DE69534747T2

DE69534747T2 - Haemophilus influenzae (nt hi) lkp tip adhesin protein und nukleinsäure

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Publication number: DE69534747T2
Application number: DE69534747T
Authority: DE
Inventors: A. Bruce Pittsford GREEN; C. Charles Export BRINTON
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC; Bactex Inc
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC; Bactex Inc
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2015-07-14
Also published as: ES2257741T3; JP2001521361A; AU706937B2; PT771352E; CA2195090C; EP0771352A1; EP0771352B1; KR100391483B1; WO1996002648A1; JP2008067707A; DE69534747D1; CA2195090A1; DK0771352T3; ATE315648T1; AU3097295A

Description

Nicht-typisierbare Haemophili influenzae (NTHi) sind hauptsächlich nicht-invasive Krankheitserreger des menschlichen Respirationstrakts. NTHi können im Respirationstrakt als Kommensalen vorliegen oder lokale Infektionen hervorrufen, umfassend Otitis media, Bronchitis, Sinusitis und selten Pneumonie, (Bluestone, C. D., und J. O. Klein, in: Pediatric Otolaryngology 356 (1983); Bluestone und Stool, Hrsg., W. B. Saunders Co., Philadelphia; Musher, D. M., et al., Ann. Intern. Med. 99: 344–350, 1983). Verschiedene mögliche Adhärenzfaktoren wurden für die Adhärenz von Haemophilus influenzae (sowohl typisierbaren als auch nicht-typisierbaren) an menschliche Zellen beschrieben, umfassend vier Klassen von Fimbriae/Pili und zwei Proteine mit einem hohen Molekulargewicht, die eine Ähnlichkeit mit dem filamentösen Hämagglutinin von Bordetella pertussis aufweisen (St. Geme, J. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2875–2879, 1993). Pili sind bakterielle Oberflächenantigene. Sie sind Protein-Anhängsel, die aus einer helikalen symmetrischen Zusammenlagerung von Haupt-Protein-(Pilin-)Untereinheiten bestehen. Einige Pili können auch zwei bis drei Neben-Proteine enthalten, die an ihren Spitzen angeordnet sind. Eines dieser Proteine, Adhäsin, enthält die aktive Stelle für die Pilus-Adhäsion an spezifische Membranrezeptoren auf menschlichen und tierischen Zellen.
Eine Klasse von Pili/Fimbriae wurde gründlich untersucht, hierbei handelt es sich um die Familie der langen dicken Pili („long thick pili") (LKP). LKP-Pili werden sowohl durch typisierbare als auch durch nicht-typisierbare H. influenzae (Hib) exprimiert. Die Pili in dieser Familie weisen eine charakteristische Morphologie und eine teilweise gemeinsame Adhäsionsspezifität auf, außerdem haben ihre Strukturproteine Aminosäuresequenzen gemeinsam. Diese Pili sind hämagglutinationspositiv und vermitteln die Anheftung an menschliche Schleimhautzellen (Brinton, C. C., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8, Suppl.: 54–61, 1989). Die Hämagglutination von menschlichen Erythrocyten wird durch Bindung an das Blutgruppenantigen AnWj erreicht, während an der Bindung an Epithelzellen ein Sialinsäure-enthaltender Lactosylceramid-Rezeptor beteiligt ist (van Alphen, L., et al., Infect. Immun. 69: 4473–4477, 1991).
Die LKP-Familie wurde aufgrund der Reaktivität gegenüber polyclonalen Antiseren, die gegen gereinigte Pili hervorgebracht wurden, in verschiedene Stamm-spezifische Serotypen eingeteilt. Zwischen den Pili-Serotypen wurde eine geringe Kreuzreaktivität festgestellt (Brinton, C. C., et al., Pediatric Infect. Dis. J. 8, Suppl.: 54–61, 1989).
Durch Hemmen oder Blockieren der LKP-Pilus-vermittelten Adhäsion von H. influenzae an Zellen können H. influenzae-Krankheiten verhindert werden. Im Chinchilla-Modell wurde gezeigt, dass gereinigte intakte LKP-Pili mögliche Kandidaten für Impfstoffe gegen eine NTHi-Otitis-media sind, wobei sie einen Schutz gegen eine Infektion mit NTHi-Stämme verleihen, die den homologen Pili-Serotyp enthalten (Karasic, R., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8, (Erg.): S62–65, 1988). Da jedoch der Schutz Pilus-spezifisch ist, müsste ein Impfstoff für einen umfassenden Schutz multivalent sein, wobei er die meisten in der natürlichen Population von Krankheitserregern häufig vorkommenden Serotypen von Pili umfassen müsste. LKP-Pilin-Strukturgene wurden von verschiedenen Gruppen cloniert und sequenziert (Coleman, T., et al., Infect. Immun. 59: 1716–1722, 1991; Formey, L. J., et al., Infect. Immun. 59: 1991–1996, 1991; Kar, S., et al., Infect. Immun. 58: 903–908, 1990; van Ham, S. M., et al., EMBO J. 8: 3535–3540, 1989), jedoch wurden nur die Gene identifiziert, die für die Pili-Serotypen 1 und 4 verantwortlich sich.
Wir beschreiben die Isolierung, Clonierung und Sequenzierung des Pilin-Gens für den Pili-Serotyp 5 von Haemophilus influenzae (1), die Sequenzierung des gesamten LKP1-Operons, das in Tabelle 5 dargestellt ist, und die Clonierung der LKP10-, LKP11- und LKP12-Pili. Wir beschreiben DNA-Moleküle (hier auch als DNA-Sequenzen oder Nucleinsäuresequenzen bezeichnet), die Proteine codieren, welche H. influenzae-LKP umfassen, insbesondere ein Tip-Adhäsin-Protein. Außerdem beschreiben wir DNA-Moleküle, die in der Lage sind, mit den DNA-Sequenzen des Haemophilus influenzae-Genoms zu hybridisieren, die mit den Pili im Zusammenhang stehen. Die hier beschriebenen DNA-Moleküle können in einem Verfahren eingesetzt werden, mit dem eine Probe, z.B. eine Blutprobe, auf das Vorliegen von Haemophilus influenzae getestet wird. Die hier beschriebenen DNA-Moleküle können demgemäß als ein Mittel für die Diagnose eingesetzt werden.
Außerdem werden rekombinante Haemophilus influenzae-Pili-Proteine und -Peptide, spezifisch ein Tip-Adhäsin-Protein, beschrieben. Die Proteine oder Peptide können für die Herstellung von Antikörpern, sowohl polyclonalen als auch monoclonalen, eingesetzt werden, die fähig sind, mit den H. influenzae-Pili-Proteinen zu reagieren (d.h. die daran binden), und sie können in diagnostischen Tests eingesetzt werden, um das Vorliegen von Haemophilus influenzae-Antikörpern z.B. in einer Blutprobe nachzuweisen. Solche Antikörper können auch als Impfstoffe in Verfahren der passiven Immunisierung verwendet werden.
Die beschriebenen Proteine und Peptide können auch in Verfahren zum Immunisieren eines Säugers, z.B. eines Menschen, gegen eine Haemophilus influenzae-Infektion und somit als Impfstoff zur Verhinderung von mit Haemophilus influenzae zusammenhängenden Krankheiten, z.B. Otitis media, eingesetzt werden. Insbesondere kann aufgrund der hier dargestellten DNA- und Aminosäuresequenzen ein Adhäsin-Protein- oder -Peptid-Impfstoff konstruiert werden, der in Säugern schützende Antikörper gegen H. influenzae induzieren kann.
1 ist eine graphische Darstellung der konservierten Regionen der Proteine, die durch Pilin-Gene der H. influenzae-Serotypen 1, 4 und 5 codiert werden (SEQ ID NO: 1 bis 3).
Die 2A, 2B und 2C sind schematische Darstellungen der physikalischen Karten, die durch Restriktionsenzymspaltung von Vektoren, die LKP-Inserte enthalten, erhalten wurden.
3 zeigt die Aminosäuresequenz des LKP1-Fusionsproteins. Der unterstrichene Bereich gibt die partielle Aminosäuresequenz des LKP-Tip-Adhäsin-Proteins an, der mit dem Maltose-bindenden Protein fusioniert wurde.
4 ist ein Foto eines Gels, welches die Identifizierung des LKP1-Tip-Adhäsin-Proteins durch Antikörper, die fähig sind, mit dem Fusionsprotein von LKP1-Tip-Adhäsin-MBP zu reagieren, in durch Western-Blots erhaltenen Membranen zeigt. Bahnen 1 und 2: verschiedene Präparate von gereinigten LKP1-Pili mit Tip-Protein (47 Kd) (eine positive Reaktion zwischen dem Tip-Protein und dem Antikörper wurde gezeigt); Bahn 3: gereinigte LKP10-Pili mit Tip-Adhäsin (47 Kd) (das Tip-Protein reagiert nicht mit dem Antikörper); Bahn 4: gereinigte LKP11-Pili mit Tip-Protein (47 Kd) (das Tip-Protein reagiert nicht mit dem Antikörper); Bahn 5: Protein-Molekulargewichts-Marker.
5 ist ein Foto eines Gels, welches die Bindungsaktivität von LKP1-Tip-Adhäsin an menschliche Erythrocyten-(HRC-)Ghosts zeigt. Bahn 1: Molekulargewichts-Marker; Bahn 2: gereinigte LKP1-Pili mit Tip-Protein; Bahn 3: die Pili mit HRC-Ghosts nach einer Zentrifugation. Die Tip-Protein-Bande (47 Kd) verschwand aufgrund der Bindung von Tip-Adhäsin-Pili an das Ghosts-Pellet. Bahn 4: HRC-Ghosts nach einer Zentrifugation, die als Kontrolle dienten; Bahn 5: gereinigte Pili ohne Tip-Protein (behandelt mit 1% SDS) wurden mit frischen Ghosts inkubiert, wobei sie das gleiche Muster der Proteinbanden wie das Muster von Bahn 3 zeigten; Bahn 6: gereinigte Pili ohne Tip-Protein. Die Pili wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 1% SDS behandelt, gründlich in 25 mM Tris-Puffer, pH 8,0, dialysiert, durch PEG plus NaCl kristallisiert und in 25 mM Tris-Puffer, pH 8,0, erneut solubilisiert.
6 ist ein Foto eines Gels, welches die Bindungsaktivität des gereinigten LKP1-Tip-Adhäsin-Proteins an menschliche Erythrocyten-Ghosts zeigt. Bahn 1: Molekulargewichts-Marker; Bahn 2: gereinigtes Tip-Adhäsin-Protein mit einem Molekulargewicht von 47 Kd, wobei das Protein durch 0,1% SDS in 100 mM Glycin-Puffer, pH 2,0, entfernt wurde; Bahn 3: gereinigtes Adhäsin wurde mit frischen menschlichen Erythrocyten-Ghosts inkubiert und abzentrifugiert, anschließend wurde der Überstand auf das Gel aufgetragen. Die Tip-Adhäsin-Bande verschwand aufgrund der Bindung an die HRC-Ghosts; Bahn 4: gereinigtes Adhäsin wurde mit gekochten HRC-Ghosts inkubiert und abzentrifugiert, anschließend wurde der Überstand auf das Gel aufgetragen. Hier war die Adhäsin-Bande mit 47 Kd zu sehen, dies macht deutlich, dass das Tip-Adhäsin-Protein nicht an das Ghosts-Pellet bindet; Bahn 5: Überstand frischer Ghosts nach einer Zentrifugation; dieser wurde als Kontrolle eingesetzt; Bahn 6: Überstand gekochter HRC-Ghosts nach einer Zentrifugation, wobei ein anderes Muster löslicher Proteine als das von frischen HRC-Ghosts zu sehen ist, dieses Präparat wurde als eine weitere Kontrolle eingesetzt; Bahn 7: anderes Präparat des gereinigten Tip-Proteins, inkubiert mit frischen HRC-Ghosts, das die Bindung zwischen dem Tip-Protein und dem Pellet frischer HRC-Ghosts zeigt; Bahn 8: anderes Präparat des gereinigten Tip-Proteins, inkubiert mit gekochten HRC-Ghosts, das zeigt, dass das Tip-Protein nicht an die denaturierten Ghosts bindet. Das Gel wurde mit Silber gefärbt.
7 ist ein Foto eines Gels, das Adhäsin-Proteine aus Pili unterschiedlicher LKP-Typen mit dem gleichen Molekulargewicht zeigt. Bahn 1: Molekulargewichts-Marker; Bahn 2: LKP10-Pili; Bahn 3: LKP11-Pili und Bahn 4 bis 6: verschiedene gereinigte Präparate von LKP1-Pili. Die Proteine wurden mit Silber gefärbt.
Hier werden erstmalig die Clonierung des Pilin-Gens von Haemophilus influenzae Serotyp 5 sowie die Sequenz des gesamten LKP1-Operons (Tabelle 5, SEQ ID NO: 4) und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für sechs offene Leseraster (SEQ ID NOs: 5 bis 10) beschrieben. Das LKP1-Operon, wie in Tabelle 5 dargestellt, besteht aus fünf getrennten Genen, die hipP (das Pilin-Gen), hipC (das periplasmatische Chaperon-Gen), hipR (das Membrananker-Gen), hipM (das Gen des Tip-assoziierten Neben-Proteins) und hipA (das Tip-Adhäsin-Gen) genannt werden. Diese fünf Gene werden hier auch als hifA (für hipP), hifB (für hipC), hifC (für hipR), hifD (für hipM) und hifE (für hipA) bezeichnet. Außerdem liegen auf dem LKP1-Operon ein Integrase-Gen und ein Peptidase-Gen vor. Die Proteine, die durch diese Gene des LKP1-Operons codiert werden, und das LKP5-Pilin-Protein werden insgesamt hier als die H. influenzae-Pili-Proteine bezeichnet.
Hier werden isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuresequenzen beschrieben, welche die H. influenzae-Pili-Proteine oder biologisch aktive Fragmente davon codieren. In der Verwendung hier werden Nucleinsäuren auch als DNA und RNA oder DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen oder DNA-Moleküle und RNA-Moleküle bezeichnet. Nucleinsäuren, die hier als „isoliert" bezeichnet werden, sind Nucleinsäuren, die von den Nucleinsäuren der genomischen DNA oder der zellulären RNA des ursprünglichen Präparats (z.B. wie sie in Zellen oder in einem Gemisch von Nucleinsäuren, z.B. einer Bank, vorliegen) abgetrennt wurden, und können noch weiter bearbeitet worden sein. „Isolierte" Nucleinsäuren umfassen Nucleinsäuren, die durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zum Herstellen isolierter Nucleinsäuren und durch hier beschriebene Verfahren erhalten wurden. Diese isolierten Nucleinsäuren umfassen im Wesentlichen reine Nucleinsäuren, Nucleinsäuren, die durch eine chemische Synthese oder durch Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren produziert wurden, und rekombinante Nucleinsäuren, die isoliert vorliegen.
Nucleinsäuren, die hier als „rekombinant" bezeichnet sind, sind Nucleinsäuren, die durch DNA-Rekombinations-Verfahren produziert wurden, umfassend diejenigen Nucleinsäuren, die durch Verfahren erzeugt werden, die auf einer Methode der künstlichen Rekombination beruhen, z.B. durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Clonierung in einen Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen. „Rekombinante" Nucleinsäuren sind auch solche, welche die Folge von Rekombinationsereignissen sind, die anhand der natürlichen Mechanismen der Zellen stattfinden, nach denen jedoch selektiert wird, nachdem in die Zellen Nucleinsäuren eingeführt wurden, die so entworfen wurden, dass ein gewünschtes Rekombinationsereignis zugelassen und wahrscheinlich gemacht wird.
Außerdem werden hier Nucleinsäuresequenzen (DNA- oder RNA-Sequenzen), die im Wesentlichen komplementär zu den hier beschriebenen DNA-Sequenzen von H. influenzae sind, und Nucleinsäuresequenzen beschrieben, die mit diesen DNA-Sequenzen unter Stringenz-Bedingungen hybridisieren, die nach Kenntnis des Fachmanns ausreichend sind, so dass DNA-Sequenzen mit einer wesentlichen Nucleinsäuresequenz-Identität identifiziert werden können. Man kann davon ausgehen, dass DNA-Sequenzen, die unter solchen stringenten Bedingungen identifiziert wurden, mit großer Wahrscheinlichkeit ein Protein (hier auch als ein Polypeptid oder Peptidfragment bezeichnet) mit der biologischen Aktivität der Pili-Proteine von H. influenzae codieren. Eine allgemeine Beschreibung von stringenten Hybridisierungsbedingungen findet sich in Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1989. Faktoren wie Sondenlänge, Basenzusammensetzung, prozentualer Anteil der Fehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Sequenzen, Temperatur und Ionenstärke beeinflussen die Stabilität von Nucleinsäure-Hybriden. So können Stringenz-Bedingungen, die zum Identifizieren weiterer H. influenzae-Pili-Proteine ausreichend sind (z.B. Bedingungen mit einer hohen oder mittleren Stringenz), empirisch bestimmt werden, z.T. abhängig von den Merkmalen der bekannten DNA, mit der andere unbekannte Nucleinsäuren auf eine Sequenzähnlichkeit verglichen werden.
In der Definition hier bedeutet im Wesentlichen komplementär, dass die Sequenz nicht die exakte Sequenz von z.B. Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) darstellen muss, dass sie jedoch in der Sequenzidentität ausreichend ähnlich sein muss, um mit Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Z.B. können nicht-komplementäre Basen oder längere oder kürzere Sequenzen unter der Voraussetzung in Sequenzen verteilt sein, dass die Sequenz ausreichend komplementäre Basen mit z.B. Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) besitzt, um damit zu hybridisieren.
Die DNA-Moleküle können vorzugsweise ein funktionelles oder biologisch aktives Pili-Protein codieren, z.B. das Pilin-Gen, hipP; das periplasmatische Chaperon, hipC; das Membrananker-Protein, hipR; das Tip-assoziierte Protein, hipM; und das hier beschriebene Tip-Adhäsin-Protein, hipP. Ein „funktionelles oder biologisch aktives Protein" ist hier als ein Protein definiert, das eine signifikante Identität (z.B. mindestens etwa 65%, vorzugsweise mindestens etwa 80% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95%) mit den entsprechenden Sequenzen des endogenen Proteins aufweist und eine oder mehrere Funktionen davon besitzt. Biologische Funktionen der Pili-Proteine von H. influenzae umfassen antigene, strukturelle und Adhäsionseigenschaften. Z.B. kann gezeigt werden, wie in Karasic, R., et al. (Karasic, R., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (Erg.): S62–65, 1988) beschrieben wird, dass Pili-Proteine sich an Schleimhautzellen und Erythrocyten anheften. Somit können solche Adhäsionseigenschaften, z.B. die Bindung an Erythrocyten, ein Maß für die biologische Aktivität darstellen. Außerdem wird hier beschrieben, dass die biologische Aktivität die Antigenität des Proteins oder Peptids umfassen kann, die zur Produktion von Antikörpern führt, welche an die Pili-Proteine binden können.
Die H. influenzae-Pili-Proteine umfassen die Proteine des LKP1-Operons und das hipP-Pilin-Protein des Serotyps 5 sowie Proteine, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die zu diesen Sequenzen analog sind. Solche Proteine sind hier als H. influenzae-Pili-Protein-Analoga oder Derivate definiert. Analoge Aminosäuresequenzen sind hier so definiert, dass sie Aminosäuresequenzen mit einer ausreichenden Identität der Aminosäuresequenz mit z.B. dem LKP1-Tip-Adhäsin- Protein darstellen, so dass sie die biologische Aktivität des Tip-Adhäsins besitzen. Die biologische Aktivität des Tip-Adhäsins kann z.B. die Fähigkeit des Tip-Adhäsins umfassen, an spezifische Membranrezeptoren auf menschlichen und tierischen Zellen zu binden, einschließlich der Bindung an native Erythrocyten-Ghost-Präparate.
Z.B. kann ein analoges Polypeptid mit „stummen" Änderungen in der Aminosäuresequenz hergestellt werden, wobei sich eine oder mehrere Aminosäurereste von den Aminosäureresten des LKP1-Adhäsins unterscheiden, das jedoch immer noch eine Adhäsions-Aktivität besitzt. Beispiele solcher Unterschiede umfassen Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Resten.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung analoge Proteine, die eine schwächere oder stärkere biologische Aktivität der Pili-Proteine der vorliegenden Erfindung zeigen.
Ferner beschreiben wir biologisch aktive Proteine oder biologisch aktive Fragmente der H. influenzae-Pili-Proteine. Solche Fragmente können nur einen Teil der vollständigen Aminosäuresequenz eines Pili-Proteins umfassen, besitzen jedoch noch eine biologische Aktivität. Solche Fragmente können durch Amino- oder Carboxy-terminale Deletionen und außerdem durch innere Deletionen hergestellt werden. Solche Peptidfragmente können, wie hier beschrieben, auf biologische Aktivität getestet werden. So umfasst ein funktionelles oder biologisch aktives Protein Mutanten oder Derivate des endogenen Proteins, in dem eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert oder zugefügt wurden. Außerdem werden aktive Fragmente des Proteins beschrieben. Die H. influenzae-Pili-Proteine umfassen funktionelle oder biologisch aktive Pili-Proteine, z.B. das Pilin-Strukturprotein, hipP; das periplasmatische Chaperon, hipC; das Membrananker-Protein, hipR; das Tip-assoziierte Protein, hipM; und am stärksten bevorzugt das hier beschriebene Tip-Adhäsin-Protein, hipA. In Fusionsproteinen, welche die hier beschriebenen Pili-Proteine umfassen (die hier als eine erste Einheit bezeichnet werden), sind diese an eine zweite Einheit gebunden, die nicht in dem in der Natur zu findenden Pili-Protein vorkommt. So kann die zweite Einheit eine einzelne Aminosäure, ein Peptid oder ein Polypeptid sein. Die erste Einheit kann im Fusionsprotein in einer N-terminalen Lage, einer C-terminalen Lage oder im Inneren vorliegen.
Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen können auch in einem rekombinanten Konstrukt für die Infektion, Transfektion oder Transformation einer Zelle in vitro oder in vivo unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors für die Expression funktioneller H. influenzae-Pili-Proteine, wie hier definiert, in einer geeigneten Wirtszelle eingesetzt werden. Solche rekombinanten Konstrukte werden hier auch als Expressionsvektoren bezeichnet. Z.B. kann eine DNA-Sequenz, die an einen geeigneten Promotor (z.B. einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor oder den endogenen Promotor) funktionell ligiert ist, in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. pUC19, eingeführt werden, der sodann in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Das Konstrukt kann auch eine DNA, die einen oder mehrere selektierbare Marker codiert (z.B. neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg und hisd), oder eine DNA umfassen, die ein oder mehrere verschiedene Antigene oder therapeutische Proteine codiert.
Das Konstrukt kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren eingeführt werden, wie vorstehend angegeben, z.B. durch Calciumphosphat-Fällung, Mikroinjektion, Elektroporation oder Infektion (z.B. mit einem infektiösen Retrovirus-, Herpes-, Vaccinia- oder Adenovirus-Vektor). Die Wirtszelle kann eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle sein. Geeignete Zellen umfassen Bakterien-(z.B. E. coli) oder Säugerzellen. Säugerzellen umfassen primäre somatische Zellen, z.B. Epithelzellen, Fibroblasten, Keratinocyten, Makrophagen oder T-Zellen oder immortalisierte Zelllinien, z.B. HeLa oder HT1080. Anschließend kann die rekombinante Wirtszelle gezüchtet und gegebenenfalls selektiert werden, dies erfolgt in vitro unter geeigneten Bedingungen, die zur Expression des Proteins führen. Andererseits kann die Zelle für eine in vivo-Expression in ein Tier, z.B. einen Menschen, transplantiert oder injiziert werden.
Eine Ausführungsform betrifft rekombinante, LKP-Typ-Pili-produzierende E. coli-Zellen. Solche Rekombinanten wurden aus Haemophilus influenzae, wie hier beschrieben, konstruiert. Diese Rekombinanten einzelner Serotypen produzierten Pili in großen, einfach zu reinigenden Mengen. Sie variierten nicht mit der Phase oder wurden bei Subkultur nicht widerstandsfähig („recalcitrant") und konnten wie E. coli in einem flüssigen Medium mit guten Pilus-Ausbeuten gezüchtet werden. Die gezüchteten und daraus gereinigten Pilus-Präparate eines einzelnen Serotyps enthielten Pili, die mit denjenigen auf den elterlichen H. influenzae-(Hflu-)Stämmen identisch waren, und sie enthielten keine anderen Hflu-Antigene. Diese Präparate lassen sich leicht auf Reinheit, Identität, Konzentration und Wirksamkeit standardisieren, um in einen multivalenten Impfstoff eingemischt zu werden, und stellen somit ein effizientes Verfahren für die Herstellung von Pilus-Präparaten für die Impfstoffproduktion dar. Wie hier beschrieben, wurden rekombinante E. coli-Vaccinestämme, die einen einzelnen Typ produzieren, für die Serotypen LKP10, LKP11 und LKP12 konstruiert.
Außerdem wurden Rekombinanten für mehrere Serotypen konstruiert, die zwei Operons auf getrennten Plasmiden enthielten. Einzelne Kolonien dieser Stämme exprimierten gleichzeitig zwei Serotypen von Pili in deutlichen Mengen. Jedoch waren diese Stämme insofern instabil, als sie während der in vitro-Subkultur dazu neigten, rasch die Pilus-Expression zu verlieren, vielleicht weil die verwendeten Plasmide inkompatibel waren. Wenn man die zwei Operons jedoch auf zwei kompatiblen Plasmiden platziert, kann man erwarten, dass diese Stämme stabiler sind. Durch die Verwendung von stabilen, auf hohem Niveau produzierenden, doppelt exprimierenden rekombinanten Stämmen könnte die Produktion von Proteinen, die für die Verwendung als Impfstoff geeignet sind, vereinfacht werden, indem die Zahl der erforderlichen Impfstoffstämme auf die Hälfte reduziert wird.
Gute Verfahren zur Produktion, Einengung und Reinigung von Hflu LKP-Pili verschiedener Serotypen wurden entwickelt und sind hier beschrieben. Pili können aus rekombinanten E. coli-Kulturen gereinigt werden, die Hflu-Pili produzieren, wie für die Reinigung von Pili aus einer Hflu-Kultur beschrieben wird. Sowohl Festphasen- als auch Flüssigphasen-Fermentationsverfahren wurden verwendet. In dem bevorzugten Verfahren werden die Pili aus den geernteten Bakterien mechanisch entfernt und sodann von den Bakterienzellen durch Zentrifugation abgetrennt. Die Pili werden eingeengt und weiter gereinigt, indem aufeinanderfolgende Zyklen erfolgen, bei denen eine Längs-Aggregation (Kristallisation) von intakten Pilus-Stäbchen mit Entfernung der löslichen Verunreinigungen durch Zentrifugation der Kristalle, und anschließend eine Solubilisierung der Pilus-Kristalle erfolgt, wodurch freie Pilus-Stäbchen entstehen, wobei die in Partikelform vorliegenden Verunreinigungen durch Zentrifugation entfernt werden. Jeder Schritt des Produktions-/Reinigungsprozesses wurde für den jeweiligen Pilus-Serotyp optimiert. Bisher wurden 19 verschiedene LKP-Serotypen gereinigt.
Außerdem wurden andere Pilus-Reinigungsverfahren entwickelt, die sich für die analytische und industrielle Anwendung eignen. Unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel- und Säulen-Bedingungen können intakte Pili durch HPLC oder FPLC auf Molekülgrößensortierung-, hydrophoben oder Ionenaustauscher-Säulen von den als Verunreinigung vorliegenden Proteinen gereinigt werden. Diese Verfahren eignen sich auch für eine Herstellung im technischen Maßstab.
Ferner wurden Reinigungsverfahren für einzelne Pilus-Proteine entwickelt, wobei mit intakten LKP-Pili begonnen wird. Hflu-LKP-Pilus-Strukturproteine, die durch das mehrfache Sequenz-Ausrichtung von Pilus-Gensequenzen mit anderen Pilus-Genen abgeleitet wurden, umfassen Pilin, das kleine Tip-Neben- und das große Tip-Neben-Protein. Das große Tip-Neben-Protein wird als das „Adhäsin" bezeichnet, da es die bekannte Spezifität der Adhäsion des LKP-Pilus an menschliche Erythrocyten aufweist. Jedoch kann man anhand der Analogie mit anderen Pilus-Familien sagen, dass auch die anderen zwei LKP-Pilus-Strukturproteine möglicherweise Adhäsine mit Spezifitäten für bisher noch unbekannte menschliche Rezeptoren sind. Sowohl Piline als auch Adhäsine von LKP-Pili wurden so gereinigt, dass die biologisch aktive Form vorlag.
Die Piline werden in Form zusammengelagerter Stäbchen gereinigt, indem die Tip-Neben-Proteine entfernt und die Stäbchen von den Neben-Proteinen auf Molekülgrößensortierung-Säulen abgetrennt werden. Die Pilin-Untereinheiten behalten in ihrer zusammengelagerten Form die antigene Spezifität der intakten Pili bei, die durch die exponierten Oberflächendeterminanten der Pilin-Untereinheiten auf der seitlichen Oberfläche des Pilus-Stäbchens bewirkt wird. Man kann davon ausgehen, dass Pilin-Stäbchen genauso wirksame multivalente Impfstoffkomponenten sind wie intakte Pili und außerdem möglicherweise den Vorteil haben, dass sie reiner sind und eventuell weniger Nebenwirkungen aufweisen.
Das Adhäsin von LKP11 wurde isoliert und zur aktiven und löslichen Form gereinigt. Wenn es von den LKP11-Pili entfernt wird, verlieren diese Pili dadurch die Fähigkeit, an menschliche Erythrocyten zu binden. In der reinen Form kann es an menschliche Erythrocytenmembranen binden. Die Adhäsin-Bande auf SDS-Gelen wird durch Antikörper markiert, die mit einem Fusionsprotein reagieren, das ein Fragment des Adhäsins und das Maltose-bindende Protein umfasst. Gereinigte LKP-Pilus-Adhäsine sind möglicherweise als Impfstoffbestandteile geeignet, die in der Lage sind, Adhäsion-blockierende oder klärende Antikörper zu induzieren. Das LKP11-Adhäsin zeigte auf Western-Blots keine antigene Kreuzreaktion mit dem LKP1-Adhäsin. Somit konnte in diesem auf zwei Serotypen begrenzten Test anhand der Ähnlichkeit im SDS-PAGE-Gel des offensichtlichen Molekulargewichts von drei verschiedenen LKP-Adhäsinen keine Voraussage gemacht werden, dass auch eine antigene Ähnlichkeit bestand. Freie Adhäsine können auf ihre Wirksamkeit als Impfstoffe gegen Otitis media und auf ihre Fähigkeit getestet werden, Adhäsions-blockierende Antikörper zu induzieren. Antiserum gegen das Fusionsprotein, welches die Adhäsin-Bande auf Western-Blots markierte, blockierte nicht die Adhäsion an Erythrocyten.
Die isolierten rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung können an einen Säuger verabreicht werden, um den Säuger gegen eine H. influenzae-Infektion zu schützen oder diese bei ihm zu behandeln. Das isolierte rekombinante Pili-Protein kann zu einer Impfstoffzusammensetzung formuliert werden, z.B. wie im US-Patent 5 336 490 beschrieben. Das Protein kann auch mit Hilfe eines infektiösen Konstrukts, vorzugsweise eines Replikations-inkompetenten oder abgeschwächten viralen Konstrukts, verabreicht werden. Andererseits kann das Protein anhand einer rekombinanten Wirtszelle (z.B. einer Säugerzelle), die das Protein in vivo exprimiert, oder in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Insbesondere kann das rekombinante LKP1-Tip-Adhäsin-Protein, ein biologisch aktives Fragment davon oder ein Fusionsprotein in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern in einem Säuger zu induzieren. Man kann davon ausgehen, dass solche Antikörper den Säuger vor H. influenzae-Krankheiten schützen können.
Die Impfstoffzusammensetzung kann in einer Einzeldosis oder in mehr als einer Dosis innerhalb eines Zeitraums verabreicht werden, so dass ein ausreichender Antikörperspiegel im Blut erreicht wird, um einen Schutz vor einer H. influenzae-Infektion bereitzustellen.
Geeignete pharmazeutische Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate, z.B. Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, Kieselsäure, viskoses Parrafin, Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw.. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsstoffen gemischt werden, z.B. mit Gleitmitteln, Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Feuchthaltemitteln, Emulgatoren, Salzen zum Beeinflussen des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, welche mit den Wirkstoffen nicht auf schädigende Weise reagieren. Sie können auch mit anderen Wirkstoffen, z.B. mit Enzyminhibitoren, kombiniert werden, um den Abbau im Stoffwechsel zu reduzieren, sofern dies gewünscht wird.
Für die parentale Anwendung sind insbesondere injizierbare sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, außerdem Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Suppositorien, geeignet. Ampullen sind günstige Einheitsdosierungen.
Die Verabreichungsarten sind dem Fachmann bekannt, z.B. die parentale, orale oder intranasale Verabreichung oder eine durch eine zelluläre Implantation erfolgte Verabreichung.
Es ist so zu verstehen, dass die tatsächlichen wirksamen Mengen des Proteins in einem bestimmten Fall variieren, z.B. entsprechend der spezifischen Verbindung, die verwendet wird, der bestimmten formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsart und dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten. In der Verwendung hier ist die wirksame Proteinmenge eine Proteinmenge, die in der Lage ist, den Antikörperspiegel in einem Säuger auf einen ausreichenden Spiegel anzuheben, so dass ein Schutz vor einer H. influenzae-Infektion bereitgestellt wird. Der Fachmann kann die Dosierungen für einen bestimmten Patienten ermitteln, indem er herkömmliche Überlegungen anstellt (z.B. anhand eines geeigneten herkömmlichen pharmakologischen Protokolls).
Die hier beschriebenen DNA-Moleküle und Proteine können in diagnostischen in vitro-Tests eingesetzt werden, um das Vorliegen von H. influenzae in biologischen Proben nachzuweisen. Diese DNA-Moleküle oder Fragmente davon können als Sonden in einem Test verwendet werden, mit dem Haemophilus influenzae in einer Probe, z.B. einer Blutprobe eines Säugers, z.B. eines Menschen, nachgewiesen wird. Solche Sonden können so entworfen werden, dass sie spezifisch an die Zielsequenz binden (z.B. ein H. influenzae-Pili-Protein).
In einer Ausführungsform kann die DNA-Sonde die Nucleotide einer Serotyp-konservierten Region des H. influenzae-Genoms umfassen, z.B. die Nucleotide, welche ein Tip-Adhäsin-Protein codieren. Damit die Sonde spezifisch an die Zielsequenz bindet, muss sie eine ausreichende Länge haben, um die gewünschte Spezifität bereitzustellen, d.h. um zu vermeiden, dass sie mit zufälligen Sequenzen in der Probe hybridisiert. Das DNA-Molekül, das zu einer Hybridisierung in der Lage ist, enthält vorzugsweise mindestens etwa 400 Nucleotide, stärker bevorzugt mindestens etwa 1000 Nucleotide und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 1200 Nucleotide. Z.B. kann das DNA-Molekül mindestens etwa 400 Nucleotide zwischen etwa Nucleotid 7000 bis 7400 von Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) umfassen. Die DNA-Hybridisierungssonde weist vorzugsweise eine Homologie von mindestens etwa 70% mit den entsprechenden Sequenzen des Haemophilus influenzae-Genoms, stärker bevorzugt von mindestens etwa 80% und am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 90% auf.
Insbesondere sind die hier beschriebenen DNA-Moleküle in der Lage, mit Serotyp-konservierten Regionen des H. influenzae-Genoms zu hybridisieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sind DNA-Moleküle, die mit der H. influenzae-Region hybridisieren, welche das Tip-Adhäsin-Protein codiert. Z.B. kann ein DNA-Molekül in der Lage sein, mit dem Gen zu hybridisieren, welches das Tip-Adhäsin-Protein von Serotyp 1 codiert, vorzugsweise mit der Sequenz, die zwischen etwa Nucleotid 6955 und 8265 von Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) dargestellt ist. In einer Ausführungsform ist das DNA-Molekül in der Lage, mit dem Genom unter stringenten Bedingungen, wie hier beschrieben, zu hybridisieren. Der Hybridisierungstest kann durchgeführt werden, indem bekannte Hybridisierungsverfahren, z.B. die hier beschriebenen Prozeduren, verwendet werden. Die Sonde kann z.B. nachweisbar markiert werden, indem Markierungen, die dem Fachmann bekannt sind, eingesetzt werden, umfassend Enzyme, Farbstoffe, Antikörper und radioaktive Markierungen. Die Sonde ist vorzugsweise an einem festen Träger (z.B. an einer Membran) immobilisiert.
Alternativ kann das DNA-Molekül so ausgewählt werden, dass es mit einer nicht-konservierten Region des Haemophilus influenzae-Genoms hybridisiert. Z.B. kann ein DNA-Molekül eingesetzt werden, das mit dem Gen hybridisiert, welches das Pilin-Protein codiert. Ein solcher Test kann das Vorliegen eines bestimmten Serotyps von Haemophilus influenzae in der Probe nachweisen.
Eine Probe, die dem vorliegenden Test unterworfen werden kann, kann eine beliebige Probe sein, von der man annimmt, dass sie Haemophilus influenzae enthält oder damit kontaminiert ist. Beispiele einer solchen Probe umfassen eine Blutprobe, eine Probe aus dem Nasenrachenraum oder ein Aspirat aus dem Ohr.
Der Test kann somit für diagnostische Zwecke zum Nachweisen einer Infektion eines Individuums, z.B. eines Säugers (z.B. eines Menschen), mit Haemophilus influenzae eingesetzt werden. Außerdem kann der Test verwendet werden, um das Vorliegen einer Verunreinigung eines Materials, z.B. eines Nahrungsmittels, Medikaments oder biologischen Materials, mit Haemophilus influenzae nachzuweisen.
Das Protein kann in einem Test zum Nachweisen einer Haemophilus influenzae-Infektion in einer Probe, z.B. einer Blutprobe, eingesetzt werden. Z.B. können die Pili eines Pathogens aus der Probe isoliert oder rekombinant produziert werden, wobei die hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. Sodann kann eines oder können mehrere der Proteine der Pili oder Fragmente davon sequenziert werden. Die Sequenzen können an der (den) entsprechenden Proteinsequenz(en) von SEQ ID NO: 4 ausgerichtet und damit verglichen werden. Eine Homologie von mehr als 90% zeigt z.B. das Vorliegen des Pathogens (d.h. einer Infektion) in der Probe an.
Außerdem kann das Pili-Protein oder ein Fragment davon (z.B. ein Peptidfragment) in einem Immuntest, insbesondere einem ELISA, eingesetzt werden, um das Vorliegen von Antikörpern in einer biologischen Probe (z.B. Blut, Serum oder Gewebe) nachzuweisen. Ein solcher Immuntest kann vom Fachmann einfach durchgeführt werden, indem er eingeführte Verfahren verwendet, mit denen ein Antikörper nachgewiesen wird, der an das LKP-Pili-Protein oder an Peptidfragmente gebunden ist.
Die Pili-Proteine oder Fragmente davon (hier auch als Peptide oder Peptidfragmente bezeichnet) können auch eingesetzt werden, um Antikörper zu produzieren, die befähigt sind, mit den hier beschriebenen Pili-Proteinen zu reagieren. Der Begriff Antikörper soll sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper umfassen. Polyclonale Antikörper können hergestellt werden, indem ein Tier mit einem Präparat eines rohen oder gereinigten Pili-Proteins unter Verwendung von Verfahren immunisiert wird, die dem Fachmann bekannt sind. Ferner können Pili-Fusionsproteine für die Immunisierung verwendet werden. Monoclonale Antikörper können anhand von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Antikörper können in diagnostischen Tests eingesetzt werden, um das Vorliegen von H. influenzae-Antikörper in biologischen Proben, wie vorstehend beschrieben, nachzuweisen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch weiter spezifisch erläutert.
Beispiel 1
Clonierung und Sequenzierung des LKP 5-hipP-Gens und des LKP1-Operons
Material und Methoden
Bakterienstämme und Plasmide
Die H. influenzae-Stämme P860295, P861249 und P860688, welche die LKP-Serotypen 1, 4 bzw. 5 exprimieren, wie früher beschrieben wurde (Brinton, C. C., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8, Suppl.: 54–61, 1989), wurden eingesetzt. Die E. coli-Stämme MB392 (Kar, S., et al., Infect. Immun. 58: 903–908, 1990) und HB101 wurden als Wirte für rekombinante Plasmide verwendet, und der Stamm DH5-α wurde für Clonierungsschritte eingesetzt, umfassend die β-Galactosidase-α-Peptid-Komplementierung. Hflu wurden in Gehirn-Herz-Infusionslösung (Dco Laboratories, Detroit, MI), enthaltend 10 μg/ml Hämin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 2 μg/ml NAD (Sigma), bei 37°C gezüchtet. E. coli-Stämme wurden in Luria-Brühe (Miller, J. H., in: Experiments in Molecular Genetics 203, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) bei 37°C gezüchtet. Gegebenenfalls wurden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen eingesetzt: Ampicillin (Sigma) 100 μg/ml, Kanamycin (Sigma) 25 μg/ml und Chloramphenicol (Sigma) 20 μg/ml.
Die Konstruktion und die Eigenschaften des Plasmids pHF1, welches LKP1-Pili in E. coli, wie früher beschrieben, exprimiert (Kar, S., et al., Infect. Immun. 58: 903–908, 1990), wurden genutzt. Das Plasmid pPX551 ist ein pUC18-Derivat, welches das 1,9 kb-XhoI-Fragment von pHF1 enthält, das in die BamHI-Stelle eingefügt ist. Deletionsclone von pHF1, denen der pepN-Locus fehlt, wurden, wie im Text beschrieben, konstruiert. Das LKP4-Pilin-Strukturgen wurde durch PCR-Amplifikation der chromosomalen DNA von P860295 unter Verwendung von Primern mit den folgenden Sequenzen isoliert: für das 5'-Ende des Gens: 5'-GTGCTGGATCCGTTTCTCTTGCATTACATTAGG-3' (SEQ ID NO: 12) und für das 3'-Ende: 5'-TTAGGAATTCGGAAGCGTTTTTTACTTTTTTTGG-3' (SEQ ID NO: 13). Der 5'-Primer umfasste eine HindIII-Restriktionsstelle, die in der Sequenz unterstrichen ist, und der 3'-Primer enthielt eine EcoRI-Stelle, die auch unterstrichen ist. Das PCR-Produkt wurde in pCR1000 (Invitrogen, Inc., CA) cloniert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Das LKP4-Strukturgen wurde subcloniert, indem die EcoRI-Stelle mit Klenow in Gegenwart aller vier dNTPs mit glatten Enden versehen wurde und es mit Asp718I gespalten wurde (eine Asp718I-Stelle liegt im Vektor vor), wodurch das Fragment freigesetzt wurde. Das LKP4-Gen wurde in den mit HindII und Asp718I gespaltenen pPX191 ligiert (ein Derivat von pUC19, worin das bla-Gen durch das cat-Gen aus pACYC184 ersetzt ist (Chang, A. C. Y., und S. N. Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141–1156, 1978)), wodurch pPX602 erzeugt wird.
Das LKP5-Pilin-Strukturgen wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer isoliert: für das 5'-Ende: 5'-AACGAATTCTGCTGTTTATTAAGGCTTTAG (SEQ ID NO: 14) und für das 3'-AGCTGGATCCTTGTAGGGTGGGCGTAAGCC (SEQ ID NO: 15). Das PCR-Produkt von etwa 1 kb wurde in pCRII (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) cloniert und als ein durch Klenow-Behandlung der EcoRI-Enden mit glatten Enden versehenes Fragment subcloniert, das unter Verwendung der flankierenden EcoRI-Stellen des Vektors erzeugt wurde. Das LKP5-Pilin-Gen wurde in Plasmid pPX191 subcloniert und die Orientierung durch Restriktionsanalyse bestimmt. Der LKP5-Subclon wurde als pPX605 gewonnen.
Clonierung von hipP-Genen, welche andere LKP-Serotypen codieren
Die hipP-Loci, welche die LKP-Gene des Serotyps 4 und des Serotyps 1 codieren, wurden beschrieben (Kar, S., et al., Infect. Immun. 58: 903–908, 1990; van Ham, S. M., et al., EMBO Jour. 8: 3535–3540, 1989). Um zu bestimmen, ob die Serotyp-Spezifität von LKP-Pili innerhalb des hipP-Gens liegt, wurden anhand von PCR die Pilin-Gene der Serotypen 4 und 5 aus NTHi-Stämmen cloniert, die diese Pili exprimieren. Das PCR-Produkt für das LKP4-Pilin-Gen wurde, wie vorstehend beschrieben, in pPX191 cloniert und wird unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert. Das hipP-Gen aus einem LKP5-exprimierenden Hflu-Stamm wurde durch PCR, wie beschrieben, isoliert und in pPX191 für eine Expression unter der lac-Kontrolle cloniert.
Oligonucleotid-Synthese
Die synthetischen Oligonucleotide, die als Primer für die PCR-Amplifikation und die DNA-Sequenzierung verwendet wurden, wurden auf einem Applied Biosystems (ABI)-380B-DNA-Synthesegerät unter Verwendung der b-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert (Sinha, N. D., et al., Nucleic Acids Research 12: 4539–4557, 1984).
Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die LKP4-hipP- und LKP5-hipP-Pilin-Gene wurden durch PCR aus den NTHi-Stämmen P861249 bzw. P860688 unter Verwendung herkömmlicher PCR-Amplifikations-Protokolle amplifiziert (Saiki, R. K., et al., Science 239: 487–491, 1988).
DNA-Sequenzierung
Das auf dem Plasmid pPX551 enthaltene hipP-Gen und das auf dem Plasmid pHF1 enthaltene gesamte LKP1-Operon wurden mit herkömmlichen M13-Sequenzierungs-Primern und mit überlappenden Sense- und Antisense-Primern sequenziert. Die gesamte DNA-Sequenzierung erfolgte auf einem Applied Biosystems (ABI)-373A-DNA-Sequenziergerät, wobei der Taq-Thermozyklus-DyeDeoxy^TM Terminator-Sequenzierungs-Kit von ABI, Teile-Nr. 901497, verwendet wurde. Die Serotypen LKP4 und LKP-5 wurden direkt aus den PCR-Produkten unter Verwendung von PCR-Amplifikations-Primern und inneren synthetischen Primern, die auf der LKP1-Sequenzierungsstudie beruhten, sequenziert.
SDS-PAGE-Analyse
Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde in einem 70 × 100 mm Mini-Gelsystem (Bio-Rad, Richmond, CA) unter Verwendung des Verfahrens von Laemmli (Laemmli, U. K., Nature (London) 227: 680–685, 1970) durchgeführt. Die Proben wurden mit β-Mercaptoethanol oder DTT im Proben-Präparationspuffer reduziert und fünf Minuten gekocht. Die Gele wurden bei einer konstanten Spannung von 150 V laufen gelassen. Die aufgetrennten Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brilliantblau G-250 (Sigma) nachgewiesen.
Teilweise Reinigung von Pili
Die LKP-Pili wurden gemäß früher beschriebenen Verfahren gereinigt, wobei die unterschiedliche pH-Löslichkeit genutzt wurde (Brinton, C. C., Jr., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8, Suppl.: 54–61, 1989). Kurz gesagt wurden die Pili-aufweisenden Bakterien aus einer flüssigen Kultur abzentrifugiert und zweimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, gewaschen. Der bakterielle Niederschlag wurde in 100 mM Tris, pH 10,3, enthaltend 150 mM NaCl, mit einem Verhältnis von 4 ml Puffer pro g Nassgewicht der Zellen resuspendiert. Die Pili wurden von den Zellen abgeschert, indem sie in einem Oster-Minimixer in drei 3-Minuten-Salven bei 4°C gemixt wurden. Die Bakterientrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der Überstand wurde gegen 50 mM Natriumacetat, pH 5,0, über Nacht dialysiert, um die Pili auszufällen und andere Proteine zu denaturieren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation bei 15000 × g bei 4°C gewonnen und über Nacht in 50 ml 0,01 N CAPS-Puffer, pH 10,4, unter leichten schwankenden Bewegungen gelöst. Dieser Zyklus der Säurefällung und Solubilisierung in basischem Puffer wurde noch zweimal wiederholt. Das endgültige saure Pellet wurde sodann in 0,01 M Natriumphosphat, pH 10,4, gelöst und das unlösliche Material verworfen. Diese lösliche Fraktion wurde als die teilweise gereinigten Pili bezeichnet.
Sequenz des LKP1-Operons
Das LKP1-Operon wurde, wie vorstehend beschrieben, sequenziert, und die vollständige Sequenz ist in Tabelle 5 (SEQ ID NO: 4) angegeben. Die Sequenzanalyse identifizierte sechs mögliche offene Leseraster (ORFs) in dem LKP-Operon, umfassend die Gene hipP (etwa bei Nucleotid 1882 bis 2532 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4) und hipC (etwa bei Nucleotid 2854 bis 3630 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4). Alle sechs ORFs in dem LKP-Operon wurden als homolog zu äquivalenten Pilus-Operon-Genen in der Pilus-Superfamilie identifiziert, die durch mehrere Sequenz-Ausrichtungen von Proteinen definiert wurden. Die Analyse der Sequenz-Ausrichtung erfolgte auch unter Verwendung der Entrez Sequences Database Release 10,0 des National Center for Biotechnology Information (National Library of Medicine, Bethesda, MD). Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der ORFs sind in Tabelle 5 (SEQ ID NOs: 5 bis 10) angegeben. Jedem Leseraster wurde aufgrund der Sequenz-Ausrichtungs-Analyse eine Funktion zugewiesen. Es gibt fünf ORFs, die in einem Operon gruppiert zu sein scheinen, das durch die hipC-Promotorregion kontrolliert wird. Hinter dem hipC-Gen (für periplasmatisches Chaperon) wurde das zweite Leseraster hipR (etwa bei Nucleotid 4016 bis 6238 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4) bestimmt, ein Membrananker-Protein, das dritte ORF hipM (etwa bei Nucleotid 6259 bis 6873 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4) wurde bestimmt, ein Tip-assoziiertes Protein (hier auch als Tip-Neben-Protein bezeichnet) und das fünfte ORF hipA (etwa bei Nucleotid 6955 bis 8265 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4) wurde bestimmt, ein Tip-Adhäsin-Protein. Das Pilin-Gen (hipP) und das periplasmatische Chaperon-Gen (hipC) werden in entgegengesetzter Orientierung wie im LKP4-Operon transkribiert, wobei die Promotorregion die früher identifizierten TA-Wiederholungseinheiten aufweist (van Ham, S. M., et al., Cell 73: 1187–1196, 1993). Da pHF1 LKP1-Pili in E. coli exprimiert, gibt es zehn TA-Wiederholungseinheiten in der Intrapromotor-Region, wie von van Ham et al. beschrieben. Diese TA-Wiederholungseinheiten sind für die Phasenvariation des Phänotyps der LKP-Pili verantwortlich, wobei ein Verlust einiger der Wiederholungseinheiten zum Verlust der Piliation führt und eine Zahl an TA-Wiederholungseinheiten zwischen 10 oder 11 die Expression des LKP-Operons zulässt. Wie auf dem LKP1-Operon identifiziert wurde, codierte ein ORF eine Integrase (etwa bei Nucleotid 1495 bis 1868 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4). Außerdem lag auf dem LKP1-Operon eine Sequenz, die ein Enzym, eine Peptidase, codierte (etwa bei Nucleotid 8395 bis 9342 von Tabelle 5, SEQ ID NO: 4).
Die vorausgesagte Größe des LKP1-hipP-Genprodukts beträgt etwa 21,2 Kilodalton, dies lässt eine Signalsequenz mit einer Länge von 20 Aminosäuren annehmen, während das festgestellte Molekulargewicht in den SDS-PAGE-Gelen etwa 27 Kilodalton ausmacht. Dies lässt sich teilweise durch die anomale Wanderung von LKP-Pilin-Sequenzen in SDS-PAGE-Gelen im Allgemeinen erklären (reifes LKP4 wandert entsprechend einer Molekülgröße von 24 Kilodalton, während seine vorausgesagte Größe 22,1 Kilodalton beträgt), die genaue Erklärung hierfür bleibt jedoch unbekannt.
Sequenzvergleich der hipP-Gene der LKP-Serotypen 1, 4 und 5
Diese Beschreibung präsentiert die erste Sequenzanalyse der hipP-Gene, welche die LKP-Serotypen 1 und 5 codieren (1). Außerdem wurde das hipP-Gen aus einem LKP4-exprimierenden Hib-Stamm sequenziert (van Ham, S. M., et al., EMBO Jour. 8: 3535–3540, 1989), wobei die abgeleitete Aminosäuresequenz eine Identität von 99% mit der hier enthaltenen, von LKP4 hipP abgeleiteten Aminosäuresequenz zeigt. Die Sequenzen der hipP-Gene aus den Hib-Stämmen Eagan und M43 wurden veröffentlicht (Forney, L. J., et al., Infect. Immun. 59: 1991–1996, 1991). Das LKP1-hipP-Gen sollte ein Protein von etwa 21,5 Kd codieren, während das vorausgesagte Molekulargewicht des LKP4-hipP-Proteins 23,8 Kd beträgt. Die tatsächlichen hipP-Genprodukte, die in rekombinanten E. coli festgestellt werden, weisen in Western-Blots etwa die korrekten Größen für LKP4 und LKP5 auf, jedoch läuft das LKP1-Pilin abweichend bei einem höheren Molekulargewicht als vorausgesagt bei 26 Kd. Die MacVector-Software wurde eingesetzt, um die Homologie dieser Gene festzustellen, wobei die LKP4-hipP- und LKP5-hipP-Proteine zu 70 bzw. 67% identisch sind mit dem LKP1-hipP. Die Ausrichtung zwischen den Sequenzen ist an den Aminoenden der Proteine sehr gut, wobei drei Hauptbereiche mit einer Sequenzdivergenz in den Genen des Serotyps LKP1, 4 und 5 weiter innen in den Proteinen vorliegen, wie in 1 zu sehen ist. Da nur eine geringe Kreuzreaktivität zwischen anti-LKP1-, anti-LKP4- oder anti-LKP5-Seren mit intakten Pili eines heterologen Serotyps festzustellen ist, müssen die Sequenzen, die für die Serotyp-Spezifität der typisierenden Antiseren verantwortlich sind, in diesen Regionen liegen. Durch Vergleich der Sequenzen in GenBank mit der LKP4-Sequenz zeigt sich, dass das H. influenzae Typ b-M43-Pilin (Gilsdorf, J. R., et al., Infect. Immun. 58: 1065–1072, 1990), sequenziert durch Gilsdorf et al., auch ein LKP4-Serotyp-Gen zu sein scheint (Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 2
Konstruktion von E. coli-Rekombinanten, die Pili des LKP-Typs produzieren
Bakterienstämme
Die Pili-aufweisenden Hflu-Stämme, die für die Konstruktion von rekombinanten E. coli-Zellen verwendet wurden, sind LKP11/CB59, LKP10/88-0807 und LKP12/88-0677. Hämagglutination und Serumagglutination wurden untersucht, bevor die genomische Bank hergestellt wurde. Die E. coli-Stämme XL-1-Blue^MR und HB101 wurden als clonierende Wirtszelle verwendet.
DNA-Bank-Konstruktion und Cosmid-Vektor-DNA
Die chromosomale DNA aus LKP11, LKP10 und LKP12 wurde jeweils durch Standardverfahren extrahiert und gereinigt. Die Größe der genomischen DNA von Hflu beträgt etwa 1,8 × 10⁶ bp. Die chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3Al teilweise gespalten. Ein etwa 30 kb großes DNA-Fragment wurde aus einem LMTA-Gel (Sigma) extrahiert und durch das Phenol-Chloroform-Verfahren gereinigt. Die endgültige DNA-Konzentration beträgt etwa 1 μg/μl.
Die Vektor-DNA SuperCosI (Stratagene, La Jolla, CA) wurde mit XbaI gespalten und mit alkalischer Phosphatase des Kälberdarms (CIAP) dephosphoryliert. Danach wurde die mit XbaI und CIAP behandelte Vektor-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Ein etwa 6,5 kb großes Vektor-DNA-Fragment wurde erhalten.
Die DNA-Fragmente LKP11/CB59, LKP10/88-0807 bzw. LKP12/88-0677 wurden jeweils an der BamHI-Stelle der Vektor-DNA SuperCosI ligiert. Die ligierte DNA wurde unter Verwendung von Ciga-pack Gold-Kit (Stratagene, La Jolla, CA) in λ-Phagenpartikel verpackt. Die Wirtszelle für die Verpackung war XL1-Blue^MR.
Durchmusterung der Bank
Die rekombinant exprimierten Pili des LKP-Typs wurden durch das Kolonie-Blot-Verfahren durchgemustert. Die Konzentration von anti-Pilus-Seren von LKP11, LKP10 und LKP12 war so, dass sie als eine 1:1000-Verdünnung vorlagen. Der prozentuale Anteil von positiven Kolonien betrug 40/4200 für LKP11, 9/700 für LKP10 und 1/600 für LKP12. Die Piliation der Zellen wurde durch EM untersucht. Die Rekombinanten wurden durch weitere HA- und SA-Tests verifiziert und mit CLJ11 für LKP11, CLJ10 für LKP10 und CLJ12 für LKP12 bezeichnet (2A, 2B und 2C). Die DNA der Rekombinanten wurde extrahiert und auf den E. coli Stamm HB101 transformiert, da die XL1-Blue-Zelle Typ-I-Pili exprimiert. Die DNA der Rekombinanten weist bei CLJ11 eine Größe von etwa 18,5 kb auf. Diese wurde durch Spaltung und anschließende Ligierung unter Verwendung einer Restriktionsstelle auf Insert- und Vektor-DNA erhalten. Die CLJ10-DNA beträgt etwa 25 kb, die für CLJ12 etwa 35 kb. Die teilweise DNA-Sequenz für diese rekombinanten Inserte ist verfügbar.
Beispiel 3
Protokolle für die Reinigung eines LKP-Pilus aus einem rekombinanten E. coli-Stamm unter Verwendung des Flüssigphasen-Verfahrens
Allgemeines Protokoll

1. Beimpfen rekombinanter E. coli-Zellen in 3 ml eines LB-Mediums, das Ampicillin enthält, und Züchten bei 37°C, bis ein OD-Wert bei 540 nm von 0,6 bis 0,8 erreicht ist (drei bis vier Stunden).
2. Überführen der Zellsuspension in 50 ml Medium und Züchten bei 37°C, bis ein Wert bei 540 nm von 0,8 bis 1,0 erreicht ist (vier bis fünf Stunden).
3. Überführen der 50 ml-Zellsuspension auf 1 l Medium in einem 2,8-l-Kolben und Züchten bei 37°C über Nacht (16 bis 18 Stunden), bis ein Wert bei 540 nm von 4,0 bis 5,0 erreicht ist.
4. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 5000 UpM, 15 Minuten.
5. Resuspendieren der Zellen in 50 nM Acetatpuffer, pH 5,0, und Halten der Suspension bei Raumtemperatur eine Stunde.
6. Mischen bei 11000 UpM in einem großen Becher oder bei 14000 UpM in einem kleinen Becher mit einem Omnimixer auf Eis drei Minuten.
7. Titrieren auf pH 8,0 mit 1 M HCl und drei Stunden Stehenlassen bei Raumtemperatur.
8. Zentrifugieren bei 12000 UpM 20 Minuten bei 4°C. Wiegen aller Pellets und Verwerfen.
9. Zufügen von 10 μl DNase und RNase zu jeweils 100 ml Präparat. Gründliches Mischen und zehn Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur.
10. Dialysieren gegen 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, über Nacht mit mehrmaligem Austauschen. Wenn das Präparat über Nacht nicht den pH-Wert 5,0 erreicht, erfolgt ein längeres Dialysieren gegen den Puffer mit häufigerem Austauschen.
11. Zentrifugieren bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C, um den Proteinniederschlag und die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
12. Resuspendieren des Pellets in etwa 25% des ursprünglichen Volumens in 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0.
13. Zufügen von Triton X-100 und EDTA zum Präparat unter leichtem Rühren, so dass eine Endkonzentration von 0,2% und 5 mM erreicht wird. Leichtes Rühren über Nacht bei 4°C.
14. Klären des Präparats durch Zentrifugation bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C.
15. Zufügen von NaCl und PEG 8000 auf eine Endkonzentration von 0,5 M bzw. 3,0%, danach Inkubieren des Präparats über Eis zwei Stunden.
16. Zentrifugieren des Präparats bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C, um die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
17. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, in 1/3 des vorherigen Volumens. Bei Verwendung von weniger Lösung wird eine geringere Ausbeute an Pilus-Kristallen erhalten.
18. Wiederholen der Schritte 13 bis 17.
19. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0. Abhängig von der Reinheit und der Menge des Materials können gegebenenfalls noch andere Schritte zur Solubilisierung und Kristallisation durchgeführt werden.

Während der Reinigung wird nach jedem Schritt eine Probe genommen und für die SDS-PAGE verwendet, um die Reinheit der Proben zu untersuchen. Außerdem wird zur Prüfung der Reinheit ein Test mit Dunkelfeld-Mikroskopie benötigt. Ferner ist der Einsatz von UV-Scanning erforderlich, um eine Verunreinigung durch DNA oder RNA zu bestimmen.
Da Triton X-100 eine starke Absorption bei 280 nm zeigt, ist es wichtig, das restliche Triton X-100 nach der Reinigung durch eine einmalige oder durch mehrmalige Kristallisation von Pili durch PEG und NaCl zu entfernen. Hierdurch werden falsche Werte bei 280 nm vermieden, wenn man die Konzentration der Pili-Präparate durch das UV-Verfahren bestimmt.
Reinigung der LKP5-Pili

1. Ernten in 80 mM PBS, pH 5,0, unter Verwendung von 5 bis 10 ml pro Schale.
2. Titrieren des Präparats auf den pH-Wert 5,0 mit 6 N HCl, sofern dies erforderlich ist.
3. Mischen mit einem Omnimixer über Eis drei Minuten (durchschnittliche Geschwindigkeit = 9800 UpM) (bis zu 11000 UpM, wenn es in größeren Bechern möglich ist, und bis zu 14000 UpM in kleinen Bechern).
4. Titrieren auf pH 9,0 mit 5 M NaOH und Stehenlassen drei Stunden bei Raumtemperatur. Ein leichtes Rühren kann erforderlich sein, um pH-Änderungen zu vermeiden. Der pH-Wert wird die ganze Zeit überwacht und gegebenenfalls eingestellt. (Wenn Kulturen in Brühe gezüchtet wurden, erfolgt das Titrieren mit einer 1 M Lösung von Puffer (Tris) anstelle von NaOH).
5. Zentrifugieren bei 15300 g 20 Minuten bei 4°C. Überführen des Überstands in saubere Flaschen und Klären wie vorstehend ein zweites Mal. Wiegen aller Pellets und Verwerfen.
6. Einstellen des pH-Werts des Überstands auf 8,0 und Zufügen von 10 μl DNase und RNase zu jeweils 100 ml Präparat. Gründliches Mischen und zehn Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur.
7. Dialysieren gegen 40 mM Acetatpuffer, pH 5,0, über Nacht mit mehrmaligem Austauschen. Wenn das Präparat über Nacht nicht den pH-Wert 5,0 erreicht, erfolgt ein längeres Dialysieren gegen den Puffer mit häufigerem Austauschen.
8. Zentrifugieren bei 18600 g 60 Minuten bei 4°C, um die Pilus-Kristalle zu sedimentieren (Kristalle nicht typisch für klare Pili).
9. Resuspendieren des Pellets in etwa 25% des ursprünglichen Volumens in 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,0, unter Verwendung eines Gummischabers. Leichtes Rühren bei 4°C (Vermeiden von Schäumen) mehrere Stunden. Große Stücke gegebenenfalls durch vorsichtiges Pipettieren aufbrechen.
10. Zufügen von Triton X-100 (2% Vorratslösung) zum Präparat unter leichtem Rühren, so dass eine Endkonzentration von 0,4% erhalten wird, und von EDTA (25 mM Vorratslösung), so dass eine Endkonzentration von 5 mM erreicht wird. Inkubieren über Nacht bei 4°C.
11. Klären des Präparats durch Zentrifugation bei 186000 g 60 Minuten bei 4°C. Überführen des Überstands in einen sauberen Kolben.
12. Einstellen des pH-Werts des Überstands auf unter 8,0 unter Verwendung von 1 N HCl.
13. Zufügen von NaCl (5 M Vorratslösung) auf eine Endkonzentration von 0,5 M und von PEG (30% Vorratslösung) auf eine Endkonzentration von 3%, danach Inkubieren des Präparats über Eis 0,5 Stunden. Überprüfen im Dunkelfeld auf Kristalle. Gegebenenfalls Verlängern der Zeit, wobei es jedoch kritisch ist, die Pili nicht zu lange gegenüber dem PEG zu exponieren, da die erneute Solubilisierung mit zunehmender Zeit immer schwieriger wird.
14. Zentrifugieren des Präparats bei 18600 g 60 Minuten bei 4°C, um die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
15. Waschen des Pellets mit 40 mM Citratpuffer, pH 5,0, um überschüssiges PEG/NaCl zu entfernen. Danach Zentrifugieren bei 186000 g 60 Minuten) (zweimal).
16. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, in 1/3 bis 1/2 des vorherigen Volumens. Solubilisieren durch Aufwirbeln und anschließendes vorsichtiges Pipettieren. Laufenlassen der Probe auf einem Gel, um die Reinheit zu testen. Gegebenenfalls Fortfahren mit Schritt 17.
17. Zufügen von Triton X-100 zum Präparat, so dass eine Endkonzentration von 0,4% erhalten wird, und von EDTA, so dass eine Endkonzentration von 5 mM erhalten wird, anschließend Inkubieren über Nacht bei 4°C (vgl. Einzelheiten in Schritt 10).
18. Einstellen des pH-Werts des Präparats auf unter 8,0 unter Verwendung von HCl (zwischen 7 und 8).
19. Zufügen von NaCl auf eine Endkonzentration von 0,5 M und von PEG auf eine Endkonzentration von 3%, danach Inkubieren des Präparats über Eis 0,5 Stunden (vgl. Einzelheiten in Schritt 13).
20. Zentrifugieren des Präparats bei 186000 g 60 Minuten bei 5°C, um die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
21. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, um die Pili zu solubilisieren (vgl. Einzelheiten in Schritt 16). Überprüfen der Reinheit durch SDS-PAGE. Gegebenenfalls Fortfahren mit Schritt 22.
22. Zufügen von Triton X-100 zum Präparat, so dass eine Endkonzentration von 0,4% erhalten wird, und von EDTA, so dass eine Endkonzentration von 5 mM erhalten wird, anschließend Inkubieren über Nacht bei 4°C (vgl. Einzelheiten in Schritt 10).
23. Klären durch Zentrifugation bei 18600 g 60 Minuten bei 4°C.
24. Zufügen von NaCl auf eine Endkonzentration von 0,5 M und von PEG auf eine Endkonzentration von 3%, danach Inkubieren des Präparats über Eis 0,5 Stunden (vgl. Einzelheiten in Schritt 13).
25. Zentrifugieren des Präparats bei 18600 g 1 Stunde bei 4°C. Verwerfen des Überstands.
26. Resuspendieren des Pellets in Tris-HCl, pH 9,0. Abhängig von der Menge und der Reinheit des Materials können gegebenenfalls abwechselnd noch weitere Schritte zur Solubilisierung und Kristallisation durchgeführt werden.

Während des Reinigungsprozesses Überwachen des Pelletmaterials und Überstands durch Dunkelfeld und/oder Gel und/oder Scan. Gegebenenfalls kann eine erneute Behandlung erforderlich sein.
Reinheit durch Überprüfung mittels SDS-PAGE: gegebenenfalls Wiederholen des Triton-Schritts, wobei jedoch die SDS-Reaktionsschritte in früheren Protokollen vermieden werden sollten, da es hierbei zu hohen Verlusten von Pili kommen kann.
Beispiel 4
Reinigung der LKP-Pili durch HPLC und andere Säulenverfahren
Die LKP-Pili können, abgesehen von Detergens-Extraktion und PEG-Fällung, auch durch HPLC, FPLC und andere Säulenverfahren gereinigt werden. Diese Verfahren sind gut geeignet, insbesondere für unbekannte LKP-Pili. Normalerweise werden die Pili zuerst durch Extraktion und Fällung teilweise gereinigt, bis die Pilus-Lösung klar und eingeengt ist und eine sehr kleine Größe aufweist. Wenn das Präparat immer noch nicht rein ist, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird, wären Säulenverfahren die Methoden der Wahl. Für diesen Zweck werden bevorzugt Größensortierungs-Säulen eingesetzt. Vor dem Auftragen auf eine Säule ist es wichtig, dass die Pilus-Probe noch weiter gereinigt wird. Das für die teilweise Reinigung der Pili verwendete Detergens sollte aus den Pilus-Proben durch Dialyse oder andere bekannte Verfahren entfernt werden. Ein Detergens reduziert die Auflösung der Säulentrennung signifikant. Für eine Größenausschluss-Säule ist ein kleines Probenvolumen erforderlich.
Für HPLC oder FPLC wird ein Auftragvolumen von 50 μl bis 200 μl empfohlen, das Proben-Auftragvolumen für andere herkömmliche LC-Gelfiltrations-Säulen hängt von der Länge und der Größe der Säule ab. Eine Pilus-Probe von 1 ml ist für eine Säule mit einem Gesamtvolumen von 50 ml bevorzugt. Da Pili eine niedrige Absorption bei 280 nm besitzen, ist für den Monitor eine höhere Empfindlichkeit empfehlenswert. Das aus der Säule eluierte verfügbare Protein kann bei 230 nm überwacht werden. Eine weitere Reinigung der Proteine kann durch HPLC erfolgen. Säulenverfahren zur Reinigung eignen sich auch für die Isolierung von Pilin aus Pili.
Beispiel 5
Protokoll der Reinigung eines LKP-Pilus aus einem [Hflu]-Stamm oder einem rekombinanten E. coli-Stamm unter Verwendung eines Festphasen-Verfahrens
Allgemein gesagt exprimiert ein rekombinanter Stamm das Pilus-Strukturprotein besser als der Elternstamm Hflu, deshalb ist es einfacher, Pili aus den rekombinanten Zellen zu reinigen. Da jedoch der rekombinante E. coli-Stamm das Pilus-Protein genauso wie der Elterstamm Hflu exprimiert, sind die Reinigungsverfahren der Pilus-Stäbchen aus Hflu oder aus dem rekombinanten Stamm im Grunde die gleichen. Für das Züchten des Hflu-Stamms sind Schokoladenagar-Medien und ein bestimmter CO₂- und Feuchtigkeitsgehalt erforderlich. Für das Züchten des rekombinanten E. coli-Stamms sind LB-Agar-Medien erforderlich, die Ampicillin enthalten.

1. Ernten in 80 mM PBS, pH 5,0, unter Verwendung von 5 ml pro Schale. Verwenden eines geglätteten Glasspachtels, um die feuchten Zellen abzuschaben, und danach Überführen der Zellsuspension in einen Omnimixer-Becher. Wenn die Zellen an der Oberfläche vorliegen, wird nur die Oberflächenfeuchtigkeit der Medien genutzt, um die feuchten Zellen zu gewinnen.
2. Titrieren des Präparats auf den pH-Wert 5,0 mit 2 M Acetatpuffer, sofern dies erforderlich ist.
3. Mischen mit einem Omnimixer bei 14000 UpM über Eis drei bis fünf Minuten.
4. Titrieren auf pH 8,0 mit 1 M Tris-HCl-Puffer und Überwachen der pH-Änderung durch ein pH-Meter. Das Titrieren auf den pH-Wert kann anstelle von Tris-Puffer mit 2,5 oder 5 M NaOH erfolgen, wenn das Präparat eine große Menge feuchter Zellen enthält. Bei der Verwendung von NaOH muss vorsichtig vorgegangen werden, um die Lyse der Zellen zu vermeiden. Inkubieren des Präparats bei Raumtemperatur drei Stunden.
5. Zentrifugieren bei 12000 UpM 20 bis 30 Minuten bei 4°C. Wiegen aller Pellets und Verwerfen.
6. Zufügen von 10 μl DNase und RNase zu jeweils 100 ml des Präparats. Gründliches Mischen und zehn Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur.
7. Dialysieren gegen 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, über Nacht mit mehrmaligem Austauschen. Wenn das Präparat über Nacht nicht den pH-Wert 5,0 erreicht, erfolgt ein längeres Dialysieren gegen den Puffer mit häufigerem Austauschen.
8. Zentrifugieren bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C, um den Proteinniederschlag und die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
9. Resuspendieren des Pellets in etwa 25% des ursprünglichen Volumens mit 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0.
10. Zufügen von Triton X-100 und EDTA zum Präparat unter leichtem Rühren, so dass eine Endkonzentration von 0,2% und 5 mM erhalten wird. Leichtes Rühren über Nacht bei 4°C.
11. Klären des Präparats durch Zentrifugation bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C.
12. Zufügen von NaCl und PEG 8000 auf eine Endkonzentration von 0,5 M bzw. 3,0%, danach Inkubieren des Präparats über Eis zwei Stunden. LKP-Pili mit einer anderen Länge und das Dimer können in unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl und PEG 8000 kristallisiert werden. Deshalb ist ein Konzentrationstest für NaCl und PEG zum Kristallisieren verschiedener Pili wichtig.
13. Zentrifugieren bei 16000 UpM 60 Minuten bei 4°C, um die Pilus-Kristalle zu sedimentieren.
14. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, in 1/3 des vorherigen Volumens. Verwendung von noch weniger Lösung, wenn eine kleinere Ausbeute an Pilus-Kristallen gefunden wird.
15. Wiederholen der Schritte von Schritt 10 bis Schritt 14.
16. Resuspendieren des Pellets in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0. Abhängig von der Reinheit und der Menge des Materials können gegebenenfalls abwechselnd noch weitere Schritte zur Solubilisierung und Kristallisation durchgeführt werden.

Während der Reinigung wird nach jedem Schritt eine Probe genommen und für die SDS-PAGE verwendet, um die Reinheit der Proben zu untersuchen. Außerdem wird ein Dunkelfeld-Mikroskopie-Test benötigt, um die Reinheit zu überprüfen. Ferner ist der Einsatz von UV-Scanning erforderlich, um eine eventuelle Verunreinigung durch DNA oder RNA zu erkennen.
Da Triton X-100 eine starke Absorption bei 280 nm zeigt, ist es wichtig, das restliche Detergens nach der Reinigung durch eine weitere Kristallisation von Pili durch PEG und NaCl zu entfernen. Hierdurch werden falsche Werte bei 280 nm vermieden, wenn man die Konzentration des Pilus-Präparats durch das UV-Verfahren bestimmt.
Beispiel 6
Konstruktion eines MBP-Δ3'-Tip-Fusionsproteins
Die genetische Fusion wurde unter Verwendung von PCR-Primern konstruiert, so dass ein Teil des LKP1-Tip-Gens von pHF1 erhalten wurde, der dann mit dem MBP-Protein-Gen im Vektor pMAL-p2 im Raster vorliegt. Die Primer wurden so entworfen, dass das Carboxylende von etwa 100 Aminosäuren des Tip-Proteins entfernt und durch ein Stopp-Codon ersetzt wird. Der aminoterminale Teil des Proteins wurde durch PCR vermehrt, im Raster mit einer geeigneten Restriktionsstelle etwa am Punkt der Signalsequenz-Spaltstelle, die durch Analogie mit anderen bakteriellen Signalsequenzen und des Hydrophobie-Profils der hergeleiteten Aminosäuresequenz des Tip-Proteins bestimmt wurde. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist in 2 dargestellt. Die teilweise Sequenz des LKP-Tip-Proteins des Fusionsproteins ist unterstrichen.
Expression der Fusion, Reinigung und Produktion von Antiseren
Das Protein wurde in E. coli BL21 (einem onnipT.Ion K-12-Stamm) exprimiert, der in SOB-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, bei 28°C nach Induktion mit 0,2 mM IPTG gezüchtet wurde. Die Zellen wurden abzentrifugiert und einmal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 20 mM Tris, pH 7,5, enthaltend 2 mM EDTA und 400 mM NaCl, mit einem Verhältnis von 20 ml/Liter der ursprünglichen Kultur resuspendiert. Die Zellen wurden lysiert, indem sie dreimal durch eine French-Press-Zelle geschickt wurden, und die Zelltrümmer wurden durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 8 mal × g 20 Minuten bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde im gleichen Puffer, der für das Aufschließen verwendet wurde, fünffach verdünnt und über eine Amylose-Harz-Säule mit 15 ml Bettvolumen bei 1 ml/Min. bei Raumtemperatur geschickt. Nachdem das Lysat durch die Säule gelaufen war, wurde die Säule mit 15 Bettvolumina des Lysepuffers mit 5 ml/Min. gewaschen. Das gebundene Material wurde unter Verwendung von Waschpuffer, der 10 mM Maltose enthielt, eluiert. Die Elution erfolgte mit 50 ml Puffer bei 1 ml/Min., anschließend wurde das Eluat vereinigt. Das resultierende Proteingemisch wurde durch SDS-PAGE und Western-Blot und anti-MBP-Seren analysiert, wobei gefunden wurde, dass es die Fusion, Spaltprodukte und das vollständige MBP enthielt. Anderes Material wurde nur in geringem Umfang nachgewiesen.
Die Fusionsproteine, das MBP und die Spaltprodukte wurden als ein Komplex eluiert. Mäuse wurden mit 10 μg Dosen des Komplexes immunisiert, wobei 100 μg MPL als Adjuvans verwendet wurden. Die Immunisierungen erfolgten subkutan in den Wochen 0, 4 und 6, und die Mäuse wurden in der Woche 8 ausgeblutet. Das Serum der negativen Kontrolle war anti-MBP-Serum der Maus, das gegen das gereinigte MBP hergestellt wurde, wobei die gleichen Reinigungs- und Immunisierungsprotokolle verwendet wurden.
Anti-GST-Seren
Die GST-Fusion wurde konstruiert, indem das vollständige LKP-Tip-Gen, einschließlich der Signalsequenz, verwendet wurde. Das Gen wurde aus PHF1 mit den geeigneten Restriktionsenzym-Spaltstellen für die Insertion in pGEX-3X im Raster durch PCR vermehrt und in E. coli DH5α exprimiert. Die Zellen wurden in SOB, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin gezüchtet, und mit IPTG bei 0,2 mM zwei Stunden bei 37°C induziert. Die Zellen wurden geerntet und in PBS gewaschen, danach in PBS resuspendiert und lysiert, indem sie durch eine French-Press-Zelle passiert wurden. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation geerntet und dreimal mit Puffer, der 1% Triton X-Zwittergent 3–14 enthielt, gewaschen, anschließend wurden die Einschlusskörper durch Zentrifugation gewonnen. Die Einschlusskörper wurden in 5 M Guanidin-HCl solubilisiert und durch SDS-PAGE analysiert. Die Guanidin-Konzentration wurde durch Dialyse auf 2,5 M abgesenkt und die löslichen Einschlusskörper wurden bei 4°C gelagert. Die Antiseren wurden hergestellt, indem präparative 10% SDS-PAGE-Gele laufen gelassen wurden und jeweils die Fusionsbande aus dem Gel ausgeschnitten wurde. Die Acrylamid-Protein-Bande wurde mit einem Skalpell zerkleinert und mit MPL (100 μg) gemischt und sodann den Mäusen dreimal in den Wochen 0, 4 und 6 injiziert. Die Mäuse wurden in der Woche 8 ausgeblutet.
Beispiel 7
Entfernung, Reinigung und Identifizierung des LKP-Pilus-Tip-Adhäsin-Proteins von H. influenzae
Hierdurch wird erstmals gezeigt, dass das Tip-Adhäsin-Protein aus H. influenzae-LKP1-Pili ohne Depolymerisation der Pilus-Stäbchen entfernt werden kann. Freies Tip-Adhäsin-Protein kann isoliert und gereinigt werden, indem Dialyse und präparative Elektrophorese angewendet werden. Das gereinigte Tip-Adhäsin kann unter Verwendung der Western-Blot-Analyse durch das Antiserum identifiziert werden, das anhand eines konstruierten genetischen Fusionsproteins erhalten wurde, das von einem Teil des LKP1-Tip-Gens und dem Gen des MBP (Maltose- bindenden Proteins) stammt. Eine spezifische Bindung wurde zwischen dem gereinigten Tip-Protein und dem Fusionsprotein-Antiserum nachgewiesen, dies zeigt deutlich, dass es sich bei dem aus dem LKP1-Pilus-Präparat gereinigten Protein um das LKP1-Tip-Adhäsin-Protein handelt.
Aktivitätstests mit menschlichen Erythrocyten-(RBC-)Ghosts zeigten, dass das gereinigte Tip-Protein an ein natives Ghosts-Präparat bindet, dass es jedoch nicht an denaturierte RBC-Ghosts bindet, dies macht deutlich, dass das gereinigte Tip-Protein biologisch funktionell oder zumindest teilweise funktionell ist.
Entfernung des Tip-Proteins aus Pilus-Stäbchen

1. Dialysieren gereinigter LKP1-Pili in 200 mM Gly-HCl-Puffer, pH 2,0, enthaltend 5 M NaCl, bei Raumtemperatur vier bis sechs Stunden.
2. Überführen des Dialyseschlauchs in einen 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, und mehrere Stunden Dialysieren, bis der pH-Wert des Pilus-Präparats auf pH 8,0 kommt.
3. Zufügen von SDS zum Pilus-Präparat auf eine Endkonzentration von 0,1% und Inkubieren bei 4°C zehn Stunden.
4. Dialysieren des Pilus-Präparats in 50 mM Citrat-Puffer, pH 5,0, über Nacht.
5. Pilus-Aggregate können abzentrifugiert werden, wobei der größte Teil des freien Tip-Proteins im Überstand verbleibt.

Das Tip-Protein kann durch 2% SDS in 25 mM Tris-Puffer vollständig entfernt werden, und zwar ohne Depolymerisation der Pilus-Stäbchen, wobei jedoch das SDS möglicherweise die Aktivität des Proteins schädigt. 0,1% SDS entfernt nur 20 bis 30% des gesamten Tip-Proteins, wobei das Protein jedoch seine biologische Aktivität beibehält. Außerdem zeigten die Ergebnisse, dass das Tip-Protein durch 4 M Harnstoff und 2 M GuHCl in Puffer, pH 2,0, von den Pilus-Stäbchen teilweise entfernt werden kann, ohne dass es zur Depolymerisation kommt.
Reinigung des Tip-Proteins

1. Mischen des eingeengten Tip-Proteins mit SDS-PAGE-Probenbehandlungs-Puffer ohne SDS und β-Mercaptoethanol. Das Verhältnis beträgt 2,5 ml des Pilus-Präparats zu 0,3 ml Probenbehandlungs-Puffer.
2. Auftragen der Probe auf ein 12% SDS-PAGE (0,1% SDS) in einer Prep-Cell (Bio-Rad), wobei die Länge des Sammelgels 0,8 bis 1,0 cm und des Laufgels 5 cm beträgt.
3. Laufenlassen des Gels bei 300 Volt mit einem Kühlsystem sechs bis acht Stunden und Überwachen der Elution bei 280 nm.
4. Vereinigen der Fraktionen, die das Tip-Protein enthalten, und Einengen.
5. Bestimmen der Reinheit der vereinigten Fraktionen durch Mini-SDS-PAGE. Die Identifizierung des gereinigten Tip-Proteins durch anti-KLP1-MBP-Fusionsprotein ist in 4 dargestellt. Die Bindungsaktivität des gereinigten Tip-Proteins mit menschlichen Erythrocyten-Ghosts ist in den 5 und 6 dargestellt. In 7 werden Adhäsin-Proteine aus Pili unterschiedlicher LKP-Typen durch SDS/PAGE verglichen.

Beispiel 8
Analyse des Serotyps
Der Haemophilus influenzae-(Hflu-)Bacterioplex ist ein differenzierter Komplex von bakteriellen Phasen oder Zelltypen, die sozial organisiert sind, um die Protein-Anhängsel zu unterstützen, die auf der Oberfläche von Hflu exprimiert werden und die außerdem aus Hflu in freier Form ausgeschieden werden, wobei sie spezifische Adhäsions-Determinanten für die Bindung an menschliche Zellmembranrezeptoren tragen. Anhand der Pili werden die pathogenen Bakterien an ein Leben in Wirbeltier-Wirten angepasst, indem sie die Funktionen der eigenen Proteine des Wirts nachahmen. Zu den Pilus-Funktionen zählen das Anlagern von Bakterien an eine Vielzahl von Wirtszellen und Geweben und das Stimulieren des Immunsystems des Wirts in einer Weise, so dass die Bakterien begünstigt werden und der Wirt geschädigt wird. Pili dienen bei den meisten Bakterienkrankheiten als Faktoren für die Übertragung, Virulenz, Keimstreuung, Pathogenität und Immunität.
Die Expression von Pili wird durch einen genetischen Umschaltmechanismus, eine Phasenvariation, gesteuert, wobei die Pilus-Expression und der Pilus-Typ mit Wahrscheinlichkeiten an- und ausgeschaltet werden, die mit Bedingungen und Signalen in der unmittelbaren Umgebung der Bakterien variieren und dadurch bestimmt werden. Unter einigen Bedingungen können die Umschalt-Wahrscheinlichkeiten sehr hoch sein, z.B. etwa 10^–2 pro Bakterienzellteilung. Unter anderen Bedingungen der Umgebung kann die Wahrscheinlichkeit der gleichen Phase-Umschaltung bei 10^–6 oder darunter liegen. Die Phasen-Umschaltung wird von sowohl reversiblen als auch irreversiblen Umlagerungen in der DNA von Pilus-Operons begleitet. Die Phasen-Umschaltung während der in vitro-Züchtung geht häufig mit Deletionen an Pilus-Operon-Genen einher, so dass die keine Pili aufweisenden Phasen in diesem Stadium irreversibel bleiben.
Durch Reinigen von Hflu-Pili aus verschiedenen Isolaten und Erzeugen von Antiseren gegen die gereinigten Präparate wurden bisher verschiedenartige LKP-Pilus-Serotypen identifiziert. Die Expression der verschiedenen Serotypen wird als Marker eingesetzt, um die verschiedenen Piliations-Phasen des Hflu-Bacterioplexes zu identifizieren. Tabelle 1

L = 1: ist eine Länge < 0,2 μm
L = 2: ist eine Länge < 0,2 μm < 0,5 μm
L = 3: ist eine Länge < 0,5 μm
D = 3: ist ein Durchmesser von 3 nm („dünn")
D = 4: ist ein Durchmesser von 4 nm („dick")

Die Häufigkeit jedes LKP-Serotyps wurde für alle serotypisierbaren Kulturen und für alle exprimierenden Kulturen bestimmt, indem die Typen sowohl auf den einzeln expimierenden als auch auf mehrfach exprimierenden Kulturen gezählt wurden. 16 der 20 Serotypen wurden auf in typischer Weise LKP-Pili-aufweisenden Kulturen gefunden, und 90% dieser Kulturen konnten in dem 20-Typ-System einem Serotyp zugeordnet werden. Die Häufigkeitsverteilung von Serotypen für diese Kulturen ist in Tabelle 1 dargestellt.
Drei verschiedene LKP-Pilus-Operon-Gene wurden selektiert, das Pilin-Gen, das Anker-Gen und das Adhäsin-Gen, die alle bei verschiedenen Serotypen in mehrfachen Sequenz-Ausrichtungen Sequenzähnlichkeiten aufwiesen, die jedoch auch für Hflu-LKP-Pili charakteristisch waren. Aus diesen Genen wurden Sequenzen selektiert, die als geeignete Primersequenzen, die das jeweilige Gen flankieren, zur Verwendung in einer PCR-Reaktion dienen könnten.
Alle drei Paare von Primern wurden synthetisiert und in einer PCR-Reaktion eingesetzt, um Segmente einer DNA zu amplifizieren, die aus Hflu-Isolaten extrahiert wurde.
Die Ergebnisse, die das Vorliegen von LKP-Pilus-Operons in getesteten Haemophilus influenzae-Stämmen zeigen, sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Korrelation zwischen dem Vorliegen von genetischem Material des LKP-Pilus-Operons in H. influenzae-Isolaten und den exprimierten LKP-Parametern von Piliation und Hämagglutination

1. Pilus-Länge 0 bedeutet keine Pili aufweisend;
2. Länge 3 bedeutet > 0,5 μm (die längsten, typisch für LKP-Pili);
3. HA+ bedeutet positiv für Hämagglutination menschlicher Erythrocyten; typisch für LKP-Pili. (Diese Isolate sind per Definition nicht widerstandsfähig („recalcitrant");
4. HA– bedeutet negativ für Hämagglutination menschlicher Erythrocyten; typisch für SNN-Pili. (Diese Isolate sind widerstandsfähig, da alle Isolate mindestens einmal hämadsorbiert wurden);
5. Pilus-Durchmesser 3 bedeutet, dass die Isolate Pili mit Durchmessern exprimieren, die für SNN-Pili typisch sind;
6. Pilus-Durchmesser 4 bedeutet, dass die Isolate Pili mit Durchmessern exprimieren, die für LKP-Pili typisch sind;
7. Serotypisierbar bedeutet, dass die Isolate unter Standardbedingungen mit mindestens einem der LKP-Pilus-typisierenden Antiseren in dem 1-20-System agglutinieren;
8. Nicht-serotypisierbar bedeutet, dass die Isolate mit keinem der LKP-Pilus-typisierenden Antiseren in dem 1-20-System agglutinieren.

Beispiel 9
Hybridisierungstest für die Konstruktion einer Haemophilus influenzae-Testsonde
Ein etwa 1100 bp großes Fragment aus dem Plasmid pHF1 (Karasic, R., et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (Erg.): S62–65, 1988), welches das LKP1-Serotyp- Operon enthält, wurde durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die mit den 5'- und 3'-Enden des hipA-Gens hybridisieren. Dieses Gen codiert das Tip-Adhäsin-Protein der LKP1-Pili. Bei der PCR-Reaktion wurde Digoxigenin-markiertes dUTP zusammen mit den vier dNTPs eingesetzt, so dass das PCR-Reaktionsprodukt mit Digoxigenin markiert wurde. Diese Sonde wurde auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und gereinigt, indem die etwa 1,2 kb große Bande ausgeschnitten und die DNA durch Standardverfahren extrahiert wurde. Die Sonde wurde in 30 μl eines geeigneten Puffers wieder gelöst.
Hybridisierungstest
Elf zufällig ausgewählte klinische Haemophilus influenzae-Isolate wurden auf BHI-XV-Platten bei 37°C mit 5% CO₂ gezüchtet und außerdem auf BHI-Agar ausgestrichen. Alle Isolate wuchsen nur auf der BHI-XV-Platte, dies zeigt, dass es sich um H. influenzae handelte. Die Isolate umfassten zwei Hib-Stämme und neun NTHi. Die Stämme wurden auf eine Nylonmembran geimpft, die auf BHI-XV-Agar gelegt wurde. Außerdem wurden fünf klinische Isolate eines anderen Atemwegs-Pathogens, Moraxella catarrhalis, auf das Filter getüpfelt. Die Bakterien wurden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Nach dem Züchten wurden zwei Bordetella pertussis-Stämme auf das Filter getüpfelt. An den Filtern wurde eine Koloniehybridisierung gemäß dem Verfahren von Maniatis et al. durchgeführt (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1991, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). Die Filter wurden in Prähybridisierungslösung bei 65°C drei Stunden blockiert, wie von Boehringer-Mannheim für das Genius^TM-System beschrieben. Kolonietrümmer wurden durch vorsichtiges Abreiben mit feuchten Papiertüchern entfernt. Die Sonde, 30 μl, wurde zu 5 ml der Prähybridisierungslösung zugegeben und zehn Minuten gekocht, um die DNA zu denaturieren. Die Sonde wurde unmittelbar zu dem Filter zugegeben und die Hybridisierung über Nacht bei 65°C zugelassen. Die Filter wurden in 2 × SSC, 0,1% SDS, zweimal fünf Minuten pro Waschgang bei Raumtemperatur gewaschen, worauf zwei 15-Minuten-Waschgänge mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS, bei 65°C folgten. Die gebundene Sonde wurde unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxigenin-Antikörpern, wie vom Hersteller beschrieben, nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3 Hybridisierung einer Dig-markierten LKP1-Tip-Sonde mit zufälligen klinischen Isolaten
Die Sonde war für H. influenzae spezifisch, wobei weder mit M. catarrhalis noch mit B. pertussis eine Hybridisierung zu sehen war.
Hybridisierungstest von Pili von nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae-Stämmen
Zehn LKP-Pili-exprimierende NTHi-Stämme, die unterschiedliche Serotypen von LKP-Pili exprimieren, und Hib Eagan wurden auf einem Nylon-Filter, das auf Schokoladen-Agar aufgelegt war, bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Außerdem war noch ein weiteres NTHi-Isolat enthalten. Nach dem Wachstum waren zwei Stämme auf dem Filter gelb, dies ließ vermuten, dass es sich um Non-Haemophilus-Bakterien handelte, deshalb wurden sie durch Wachstum auf BHI- und BHI-XV getestet. Dieses Experiment zeigte, dass sie Verunreinigungen und keine NTHi waren. Das Filter wurde von dem Agar entfernt und, wie vorstehend beschrieben, bearbeitet. Die Sonde aus dem ersten Experiment wurde erneut gekocht und wie vorstehend zum Filter zugegeben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierungstemperatur auf 62°C erniedrigt wurde. Das Filter wurde wie vorher gewaschen, mit der Ausnahme, dass die Waschtemperatur auch 62°C betrug. Die gebundene Sonde wurde wie vorstehend nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 Hybridisierung einer Dig-markierten TKP-Tip-Sonde mit LKP-Typ-Stämmen
Die vorstehend dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Sonden selektiv mit Haemophilus influenzae hybridisierten.
Für den Fachmann werden zahlreiche gleichwertige Formen der hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen ersichtlich sein, oder er wird in der Lage sein, diese unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten zu bestimmen.
Tabelle 5
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer isolierten Nucleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nucleotiden 6955 bis 8265 der Tabelle 5; b) Nucleinsäuresequenzen, die mit den Nucleotiden aus a) unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren; und c) RNA-Sequenzen, transkribiert von den Nucleotiden aus a) oder b); und ii) einer isolierten DNA-Sequenzen, die mit einer DNA- Sequenz, die nicht typisierbares Haemopilus influenzae Serotyp 1 LKP Tip-Adhäsin-Protein kodiert, unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die DNA-Sequenz, die das Serotyp 1 LKP Tip-Adhäsin-Protein kodiert, aus den Nucleotiden 6955 bis 8265 von Tabelle 5 besteht.
Isoliertes, nicht typisierbares Haemophilus influenzae Protein, umfassend: ein Serotyp 1 LKP Tip-Adhäsin-Protein mit der durch das ORF der Nucleotide 6955 bis 8265 von Tabelle 5 kodierten Aminosäuresequenz, und biologisch aktive Fragmente davon, die sich an native Erythrozyten-Ghost-Präparate binden, aber an denaturierte Erythrozyten-Ghosts nicht binden.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Insert, wobei das genannte DNA-Insert mit dem Komplement einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die nicht typischerweise Haemophilus influenzae LKP Tip-Adhäsin-Protein unter hochstringenten Bedingungen kodiert, wobei die genannte Nucleotidsequenz aus den Nucleotiden 6955 bis 8265 der Tabelle 5 besteht, wobei der genannte Expressionsvektor ein nicht typisierbares Haemophilus influenzae Tip-Adhäsin-Protein in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle exprimiert.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das DNA-Insert ein Protein kodiert, umfassend die durch das ORF der Nucleotide 6955 bis 8265 der Tabelle 5 kodierten Aminosäuresequenz.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 3.
In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines nicht typisierbaren Haemphilus influenzae Proteins nach Anspruch 2 unter Verwendung des rekombinanten Expressionsvektors aus Anspruch 3 in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, umfassend das Transfizieren der Wirtszelle mit dem rekombinanten Expresionsvektor und Halten der transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression von nicht typisierbaren Haemophilus influenzae LKP Pilusproteinen in der Wirtszelle geeignet sind.