Cyclisierung führt; McMurray et al. (1994, Peptide Research 7: 195-206), der die Kopf-Schwanz-Cyclisierung von Peptiden, die an unlöslichen Trägern befestigt sind, mittels der Seitenketten Asparagin- und Glutaminsäure offenbaren; Hruby et al. (1994, Reactive Polymers 22: 231-241), die ein alternatives Verfahren zur Cyclisierung von Peptiden über feste Träger lehren; und Schmidt und Langer (1997, J. Peptide Res. 49: 67-73), die ein Verfahren zur Synthese von Cyclotetrapeptiden und Cyclopentapeptiden offenbaren. Die im vorhergehenden genannten Verfahren können zur Produktion konformationsmäßig beschränkter Polypeptide verwendet werden, die eine Immunantwort gegen Helicobacter und vorzugsweise gegen H. pylori auslösen.
Die Erfindung betrachtet ferner Polypeptide, immunogene Fragmente oder Varianten der Erfindung, die unter Verwendung üblicher molekularbiologischer Techniken so modifiziert wurden, dass deren Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau verbessert ist oder Löslichkeitseigenschaften optimiert sind oder diese als immunogene Mittel geeigneter sind.
2.5 Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung
Polypeptide der Erfindungen können durch jedes geeignete Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden. Beispielsweise können die Polypeptide durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Stufen:

– der Herstellung eines rekombinanten Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für das in einem von SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Polypeptid oder ein immunogenes Fragment desselben umfasst, oder einer Variante oder eines Derivats von diesen, wobei die Nucleotidsequenz funktional mit einem regulatorischen Polynucleotid verknüpft ist;
– des Einführens des rekombinanten Polynucleotids in eine geeignete Wirtszelle;
– des Kultivierens der Wirtszelle unter Expression eines rekombinanten Polypeptids von dem rekombinanten Polynucleotid und
– des Isolierens des rekombinanten Polypeptids, umfasst.

Günstigerweise umfasst die Nucleotidsequenz die in einem von SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Sequenz.
Das rekombinante Polynucleotid umfasst vorzugsweise entweder einen Expressionsvektor, der ein selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor wie ein Plasmid sein kann, oder einen Vektor, der in ein Wirtsgenom integriert wird.
Das regulatorische Nucleotid umfasst typischerweise Sequenzen zur transkriptionalen und translationalen Initiation und Termination, die allgemein für die zur Expression verwendete Wirtszelle geeignet sind. Zahlreiche Arten geeigneter Expressionsvektoren und verwendbarer regulatorischer Sequenzen sind für eine Vielzahl von Wirtszellen einschlägig bekannt.
Typischerweise umfasst das regulatorische Polynucleotid, ohne hierauf beschränkt zu sein, Promotorsequenzen, Leaderoder Signalsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, Transkriptionsstart- und -stoppsequenzen, Translationsstart- und -terminationssequenzen und Enhancer- oder Aktivatorsequenzen.
Konstitutive oder induzierbare Promotoren, die einschlägig bekannt sind, werden von der Erfindung in Betracht gezogen. Die Promotor können entweder natürlich vorkommende Promotoren oder Hybridpromotoren, die Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor ein selektierbares Markergen, um die Selektion transformierter Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind einschlägig bekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor pGEXStopIV^TM, das im folgenden vollständiger beschrieben ist.
Der Expressionsvektor kann auch einen Fusionspartner umfassen (der typischerweise durch den Expressionsvektor bereitgestellt wird), so dass das rekombinante Polypeptid der Erfindung als Fusionspolypeptid mit dem Fusionspartner exprimiert wird. Der Hauptvorteil von Fusionspartnern besteht darin, dass sie die Identifizierung und/oder Reinigung des Fusionspolypeptids unterstützen.
Um das Fusionspolypeptid zu exprimieren, ist es notwendig, ein Polynucleotid gemäß der Erfindung in den Expressionsvektor derart zu ligieren, dass die Translationsleseraster des Fusionspartners und des Polynucleotids zusammentreffen.
Bekannte Beispiele für Fusionspartner umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Glugathion-S-transferase (GST), den Fc-Teil von humanem IgG, Maltose-Bindungsprotein (MBP) und Hexahistidin (HIS₆), die zur Isolierung des Fusionspolypeptids durch Affinitätschromatographie besonders günstig sind. Für die Zwecke der Fusionspolypeptidreinigung durch Affinitätschromatographie sind relevante Matrizes für Affinitätschromatographie Glutathion-, Amylose- bzw. Nickel- oder Cobalt-konjugierte Harze. Viele derartige Matrizes sind in "Kit"-Form erhältlich, beispielsweise das QIAexpressTM-System (Qiagen), das mit (HIS₆)-Fusionspartfern verwendbar ist, und das Pharmacia GST Purification System.
Ein weiterer Fusionspartner, der einschlägig bekannt ist, ist das grün fluoreszierende Protein (GFP). Dieser Fusionspartner dient als Fluoreszenz-"Tag", das eine Identifizierung des Fusionspolypeptids der Erfindung durch Fluoreszenzmikroskopie oder durch Durchflusszytometrie ermöglicht. Das GFP-Tag ist verwendbar, wenn die subzelluläre Lokalisation des Fusionspolypeptids der Erfindung bestimmt wird, oder zur Isolierung von Zellen, die das Fusionspolypeptid der Erfindung exprimieren. Durchflusszytometrieverfahren, wie fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), sind bei dieser letzteren Anwendung besonders günstig.
Vorzugsweise weisen die Fusionspartner auch Proteasespaltungsstellen auf, beispielsweise für Faktor Xa oder Thrombin, die es ermöglichen, dass die relevante Protease das Fusionspolypeptid der Erfindung partiell verdaut und dadurch das rekombinante Polypeptid der Erfindung aus diesem freisetzt. Das freigesetzte Polypeptid kann dann aus dem Fusionspartner durch anschließende chromatographische Trennung isoliert werden.
Fusionspartner gemäß der Erfindung umfassen ferner innerhalb deren Umfang "Epitop-Tags", die üblicherweise kurze Peptidsequenzen sind, für die ein spezifischer Antikörper verfügbar ist. Bekannte Beispiele für Epitop-Tags, für die spezifische monoklonale Antikörper ohne weiteres verfügbar sind, umfassen c-Myc-, Influenzavirus-, Hämagglutinin- und FLAG-Tags.
Die Stufe der Einführung des rekombinanten Polynucleotids in die Wirtszelle kann durch jedes geeignete Verfahren, das Transfektion und Transformation umfasst, bewirkt werden, wobei die Wahl desselben von der verwendeten Wirtszelle abhängig ist. Derartige Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Rekombinante Polypeptide der Erfindung können durch Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der Nucleinsäure mit Codierung für ein Polypeptid, immunogenes Fragment, eine Variante oder ein Derivat gemäß der Erfindung enthält, produziert werden. Die zur Proteinexpression geeigneten Bedingungen variieren mit der Wahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle. Dies wird durch den Fachmann durch Routineversuche ohne weiteres festgestellt.
Geeignete Wirtszellen zur Expression können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Eine bevorzugte Wirtszelle zur Expression eines Polypeptids gemäß der Erfindung ist ein Bakterium. Das verwendete Bakterium kann Escherichia coli sein. Alternativ kann die Wirtszelle eine Insektenzelle, beispielsweise SF9-Zellen, sein, die mit einem Baculovirus-Expressionssystem verwendet werden kann.
Das rekombinante Protein kann günstigerweise durch einen Fachmann unter Verwendung von Standardprotokollen hergestellt werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989), insbesondere Abschnitte 16 und 17; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998), Insbesondere Kapitel 10 und 16; und Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), insbe sondere Kapitel 1, 5 und 6.
In einigen Fällen kann das rekombinante Polypeptid eine Rückfaltung erfordern. Verfahren zur Rückfaltung sind dem Fachmann geläufig.
Alternativ können die Polypeptide, Polypeptidfragmente oder Varianten oder Derivate der Erfindung unter Verwendung von Lösungssynthese oder Festphasensynthese synthetisiert werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Kapitel 9 von Atherton und Shepard (aaO).
3. Polynucleotide der Erfindung
3.1 Polynucleotide mit Codierung für einen C-terminalen Bereich von Helicobacter-Katalase
Die Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das für ein Polypeptid, immunogenes Fragment, eine Variante oder ein Derivat gemäß der obigen Definition codiert. Günstigerweise umfasst das Polynucleotid SEQ ID NO: 1. Wie im folgenden vollständiger beschrieben ist, entspricht SEQ ID NO: 1 Nucleotid 1365 bis Nucleotid 1769 des Katalasegens des H. pylori-Stamms RU-1, das unter der Hinterlegungsnummer U67458 der National Center for Biotechnology Information Entrez-Datenbank beschrieben ist (aaO). Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid SEQ ID NO: 3, das von dem Katalasegen des H. pylori-Stamms HP921023 abgeleitet ist.
3.2 Polynucleotidvarianten
Allgemein umfassen Polynucleotidvarianten gemäß der Erfindung Bereiche, die mindestens 60%, noch günstiger mindestens 70%, noch besser mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% Sequenzidentität gegenüber einer Referenzpolynucleotidsequenz identischer Größe ("Vergleichsfens ter") oder bei Vergleich mit einer alignierten Sequenz, wobei das Alignment durch ein einschlägig bekanntes Computerhomologieprogramm durchgeführt ist, zeigen. Was geeignete Varianten darstellt, kann durch herkömmliche Techniken bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Polynucleotid gemäß einem von SEQ ID NO: 1 oder 3 unter Verwendung von Zufallsmutagenese (beispielsweise Transposonmutagenese), oligonucleotidvermittelter (oder positionsspezifischer) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Variante oder Nichtvariantenversion eines isolierten natürlichen Promotors gemäß der Erfindung mutiert werden.
Oligonucleotidvermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Nucleotidsubstitutionsvarianten eines Polynucleotids der Erfindung. Diese Technik ist einschlägig bekannt, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Adelman et al. (1983, DNA 2: 183). Kurz gesagt wird eine DNA mit Codierung für einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase (beispielsweise SEQ ID NO: 1 oder 3) durch Hybridisieren eines Oligonucleotids mit Codierung für die gewünschte Mutation an eine Templat-DNA geändert, wobei das Templat die Einzelstrangform eines Plasmids oder Bakteriophagen, die die nichtgeänderte oder native DNA-Sequenz des C-terminalen Bereichs enthält, ist. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase zur Synthese eines vollständigen zweiten komplementären Strangs des Templats verwendet, der daher den Oligonucleotidprimer enthält und die gewählte Änderung in dem C-terminalen Bereich codiert.
Allgemein werden Oligonucleotide einer Länge von mindestens 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid weist 12 bis 15 Nucleotide auf, die vollständig komplementär zu dem Templat auf jeder Seite des Nucleotids bzw. der Nucleotide mit Codierung für die Mutation sind. Dies stellt sicher, dass das Oligonucleotid richtig an das einsträngige DNA-Templatmolekül hybridisiert.
Das DNA-Templat kann durch die Vektoren, die entweder von Bakteriophage-M13-Vektoren abgeleitet sind, oder die Vektoren, die einen einsträngigen Phagenreplikationsursprung gemäß der Beschreibung bei Viera et al. (19897, Methods Enzymol. 153: 3) enthalten, erzeugt werden. Daher kann die DNA, die mutiert werden soll, in einen der Vektoren insertiert werden, wobei ein einsträngiges Templat erzeugt wird. Die Herstellung eines einsträngigen Templats wird beispielsweise in den Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al. (1989, aaO) beschrieben.
Alternativ kann das einsträngige Templat durch Denaturierung eines doppelsträngigen Plasmids (oder einer anderen DNA) unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden.
Zur Änderung der nativen DNA-Sequenz wird das Oligonucleotid an das einsträngige Templat unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-Polymerisationsenzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dann zur Synthese des komplementären Strangs des Templats unter Verwendung des Oligonucleotids als Primer zur Synthese zugefügt. Ein Heteroduplexmolekül wird so derart gebildet, dass ein Strang der DNA für die mutierte Form des C-terminalen Bereichs der Katalase im Test codiert und der andere Strang (das ursprüngliche Templat) die native unveränderte Sequenz des C-terminalen Bereichs der Katalase im Test codiert. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle, üblicherweise einen Prokaryoten wie E. coli, transformiert. Nach dem Züchten der Zellen werden diese auf Agaroseplatten ausplattiert und unter Verwendung des Oligonucleotidprimers mit einer detektierbaren Markierung zur Identifizierung der Bakterienkolonien mit der mutierten DNA gescreent. Die erhaltenen mutierten DNA-Fragmente werden dann in geeignete Expressionswirte, wie E. coli, unter Verwendung herkömmlicher Technologie kloniert und Klone, die die gewünschte Antigenaktivität beibehalten, werden detektiert. Wenn die Klone unter Verwendung von Zufallsmutagenesetechniken abgeleitet wurden, müssen Klone sequenziert werden, um die Mutation zu detektieren.
Alternativ kann eine Linker-Scanning-Mutagenese von DNA zur Einführung von Clustern von Punktmutationen in eine interessierende Sequenz, die in einen Plasmidvektor kloniert wurde, verwendet werden. Beispielsweise kann verwiesen werden auf Ausubel et al., aaO (insbesondere Kapitel 8.4), der ein erstes Protokoll beschreibt, das komplementäre Oligonucleotide verwendet und eine singuläre Restriktionsstelle in der Nachbarschaft des Bereichs, in dem eine Mutagenese durchgeführt werden soll, erfordert. Eine zusammengehörige Reihe von Deletionsmutationen wird zunächst in dem Bereich erzeugt. Ein Paar komplementärer Oligonucleotide wird synthetisiert, um die Lücke in der interessierenden Sequenz zwischen dem Linker am Deletionsendpunkt und der nahegelegenen Restriktionsstelle aufzufüllen. Die Linkersequenz ergibt tatsächlich die gewünschten Cluster von Punktmutationen, wenn sie über den Bereich bewegt oder "gescannt" wird, durch deren Position an den variierten Endpunkten der Deletionsmutationsreihe. Ein alternatives Protokoll wird ebenfalls von Ausubel et al., aaO, beschrieben, wobei dieses positionsspezifische Mutageneseverfahren zur Einführung von kleinen Clustern von Punktmutationen über den Targetbereich verwendet. Kurz gesagt werden Mutationen in eine Sequenz durch Denaturieren eines synthetischen Oligonucleotids, das eine oder mehrere Nichtübereinstimmungen mit der interessierenden Sequenz enthält, kloniert in einen einsträngigen M13-Vektor eingeführt. Dieses Templat wird in einem E. coli-dut^--ung^--Stamm gezüchtet, was den Einbau von Uracil in den Templatstrang ermöglicht. Das Oligonucleotid wird zu dem Templat denaturiert und mit T4-DNA-Polymerase verlängert, wobei eine doppelsträngige Heteroduplex erzeugt wird. Schließlich wird die Heteroduplex in einen E. coli-Stamm des Wildtyps eingeführt, was eine Replikation des Templatstrangs aufgrund des Vorhandenseins von purinfreien Stellen (die erzeugt werden, wo Uracil eingebaut ist) verhindert, wodurch Plaques erhalten werden, die nur mutierte DNA enthalten.
Bereichspezifische Mutagenese und gerichtete Mutagenese unter Verwendung von PCR können ebenfalls zur Konstruktion von Polynucleotidvarianten gemäß der Erfindung verwendet werden. Im Hinblick darauf kann verwiesen werden auf beispielsweise Ausubel et al., aaO, insbesondere Kapitel 8.2A und 8.5.
Alternativ können geeignete Polynucleotidsequenzvarianten der Erfindung nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden:

– Gewinnen eines Nucleinsäureextrakts aus einer Helicobacter-Art;
– Erzeugen von Primern, die optional degeneriert sind, wobei jeder einen Bereich eines Referenzpolynucleotids mit Codierung für einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase, vorzugsweise mit Codierung für die in einem von SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Sequenz umfasst; und
– Verwenden der Primer zur Amplifikation, über Nucleinsäureamplifikationstechniken, mindestens eines Amplifikationsprodukts ausgehend von dem Nucleinsäureextrakt, wobei das Amplifikationsprodukt einer Polynucleotidvariante entspricht.

Geeignete Nucleinsäureamplifiationstechniken sind dem Fachmann geläufig und sie umfassen Polymerasekettenreaktion (PCR), beispielsweise gemäß der Beschreibung in Ausubel et al. (aaO); Strangaustauschamplifikation (SDA), beispielsweise gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 422 252 ; Rolling-Circle-Replikation (RCR), beispielsweise gemäß der Beschreibung in Liu et al. (1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594, und internationale Anmeldung WO 92/01813 ) und Lizardi et al. (internationale Anmeldung WO 97/19193 ); eine Amplifikation auf Nucleinsäuresequenzbasis (NASBA), beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Sooknanan et al. (1994, Biotechniques 17: 1077-1080); und Q-β-Replikase-Amplifikation, beispielsweise gemäß der Beschreibung bei Tyagi et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395-5400).
Typischerweise werden Polynucleotidvarianten, die im wesentlichen komplementär zu einem Referenzpolynucleotid sind, durch Blottingtechniken identifiziert, die eine Stufe, wodurch Nucleinsäuren auf einer Matrix (vorzugsweise einer synthetischen Membran wie Nitrocellulose) immobilisiert werden, umfassen, worauf eine Hybridisierungsstufe und eine Detektionsstufe folgen. Southern-Blotting wird zur Identifizierung einer komplementären DNA-Sequenz verwendet; Northern-Blotting wird zur Identifizierung einer komplementären RNA-Sequenz verwendet. Dot-Blotting und Slot-Blotting können zur Identifizierung von komplementären DNA/DNA-, DNA/RNA- oder RNA/RNA-Polynucleotidsequenzen verwendet werden. Derartige Techniken sind dem Fachmann geläufig und in Ausubel et al. (1994-1998, aaO) auf den Seiten 2.9.1 bis 2.9.20 beschrieben.
Gemäß derartigen Verfahren umfasst Southern-Blotting die Trennung von DNA-Molekülen entsprechend der Größe durch Gelelektrophorese, die Übertragung der nach der Größe getrennten DNA auf eine synthetische Membran und die Hybridisierung der membrangebundenen DNA mit einer komplementären Nucleotidsequenz, die radioaktiv, enzymatisch oder fluorochromatisch markiert ist. Bei Dot-Blotting und Slot-Blotting werden DNA-Proben direkt auf eine synthetische Membran vor einer Hybridisierung wie oben appliziert.
Eine alternative Blottingstufe wird verwendet, wenn komplementäre Polynucleotide in eine cDNA- oder Genom-DNA-Bibliothek, beispielsweise durch das Verfahren der Plaque- oder Koloniehybridisierung, identifiziert werden. Ein typisches Beispiel für dieses Verfahren ist in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Press, 1989) Kapitel 8-12 beschrieben.
Typischerweise kann das folgende allgemeine Verfahren zur Bestimmung von Hybridisierungsbedingungen verwendet werden. Polynucleotide werden auf eine synthetische Membran wie oben beschrieben geblottet/übertragen. Ein Referenzpolynucleotid, beispielsweise ein Polynucleotid der Erfindung, wird wie oben beschrieben markiert und die Fähigkeit dieses markierten Polynucleotids zur Hybridisierung mit einem immobilisierten Polynucleotid wird analysiert.
Ein Fachmann weiß, dass eine Zahl von Faktoren die Hybridisierung beeinflussen. Die spezifische Aktivität einer radioaktiv markierten Polynucleotidsequenz sollte typischerweise größer als oder gleich etwa 10⁸ dpm/mg sein, um ein detektierbares Signal zu erhalten. Eine radioaktiv markierte Nucleotidsequenz einer spezifischen Aktivität von 10⁸ bis 10⁹ dpm/mg kann etwa 0,5 pg DNA detektieren. Es ist einschlägig bekannt, dass ausreichend DNA auf der Membran immobilisiert sein muss, um eine Detektion zu ermöglichen. Es ist günstig, wenn immobilisierte DNA im Überschuss, üblicherweise 10 μg, vorliegen. Die Zugabe eines inerten Polymers, wie 10 (Gew/V) Dextransulfat (MG 500 000) oder Polyethylenglykol 6000, während der Hybridisierung kann ebenfalls die Empfindlichkeit der Hybridisierung erhöhen (siehe Ausubel, aaO bei 2.10.10).
Um Ergebnisse von Bedeutung durch die Hybridisierung zwischen einem auf einer Membran immobilisierten Polynucleotid und einem markierten Polynucleotid zu erhalten, muss eine ausreichende Menge des markierten Polynucleotids mit dem immobilisierten Polynucleotid nach dem Waschen hybridisiert werden. Waschen stellt sicher, dass das markierte Polynucleotid nur mit dem immobilisierten Polynucleotid mit einem gewünschten Komplementaritätsgrad zu dem markierten Polynucleotid hybridisiert wird.
Es ist klar, dass Polynucleotidvarianten gemäß der Erfindung mit einem Referenzpolynucleotid unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz hybridisieren. Der Verweis hierin auf Bedingungen niedriger Stringenz enthält und umfasst mindestens etwa 1% (V/V) bis mindestens etwa 15% (V/V) Formamid und mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz zur Hybridisierung bei 42 °C und mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz zum Waschen bei 42 °C. Bedingungen niedriger Stringenz umfassen auch 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS zur Hybridisierung bei 65 °C und (i) 2 × SSC, 0,1% SDS; oder (ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS zum Waschen bei Raumtemperatur.
Günstigerweise hybridisieren die Polynucleotidvarianten mit einem Referenzpolynucleotid unter Bedingungen von mindestens mittlerer Stringenz. Der Verweis hierin auf Bedingungen mittlerer Stringenz enthält und umfasst mindestens etwa 16% (V/V) bis mindestens etwa 30% (V/V) Formamid und mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz zur Hybridisierung bei 42 °C und mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz zum Waschen bei 42 °C. Bedingungen mittlerer Stringenz können ferner 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS zur Hybridisierung bei 65 °C und (i) 2 × SSC, 0,1% SDS; oder (ii) 0,5 % BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS zum Waschen bei 42 °C umfassen.
Vorzugsweise hybridisieren die Polynucleotidvarianten mit einem Referenzpolynucleotid unter Bedingungen hoher Stringenz. Bedingungen hoher Stringenz enthalten und umfassen mindestens etwa 31% (V/V) bis mindestens etwa 50% (V/V) Formamid und mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz zur Hybridisierung bei 42 °C und mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz zum Waschen bei 42 °C. Bedingungen hoher Stringenz können ferner 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7 % SDS zur Hybridisierung bei 65 °C und (i) 0,2 × SSC, 0,1% SDS; oder (ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH 7,2), 1% SDS zum Waschen bei einer Temperatur von mehr als 65 °C umfassen.
Andere stringente Bedingungen sind einschlägig bekannt. Ein Fachmann weiß, dass verschiedene Faktoren manipuliert werden können, um die Spezifität der Hybridisierung zu optimieren. Die Optimierung der Stringenz der letzten Waschvorgänge kann zum Sicherstellen eines hohen Hybridisierungsgrads dienen. Für detaillierte Beispiele siehe Ausubel et al., aaO, auf den Seiten 2.10.1 bis 2.10.16, und Sambrook et al. (1989, aaO) in den Abschnitten 1.101 bis 1.104.
Zwar werden stringente Waschvorgänge typischerweise bei einer Temperatur von etwa 42 °C bis 68 °C durchgeführt, doch ist dem Fachmann klar, dass andere Temperaturen für stringente Bedingungen geeignet sein können. Eine maximale Hybridisierung erfolgt typischerweise bei etwa 20 °C bis 25 °C unter der T_m zur Bildung eines DNA-DNA-Hybrids. Es ist einschlägig bekannt, dass T_m die Schmelztemperatur oder eine Temperatur, bei der zwei komplementäre Polynucleotidsequenzen dissoziieren, ist. Verfahren zur Bestimmung von T_m sind einschlägig bekannt (siehe Ausubel et al., aaO, auf Seite 2.10.8).
Allgemein wird Waschen bei T = 69,3 + 0,41 (G + C)% -12°C durchgeführt. Jedoch nimmt T_m einer Duplex-DNA mit jeder Zunahme der Zahl nichtpassender Basenpaare um 1% um 1 °C ab.
In einem bevorzugten Hybridisierungsverfahren wird eine Membran (beispielsweise eine Nitrocellulosemembran oder eine Nylonmembran), die immobilisierte DNA enthält, über Nacht bei 42 °C in einem Hybridisierungspuffer [50% entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon und 0,1% Rinderserumalbumin), 0,1% SDS und 200 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA)], der markierte Sonde enthält, hybridisiert. Die Membran wird dann zwei aufeinander folgenden Waschvorgängen mittlerer Stringenz (d. h. 2 × SSC/0,1% SDS über 15 min bei 45 °C, anschließend 2 × SSC/0,1% SDS über 15 min bei 50 °C) und anschließend zwei aufeinanderfolgenden Waschvorgängen hoher Stringenz (d. h. 0,2 × SSC/0,1% SDS über 12 min bei 55 °C und anschließend 0,2 × SSC und 0,1% SDS-Lösung über 12 min) unterzogen.
Verfahren zur Detektion eines markierten Polynucleotids, das mit einem immobilisierten Polynucleotid hybridisiert ist, sind Praktikern auf dem Fachgebiet geläufig. Derartige Verfahren umfassen Autoradiographie, Phosphorimaging und Chemilumineszenz-, Fluoreszenz- und kolorimetrische Detektion.
4. Antigenbindende Moleküle
Die Erfindung betrachtet ferner antigenbindende Moleküle gegenüber den im vorhergehenden genannten Polypeptiden, Fragmenten, Varianten und Derivaten. Beispielsweise können die antigenbindenden Moleküle ganze polyklonale Antikörper umfassen. Derartige Antikörper können beispielsweise durch Injektion eines Polypeptids, Fragments, einer Variante oder eines Derivats gemäß der Erfindung in eine Produktionsart, die Mäuse oder Kaninchen umfassen kann, hergestellt werden, wobei polyklonale Antiseren erhalten werden. Verfahren zur Produktion polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann geläufig. Beispiele für Protokolle, die verwendet werden können, sind beispielsweise in Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley Sons, Inc, 1991) und Ausubel et al. (1994-1998, aaO), insbesondere Abschnitt III von Kapitel 11, beschrieben.
Anstelle der in der Produktionsspezies erhaltenen polyklonalen Antiseren können monoklonale Antikörper unter Verwendung des Standardverfahrens, das beispielsweise bei Köhler und Milstein (1975, Nature 256, 495-497) beschrieben ist, oder durch jüngere Modifikationen desselben, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Coligan et al. (1991, aaO), durch immortalisierende Milz- oder andere antikörperproduzierende Zellen, die von einer Produktionsspezies abgeleitet sind, die mit einem oder mehreren der Polypeptide, Fragmente, Varianten oder Derivate der Erfindung inokuliert wurde, produziert werden.
Die Erfindung betrachtet ferner als antigenbindende Moleküle Fv-, Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Immunglobulinfragmente.
Alternativ kann das antigenbindende Molekül ein synthetisches stabilisiertes Fv-Fragment umfassen. Beispiele für Fragmente dieses Typs umfassen Einzelketten-Fv-Fragmente (sFv, häufig als scFv bezeichnet), in denen ein Peptidlinker zur Verbrückung des N-Terminus oder C-Terminus einer V_H-Domäne mit dem C-Terminus bzw. N-Terminus einer V_L-Domäne verwendet wird. ScFv fehlen alle konstanten Teile von ganzen Antikörpern und sie sind nicht zur Aktivierung des Komplements fähig. Geeignete Peptidlinker zur Verbindung der V_H- und V_L-Domänen sind diejenigen, die es ermöglichen, dass sich die V_H- und V_L-Domänen zu einer einzigen Polypeptidkette mit einer Antigenbindungsstelle mit einer dreidimensionalen Struktur, die ähnlich der Antigenbindungsstelle des ganzen Antikörpers, von dem das Fv-Fragment abgeleitet ist, ist, falten. Linker mit den gewünschten Eigenschaften können durch das Verfahren gemäß der Offenbarung in US-Patent 4 946 778 erhalten werden. Jedoch ist in einigen Fällen kein Linker vorhanden. ScFvs können beispielsweise gemäß Verfahren hergestellt werden, die in Krebber et al. (1997, J. Immunol. Methods, 201 (1): 35-55) angegeben sind. Alternativ können sie durch Verfahren gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 091 513 , EP-239 400 oder den Artikeln von Winter und Milstein (1991, Nature 349: 293) und Plückthun et al. (1996, In "Antibody engineering: A practical approach", 203-252) hergestellt werden.
Alternativ umfasst das synthetische stabilisierte Fv-Fragment ein disulfidstabilsiertes Fv (dsFV), in dem Cysteinreste in die V_H- und V_L-Domänen derart eingeführt sind, dass die zwei Reste in dem vollständig gefalteten Fv-Molekül eine Disulfidbindung zwischen diesen bilden. Geeignete Verfahren zur Herstellung von dsFv sind beispielsweise in (Glockscuther et al., Biochem. 29: 1363-1367; Reiter et al. 1994, J. Biol. Chem. 269: 18327-18331; Reiter et al. 1994, Biochem. 33: 5451-5459; Reiter et al. 1994, Cancer Res. 54: 2714-2718; Webber et al. 1995, Mol. Immunol. 32: 249-258) beschrieben.
Ebenfalls als antigenbindende Moleküle werden einzelne Domänen der variablen Region (als dAbs bezeichnet) betrachtet, beispielsweise gemäß der Offenbarung in Ward et al. 1989, Nature 341: 544-546; Hamers-Casterman et al. 1993, Nature, 363: 446-448; Davies & Riechmann, 1994, FERS Lett. 339: 285-290.
Alternativ kann das antigenbindende Molekül einen "Minikörper" umfassen. Im Hinblick darauf sind Minikörper kleine Versionen ganzer Antikörper, die in einer Einzelkette die wesentlichen Elemente eines ganzen Antikörpers codieren. Günstigerweise besteht der Minikörper aus den V_H- und V_L-Domänen eines nativen Antikörpers, die an die Gelenkregion und CH3-Domäne des Immunglobulinmoleküls fusioniert sind, beispielsweise gemäß der Offenbarung in US-Patent 5 837 821 .
In einer alternativen Ausführungsform kann das antigenbindende Molekül nicht von Immunglobulin abgeleitete Proteingerüste umfassen. Beispielsweise kann verwiesen werden auf Ku & Schultz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 652-6556, das ein Vier-Helix-Bündelprotein-Cytochrom b562 mit zwei randomisierten Schleifen unter Erzeugung komplementaritätsbestimmender Regionen (CDRs), die auf Antigenbindung selektiert wurden, offenbart.
Das antigenbindende Molekül kann mehrwertig sein (d. h. mehr als eine Antigenbindungsstelle aufweisen). Derartige mehrwertigen Moleküle können für ein oder mehrere Antigene spezifisch sein. Mehrwertige Moleküle dieses Typs können durch Dimerisierung von zwei Antikörperfragmenten durch ein Cysteinyl enthaltendes Peptid hergestellt werden, beispielsweise gemäß der Offenbarung durch Adams et al., 1993, Cancer Res. 53: 4026-4034; Cumber et al., 1992, J. Immunol. 149: 120-126. Alternativ kann eine Dimerisierung durch Fu sinn der Antikörperfragmente an amphiphile Helices, die von Natur aus dimerisieren, (Pack P. Plünckthun, 1992, Biochem. 31: 1579-1584) oder durch die Verwendung von Domänen (wie die Leucin-Zipper jun und fos), die vorzugsweise heterodimerisieren, (Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553) ermöglicht werden. In einer alternativen Ausführungsform kann das mehrwertige Molekül einen mehrwertigen Einzelkettenantikörper (multi-scFv), der mindestens zwei scFvs umfasst, die durch einen Peptidlinker zusammengekoppelt sind, umfassen. Im Hinblick darauf können nichtkovalent oder kovalent verknüpfte scFv-Dimere, die als "Diabodies" bezeichnet werden, verwendet werden. Multi-scFvs können in Abhängigkeit von der Zahl der verwendeten scFvs, die verschiedene Antigenbindungsspezifitäten aufweisen, bispezifisch oder noch mehrfacher spezifisch sein. Multi-scFvs können beispielsweise durch Verfahren gemäß der Offenbarung in US-Patent 5 892 020 hergestellt werden.
Die antigenbindenden Moleküle der Erfindung können für Affinitätschromatographie bei der Isolierung von natürlicher oder rekombinanter Helicobacter-Katalase verwendet werden. Beispielsweise kann verwiesen werden auf Immunaffinitätschromatographieverfahren gemäß der Beschreibung in Kapitel 9.5 von Coligan et al. (1995-1997, aaO).
Die antigenbindenden Moleküle können zum Screening von Expressionsbibliotheken auf variante Polypeptide gemäß der Erfindung verwendet werden. Sie können auch zur Detektion einer Helicobacter-Infektion, vorzugsweise H. pylori-Infektion, wie im folgenden beschrieben ist, verwendet werden.
5. Detektion von Helicobacter
Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Helicobacter in einem Patienten kann durch Isolieren einer biologischen Probe von dem Patienten, Mischen eines oben beschriebenen antigenbindenden Moleküls mit der biologischen Probe unter Bildung eines Gemischs und Detektion eines spezifisch gebundenen antigenbindenden Moleküls in dem Gemisch, das das Vorhandensein von Helicobacter in der Probe anzeigt, bestimmt werden.
Jede geeignete Technik zur Bestimmung der Bildung des Komplexes kann verwendet werden. Beispielsweise kann ein antigenbindendes Molekül gemäß der Erfindung, das eine damit verbundene Markierung aufweist, in Immunoassays verwendet werden. Derartige Immunoassays umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Radioimmunoassays (RIAs), enzymgekoppelte Immunosorptionsassays (ELISAs) und immunchromatographische Techniken (ICTs), die dem Fachmann geläufig sind. Beispielsweise kann verwiesen werden auf "CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY" (1994, aaO), das eine Vielzahl von Immunoassays offenbart, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Immunoassays können kompetitive Assays, die einschlägig bekannt sind, umfassen.
Die Markierung, die mit dem antigenbindenden Molekül assoziiert ist, kann das folgende umfassen:

(a) die direkte Anbringung der Markierung an dem antigenbindenden Molekül;
(b) eine indirekte Anbringung der Markierung an dem antigenbindenden Molekül, d. h. die Anbringung der Markierung an einem anderen Testreagens, das anschließend an das antigenbindende Molekül bindet; und
(c) die Anbringung an einem anschließenden Reaktionsprodukt des antigenbindenden Moleküls.

Die Markierung kann aus einer Gruppe ausgewählt sein, die ein Chromogen, einen Katalysator, ein Enzym, ein Fluoro chrom, ein chemilumineszierendes Molekül, ein Lanthanoidion, wie Europium (Eu³⁴), ein Radioisotop und eine direkte optische Markierung umfasst.
Im Falle einer direkten optischen Markierung kann ein kolloides Metall- oder Nichtmetallteilchen, ein Farbstoffteilchen, ein Enzym oder ein Substrat, ein anderes Vesikel, das eine signalproduzierende Substanz enthält, und dgl. eingesetzt werden.
Eine große Zahl von Enzymen, die zur Verwendung als Markierungen geeignet sind, ist in den Beschreibung der US-Patente US 4 366 241 , US 4 843 000 und US 4 849 338 offenbart. Geeignete Enzymmarkierungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen alklische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Luciferase, β-Galactosidase, Glucoseoxidase, Lysozym, Malatdehydrogenase und dgl. Die Enzymmarkierung kann allein oder in einer Kombination mit einem zweiten Enzym, das in Lösung ist, verwendet werden.
Geeignete Fluorochrome umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), R-Phycoerythrin (RPE) und Texas Red. Andere Beispiele für Fluorochrome umfassen die von Dower et al. (International Publication WO 93/06121 ) diskutierten. Verwiesen werden kann auch auf die Fluorochrome gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5 573 909 (Singer et al.), 5 326 692 (Brinkley et al.). Alternativ kann verwiesen werden auf die Fluorochrome gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5 227 487 , 5 274 113 , 5 404 975 , 5 433 896 , 5 442 045 , 5 451 663 , 5 453 517 , 5 459 276 , 5 516 864 , 5 648 270 und 5 723 218 .
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zur Detektion einer Infektion von Patienten durch Helicobacter, wobei das Verfahren die Stufen des Inkontaktbringen einer biologischen Probe von einem Patienten mit einem Polypeptid, Fragment, einer Variante oder einem Derivat gemäß der Erfindung und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Komplexes zwischen dem Polypeptid, Fragment, der Variante oder dem Derivat und Helicobacterspezifischen Antikörpern in dem Serum umfasst, wobei das Vorhandensein des Komplexes die Infektion anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Detektion des obigen Komplexes durch eine detektierbare Modifikation des Polypeptids, Fragments, der Variante oder des Derivats mit einer geeigneten Markierung, wie einschlägig bekannt ist, und unter Verwendung einer derartigen modifizierten Verbindung in einem geeigneten Immunoassay, der beispielsweise oben beschrieben ist, durchgeführt.
6. Zusammensetzungen
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung der Polypeptide, Fragmente, Varianten oder Derivate der Erfindung ("immunogene Mittel") als Aktivstoffe zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer Zusammensetzung zum Schutz oder zur Behandlung von Patienten vor einer Helicobacter-Infektion und vorzugsweise vor einer H. pylori-Infektion.
In Abhängigkeit von dem speziellen Verabreichungsweg kann eine Vielzahl pharmazeutisch akzeptabler Träger, die einschlägig bekannt sind, verwendet werden. Diese Träger können aus Zuckern, Stärkearten, Cellulose und deren Derivaten, Malz, Gelatine, Talkum, Calciumsulfat, pflanzlichen Ölen, synthetischen Ölen, Polyolen, Alginsäure, phosphatgepufferten Lösungen, Emulgatoren, isotonischer Kochsalzlösung und apyrogenem Wasser gewählt werden.
Jeder geeignete Verabreichungsweg kann zur Versorgung eines Patienten mit der Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann eine orale, rektale, parenterale, sublinguale, bukkale, intravenöse, intraartikuläre, intramuskuläre, intradermale, intranasale, subkutane, Inhalations-, intraokuläre, intragastrale, intraperitoneale, intrazerebroventrikuläre, transdermale Verabreichung und dgl. verwendet werden. Eine intramuskuläre und subkutane Injektion ist beispielsweise zur Verabreichung von immunogenen Zusammensetzungen, Vakzinen und DNA-Vakzinen geeignet. Vorzugsweise, wobei dies jedoch nicht wesentlich ist, wird die Zusammensetzung intranasal, oral und/oder intragastral und vorzugsweise in Verbindung mit einem Mucosa-Adjuvans, wie hierin beispielsweise beschrieben, verabreicht.
Dosierungsformen umfassen Tabletten, Dispersionen, Suspensionen, Injektionen, Lösungen, Sirupe, Pastillen, Kapseln, Suppositorien, Aerosole, transdermale Pflaster und dgl. Diese Dosierungsformen können auch die Injektion oder Implantation von Vorrichtungen mit gesteuerter Freisetzung, die speziell für diesen Zweck gestaltet sind, oder anderen Implantatformen, die derart modifiziert wurden, dass sie zusätzlich in dieser Weise wirken, umfassen. Die gesteuerte Freisetzung des therapeutischen Mittels kann durch Beschichten desselben mit beispielsweise hydrophoben Polymeren, die Acrylharze, Wachse, höhere aliphatische Alkohole, Polymilch- und Polyglykolsäuren und bestimmte Cellulosederivate, wie Hydroxypropylmethylcellulose, umfassen, bewirkt werden. Ferner kann eine gesteuerte Freisetzung durch Verwendung von anderen Polymermatrizes, Liposomen und/oder Mikrokügelchen bewirkt werden.
Ein immunogenes Mittel der Erfindung kann dem Wirt oral verabreicht werden. Zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignete Zusammensetzungen können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Säckchen oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge von einem oder mehreren immunogenen Mitteln gemäß der Erfindung enthalten, als Pulver oder Granulatkörnchen oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit, nichtwässrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion präsentiert werden. Derartige Zusammensetzungen können durch ein beliebiges Verfahren der Pharmazie hergestellt werden, doch umfassen alle Verfahren die Stufe, ein oder mehrere immunogene Mittel wie oben beschrieben mit dem Träger, der einen oder mehrere notwendige Bestandteile bildet, in Verbindung zu bringen. Allgemein werden die Zusammensetzungen durch gleichförmiges und inniges Mischen der immunogenen Mittel der Erfindung mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beiden und dann, falls nötig, Formen des Produkts zu der gewünschten Präsentation hergestellt.
Die obigen Zusammensetzungen können in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise und in einer Menge, die zum Schützen oder zur Behandlung von Patienten vor einer Helicobacter-Infektion immunogen wirksam ist, verabreicht werden. Die einem Patienten verabreichte Dosis sollte im Kontext der vorliegenden Erfindung ausreichend sein, um eine vorteilhafte Antwort in einem Patienten über die Zeit, beispielsweise eine Verringerung der Menge von Helicobacter, hervorzurufen, oder eine Infektion durch Helicobacter zu hemmen. Die zu verabreichende Menge des immunogenen Mittels bzw. der immunogenen Mittel kann von dem zu behandelnden Subjekt abhängen, was das Alter, Geschlecht, Gewicht und den allgemeinen Gesundheitszustand desselben umfasst. Im Hinblick darauf hängen genaue Mengen des immunogenen Mittels bzw. der immunogenen Mittel zur Verabreichung von der Beurteilung des Arztes ab. Bei der Beschreibung der wirksamen Menge des zu verabreichenden immunogenen Mittels bei der Behandlung oder Prophylaxe von Helicobacter kann der Arzt zirkulierende Plasmaspiegel, die Progression der Erkrankung und die Produktion von anti-Helicobacter-Antikörpern beurteilen. Auf jeden Fall kann ein Fachmann ohne weiteres geeignete Dosierungen der immunogenen Mittel der Erfindung bestimmen. Derartige Dosierungen können in einer Größenordnung von Nanogramm bis Milligramm des immunogenen Mittels der Erfindung liegen.
Die obigen Zusammensetzungen können als therapeutische oder prophylaktische Vakzine verwendet werden. Daher erstreckt sich die Erfindung auf die Produktion von Vakzinen, die als aktive Stoffe ein oder mehrere der immunogenen Mittel der Erfindung enthalten. Jedes geeignete Verfahren zur Herstellung derartiger Vakzine wird in Betracht gezogen. Beispiele für Verfahren umfassen beispielsweise die gemäß der Beschreibung in NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hongkong).
Ein immunogenes Mittel gemäß der Erfindung kann mit anderen Antigenen, die B- oder T-Zellepitope anderer Antigene umfassen, gemischt, konjugiert oder fusioniert sein. Ferner kann es mit einem Träger wie im folgenden beschrieben konjugiert sein.
Wenn ein Haptenpeptid verwendet wird (d. h. ein Peptid, das mit ererbten Antikörpern reagiert, jedoch selbst keine Immunantwort auslösen kann), kann es mit einem immunogenen Träger konjugiert werden. Verwendbare Träger sind einschlägig bekannt und umfassen beispielsweise Thyroglobulin; Albumine wie humanes Serumalbumin; Toxine, Toxoide oder ein beliebiges mutiertes kreuzreaktives Material (CRM) des Toxins von Tetanus, Diphtherie, Keuchhusten, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus und Streptococcus; Polyaminosäuren, wie Poly(lysin:glutaminsäure); Influenza; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 und VP2; Hepatitis-B-Virus-Kernprotein; ein rekombinantes Vakzin des Hepatitis-B-Virus und dgl. Alternativ kann ein Fragment oder Epitop eines Trägerproteins oder eines anderen immunogenen Proteins verwendet werden. Beispielsweise kann ein Haptenpeptid an ein T-Zellepitop eines bakteriellen Toxins, Toxoids oder CRM gekoppelt werden. Im Hinblick darauf kann auf US-Paten 5 785 973 verwiesen werden.
Ferner kann ein Polypeptid, Fragment, eine Variante oder ein Derivat der Erfindung als Trägerprotein in Vakzinzusammensetzungen, die gegen Helicobacter, vorzugsweise gegen H. pylori oder gegen andere Bakterien oder Viren gerichtet sind, fungieren.
Die immunogenen Mittel der Erfindung können als mehrwertige Untereinheitenvakzine in Kombination mit anderen Helicobacter-Immunogenen, wie Urease oder das Lipopolysaccharid (LPS) von Helicobacter-Bakterien, verabreicht werden (siehe die internationale Patentanmeldung PCT/AU95/00077). Alternativ oder zusätzlich können sie konzertiert mit immunologisch aktiven Antigenen gegen andere pathogene Spezies, beispielsweise die pathogenen Bakterien H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae, und dgl. verabreicht werden.
Die Vakzine können auch ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel oder Streckmittel, wie Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und Kochsalzlösung, enthalten.
Die Vakzine und immunogenen Zusammensetzungen können ein Adjuvans, das einschlägig bekannt ist, umfassen. Geeignete Adjuvantien umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, oberflächenaktive Substanzen, wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Octadecylaminosäureester, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dicoctadecyl-N',N' -bis(2-hydroxyethyl-propandiamin), Methoxyhexydecylglycerin und Pluronic-Polyole; Polyamine, wie Pyran, Dextransulfat, Poly-IC-carbopol; Peptide, wie Muramyldipeptid und Derivate, Dimethylglycin, Tuftsin; Ölemulsionen; und Mineralgele, wie Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun; Lymphokine und QuilA.
Vorzugsweise ist das Adjuvans ein Mucosa-Adjuvans. Ein derartiges Adjuvans wird optional und vorzugsweise mit einem immunogenen Mittel bzw. immunogenen Mitteln der Erfindung verabreicht. Vorzugsweise ist das Mucosa-Adjuvans Choleratoxin. Andere Mucosa-Adjuvantien als Choleratoxin, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen nichttoxische Derivate von Choleratoxin, wie die B-Teileinheit (CTB), chemisch modifiziertes Choleratoxin oder verwandte Proteine, die durch Modifikation der Aminosäuresequenz von Choleratoxin produziert werden. Diese können zu einem immunogenen Mittel bzw. immunogenen Mitteln der Erfindung gegeben werden oder mit diesen konjugiert werden. Die gleichen Techniken können auf andere Moleküle mit Mucosa-Adjuvans- oder -Zuführungseigenschaften, wie das hitzelabile Escherichia coli-Toxin, angewandt werden. Andere Verbindungen mit Mucosa-Adjuvans- oder -Zuführungsaktivität können verwendet werden, beispielsweise Galle; Polykationen, wie DEAE-Dextran und Polyornithin; Detergentien, wie Natriumdodecylbenzolsulfat; lipidkonjugierte Materialien; Antibiotika, wie Streptomycin; Vitamin A; und andere Verbindungen, die die Struktur- oder funktionale Integrität von Schleimhautoberflächen verändern. Andere schleimhautaktive Verbindungen umfassen Derivate von Mikroorganismenstrukturen, wie MDP; Acridin und Cimetidin.
Die immunogenen Mittel der Erfindung können in ISCOMS (immunstimulierenden Komplexen), ISCOMS, die CTB enthalten, Liposomen oder verkapselt in Verbindungen, wie Acrylaten oder Poly(DL-lactid-coglykosid) unter Bildung von Mikrokügelchen einer Größe, die zur Adsorption durch M-Zellen geeignet ist, zugeführt werden. Alternativ können Mikro- oder Nanoteilchen kovalent an Moleküle wie Vitamin B12, die spezifische Darmrezeptoren aufweisen, gebunden werden. Das Polypeptid, Fragmente, Varianten oder Derivate der Erfindung können auch in Ölemulsionen eingearbeitet und oral zugeführt werden. Eine ausführliche, wenn auch nicht erschöpfende Liste von Adjuvantien findet sich in Cox und Coulter (Cox und Coulter, 1992, Advances in adjuvant technology and application. In "Animal Parasite control Using Biotechnology". Herausgegeben von W. K. Yong. Veröffentlicht von CRC Press).
Die immunogenen Mittel der Erfindung können durch abgeschwächte virale Wirte exprimiert werden. Ein Virus kann durch ein geeignetes physikalisches Mittel (beispielsweise eine Wärmebehandlung) der chemische Mittel (beispielsweise Formaldehydbehandlung) substantiell avirulent gemacht werden. Idealerweise wird die Infektivität des Virus zerstört, ohne die Proteine, die die Immunogenität des Virus tragen, zu beeinflussen. Durch das Vorhergehende wird angenommen, dass abgeschwächte virale Wirte lebende Viren oder inaktivierte Viren umfassen können.
Abgeschwächte virale oder bakterielle Wirte, die in einem Vakzin gemäß der Erfindung verwendbar sein können, können virale Vektoren, die Adenovirus, Cytomegalovirus und vorzugsweise Pockenviren wie Vaccinia umfassen (siehe beispielsweise Paoletti und Panicali, US-Patent 4 603 112 ), und abgeschwächte Salmonella-Stämme (siehe beispielsweise Stocker, US-Patent 4 550 081 ) umfassen.
Lebende Vakzine sind insbesondere vorteilhaft, da sie zu einem längeren Reiz führen, der eine substantiell lang andauernde Immunität verleihen kann. Daher können als Alternative zur Zufuhr der immunogenen Mittel in der Form einer therapeutischen oder prophylaktischen Vakzinzusammensetzung diese Mittel dem Wirt unter Verwendung eines lebenden Vakzinvektors, insbesondere unter Verwendung lebender rekombinanter Bakterien, Viren oder anderer lebender Mittel, die das für die Expression des Polypeptids, immunogenen Fragments, einer Variante oder einem Derivat der Erfindung notwendige Genmaterial als fremdes Antigen enthalten, zugeführt werden. Insbesondere wurden Bakterien, die den Gastrointestinaltrakt besiedeln, wie Salmonella, Yersinia, Vibrio, Escherichia und BCG, als Vakzinvektoren entwickelt und diese und andere Beispiele werden bei Holmgren et al. (1992, Immunobiol. 184: 157-179) und McGhee et al. (Vaccine 10 (2): 75-88) diskutiert.
Mehrwertige Vakzine können aus einem oder mehreren Mikroorganismen, die verschiedene Epitope von Helicobacter (beispielsweise andere Oberflächenproteine oder Epitope von Helicobacter) exprimieren, hergestellt werden. Ferner können Epitope anderer pathogener Mikroorganismen in das Vakzin eingearbeitet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst dies die Konstruktion eines rekombinanten Vaccinia-Virus zur Expression einer Nucleinsäuresequenz gemäß der Erfindung. Bei Einführung in einen Wirt exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das immunogene Mittel und es löst dadurch eine Wirt-CTL-Antwort aus. Beispielsweise kann verwiesen werden auf das US-Patent 4 722 848 , das Vaccinia-Vektoren und bei Immunisierungsprotokollen verwendbare Methoden beschreibt.
Eine Vielzahl anderer Vektoren, die zur therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung mit den immunogenen Mitteln der Erfindung verwendbar sind, sind dem Fachmann aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Polynucleotid der Erfindung als Vakzin in der Form eines Vakzins mit "nackter DNA", das einschlägig bekannt ist, verwendet werden. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor der Erfindung in einem Säuger eingeführt werden, wo er die Produktion eines Polypeptids in vivo bewirkt, gegen das der Wirt eine Immunantwort bildet, beispielsweise gemäß der Beschreibung in M. Barry et al. (1995, Nature, 377: 632-635).
7. Detektionskits
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Kits zur Detektion von Helicobacter in einer biologischen Probe bereit. Diese enthalten ein oder mehrere Mittel, die oben beschrieben sind, in Abhängigkeit von der Natur des verwendeten Testverfahrens. Im Hinblick darauf können die Kits eine oder mehrere Komponenten aus einem Polypeptid, Fragment, einer Variante, einem Derivat oder antigenbindenden Molekül gemäß der Erfindung umfassen. Die Kits können auch optional geeignete Reagentien zur Detektion von Markierungen, positiven und negativen Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer und dgl. umfassen.
Damit die Erfindung ohne weiteres verstanden und in der Praxis durchgeführt werden kann, werden nun spezielle bevorzugte Ausführungsformen mittels der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung eines Vektors, der einen C-terminalen Bereich von H. pylori-Katalase exprimiert
Ein Katalaseklon voller Länge, der von einem Klon einer H. pylori-Bibliothek abgeleitet ist, (Stamm H2921023) wurde als Templat zur PCR-Amplifikation des 3'-Fragments von 402 bp unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer verwendet:
Das erhaltene PCR-Produkt wurde stumpf in den TA Cloning Vector pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Er wurde anschließend unter Verwendung der durch PCR eingeführten Restriktionsstellen BstZl71 und BglII in die entsprechenden Stellen in dem Vektor pGEXSTOPIV^TM subkloniert, wobei eine 3'-Hexahistidin codierende Fusion erzeugt wurde.
pGEXSTOPIV^TM ist eine weitere modifizierte Version des Vektorkonstrukts gemäß der Beschreibung in Edwards et al. (1998, Recent Research Developments in Biotechnology and Bioengineering 1: 343-356), wobei Sequenzen zwischen den EcoRI- und BglII-Stellen entfernt und durch eine neue Ribosombindungsstelle und eine Polylinkersequenz unter Verwendung von denaturierten Oligonucleotiden ersetzt wurden, wobei die Sequenz 5'GAATTCAATTAAAAATTAACGAGGTATACTAGTGGTACCAGATCT3' erzeugt wurde. Ferner trägt dieser Vektor eine Kan^R-Kassette von pUC4k (Pharmacia Biotech), die in die SalI-Stelle kloniert ist.
Die klonierte Katalasevariante wurde ausgehend von beiden Strängen unter Verwendung des im Handel erhältlichen 5'pGex-Primer (Pharmacia Biotech, 5'GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3') sowie eines spezifisch synthetisierten Oligonucleotidprimers, der strangabwärts des Kan^R-Gens bindet, 5'CAGCAACACCTTCTTCACG3', sequenziert. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Katalasegenfragments sind in SEQ ID NO: 3 bzw. 4 angegeben.
Eine kleinskalige Expression (10 ml) in dem E. coli-Stamm ER1793 wurde nach Induktion mit 1 mM IPTG über die Zeit überwacht. Analyse durch SDS-PAGE zeigte sichtbare Mengen von induziertem Protein der erwarteten Größe (~17 kDa), doch schien es über die Zeit zunehmend gekürzt/abgebaut, wobei wenig nach einer Induktion über Nacht zurückblieb. Western-Blots unter Verwendung von 11 verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die gegen Katalase voller Länge gebildet waren, (CA5-8E3, CA5-5C2-1C7, CA5-7D2-1C2, CA5-5B2-1B8, CA5-7B8-2F3, CA5-7D7-1C3, CA5-7D7-2F4, CA5-1E10-1E11, CA5-1E9-1C3, CA5-5G7-1B7, CA5-8B8-1F3) zeigten, dass das rekombinante Protein von den letzten vier erkannt wird. Ein Western-Blot, der mit dem monoklonalen Antikörper CA5-8B8-1F3 sondiert wurde, ist in 1 angegeben.
Bei Berücksichtigung der offensichtlichen Proteininstabilität in ER1793 wurde die klonierte DNA in einen alternativen Expressionsstamm, E. coli BL21, dem 2 Hauptproteasen, OmpT und Lon, fehlen, transformiert. Die Expression in diesem Wirt ergab ein weitaus stabileres Produkt, das nach einer Induktion über Nacht von voller Länge zu bleiben schien. Die BL21-Transformante wurde zum Scale-up (1 L) und zur Proteinreinigung unter Verwendung des C-terminalen Hexahistidin-Tags für Metallaffinitätschromatographie verwendet. Eluiertes Protein wurde gegen TNG dialysiert (0,05 M Tris-HCl/0,5 M NaCl/8% Glycerin/pH 7,4), um Imidazol zu entfernen. Es wurde auch auf einer PVDF-Membran zur anschließenden N-terminalen Sequenzierung weiterverarbeitet. Die N-terminale Sequenzanalyse des gereinigten Proteins ergab, dass es die erwartete Sequenz MQNGYY umfasste.
BEISPIEL 2
Demonstration der therapeutischen Wirksamkeit des C-terminalen Bereichs von H. pylori-Katalase
Kurz gesagt wurde der Vektor von Beispiel 1 zur Expression eines Polypeptids verwendet, das im wesentlichen aus einem C-terminalen Bereich von H. pylori-Katalase bestand. Dieses Polypeptid wurde Extraktions- und Reinigungsverfahren, die Metallaffinitätschromatographie umfassten, unterzogen. Das partiell gereinigte Katalasefragment wurde dann auf therapeutische Aktivität in zwei verschiedenen Mausmodellen einer Helicobacter pylori-Infektion (C57BL/6- und BALG/c-Mausstämme, die mit dem H. pylori-Stamm 551 infiziert waren) unter Verwendung von zwei verschiedenen Verabreichungswegen (intranasal und intragastral) getestet.
Vektorzüchtung und Fragmentreinigung
Das folgende Verfahren zur Reinigung eines Katalasefragments beruht auf einer induzierten Kultur von einem Liter. Das Verfahren ist im wesentlichen das im pET System Manual (Novagen) angegebene.

• Inokulieren von 100 ml TB/Kan mit CSL1458 und Züchten bei 37 °C, Schütteln, O/N
• Subkultivieren von 1/10 in 2 × 500 ml TB/Kan in 2-1-Kolben und Züchten bei 37 °C, Schütteln
• Bei A₆₀₀ ~ 2–3 Induktion mit 0,5 mM IPTG
• Ernten der Zellen ~ 5 h nach der Induktion und Aufbewahren bei –80 °C, falls nötig
• Resuspendieren der Zellen in 80 ml BB, das Complete^TM EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (Boehringer Mannheim) enthält
• Aufbrechen der Zellen durch Ultraschallbehandlung in 2 × 40-ml-Losen
• Ultraschallbehandlung auf Eis über insgesamt 3 min, 10 s an/20 s Ruhen
• Zentrifugieren des Lysats mit 39000 × g über 20 min zur Entfernung von Zellabfall
• Chargenweises Binden von löslichem Überstand mit ~ 12 ml Qiagen Ni-NTA-Agaroseaufschlämmung (= 6 ml Harz): 4 °C; Rühren, 90 min, über Nacht
• Beladen der Säule (30 ml, Biorad), RT
• Waschen mit 10 Volumina BB (~ 60 ml)
• Waschen mit 6 Volumina WB (~ 36 ml)
• Eluieren mit EB, Sammeln von 2-ml-Fraktionen
• Analysieren der Fraktionen durch SDS PAGE
• Dialysieren gewünschter Fraktionen unter Rühren bei 4 °C gegen TNG unter Verwendung von Pierce Slide-A-Lyzer-Kassetten mit 10000 MG-Grenze.

Das Material in der Charge, die zum Testen in Hausmodellen einer H. pylori-Infektion wie im folgenden beschrieben verwendet wurde, wurde aus 6,5 1 Kultur erhalten, die von einer einzigen chromatographischen Fraktion (Nr. 6) mit einer Konzentration von 47,5 mg Protein/ml und Reinheit nach SDS-PAGE von etwa 70% gewonnen wurde.
Medien und Puffer

TB:

Terrific Broth, die 17 mM KH₂PO₄, 72 mM K₂HPO₄ enthält

Kan:

Kanamycin mit 50 μg/ml

BB:

5 mM Imidazol/0,5 M NaCl/20 mM Tris-HC1 pH 7,9

WB:

60 mM Imidazol/0,5 M NaCl/20 mM Tris-HC1 pH 7,9

EB:

1 M Imidazol/0,5 M NaCl/20 mM Tris-HC1 pH 7,9

TNG:

0,05 M Tris-HCl/0,5 M NaCl/8% Glycerin/pH 7,4

Mäuse
80 weibliche, altersmäßig übereinstimmende C57BL/6- und BALB/c-Mäuse wurden von Biological Resources Centre, Sydney, erhalten und mit einem Alter von 6-8 Wochen verwendet.
Züchten von H. pylori-SS1 zur Impfung von Mäusen
Aliquots eines Stammmaterials von H. pylori-SS1 wurden bei –80 °C gehalten. Vor der Verwendung wurden die Bakterien durch Entfernen von Stammmaterial aus tiefem Frost wiederbelebt und bei 4 °C aufgetaut. Nach vollständigem Verflüssigen wurden 200 μl Suspension aseptisch über die gesamte Oberfläche von Horse Blood Agar (HBA)-Platten unter Verwendung eines sterilisierten Glasverteilers verteilt. Die Platten wurden "mit dem Gesicht nach oben" bei 37 °C 48 h in einem Steri-Cult^TM 200-Inkubator (Selby Scientific Ltd, NSW, Australien) mit 10% CO₂ und 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Große Mengen Bakterien zur Impfung von Mäusen wurden in Flüssigkultur hergestellt. Schrägkolben wurden zuvor durch Zugabe von 300 ml Brain Heart Infusion-Nährlösung (BHI) hergestellt und mit einem nichtabsorbierenden Baumwollpfropfen verschlossen. Der Kolben wurde dann 15 min bei 121 °C einer Autoklavbehandlung unterzogen, worauf die Zugabe von Skirrow's Antibiotic Supplement (600 μl) und Fungizone (150 μl) folgte, wobei diese aseptisch zugegeben wurden, und der Kolben wurde lose erneut mit dem Pfropfen verschlossen. Zwei Platten mit wiederbelebtem SSl wurden in jeden Kolben überführt, und dieser wurde in ein anaerobes Gefäß mit einem Gaserzeugungskit (Anaerobic System BR38, Oxoid) gegeben und 48 h bei 37 °C mit kontinuierlichem leichtem Schütteln inkubiert.
Nach der Inkubationsperiode wurde die Kultur auf Kontamination durch Lichtmikroskopie überprüft und in sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Sarstedt, Deutschland) dispergiert. Die Suspensionen wurden mit 2500 Umin^–1 10 min zentrifugiert und die Pellets wurden in BHI resuspendiert und unter einem Phasenkontrastlichtmikroskop untersucht, um Motilität und Kontaminationsfreiheit festzustellen.
Die Bakterien wurden unter einem Lichtmikroskop (400x) unter Verwendung eines Hämozytometers quantitativ bestimmt und auf etwa 10⁸ lebensfähige Organismen pro ml in BHI eingestellt. Die Mäuse wurden orogastral mit 100 μl dieser Suspension, ein Volumen, das 10⁷ Organismen enthielt, geimpft.
Introgastrale Sondenfütterung
Die Impfung von Mäusen mit Bakterien plus introgastrale Immunisierungen wurden wie im folgenden durchgeführt. Individuelle Mäuse wurden per Hand physisch festgehalten und durch Anwendung eines festen Griffs am Balg und Schwanz immobilisiert. Die Magensonde wurde in den Raum zwischen den linken Schneidezähnen und Mahlzähnen eingeführt und in kaudaler Richtung zum rechten Zweig der Mandibula geführt. Die Passage wurde allgemein durch das Einsetzen eines Schluckreflexes, wenn sich die Magensonde dem Kehlkopf näherte, erleichtert, was ein Vordringen in die Speiseröhre ermöglichte.
Der Nacken der Maus wurde leicht gestreckt, um eine gerade Linie zwischen der Speiseröhrenöffnung und dem Herzsphinkter zu bilden. Die Magensonde wurde die Speiseröhre hinunter in den Magen eingeführt und es wurde ein spezifisches Aliquot zugeführt. Die Zuführvorrichtung bestand aus einlumigem Polyethylenschlauchmaterial (Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,96 mm; Critchley Electrical Products Pty Ltd, Auburn, NSW), das mit einer hypodermischen Nadel Nr. 23 verbunden war. Die Magensondennadel war wiederum mit einer 1-ml-Tuberkulinspritze verbunden.
Aus dem vorhergehenden ist jedoch klar, dass eine intragastrale Verabreichung ein Verfahren zur Zufuhr der Formulierung zum Gastrointestinaltrakt ist und ohne weiteres durch eine orale Gabe in einer kooperativen Spezies ersetzt werden kann.
Infektion von Mäusen
80 C57BL/6-Mäuse und 80 BALB/c-Mäuse wurden intragastral mit zwei Dosen von 10 H. pylori-SS1 in 100 μl PBS infiziert, wobei jede der zwei Dosen im Abstand von zwei Tagen verabreicht wurde.
Therapeutische Immunisierung
Beide Mausstämme wurden in vier Gruppen aufgespalten, die aus jeweils 20 Tieren bestanden (im folgenden angegeben). Zwei Gruppen wurden intragastral mit entweder einer Kontrollzubereitung, die aus einem Choleratoxin-Adjuvans allein oder dem Polypeptid mit Choleratoxin-Adjuvans, die in Bicarbonat in einem Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt waren, bestand, immunisiert. Für intranasale Immunisierungen wurde ein Gesamtvolumen von 10 μl unter Verwendung einer P10-Eppendorfpipette zugeführt. Intranasale Zubereitungen wurden ebenfalls in Bicarbonat verdünnt. C57BL/6

Gruppe (n = 20) Weg Immunisierung

Intragastral Intragastral Intranasal Intranasal 10 μg CT 100 μg Cat-Fragment + 10 μg CT 10 μg CT 100 μg Cat-Fragment + 10 μg CT

BALG/c

Gruppe (n = 20) Weg Immunisierung

Intragastral Intragastral Intranasal Intranasal 10 μg CT 100 μg Cat-Fragment + 10 μg CT 10 μg CT 100 μg Cat-Fragment + 10 μg CT
Fünf Wochen nach der Infektion wurden vier therapeutische Immunisierungen in wöchentlichen Intervallen gemäß der obigen Tabelle durchgeführt.
Sammlung
Fünf Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mägen der Mäuse entfernt und die Bakterienlast in jedem Magen durch einen Koloniebildungstest festgestellt:
Zuvor gewogene Magenproben wurden in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und vor dem Ausplattieren auf Eis gehalten. Proben wurden in Kochsalzlösung 1:10¹, 1:10², 1:10³ und 1:10⁴ verdünnt und eine 200-μl-Probe jeder Verdünnung wurde über GSSA-Platten verteilt. Die Platten wurden bei 37 °C 5 Tage mit 10 CO₂ und 95 relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Bakterienlast wurde dann durch Zählen der Zahl wachsender Kolonien bestimmt.
Koloniebildende Einheiten wurden pro Gramm Magengewebe unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
Puffer und Lösungen 0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Natriumdihydrogenorthophosphat (NaH₂PO₄·2H₂O) 4,37 g/l

Dinatriumhydrogenorthoposphat, wasserfrei

(Na₂HPO₄) 10,22 g/l

Natriumchlorid (NaCl) 8,5 g/l
Die Salze wurden in destilliertem H₂O bis 90% des Gesamtvolumens gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt und das Volumen wurde in volumetrischer Glasware auf die Spezifikation gebracht. Die Lösung wurde in geeignete Glasbehälter dispensiert und durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Aliquots wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Horse Blond Agar

Horse Blond Agar (HBA) wird zur Reanimation von H. pylori aus gefrorenen Stammsuspensionen verwendet. Aufgrund der Nichtzugabe von antibiotischen Ergänzungen ist HBA ein guter Indikator für die frühe Detektion von kontaminierenden Stoffen aus Stammkulturen.

Blond Agar Base No. 2 (CM271, Oxoid,
Basingstoke, VK)	38,0 g/l
Defibrillated Whole Horse Blood (Oxoid,
Melbourne, Australien)	50,0 ml/l
Amphotericin B(Fungizone^®, Squibb, Princeton,
NJ, USA)	2,5 mg/l

Blond Agar Base-Pulver wurde genau abgewogen und sorgfältig mit destilliertem Wasser gemischt und auf das Volumen eingestellt. Die Lösung wurde in entsprechende Glasgefäße dispensiert und durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 min sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde sich in einem thermostatisierten Wasserbad langsam auf 46 °C abkühlen gelassen.
Horse Blond und Fungizone^® wurden aseptisch zu den Medien gegeben und leicht gemischt.
Aliquots von 20 ml wurden aseptisch in sterile 90-mm-Kunststoffpetrischalen (Techno-glas, SA, Australien) gegossen. Die Platten wurden mindestens 1 h abkühlen gelassen und dann dicht in Polyethylenhüllen verpackt, um Feuchtigkeit zurückzuhalten, und bei 4 °C "mit dem Gesicht nach oben" aufbewahrt. HBA-Platten wurden innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet.
Brain Heart Infusion-Nährlösung (BHI)

BHI-Nährlösung war das Medium zum Züchten von H. pylori zur In-vivo-Infektion und Bakterienimpfung von Mäusen.

Blond Agar Base No. 2 (CM271, Oxoid,
Basingstoke, VK)	38,0 g/l
Defibrillated Whole Horse Blond (Oxoid,
Melbourne, Australien)	50,0 ml/l
Amphotericin B (Fungizone^®, Squibb, Princeton,
NJ, USA)	2,5 mg/l
Skirrow's Selective Supplement	2,0 ml/l

Formulierung
Brain Heart Infusion-Pulver wurde genau abgewogen und sorgfältig mit destilliertem Wasser gemischt und auf das Volu men eingestellt. 300-ml-Aliquots von gelöstem BHI wurden in 1-1-Glasschrägkolben dispensiert und mit einem nichtabsorbierenden Baumwollpfropfen verschlossen und die Oberseite wurde mit durch Autoklavenband befestigter Aluminiumfolie bedeckt und dann wurde durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 h sterilisiert. Die präparierten Kolben (ausschließlich Serum und Antibiotika) wurden bei Raumtemperatur mit einer Lagerungsdauer von maximal 4 Wochen aufbewahrt. Skirrow's Selective Supplement

Vancomycin HCl (Eli Lilly & Co, West Ryde

Australien) 5 mg/ml

Polymyxin B Sulfate (Sigma, St Louis, MO, USA) 1250 U/ml

Trimethoprim (Sigma) 2,5 mg/ml
Formulierung

Trimethoprim wurde in minimal 95% Ethanol gelöst. Vancomycin und Polymyxin B wurden zugegeben und in sterilem destilliertem Wasser auf das Volumen eingestellt. Die Lösung wurde zu gewünschten Aliquots filtersterilisiert (0,22 μm Minisart^®, Sartorius, VIC, Australien) und bei –20 °C aufbewahrt. Campylobacter Selective Agar (CSA)

Blond Agar Base No. 2 (CM271, Oxoid,
Basingstoke, VK)	38,0 g/l
Defibrillated Whole Horse Blond (Oxoid,
Melbourne, Australien)	50,0 ml/l
Amphotericin B (Fungizone^®, Squibb, Princeton,
NJ, USA)	2,5 mg/1
Skirrow's Selective Supplement	2,0 ml/l

Formulierung
Blond Agar Base-Pulver wurde genau abgewogen und sorgfältig mit destilliertem Wasser gemischt und auf das Volumen eingestellt. Die Lösung wurde in entsprechende Glasgefäße dispensiert und durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 min sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde in einem thermostatisierten Wasserbad auf 46 °C abkühlen gelassen.
Horse Blond, Skirrow's Selective Supplement und Fungizone® wurden aseptisch zu dem Medium gegeben und sanft gemischt. Aliquots von 20 ml wurden aseptisch in sterile 90-mm-Kunststoffpetrischalen (Techno-plas^TM, SA, Australien) gegossen. Die Platten wurden härten gelassen, dann fest in Polyethylenhüllen gepackt, um Feuchtigkeit zurückzubehalten, und bei 4 °C aufbewahrt. CSA-Platten wurden innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet. Physiologische Kochsalzlösung

Natriumchlorid (NaCl) 8,5 g/l
Formulierung
Natriumchlorid wurde genau abgewogen und in destilliertem H₂O bis 90 des gesamten Volumens gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt und das Volumen wurde in volumetrischer Glasware auf die Spezifikation gebracht. Die Lösung wurde in entsprechenden Glasbehältern dispensiert und durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Aliquots wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Glaxo Selective Supplement Agar (GSSA)

Glaxo Selective Supplement Agar (GSSA) ist ein hochselektives Medium, das zur Kultur und Erkennung von koloniebildenden Einheiten von H. pylori als Test der In-vivo-Bakterienlast verwendet wird.

Blond Agar Base No. 2 (CM271, Oxoid,
Basingstoke, VK)	38,0 g/l
Defibrillated Whole Horse Blond (Oxoid,
Melbourne, Australien)	50,0 ml/l
Amphotericin B (Fungizone^®, Squibb, Princeton,
NJ, USA)	2,5 mg/l
Glaxo Selective Supplement A	1,5 ml/l
Glaxo Selective Supplement B	500 μl/l

Formulierung
Blond Agar Base-Pulver wurde genau abgewogen und sorgfältig mit destilliertem Wasser gemischt und auf das Volumen eingestellt. Die Lösung wurde in entsprechende Glasgefäße dispensiert und durch einen Autoklauen bei 121 °C und 100 kPa 15 min sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde in einem thermostatisierten Wasserbad auf 46 °C abkühlen gelassen.
Horse Blond, selektive Antibiotika und Fungizone^® wurden aseptisch zu dem Medium gegeben und sanft gemischt. Aliquots von 20 ml wurden aseptisch in sterile 90-mm-Kunststoffpetrischalen (Techno-glas, SA, Australien) gegossen. Die Platten wurden härten gelassen, dann fest in eine Polyethylenhülle verpackt, um Feuchtigkeit zurückzubehalten, und bei 4 °C "mit dem Gesicht nach oben" aufbewahrt.
GSSA-Platten wurden innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet.
Ergebnisse

Die Ergebnisse, die in den Tabellen 1-4 angegeben sind, sind als koloniebildende Einheiten (c.f.u.) pro ml pro Gramm Magengewebe, die wie oben beschrieben berechnet wurden, ausgedrückt. Die Kontrollgruppe und die Testgruppe sind für jede der vier getesteten Kombinationen angegeben: (1) C57BL/6, die intranasal immunisiert wurden; (2) C57BL/6, die intragastral immunisiert wurden; (3) BALG/c, die intranasal immunisiert wurden, und BALG/c, die intragastral immunisiert wurden. Tabelle 1

C57BL/6 Intranasal
CT (Negative Kontrolle)		Katalase-Fragment
Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)	Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)
1	1,685	1	0,092
2	3,603	2	0,196
3	10,241	3	0,265
4	1,392	4	0,045
5	18,182	5	0,163
6	1,283	6	0,013
7	14,384	7	0,107
8	1,503	8	0,044
9	14,65	9	0,315
10	3,278	10	0,357
11	3,02	11	0,23
12	9,009	12	0,146
13	10,909	13	1,667
14	1,667	14	0,296
15	1,779	15	0,062
16	13,918	16	0,494
17	4,795	17	0,124
		18	0,066
		19	0,32
		20	0,151

Tabelle 2

C57BL/6 Intragastral
CT (Negative Kontrolle)		Katalase-Fragment
Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)	Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)
1	2,24	1	0,263
2	2,34	2	0,056
3	2,5	3	0,193
4	1,89	4	1,284
5	1,69	5	0,463
6	2,45	6	1,627
7	2,36	7	0,831
8	1,86	8	1,733
9	3,54	9	0,451
10	1,94	10	2,989
11	3,33	11	0,253
12	2,55	12	0,853
13	3,1	13	1,533
14	3,18	14	0,176
15	2,27	15	2,167
16	3,06	16	1,348
17	1,69	17	0,548
18	2,64	18	1,329
19	2,85	19	0,463
20	2,86

Tabelle 3

BALG/c Intranasal
CT (Negative Kontrolle)		Katalase-Fragment
Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)	Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)
1	0,223	1	0,053
2	0,199	2	0,078
3	0,197	3	0,189
4	1,448	4	0,016
5	0,482	5	0,249
6	0,243	6	0,087
7	0,337	7	0,024
8	0,226	8	0,013
9	0,338	9	0,186
10	0,206	10	0,012
11	0,172	11	0,142
12	0,396	12	0,014
13	0,171	13	0,215
14	0,21	14	0,06
15	0,184	15	0,041
16	0,207	16	0,047
17	0,214	17	0,028
18	1,029	18	0,274
19	1,854	19	0,03
20	3,371

Tabelle 4

BALG/c Intragastral
CT (Negative Kontrolle)		Katalase-Fragment
Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)	Maus Nr.	C.F.U./g (×10⁶)
1	0,479	1	0,09
2	0,22	2	0,14
3	0,248	3	0,024
4	0,467	4	0,061
5	0,251	5	0,023
6	0,601	6	0,192
7	0,306	7	0,128
8	1,342	8	0,177
9	1,543	9	0,061
10	0,297	10	0,185
11	0,444	11	0,11
12	0,184	12	0,054
13	0,13	13	0,297
14	1,104	14	0,068
15	1,047	15	0,242
16	0,257	16	0,23
17	0,568	17	0,139
18	0,264	18	0,235
19	0,143	19	0,233
20	2,483

Analyse der Datensätze
T-Tests wurden an logarithmisch transformierten Daten durchgeführt. Die TABELLE 5 fasst die Ergebnisse für die t-Tests an den logarithmisch transformierten Daten zusammen: TABELLE 5

Stamm Weg t-Statistik df P-Wert

C57B-6 Intranasal 10,098 37 < 0,001

C57B-6 Intragastral 5,36 37 < 0,001

BALG/c Intranasal 5,862 37 < 0,001

BALG/c Intragastral 5,269 37 < 0,001
Daher bewirkte die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge des Katalase-Fragment-Polypeptids auf zwei verschiedenen Wegen in zwei verschiedenen Mausstämmen eine signifikante Verringerung des Grades einer Helicobacter pylori-Infektion in der behandelten Gruppe.
Alle Referenzpatente und -patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung angegeben sind, werden hierdurch in ihrer Gesamtheit als Bezug aufgenommen.
Durchgängig in der Beschreibung bestand das Ziel, die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu beschreiben, ohne die Erfindung auf eine Ausführungsform oder eine spezielle Sammlung von Merkmalen zu beschränken. Dem Fachmann ist daher klar, dass im Lichte der vorliegenden Offenbarung verschiedene Modifikationen und Änderungen in speziellen, als Beispiel angegebenen Ausführungsformen ohne Abweichen vom Umfang der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Alle derartigen Modifikationen und Änderungen sollen im Umfang der anhängenden Ansprüche umfasst sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, wobei das Polypeptid weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit humaner Katalase aufweist und einen Cterminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase mit weniger als 40% Aminosäuresequenzidentität mit einem entsprechenden C-terminalen Bereich von humaner Katalase, wobei der C-terminale Bereich die in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, oder eine Variante mit mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Helicobacter-Katalase eine Helicobacter pylori-Katalase ist.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid aus der in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder einem immunogenen Fragment derselben oder einer Variante mit mindestens 70% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder einem immunogenen Fragment derselben besteht.
Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, die ein Immunogen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel umfasst, wobei das Immunogen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Zusammensetzung ferner ein Adjuvans umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Adjuvans ein Mucosa-Adjuvans ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, die ferner mindestens ein zusätzliches Immunogen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das mindestens eine zusätzliche Immunogen mindestens ein weiteres Helicobacter-Antigen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das weitere Helicobacter-Antigen aus Helicobacter-Urease und Helicobacter-Lipopolysaccharid ausgewählt ist.
Verwendung eines Immunogens bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, wobei das Immunogen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Immunogen mit einem Adjuvans formuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Adjuvans ein Mucosa-Adjuvans ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Medikament zur intranasalen Verabreichung oder intragastralen Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der Wirt ein Mensch ist.
Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt, die einen Vektor, der ein Immunogen exprimiert, umfasst, wobei das Immunogen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist.
Zubereitung nach Anspruch 15, wobei der Vektor ein Bakterium ist, das den Gastrointestinaltrakt des Sängerwirts besiedelt.
Zubereitung nach Anspruch 16, wobei das Bakterium aus Salmonella-, Yersinia-, Vibrio-, Escherichia- und BCG-Bakterien ausgewählt ist.
Verwendung der Zubereitung nach Anspruch 15 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Sängerwirt.
Isoliertes Polynucleotid mit Codierung für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 19, wobei das Polynucleotid die in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Sequenz oder eine Polynucleotidvariante derselben umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 20, wobei die Polynucleotidvariante mindestens 60% Sequenzidentität mit dem in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid aufweist oder wobei die Polynucleotidvariante zur Hybri disierung mit dem durch SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz fähig ist.
Vektor, der ein Polynucleotid mit Codierung für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst, wobei das Polynucleotid funktional mit einem regulatorischen Polynucleotid verknüpft ist.
Vektor nach Anspruch 22, wobei das Polynucleotid die in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Sequenz oder eine Polynucleotidvariante derselben umfasst.
Vektor nach Anspruch 23, wobei die Polynucleotidvariante mindestens 60% Sequenzidentität mit dem in SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid aufweist oder wobei die Polynucleotidvariante zur Hybridisierung mit dem durch SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebenen Polynucleotid unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz fähig ist.
Wirtszelle, die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 19 bis 21 oder den Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 24 enthält.
Rekombinantes Polypeptid, das durch Expression des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 19 bis 21 oder des Vektors nach einem der Ansprüche 22 bis 24 in einer Wirtszelle hergestellt wird.
Verwendung eines Immunogens zur Ex-vivo-Produktion eines antigenbindenden Moleküls, das spezifisch an einen C-terminalen Bereich einer Helicobacter-Katalase bindet, wobei das Immunogen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist.
Verfahren zur Diagnostizierung einer Infektion von Patienten durch Helicobacter, das umfasst: – Inkontaktbringen einer biologischen Probe von einem Patienten mit einem Antigen, wobei das Antigen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist, und – Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Komplexes zwischen dem Antigen und Helicobacter-spezifischen Antikörpern in der Probe, wobei das Vorhandensein des Komplexes eine Infektion des Patienten durch Helicobacter anzeigt.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 zur Diagnostizierung einer Infektion von Patienten durch Helicobacter ex vivo.
Verfahren zur Identifizierung eines immunogenen Fragments des Polypeptids nach Anspruch 1, das umfasst: – Produzieren eines Fragments des Polypeptids, – Verabreichen des Fragments an einen Säuger und – Detektieren einer Immunantwort in dem Säuger, wobei die Antwort die Produktion von Elementen, die spezifisch an Helicobacter binden und eine Schutz- und/oder therapeutische Wirkung gegenüber einer Helicobacter-Infektion aufweisen, umfasst.