ES2281914T3 - Antigeno del grupo de union a adhesina de helicobacter pylori. - Google Patents
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Abstract
SE HA AISLADO Y PURIFICADO UNA NUEVA PROTEINA DE ADHESINA DE FIJACION AL ANTIGENO DE UN GRUPO SANGUINEO (BAB) DEL HELICOBACTER PYLORI, CARACTERIZADA PORQUE DICHA PROTEINA O FRACCIONES DE LA MISMA SE FIJAN ESPECIFICAMENTE A ANTIGENOS DE GRUPOS SANGUINEOS FUCOSILADOS. EN LA PRESENTE SOLICITUD SE EXPONE LA SECUENCIA PROTEINICA DE DICHA ADHESINA. AL MISMO TIEMPO SE REVELAN LAS SECUENCIAS DE DNA DE DOS GENES, BABA Y BABB, QUE PRODUCEN PROTEINAS MUY SIMILARES. DICHOS ADHESINA Y/O DNA SON UTILES PARA EL DIAGNOSTICO Y TERAPIA Y/O PROFILAXIS DIRIGIDAS CONTRA LAS INFECCIONES INDUCIDAS POR EL H. PYLORI, POR EJEMPLO, LA GASTRITIS Y LOS TRASTORNOS PEPTICOS ACIDOS, POR EJEMPLO, LA VACUNACION ACTIVA. UNA NUEVA COMPOSICION INMUNOGLOBULINA, QUE MUESTRA ACTIVIDAD ESPECIFICA A UNA ADHESIDA DEL HELICOBACTER PYLORI DE FIJACION AL ANTIGENO DE LEWISB, O PREFERENTEMENTE ANTICUERPOS MONOCLONALES Y/O POLICLONALES A DICHA ADHESINA, OFRECE UN NUEVO Y MAS EFICIENTE PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCION DE ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES, CAUSADAS POR LAS ESPECIES DE HELICOBACTER PYLORI U OTRAS ESPECIES DE HELICOBACTER, POR EJEMPLO, EN LA VACUNACION PASIVA.
Description
Antígeno del grupo de unión a adhesina de
Helicobacter pylori.
La presente invención se refiere a materiales y
métodos para la prevención, tratamiento y diagnóstico de infecciones
causadas por Helicobacter pylori. Más específicamente, la
presente invención se refiere a polipéptidos y anticuerpos útiles
en vacunas para el tratamiento y prevención de infecciones
patológicas causadas por cepas de Helicobacter pylori. La
presente invención se refiere específicamente a una adhesina
bacteriana de unión a antígeno del grupo sanguíneo (adhesina BAB).
La presente invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos
útiles para la producción recombinante de dichos polipéptidos y
para el uso en terapias de inmunización. Además, se refiere a
polipéptidos, anticuerpos, y polinucleótidos usados para la
detección de dichas bacterias.
La presente invención se refiere adicionalmente
a nuevas inmunoglobulinas, que muestran actividad específica frente
a una adhesina de unión a grupo sanguíneo, expresada por
Helicobacter pylori, y a su uso. La presente invención es
útil para el tratamiento y prevención de infecciones inducidas por
H. pylori en el tracto gastrointestinal.
Helicobacter pylori es un agente
causante de la enfermedad ácido péptica y la presencia de este
organismo está altamente correlacionada con el desarrollo de
adenocarcinoma gástrico. La adherencia bacteriana al revestimiento
del epitelio gástrico humano demostró recientemente estar mediada
por antígenos del grupo sanguíneo fucosilados.
Las recientes investigaciones se han centrado en
el papel de Helicobacter pylori en el desarrollo de úlceras
en la mucosa gástrica. Los descubrimientos recientes muestran una
fuerte conexión entre Helicobacter pylori y gastritis
crónica activa y úlceras gástricas. Además, parece haber una fuerte
correlación entre cáncer ventricular y úlceras gástricas. El
tratamiento tradicional de las úlceras gástricas ha implicado la
resección gástrica, la administración de composiciones de bismuto,
la administración de bloqueantes de H_{2} y la administración de
agentes tamponantes del pH, por mencionar unos pocos ejemplos.
Más recientemente, diversas formas de
tratamiento se han suplementado con la administración de
antibióticos. Un problema con los tratamientos actualmente
conocidos es el riesgo de fallo del tratamiento. Además, no sólo
los microbios desarrollan resistencia a antibióticos, los
antibióticos administrados a menudo alteran el equilibrio natural
de los microbios benignos, que colonizan el tracto intestinal. Esto
conduce a diarrea y a otros signos de molestias intestinales,
además de desestabilizar la flora benigna en los intestinos. Otros
tratamientos, por ejemplo bloqueantes de H_{2} a menudo requieren
una medicación de por vida para evitar la recurrencia de la
enfermedad.
Lo anterior, junto con el hecho de que H.
pylori está muy ampliamente propagado entre los seres humanos -
de acuerdo con una estimación conservativa, aproximadamente el 60%
de todos los adultos humanos en los países industrializados están
infectados - hace que el diagnóstico, prevención y tratamiento de
infecciones por H. pylori sea una tarea urgente.
Además, el hecho de que los países en desarrollo
frecuentemente carezcan de los recursos para el tratamiento
convencional de las úlceras gástricas pone de relieve adicionalmente
la importancia de encontrar nuevos modos de tratamiento y
prevención de infecciones inducidas por H. pylori. Es obvio,
por muchas razones, que la prevención de la enfermedad con vacunas
es un modo preferible. Una vacuna proporcionaría un régimen
profiláctico administrado fácilmente y económico contra infecciones
por H. pylori. Sin embargo, actualmente se carece de una
vacuna eficaz contra H. pylori.
H. pylori coloniza la mucosa gástrica
humana, en un equilibrio entre la adherencia a las células de la
mucosa de la superficie epitelial y la capa mucosa que recubre el
epitelio gástrico. Una vez infectado, parece que las bacterias
colonizan durante toda la vida. La unión al revestimiento epitelial
protege a las bacterias de los efectos
anti-microbianos del jugo gástrico ácido de la luz
del estómago, así como de las fuerzas físicas tales como la
peristalsis. Para la supervivencia en este nicho ecológico hostil,
H. pylori ha desarrollado una batería de factores de
virulencia (véase Clyne M, Drumm B. Cell envelope characteristics of
Helicobacter pylori: their role in adherence to mucosal
surfaces and virulence. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996 Dec
1; 16(2): 141-55); tales como la producción
de la enzima ureasa que tampona el microambiente alrededor de las
bacterias y los flagelos polares para asegurar una elevada
movilidad, un prerrequisito en un nicho ecológico donde la
renovación de la capa mucosa está en el intervalo de horas. Un
subconjunto de cepas de H. pylori produce la citotoxina
vacuolante, VacA, y el antígeno CagA asociado a
citotoxina.
citotoxina.
La unión es esencial para la colonización del
revestimiento epitelial y las bacterias expresan moléculas de
adhesión asociadas a la superficie que reconocen receptores de
carbohidratos y proteínas específicos en las superficies celulares
o el revestimiento de la mucosa. La especificidad en esta
interacción en combinación con la distribución de receptores
regulada genéticamente provoca un intervalo restringido de linajes
celulares y tejidos disponibles para la colonización. Se han
descrito varias estructuras de receptores putativos para H.
pylori, tales como la hemaglutinina-ácido siálico,
glucoconjugados sulfatados y sulfatidas. Recientemente, se
describieron los antígenos H-1 y Lewis^{b} del
grupo sanguíneo fucosilados (Borén et al., Science, 262,
1892, 1993), que median la adherencia específica de H. pylori
a las células de la mucosa de la superficie gástrica de seres
humanos y monos rhesus in situ. Los antígenos
H-1 y Lewis^{b} son parte de los antígenos de
grupo sanguíneo que definen el grupo sanguíneo O en el sistema ABO.
Un artículo reciente se refiere a la identificación de una adhesina
de H. pylori que se une a varios antígenos de grupo sanguíneo
incluyendo Lewis b. (Alkout AM, Blackwell CC, Weir DM, Poxton IR,
Elton RA, Luman W, Palmer K. Isolation of a cell surface component
of Helicobacter pylori that binds H type 2, Lewis(a),
and Lewis(b) antigens. Gastroenterology. 1997 Abr;
112 (4): 1179-87). Se eluyó una proteína de 61
kilodalton.
Las proteínas expresadas en la superficie a
menudo son constituyentes de la membrana externa. La membrana
externa tiene un papel estructural y funciona como barrera
selectiva, determinando lo que entra a la célula y las moléculas
que se secretan. Una clase de proteínas de membrana externa se
llaman porinas, y crean poros hidrófilos a través de la membrana
externa donde pueden cruzar metabolitos específicos, tales como
moléculas de azúcar. Recientemente se presentó el descubrimiento de
varias proteínas de membrana externa en H. pylori,
sugiriendo dichas proteínas como constituyentes de una familia de
proteínas porinas.
La adhesina BAB se ha identificado previamente y
demostró que estaba localizada en la superficie bacteriana de H.
pylori (véase la solicitud de prioridad SE
9602287-6). La actividad de unión a grupo sanguíneo
demostró ser dependiente del pH y en la presente invención se
presentan evidencias de que la afinidad de unión al receptor
Lewis^{b} revela una constante de equilibrio elevada. Para la
purificación de la adhesina BAB, se usó un conjugado de
reticulante-receptor marcado para mediar la
transferencia específica de la biotina a las adhesinas en la
superficie bacteriana. Después de ello pudo extraerse la adhesina
marcada con biotina mediante perlas magnéticas recubiertas con
estreptavidina. La determinación de la secuencia de aminoácidos
amino-terminal de la adhesina BAB purificada
muestra homologías con las proteínas de membrana externa de las
porinas de H. pylori.
Se han dirigido investigaciones intensivas al
tratamiento inmunológico y prevención de infecciones inducidas por
H. pylori. El documento EP 0 484 148 (Ando & Nakamura)
describe un método para tratar y/o prevenir enfermedades del tracto
gastrointestinal superior en mamíferos, comprendiendo dicho método
la administración oral a un paciente que lo necesita una cantidad
eficaz de una composición farmacéutica que comprende
inmunoglobulinas policlonales anti-Helicobacter pylori y un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha descripción hace
hincapié adicionalmente en la combinación de dicho tratamiento en
combinación con la administración de antibióticos. En cuanto al
método para producir dichos anticuerpos policlonales, el documento
EP 0 484 148 describe el aislamiento y purificación de
inmunoglobulinas anti-H. pylori a partir de suero y leche de
mamíferos. La propia H. pylori no se encontró en los
estómagos de vacas, cabras, ovejas, cerdos o caballos, de acuerdo
con el documento EP 0 484 148, pero se supuso que estas especies
animales tienen microorganismos colonizantes con determinantes
antigénicos similares a los de H. pylori porque tienen
inmunoglobulinas que reaccionan de forma cruzada con las cepas de
H. pylori encontradas en seres humanos. Preferiblemente, de
acuerdo con el documento EP 0 484 148, se inmunizan mamíferos
superiores, por ejemplo vacas preñadas, con células completas de
H. pylori y posteriormente se extraen las inmunoglobulinas
de la leche o calostro. En los experimentos de inmunización, se usó
de la cepa NCTC 11362 y el aislado clínico de H. pylori Nº
153 para desencadenar la producción de inmunoglobulinas. Por otra
parte, se usó la cepa NCTC 11637 para propósitos de análisis. Se
reivindica que la inmunización produce un título anti-H.
pylori en la leche de tal magnitud que dosis diarias de
0,01-0,1 g/día de composición de inmunoglobulina,
son suficientes para una terapia exitosa. El intervalo reivindicado
de 0,01-0,1 g/día, sin embargo, no está apoyado por
los experimentos presentados por Ando y Nakamura y por tanto dosis
bajas hasta ahora no han demostrado eficacia en ensayos clínicos.
Las dosis realmente usadas en el ejemplo 5 y 7 son del orden de
magnitud de 1 g/día, es decir, 10 veces el límite superior del
intervalo dado. Además, es poco probable que las mezclas de
inmunoglobulina no específicas como las fabricadas por Ando y
Nakamura, sean eficaces en las dosis reivindicadas ya que dosis
similares son ineficaces contra otros patógenos gastrointestinales.
La administración simultánea de antibióticos, analizada ampliamente
en la descripción, pone de relieve la insuficiencia de las
inmunoglobulinas descritas.
El documento EP 0 469 359 (Cordle y Schaller)
describe asimismo la inmunización de mamíferos, preferiblemente
vacas preñadas, con bacterias de H. pylori eliminadas con
formalina (Cepa de la ATCC 26695). Se aislaron anticuerpos
policlonales anti-H. pylori y se purificaron de la leche y
finalmente se suministraron a crías de cerdo, en cantidades de
aproximadamente 0,5 g de inmunoglobulina, tres veces al día. Los
resultados se evaluaron por determinación de la cantidad de
muestras de biopsia, que eran positivas para bacterias Gram
negativas después del ensayo. Se encontraron bacterias Gram
negativas en el 78% de las crías de cerdo alimentadas con un
nutriente no inmune pero solamente (Sicl) en el 35% de las crías de
cerdo alimentadas con un nutriente que contenía los llamados
anticuerpos anti-H. pylori específicos.
Los anticuerpos policlonales anti-H.
pylori, eficaces para causar la agregación de H. pylori,
por tanto se han administrado por vía oral como un régimen en el
tratamiento y prevención de infecciones inducidas por H.
pylori en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, como también
se indica en el documento EP 0 484 148 A1, aún no está claro cómo
muchos determinantes antigénicos están presentes en la superficie de
H. pylori. La existencia de una amplia diversidad de cepas
de H. pylori hace cuestionable la eficacia práctica de
cualquiera terapia inmunológica policlonal de acuerdo con el estado
de la técnica. La inmunización usando bacterias completas siempre
desencadenará una respuesta inmune elevadamente policlonal con un
bajo nivel de anticuerpos contra un determinante antigénico dado.
Esto se pone de relieve por ejemplo por los resultados presentados
por Cordle y Schaller, donde, aunque la cantidad de biopsias
positivas a Helicobacter estaba reducida, no se obtuvo una
cura completa a través del tratamiento de acuerdo con su
invención.
Es notable que la dosis de inmunoglobulina
necesaria para profilaxis o terapia oral aún no se haya definido
claramente. En un adulto humano normal, se producen y se secretan a
las superficies mucosas aproximadamente 5 g de IgA cada día.
Obviamente, dosis de esta magnitud son económica y prácticamente
inviables para una terapia o profilaxis a gran escala. En estudios
sobre el efecto de la inmunoglobulina oral sobre infección por
rotavirus, se han intentado dosis diarias en el intervalo de 600 a
9000 mg en ensayos clínicos. También se ha informado de una
intervención exitosa cuando se tratan infecciones por H.
pylori y criptosporidios con administraciones diarias de 3 a 15
g de inmunoglobulina de vacas inmunizadas (Hammarström et
al., Immunol Rev, 139 (1994) 43-70). Hablando
en líneas generales, todos los estudios hasta la fecha indican la
necesidad de usar elevadas dosis de inmunoglobulinas cuando se
intenta combatir una infección en curso. Por tanto la necesidad de
preparaciones de inmunoglobulina más específicas, que permitan el
uso de dosis más pequeñas, es una necesidad urgente.
Para maximizar la potencia de un régimen
inmunológico para el tratamiento y prevención de H. pylori,
es de gran importancia encontrar un determinante antigénico
conservado específico, que juega un papel central en la
patogenicidad de H. pylori. Usando dicho determinante
antigénico sería posible producir preparaciones de inmunoglobulina
policlonal y/o monoclonal nuevas altamente específicas y
terapéuticamente eficaces.
El problema anterior de proporcionar
preparaciones de inmunoglobulina específicas, rentables y
terapéuticamente superiores para el tratamiento y prevención de
H. pylori ahora se ha resuelto mediante la composición de
acuerdo con las reivindicaciones de patente adjuntas. En la
presente invención ahora se ha demostrado sorprendentemente que
pueden proporcionarse preparaciones de inmunoglobulina policlonal
y/o monoclonal altamente específicas y terapéuticamente eficaces a
través de la inmunización de un animal con una proteína adhesina,
específica para H. pylori. Dicha proteína adhesina está ya
caracterizada en las solicitudes de prioridad SE
9602287-6 y SE 9701014-4, que se
incorporan como referencia por la presente en su totalidad. La
invención ahora se describirá con mayor detalle con referencia a
las figuras y ejemplos adjuntos, no limitantes.
Un objeto de la presente invención fue purificar
y caracterizar adicionalmente la adhesina de unión a antígeno de
grupo sanguíneo (BAB) de H. pylori para hacer posible el
desarrollo de métodos y materiales para el diagnóstico específico y
selectivo y el tratamiento de infecciones inducidas por H.
pylori y enfermedades relacionadas y el desarrollo de dichos
métodos y materiales. Un objeto adicional e igual de importante fue
determinar las secuencias de ADN de los genes implicados en la
expresión de esta proteína. Estos objetos se cumplieron a través de
la proteína especificada en la reivindicación 1, el ADN descrito en
las reivindicaciones 12 y 13 y los métodos y materiales
especificados en las reivindicaciones posteriores. Las secuencias de
ADN originalmente presentadas se muestran en las Tablas 2 y 3 que
describen las secuencias de babA y babB, respectivamente. La
secuencia proteica completa se describe en la
Tabla 4.
Tabla 4.
La Fig. 1A) ilustra la unión bacteriana a
antígenos solubles de grupo sanguíneo. Se incubaron cepas de H.
pylori con glucoconjugados de antígeno de grupo sanguíneo
marcado con ^{125}I y se midió la actividad ^{125}I unido
(Obsérvese la ausencia de unión del antígeno de grupo sanguíneo
mostrada para las cepas MO19 y 26695).
La Fig. 1B) ilustra un ensayo de desplazamiento
de receptor. Primero se incubó la cepa CCUG 17875 con 10 ng de
glucoconjugado de antígeno Le^{b} marcado con ^{125}I y después
se expuso el complejo (1 h) a un exceso de glucoconjugado de
Le^{b} o Le^{a} no marcado, antes de que se midiera la actividad
de ^{125}I en el sedimento bacteriano. Las concentraciones del
glucoconjugado no marcado variaron de 50 ng a 8 \mug y C) muestra
los resultados de un análisis de Scatchard de la interacción de
H. pylori-antígeno Le^{b}. La unión bacteriana al
glucoconjugado de Le^{b} se valoró a un valor de constante de
afinidad (Ka) de 8 x 10^{-10} M^{-1} (13).
La Fig. 2: Panel superior: Dominancia de la
adhesina BabA en la población bacteriana. Las células de la cepa
CCUG 17875 se incubaron con glucoconjugado de Le^{b} biotinilado
(A) o Le^{b} (B). Se detectó el conjugado de Lewis biotinilado
unido con FITC-estreptavidina marcada (fluorescencia
verde) y se tiñeron con contraste las bacterias con yoduro de
propidio (fluorescencia roja). Panel inferior: Localización de la
adhesina BabA. Para microscopía electrónica (15) se incubaron
células de la cepa CCUG 17875 con Le^{b} (C) o Le^{a} (D)
biotinilado.
La Fig. 3 muestra la caracterización del peso
molecular de la adhesina BabA por el uso del análisis de
superposición de receptor (A, B) y el marcaje de BabA por afinidad
dirigida por la actividad del receptor (C).
La Fig. 4 muestra el marcaje de afinidad
dirigido por la actividad del receptor y la purificación de proteína
de la adhesina BabA.
La Fig. 5 muestra las secuencias de aminoácidos
traducidas para los genes babA y babB, correspondientes al dominio
N-terminal de la adhesina BabA.
La Fig. 6 muestra el porcentaje de inhibición de
la unión de H. pylori al antígeno de Lewis b marcado con
^{125}I para diferentes preparaciones como función del título de
anticuerpo.
La Fig. 7 muestra una detección por
transferencia de Western de la adhesina BabA por las diferentes
preparaciones de anticuerpo.
La Fig. 8 muestra cuatro análisis de
transferencia de Western de proteínas de H. pylori por las
diferentes preparaciones de anticuerpo.
La adhesina de unión a antígeno de grupo
sanguíneo, BabA, ahora se ha caracterizado bioquímicamente y se ha
purificado por una nueva técnica, el Marcaje de Afinidad Dirigido
por la Actividad del receptor (Remarcaje). Se descubrió que dos
genes, babA y babB codifican dos proteínas diferentes pero muy
similares. La presente invención, por tanto, comprende una nueva
adhesina de unión a antígeno de grupo sanguíneo de acuerdo con la
reivindicación 1 y las reivindicaciones posteriores. Las secuencias
de ADN se describen en las tablas 2 (babA) y 3 (babB). La secuencia
de la proteína se describe en la tabla 4. La invención también
incluye cualquier composición farmacéutica que comprende dicha
proteína a adhesina y/o fracciones de la misma. Ejemplos de dichas
composiciones farmacéuticas son, por ejemplo, medicamentos para la
prevención o tratamiento de gastritis inducida por Helicobacter
pylori, úlceras gástrica y duodenal y adenocarcinoma gástrico.
Opcionalmente, dicha composición farmacéutica incluye
adicionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables.
Además, la presente invención comprende el gen o
genes de la adhesina BAB para la expresión de una proteína adhesina
de acuerdo con la invención. Se describe un nuevo método para el
aislamiento y purificación de dicha adhesión. Se contempla que
dichos genes descritos funcionan como un sistema de casete,
alternando el organismo entre éstos para evitar la inmunidad en el
hospedador. Es muy probable que existan homologías de las secuencias
descritas y que suplementen adicionalmente dicha función de casete
en otras cepas de H. pylori. Además, los genes que
corresponden a una homología de los primeros 40 aminoácidos o genes,
correspondientes a una homología de los últimos aproximadamente 300
aminoácidos, pueden funcionar a este efecto. También es muy probable
que Helicobacter pylori sea capaz de cambiar entre varios
genes, similares a los genes descritos, en un sistema llamado de
casete.
La invención comprende adicionalmente antisueros
monoespecíficos producidos usando la nueva proteína adhesina y/o
fracciones inmunológicamente eficaces de la misma. Dichos antisueros
monoespecíficos se producen preferiblemente de acuerdo con
cualquier método adecuado convencional para producir antisueros
monoespecíficos in vitro o in vivo, por ejemplo,
inoculando un animal adecuado. Dichos métodos son familiares para
los especialistas en la técnica. Los anticuerpos producidos en un
animal adecuado o en el paciente a tratar, pueden administrarse
posteriormente de forma local, por ejemplo, por vía oral al
paciente.
La invención comprende adicionalmente el uso de
dichos antisueros monoespecíficos para la fabricación de un kit de
ensayo para las determinaciones cuantitativas o cualitativas de la
proteína adhesina o fracciones inmunológicamente eficaces de la
misma en células, tejidos o fluidos corporales.
La invención comprende adicionalmente el uso de
dicha proteína adhesina o el ADN correspondiente para la fabricación
de una vacuna y/o en la fabricación de composiciones para dichos
usos. Dicho ADN de la invención puede usarse para terapia de
inmunización y para la fabricación de composiciones para dicha
terapia. Preferiblemente, en una terapia de inmunización en la que
dicha composición se administra por vía oral a un paciente, la
proteína adhesina, fracciones inmunológicamente eficaces de la
misma o dicho ADN se administra en combinación con un agente
inmunoestimulador farmacéuticamente adecuado. Los ejemplos de dichos
agentes incluyen, aunque sin limitación los siguientes: toxina
colérica y/o derivados de la misma, toxinas inestables al calor,
tales como la toxina de E. coli y agentes similares. La
composición de acuerdo con la presente invención puede incluir
adicionalmente adyuvantes convencionales y farmacéuticamente
aceptables, familiares para los especialistas en la técnica de
terapia de inmunización. Preferiblemente, en una terapia de
inmunización que usa el ADN de la invención, dicho ADN se
administra preferiblemente por vía intramuscular, por lo que dicho
ADN se incorpora en vehículos plasmídicos adecuados.
Preferiblemente, puede incorporarse un gen o genes adicionales que
codifican un agente inmunoestimulador adecuado en el mismo
plásmido.
Dichas terapias de inmunización no se restringen
a las vías de administración descritas anteriormente, sino que
pueden adaptarse de forma natural a una cualquiera de las siguientes
vías de administración: oral, nasal, subcutánea e intramuscular.
Especialmente, son prometedores los métodos de administración oral y
nasal, en particular para inmunizaciones a gran escala.
En la presente invención se muestra
sorprendentemente que pueden proporcionarse preparaciones de
inmunoglobulina policlonal o monoclonal altamente específicas y
terapéuticamente eficaces a través de la inmunización de un animal
con una proteína adhesina o fracciones de la misma, específica para
H. pylori. Cuando se considera la inmunización contra H.
pylori, es importante observar que se sabe que la infección es
de por vida a pesar de una respuesta inmune vigorosa en la mucosa
gástrica. Una producción local aumentada de IgA en la mucosa no es
necesariamente suficiente y la administración de anticuerpos
monoespecíficos dirigidos contra un factor virulento central, tal
como la adhesina de acuerdo con la presente invención, puede
constituir un enfoque más eficaz.
El término "inmunización" se refiere en
este documento a un método para inducir un elevado nivel continuo
de respuesta inmune de anticuerpos y/o celular. El término
"animal" en este documento indica preferentemente cualquier
miembro del subfilo Vertebrata, una división que incluye todos los
animales, incluyendo mamíferos, que están caracterizados por una
columna vertebral ósea o cartilaginosa segmentada. Todos los
vertebrados tienen un sistema inmune funcional y responden contra
antígenos produciendo anticuerpos. El término "proteína" se
usa en este documento para indicar un polipéptido de origen natural
y el término "polipéptido" se usa en este documento en su
significado más amplio, es decir, cualquier polímero de aminoácidos
(dipéptido o mayor) unido a través de enlaces peptídicos. Por
consiguiente, el término "polipéptido" comprende proteínas,
oligopéptidos, fragmentos proteicos, análogos, muteínas, proteínas
de fusión y similares. El término "anticuerpo" como se usa en
este contexto incluye un anticuerpo que pertenece a cualquier clase
inmunológica, tal como inmunoglobulinas A, D, E, G o M. Sin
embargo, son de particular interés la inmunoglobulina A (IgA) ya que
ésta es la inmunoglobulina principal producida por el sistema
secretor de los animales de sangre caliente. Sin embargo, en el
calostro de la vaca, la clase de anticuerpo principal
es IgG 1.
es IgG 1.
Borén et al. han aislado recientemente y
caracterizado una proteína de unión a Lewis^{b} con un peso
molecular de aproximadamente 73500 Da (Véanse las solicitudes de
prioridad SE 9602287-6 y SE
9701014-4, de las que se hace referencia en su
totalidad). Se cree que esta proteína adhesina es una estructura
conservada y específica para las cepas patogénicas de H.
pylori. Dicha proteína es específica para al menos una de las
cepas de H. pylori incluidas en el siguiente grupo: CCUG
17875, NCTC 11637, A5, P466, G109, G56, Ba 185, Ba 99, 931 y
932.
Esta proteína adhesina o fracciones
inmunológicamente eficaces de la misma se caracterizan porque
incluyen la siguiente secuencia de aminoácido:
- \quad
- EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.
La siguiente secuencia de ADN se incluye en el
ADN para la expresión de dicha proteína adhesina o fracciones
inmunológicamente eficaces de la misma:
- \quad
- 5'-GAAGACGACGGCTTTTACACAAGCGTAGGCTATCAAATCGGTGAAGCCGCTCAAATGGTA-3'
La composición de inmunoglobulina de la
invención se produce inmunizando un mamífero preñado,
preferiblemente una vaca u otro animal doméstico adecuado, con
dicha proteína adhesina de unión a Lewis^{b} o fracciones
inmunológicamente eficaces de la misma. La proteína adhesina o
fracciones inmunológicamente eficaces de la misma se inyectan
preferiblemente por vía intramuscular o subcutánea en el animal
elegido, opcionalmente junto con adyuvantes adecuados. Los ejemplos
de dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación agentes
inmunoestimuladores tales como toxina colérica y/o derivados de la
misma, toxinas inestables al calor, tales como la toxina de E.
coli y similares, agentes convencionales, tales como adyuvantes
clásicos que incluyen aceites minerales y vegetales. Posteriormente
al régimen de inmunización, que comprende una cantidad necesaria de
dosis, que incluye las llamadas dosis de refuerzo, en un marco de
tiempo que permite la expresión óptima de la inmunoglobulina, se
recoge leche o suero de dicho animal. Preferiblemente, se recoge
calostro de vaca, que es especialmente elevado en inmunoglobulinas.
La fracción de inmunoglobulina específica de acuerdo con la presente
invención después se separa y purifica de un modo convencional,
por ejemplo, incluyendo la separación de grasas, precipitación de
proteínas y concentración por ultrafiltración.
De acuerdo con otro método para producir la
composición de inmunoglobulina de la invención, se inmuniza un ave,
preferiblemente un pollo u otra ave doméstica adecuada, con dicha
proteína adhesina de unión a Lewis^{b} o fracciones
inmunológicamente eficaces de la misma. La proteína adhesina o
fracciones de la misma se inyecta preferiblemente por vía
intramuscular o subcutánea en el ave elegida, opcionalmente junto
con adyuvantes adecuados. Los ejemplos de dichos adyuvantes
incluyen, aunque sin limitación, agentes inmunoestimuladores tales
como toxina colérica y/o derivados de la misma, toxinas inestables
al calor, tales como toxina de E. coli y similares, agentes
convencionales, tales como adyuvantes clásicos que incluyen aceites
minerales y vegetales. Después del régimen de inmunización, que
comprende una cantidad necesaria de dosis, incluyendo las llamadas
dosis de refuerzo, en un marco de tiempo que permite la expresión
óptima de la inmunoglobulina, se recogen los sueros o huevos de
dicho animal. Preferiblemente se recoge la yema del huevo, que es
especialmente elevada en inmunoglobulinas. La fracción específica
de inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención después se
separa y purifica de un modo convencional, por ejemplo, incluyendo
precipitación de proteínas y ultrafiltración. Como alternativa, la
yema del huevo que es de alto valor nutritivo, además de contener un
elevado título de anticuerpos específicos de acuerdo con la
presente invención, puede administrarse como tal.
De acuerdo con un método de producción
preferido, se produce inmunoglobulina monoclonal estableciendo
animales transgénicos. Dichos animales transgénicos pueden elegirse
entre el siguiente grupo de especies: mamíferos, por ejemplo, vaca,
cabra y conejo, y aves: por ejemplo, pollo, pato, pavo. El mamífero
que se usa más preferiblemente es la vaca y el ave más preferible
es el pollo. Desarrollos adicionales de animales transgénicos tales
como ratones y ratas también podrían ofrecer nuevas posibilidades.
La elección del animal está guiada de forma natural por la
disponibilidad y adaptación local.
Por ejemplo, se mantienen localmente un grupo de
animales transgénicos, adaptados a las condiciones locales, por
ejemplo, en pueblos en países en desarrollo que funcionen como
unidades locales para la producción de inmunoglobulinas para la
administración oral. Por ejemplo son adecuados vacas, cabras o
pollos transgénicos para este propósito y preferiblemente se usan
pollos. El consumo de la leche o preferiblemente los huevos,
producidos por los animales transgénicos, pueden ayudar a erradicar
enfermedades infecciones actualmente muy difíciles, por ejemplo
enfermedades causadas por H. pylori.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando el
método de hibridoma. El método de hibridoma es bien conocido para
los especialistas en el campo de la bioquímica y se describe, por
ejemplo, en Galfre, G. y Milstein, C., Preparation of monoclonal
antibodies: strategies and procedures (Methods in Enzymology, 73:
3-46, 1981). Se inmuniza un animal hospedador
adecuado con la proteína adhesina de unión a Lewis^{b} o
fracciones de la misma. Cuando se consigue la inmunización, se
sacrifica el animal, se recogen las células esplénicas y se
fusionan con células de una línea celular neoplásica,
preferiblemente células de mieloma. Eligiendo las condiciones de
crecimiento, pueden seleccionarse las células de hibridoma
fusionadas satisfactoriamente. Los anticuerpos monoclonales
producidos por la línea celular de hibridoma después pueden
administrarse por vía oral en un régimen para el tratamiento y/o
prevención de infecciones por H. pylori.
Preferiblemente, los anticuerpos policlonales
y/o monoclonales se purifican antes de la administración y, más
preferiblemente, se mezclan con vehículos y/o adyuvantes
farmacéuticamente adecuados. Los ejemplos de vehículos adecuados
son solución salina, grasas, aceites, carbohidratos y proteínas
farmacéuticamente aceptables. El vehículo o vehículos se eligen
preferiblemente de modo que se potencia la solubilidad y absorción
de la inmunoglobulina en la capa mucosa que reviste el estómago.
Usando adyuvantes adecuados puede mejorarse la estabilidad,
eficacia terapéutica y valor nutritivo de la composición. Para
mejorar la estabilidad en almacenamiento, puede liofilizarse la
composición de inmunoglobulina. Independientemente de la preparación
y formulación exactas, es de gran importancia evitar la
desnaturalización de las inmunoglobulinas.
Cuanto mayor es la especificidad, mostrada por
la preparación de inmunoglobulina de los anticuerpos policlonales
y/o monoclonales de acuerdo con la invención, se hace posible usar
dosis sustancialmente inferiores en comparación con las actualmente
usadas, disminuyendo de este modo el coste y mejorando la
disponibilidad del tratamiento. El uso de anticuerpos monoclonales
específicos puede hacer posible disminuir adicionalmente las dosis.
Las dosis son en todos los casos una función del título de
anticuerpo de la preparación. Un título elevado permite de forma
natural el uso de dosis inferiores.
Puede fabricarse una preparación de
inmunoglobulina de la invención del siguiente modo: se inmuniza un
animal con una proteína adhesina de unión de Lewis^{b} o
fracciones de la misma, expresada por Helicobacter pylori,
se aísla la fracción de inmunoglobulina a partir de una excreción de
dicho animal y se purifica posteriormente. Se mezcla la composición
de inmunoglobulina purificada con vehículos y adyuvantes adecuados
para formar una preparación de inmunoglobulina para la prevención o
tratamiento de infecciones por H. pylori. En casos en los
que el título de anticuerpo es suficientemente elevado y los demás
constituyentes de la composición de inmunoglobulina aislada del
animal son inofensivos, por ejemplo en el caso de calostro de vacas
inmunizadas o yema de huevo de pollos inmunizados, siempre existe
la opción de administrar el calostro o yema del huevo al paciente
sin ningún tratamiento adicional del calostro o yema del huevo.
La composición de inmunoglobulina de acuerdo con
la invención se administra preferiblemente por vía oral al
paciente, en la dosis terapéutica o profilácticamente eficaz más
pequeña. Actualmente se conciben dosis en el intervalo de 0,1 a
1000 mg/día, preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/día.
Las dosis elegidas dependen de forma natural del título de
anticuerpo de la preparación en cuestión. Las dosis exactas y el
régimen de administración pueden elegirse por el médico responsable
del paciente infectado por Helicobacter pylori. La
experimentación rutinaria y posteriormente con una experiencia
creciente de este método, la información empírica será suficiente
para establecer la cantidad necesaria. Pueden usarse múltiples
dosificaciones, según sean necesarias, para proporcionar el nivel
deseado de efecto terapéutico o profiláctico. Las preparaciones de
inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención también pueden,
estando libres de efectos secundarios adversos y no suponiendo
prácticamente peligro de sobredosis, tomarse profiláctica o
terapéuticamente por una persona sin supervisión médica.
Puede conseguirse un efecto terapéutico, excepto
con el anticuerpo específico de acuerdo con la presente invención,
también con al menos dos fragmentos Fab de dicho anticuerpo. Dicha
realización también está incluida por el alcance de la presente
invención.
De acuerdo con otra realización más, se usan
microorganismos avirulentos, preferiblemente bacterias como sistemas
de expresión para el anticuerpo específico de acuerdo con la
presente invención. Un "microorganismo avirulento" en este
contexto es un microorganismo que tiene la capacidad de colonizar y
replicarse en un individuo infectado, pero que no causa síntomas de
enfermedad asociados con cepas virulentas de la misma especie de
microorganismo. La definición inherente en el concepto de GRAS
(Generalmente Considerado Como Seguro) puede aplicarse en esta
ocasión. Un organismo GRAS es adecuado para su uso de acuerdo con la
presente invención, con la condición de que el organismo
externalice el anticuerpo o pueda modificarse a este efecto. El
término "microorganismo" como se usa en este documento incluye
bacterias, protozoos y hongos unicelulares. Preferiblemente, se usan
bacterias como sistemas de expresión, por ejemplo, bacterias del
género Lactobacillus, Streptococcus o
Enterobacteriaceae. El sistema de expresión mencionado
anteriormente puede utilizarse in vitro para la producción
del anticuerpo específico de acuerdo con la presente invención o,
de acuerdo con una realización adicional de la invención, el
microorganismo que constituye el sistema de expresión puede
administrarse directamente al paciente. Los microorganismos pueden
recogerse y administrarse como tales, pero preferiblemente se
mezclan con un vehículo adecuado, se mezclan en un producto
alimenticio adecuado, se liofilizan, encapsulan o tratan de
cualquier modo convencional, usado para el suministro de
microorganismos viables al tracto gastrointestinal.
De acuerdo con otra realización más, se usan
microorganismos avirulentos, preferiblemente bacterias como sistemas
de expresión para el anticuerpo específico de acuerdo con la
presente invención. Un "microorganismo avirulento" en este
contexto es un microorganismo que tiene la capacidad de colonizar y
replicarse en un individuo infectado, pero que no causa síntomas de
enfermedad asociados con cepas virulentas de la misma especie de
microorganismo. La definición inherente en el concepto de GRAS
(Generalmente Considerado Como Seguro) puede aplicarse en esta
ocasión. Un organismo GRAS es adecuado para su uso de acuerdo con la
presente invención, con la condición de que el organismo
externalice la proteína adhesina o pueda modificarse a este efecto.
El término "microorganismo" como se usa en este documento
incluye bacterias, protozoos y hongos unicelulares. Preferiblemente,
se usan bacterias como sistemas de expresión, por ejemplo,
bacterias del género Lactobacillus, Streptococcus o
Enterobacteriaceae. El sistema de expresión mencionado
anteriormente puede utilizarse in vitro para la producción
del anticuerpo específico de acuerdo con la presente invención o,
de acuerdo con una realización adicional de la invención, el
microorganismo que constituye el sistema de expresión puede
administrarse directamente al paciente. Los microorganismos pueden
recogerse y administrarse como tales, pero preferiblemente se
mezclan con un vehículo adecuado, se mezclan en un producto
alimenticio adecuado, se liofilizan, encapsulan o tratan de
cualquier modo convencional, usado para el suministro de
microorganismos viables al tracto gastrointestinal.
Las dosis exactas y el régimen de administración
de dichos microorganismos pueden elegirse por el médico responsable
del paciente infectado por Helicobacter pylori. La
experimentación rutinaria y posteriormente con una experiencia
creciente de este método, la información empírica será suficiente
para establecer la cantidad necesaria. Pueden usarse múltiples
dosificaciones, según sean necesarias, para proporcionar el nivel
deseado de efecto terapéutico o profiláctico. El microorganismo
avirulento que expresa el anticuerpo o proteína adhesina de acuerdo
con la presente invención también puede, estando libres de efectos
secundarios adversos o no suponiendo prácticamente peligro de
sobredosis, tomarse profiláctica o terapéuticamente por una persona
sin supervisión médica. Un vehículo preferido en esta aplicación
específica es un producto alimenticio, por ejemplo, un producto
fermentado tal como un cereal fermentado o producto lácteo.
La creación de los sistemas de expresión
mencionados previamente y los métodos mencionados antes aún para
crear hibridomas y animales transgénicos pueden incluir etapas que
implican técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de ADN
recombinante ahora son suficientemente bien conocidas y están
suficientemente extendidas para considerarse rutinarias. En
términos muy generales y amplios, las técnicas de ADN recombinante
consisten en la transferencia de parte del material genético de un
organismo en un segundo organismo, de modo que el material genético
transferido llegue a ser una parte permanente del material genético
del organismo al que se transfiere. Los métodos para conseguir esto
son bien conocidos y la simple elección de los métodos específicos
para conseguir los objetivos, expuestos en la presente descripción y
reivindicaciones, pertenecen al alcance de la invención.
Es posible que H. pylori solo o junto con
bacterias de actuación lenta relacionadas estén implicadas en la
génesis y agravamiento de otras enfermedades inflamatorias crónicas
en el tracto gastrointestinal. Es obvio para un especialista en la
técnica cómo modificar la presente invención dentro del alcance de
las reivindicaciones, para conseguir utilidad en el tratamiento y/o
prevención de dichas enfermedades. Los ejemplos de dichas
enfermedades son colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn,
sarcoidosis, granulomatosis de Wegener y otros trastornos
vasculíticos, así como diversos neoplasmas, incluyendo carcinomas
del colon, páncreas y próstata.
Se obtuvo la cepa CCUG 17875 de H. pylori
de CCUG, Göteborg, Suecia. Cepa A5, un aislado de úlcera gástrica
de Astra Arcus, Södertälje, Suecia. Las cepas P466 y MO19 se han
descrito previamente (Borén et al, Science, 262, 1982
(1993)). La cepa 26695 proviene del Dr. K.A. Eaton, The Ohio
University y su genoma se secuencia recientemente por TIGR,
Rockville, Maryland, USA. El panel de 45 aislados clínicos de H.
pylori provienen del University Hospital de Uppsala, Suecia.
Las bacterias se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 10% y O_{2} al
5% durante 48 horas.
Todos los glucoconjugados de antígeno de grupo
sanguíneo usados, es decir, glicoproteínas
semi-sintéticas construidas por la conjugación de
oligosacáridos fucosilados purificados con albúmina de suero eran de
IsoSep AB, Tullinge, Suecia. El RIA se realizó de acuerdo con Falk
et al. (Meth. Enzymol., 236, 353, 1994) con algunas
modificaciones: los conjugados H-1, Le^{b},
Le^{a}, H-2, Le^{x} y Le^{y} se marcaron con
^{125}I por el método de Cloramina T. Se incubó 1 ml de bacterias
(A600 = OD 0,10) con 300 ng de conjugado marcado con ^{125}I (es
decir, un exceso de receptores) durante 30 minutos en solución
salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina al 0,5%, Tween 20 al
0,05% (tampón BB). Después de la centrifugación, se midió la
actividad 125I en el sedimento bacteriano por recuento de
centelleo
gamma.
gamma.
En este estudio se caracterizó primero
bioquímicamente y se identificó la adhesina de unión a antígeno de
grupo sanguíneo de H. pylori, BabA. Se analizaron las cepas
de H. pylori para la unión a antígenos de grupo sanguíneo
fucosilados solubles marcados con ^{125}I (Fig. 1A). La unión de
estas cepas a los antígenos de grupo sanguíneo solubles se
correlaciona con la adherencia in situ. La dominancia de la
actividad de unión a antígeno de grupo sanguíneo (BAB) se evaluó
entre 45 aislados clínicos de H. pylori y la mayoría de los
aislados, el 71%, expresa las propiedades de unión a antígeno de
Le^{b} (datos no mostrados). Por el contrario, ninguna de las
cepas de referencia (Fig. 1A), o las cepas del panel de 45 aislados
clínicos, se une a los antígenos Le^{a}, H-2,
Le^{x}, o Le^{y}. Estos resultados apoyan los descubrimientos
previos de una elevada especificidad del receptor por los antígenos
de grupo sanguíneo Le^{b} y H-1 y demuestran la
elevada dominancia de la actividad BAB entre aislados clínicos.
En base a la presencia o ausencia de factores de
virulencia tales como el gen A asociado a
Citotoxina (CagA) y la citotoxina A
Vacuolante (VacA), se clasifican las cepas de H.
pylori como cepas de tipo I o de tipo II. Los aislados de H.
pylori de pacientes con úlceras duodenales muy a menudo expresan
las proteínas VacA y CagA, es decir, las cepas de tipo I. Por
definición, las cepas de tipo II no expresan ninguno de los
marcadores. Se analizaron veintiún aislados clínicos previamente
definidos para la expresión de CagA y VacA para las propiedades de
unión a antígeno Le^{b}. Se descubrió que la expresión de CagA se
correlaciona con la unión bacteriana al antígeno Le^{b} (Tabla
1). El gen cagA pertenece a una isla de patogenicidad de 40
kb que codifica componentes de secreción y sistemas de transporte.
Estos descubrimientos podrían indicar una relación funcional entre
la isla de patogenicidad cag y el gen de la adhesina BabA, para la
presentación correcta de la proteína adhesina BabA y la membrana
externa bacteriana.
Para caracterizar adicionalmente BabA, se
determinó la constante de afinidad (K_{a}) entre BabA y el
antígeno Le^{b}. Como los valores K_{a} se basan en las
condiciones de equilibrio (13), primero se analizó la interacción
realizando análisis de desplazamiento de receptor. Primero se incubó
la cepa CCUG 17875 de H. pylori (positiva para la unión a
Le^{b}, Fig. 1A) con glucoconjugado de Le^{b} marcado con
^{125}I. Después, se añadió glucoconjugado de Le^{b} no marcado
en una serie de dilución. El conjugado de Le^{b} no marcado
desplazó la eficacia del glucoconjugado de Le^{b} marcado con
^{125}I unido (Fig. 1B). Los resultados demuestran que el
complejo de receptor-adhesina formado es un
verdadero estado de equilibrio. Un exceso equivalente de
glucoconjugado de Le^{a} no disociaba el complejo de
Le^{b}-BabA, verificando la elevada especificidad
del receptor (Fig. 1B). El valor de K_{a} para el complejo de
Le^{b}-BabA de la cepa CCUG 17875 se valoró con
el glucoconjugado de Le^{b} en concentraciones de 10 ng a 260
ng/ml y se determinó que era de una afinidad elevada cercana a
1x10^{10} M^{-1} (Fig. 1C). La cantidad de moléculas de
glucoconjugado de Le^{b} unidas a BabA en la superficie celular
bacteriana se calculó en aproximadamente 500 por célula. Esta
cantidad es similar a la cantidad de orgánulos fimbrias en la
superficie de E. coli (14). Sin embargo, para la adhesina
BabA, los cálculos se basan en la suposición de que la mayoría de
las células bacterianas en el experimento muestran una cantidad
igual de moléculas de adhesina con propiedades de unión al antígeno
Le^{b}.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para determinar la dominancia de BabA en la
población bacteriana, se incubó la cepa CCUG 17875 con los antígenos
Le^{b} y Le^{a}, y se visualizó la actividad de unión
bacteriana por microscopía de fluorescencia confocal (Fig. 2, panel
superior). Los análisis demuestran la alta dominancia de la
actividad de unión de BabA en la población bacteriana para el
antígeno Le^{b} (Fig. 2A, tinción verde) y la ausencia completa de
unión al antígeno Le^{a} (Fig. 2B, tinción de contraste
roja).
A continuación, se investigó la localización y
densidad de BabA en las superficies celulares bacterianas por
microscopía electrónica por inmunomarcaje con oro. La actividad de
unión al antígeno Le^{b} de la adhesina localizó partículas de
oro en la membrana externa bacteriana (Fig. 2C). Las células
bacterianas individuales muestran una cantidad igual de partículas
de oro (datos no mostrados). Cuando se sustituyó el antígeno
Le^{b} con el antígeno Le^{a} (que carece de actividad
receptora), no se detectaron partículas de oro (Fig. 2B).
El peso molecular de BabA se caracterizó por
análisis de superposición de receptor. Se separó un extracto
proteico de la cepa CCUG 17875 en SDS-PAGE y se
transfirió a una membrana. La membrana se incubó con glucoconjugado
Le^{b} biotinilado, seguido de la detección con estreptavidina y
quimioluminiscencia potenciada. La actividad adhesina de BabA
corresponde a una única banda de 74 kDa (Fig. 3A). La banda de 40
kDa es supuestamente la actividad peroxidasa endógena ya que se
tiñe independientemente de la superposición del conjugado Le^{b}
(carril 3). BabA era muy estable al calor y podría recuperar alguno
de actividad después del calentamiento a 97ºC (Fig. 3A, carril 2).
El panel de cepas mostró el mismo peso molecular que BabA (Fig.
3B).
Para purificar BabA, se desarrolló una nueva
técnica, Marcaje de Afinidad Dirigido por la Actividad del
Receptor (ReMarcaje). Se han usado previamente agentes
reticulantes multifuncionales con marcas donantes radiomarcadas
para estudios de caracterización de
receptor-ligando. Sin embargo, el uso de marcas
donantes de afinidad, tales como restos de biotina presentados en
estructuras espaciadoras flexibles, añade una nueva dimensión a la
aplicabilidad de la tecnología de reticulantes. Una marca de
afinidad, la biotina, se transfiere a la proteína adhesina por la
actividad receptora y se usa para la identificación adicional y para
la purificación de afinidad de la parte adhesina de la interacción,
por estreptavidina (Fig. 4A, B).
Se unió un agente reticulante multifuncional con
un saliente donante de biotina al glucoconjugado Le^{b}. La
actividad receptora del glucoconjugado de Le^{b} dirigió
posteriormente el marcaje con biotina marcada de la proteína
adhesina BabA (Fig. 4A, B). Después de la reticulación, se separó la
proteína bacteriana de las cepas A5, P466, y CCUG 17875 en
SDS-PAGE. La inmunodetección con estreptavidina
demostró una proteína marcada con biotina, con un peso molecular de
74 kDa (Fig. 3C) (28). Estos resultados apoyan las estimaciones de
peso molecular de los análisis de superposición previos (Fig. 3B).
La cepa MO19 desprovista de las propiedades de unión a antígeno
Le^{b} (Fig. 3B) (Fig. 1A), fue negativa para la unión también en
este conjunto de análisis (Fig. 3C).
La elevada especificidad en la técnica de
ReMarcaje proporcionó un método para la purificación de la proteína
adhesina. Las cepas CCUG 17875 y A5, que expresan ambas la adhesina
BabA (Fig. 1A), se procesaron por la técnica de ReMarcaje usando el
conjugado del receptor de Le^{b} marcado con reticulante como el
donante de biotina. Después de la reticulación, las bacterias se
suspendieron en tampón de muestra de SDS. Posteriormente se
añadieron perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina a las
proteínas solubilizadas, y se extrajo BabA marcada con biotina
(Fig. 4C). Se descubrió que las secuencias de 20 aminoácidos
N-terminales de las adhesinas BabA de las cepas
CCUG 17875 (Australia) y A5 (Suecia) eran idénticas, que indica una
proteína biológicamente conservada (Fig. 5). Recientemente, se
caracterizó una serie de proteínas de membrana externa de H.
pylori. Estas proteínas, HopA-E, son homólogas
en las secuencias N-terminales a BabA (17),
indicando posiblemente un motivo para un mecanismo de secreción
común. La adhesina BabA marcada con biotina se purificó más de 3000
veces del extracto celular, y se calculó el rendimiento en un 20%.
Sin embargo, en base a los datos de las representaciones del
Scatchard, el nivel de adhesina BabA disponible sería
aproximadamente 5 veces mayor, es decir, aproximadamente 1 mg de
adhesina/750 mg de proteína bacteriana, que sin embargo podría ser
la razón para la elevada proporción señal a ruido (Fig. 3B). La
purificación de BabA mediante la técnica de ReMarcaje indica el
potencial de esta técnica de purificación de lecitinas en
interacciones de complejo receptor-ligando, tal como
la familia de moléculas de adhesión celular selectinas.
Para clonar el gen que codifica BabA, se utilizó
la secuencia de 20 aminoácidos N-terminal para la
construcción de cebadores degenerados (18). Se identificaron los
conjuntos de clones que codificaban ambos dos proteínas diferentes
pero muy similares. Ambos genes codifican proteínas que tienen
dominios N-terminales casi idénticos y dominios
C-terminales idénticos, que complica la
identificación del gen BabA funcional. (Fig. 5). Para identificar
el gen correspondiente, se purificó la adhesina BabA a gran escala
por ReMarcaje. Esto proporcionó suficiente proteína para una
secuencia amino terminal ampliada. Se identificaron 41 aminoácidos y
estos restos se distinguen de forma inequívoca entre los dos genes
por las diferencias en las posiciones de los aminoácidos 28, 35, 37,
38 y 41 (Fig. 5). El gen que codifica BabA se llamó babA y
corresponde a una proteína básica con un pI de 9,4 y un peso
molecular de 78 kDa, es decir, de peso molecular ligeramente mayor
que la forma predicha a partir de los análisis de
SDS-PAGE (Fig. 3). El otro gen, babB,
corresponde a una proteína de un peso molecular calculado de 75,5
kDa. En contraste con babA, el gen babB contiene un
codón de inicio de la traducción predicho (Fig. 5). Esto podía
indicar la existencia de un tercer gen bab en el genoma o
mecanismos para actividades de recombinación. Es interesante
observar que los genes bab también se detectaron en cepas que
carecen de las propiedades de unión de Lewis b (datos no
mostrados). Los sistemas de casete de genes han demostrado promover
la variación antigénica en Neisseria gonorrhoeae (19). Otra
posibilidad sería la presencia de genes similares que codifican
adhesinas con diferencias en la especificidad de receptor/tropismo
por el tejido hospedador (20). Experimentos de inactivación génica
dirigida a genes bab podrían ayudar a entender esta
organización génica compleja.
Experimentos de inmunización con adhesinas de
Bordetella pertussis (21) indican el potencial de proteínas
de membrana externa de actuar como vacunas candidatas (analizadas en
la ref. 22). En un modelo de ratón para infección persistente por
H. pylori, la inmunización oral con antígenos de H.
pylori mostró protección contra infección por H. pylori
(10). Sin embargo, los resultados de modelos animales son difíciles
de evaluar para patógenos específicos humanos, tales como H.
pylori y el virus de la polio. Para la polio, se ha conseguido
un modelo animal expresando el receptor del virus en ratones
transgénicos (23). Se emprendió una estrategia similar para H.
pylori. Se construyó un ratón transgénico mediante el uso de una
1,3/4-fucosiltransferasa, que dirige la síntesis
del antígeno Le^{b} específico humano en el tracto
gastrointestinal (24). El ratón Lewis b puede ser útil para la
evaluación del papel de la adhesina BabA como un factor de
colonización/virulencia y además para la evaluación de BabA como
una vacuna candidata contra la enfermedad ácido péptica y
adenocarcinoma gástrico.
En el presente estudio se usó la técnica de
ReMarcaje para la purificación de la parte adhesina de la
interacción receptor-ligando microbiano. Mediante
el uso de la adhesina purificada/lectina-proteína,
la técnica de ReMarcaje podría, además, usarse para estudiar
adicionalmente la parte receptora de la interacción. La
identificación de la estructura del receptor biológicamente activo,
que lleva oligosacáridos de Le^{b}, ayudaría a entender los
mecanismos que apoyan la infección crónica por H. pylori.
La inhibición de la unión de H. pylori al
antígeno Lewis b marcado con ^{125}I por preparaciones se presenta
gráficamente, como función de la concentración de anticuerpo
(mg/ml) en la Fig. 6: se preincubaron alícuotas de 1 ml de bacteria
H. pylori (A_{600} = OD 0,10) con series de dilución de
preparaciones de anticuerpo, en 0,01-10 mg/ml
durante 2 horas en solución salina tamponada con fosfato (PBS),
albúmina al 0,5%, Tween 20 al 0,05%. Después se añadieron 500 ng de
conjugado marcado con ^{125}I (es decir, un exceso de la
estructura receptora) y se incubaron durante 30 minutos. Después de
centrifugación, se midió la actividad de ^{125}I en el sedimento
bacteriano por recuento de centelleo gamma. Los glucoconjugados de
antígeno de grupo sanguíneo de Lewis b usados, es decir, las
glicoproteínas semi-sintéticas construidas por la
conjugación de oligosacáridos fucosilados purificados con albúmina
de suero eran de IsoSep AB, Tullinge, Suecia.
La detección por transferencia de Western de la
adhesina BabA por las diferentes preparaciones de anticuerpo se
presenta en la Fig. 7. El marcador de múltiples pesos moleculares (2
\mul) de Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra, se disolvió en
tampón de muestra de SDS (carril 1). Se disolvieron aproximadamente
100 ng de adhesina BabA purificada (aproximadamente 74 kDa con
producto de degradación de aproximadamente 55 kDa) en tampón de
muestra de SDS (carril 2). Los extractos proteicos solubilizados con
SDS de la cepa CCUG 17875 se prepararon disolviendo el sedimento
bacteriano correspondiente a 0,15 ml de bacterias (A_{600} = OD
0,10) por tampón de muestra de SDS (carril 3). Después se hirvieron
las 3 muestras proteicas a 100ºC durante 5 minutos. Las proteínas
se separaron en SDS-PAGE, y se transfirieron a una
membrana PVDF para inmunoanálisis de transferencia de Western. Se
prepararon cinco conjuntos de membranas PVDF. Las membranas PVDF se
bloquearon/incubaron durante una noche con suero humano/plasma al
4%, en solución salina tamponada con fosfato, de un paciente sin
infección por H. pylori, es decir, sin anticuerpos séricos
contra H. pylori. La membrana después se lavó en solución
salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina al 0,5%,
Tween-20 al 0,05%, seguido de la adición de las
preparaciones de anticuerpo. Los conjuntos de membranas se
incubaron con las siguientes 5 preparaciones de anticuerpo; 1)
sueros humanos combinados de pacientes infectados con H.
pylori, diluidos 1:500, 2) Anticuerpos de pollo (positivos) a 1
mg/ml diluidos 1:100x, 3) Preparación bovina I de anticuerpos, 1
mg/ml diluida 1:100x, 4) Preparación bovina II de anticuerpos, 1
mg/ml diluida 1:100x, 5) Preparación bovina III de anticuerpos, 1
mg/ml diluido 1:100x (indicada en la figura). Estos anticuerpos se
incubaron con la membrana durante 2 horas seguido de lavados
extensivos en solución salina tamponada con fosfato (PBS),
Tween-20 al 0,05%, seguido de la adición de
anticuerpos secundarios anti-humano,
anti-pollo, y anti-bovino marcados
con HRP-peroxidasa (de DAKO, Dinamarca), todos
diluidos 1:2000x. Las membranas se incubaron durante 1 hora, seguido
de lavados extensivos de solución salina tamponada con fosfato
(PBS), Tween-20 al 0,05%. Las membranas se revelaron
con quimioluminiscentes potenciados (ECL) de Amersham. Los
resultados muestran que la respuesta antigénica contra la adhesina
está fuertemente potenciada en las preparaciones bovinas. Este
descubrimiento también está apoyado por los datos de inhibición de
la Fig. 6.
Los análisis de transferencia de Western de
proteínas de H. pylori por las diferentes preparaciones de
anticuerpo se muestran en la Fig. 8. Se prepararon 2 aislados
clínicos (1-2) del Dr. Lars Engstrand, Department of
Clinical Microbiology and Cancerepidemiology, University Hospital,
Uppsala, Suecia y la cepa CCUG 17875 (3), de Culture Collection,
University of Göteborg, Department of Clinical Bacteriology,
Göteborg. Suecia y la cepa 52 (4) del Prof. Torkel Wadström, Dept.
Medical Microbiology, Lunds University, para la electroforesis
SDS-PAGE. Los sedimentos bacterianos
correspondientes a 0,15 ml de bacterias (A_{600} = OD 0,10) se
disolvieron en tampón de muestra de SDS y se calentaron a 100ºC
durante 5 minutos. Las proteínas se separaron en
SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas PVDF para
el inmunoanálisis de transferencia de Western. Los análisis de
transferencia de Western son como se han descrito anteriormente, es
decir, los conjuntos de membrana se incubaron con las siguientes 4
preparaciones de anticuerpo: 1) sueros humanos combinados de
pacientes infectados con H. pylori, diluidos 1:500, 2)
Anticuerpos de pollo (positivos) a 1 mg/ml diluidos 1:100x, 3)
Preparación bovina I de anticuerpos, 1 mg/ml diluida 1:100x, 4)
Preparación bovina III de anticuerpos, 1 mg/ml diluida 1:100x
(indicada en la figura). Estos anticuerpos se incubaron con la
membrana durante 2 horas seguido de lavados extensivos en solución
salina tamponada con fosfato (PBS), Tween-20 al
0,05%, seguido de la adición de anticuerpos secundarios
anti-humano, anti-pollo, y
anti-bovino marcados con
HRP-peroxidasa (de DAKO, Dinamarca), todos diluidos
con 1:2000x. Las membranas se incubaron durante 1 hora, seguido de
lavados extensivos en solución salina tamponada con fosfato (PBS),
Tween-20 al 0,05%. Las membranas se revelaron con
quimioluminiscentes potenciados (ECL) de Amersham. Los resultados
muestran que los anticuerpos de pollo y las preparaciones bovinas
reaccionan de forma casi idéntica contra las cuatro cepas,
indicando propiedades conservadas en las cepas de diferente origen
geográfico.
Aunque la invención se ha descrito con respecto
a sus realizaciones preferidas, que constituyen el mejor modo
actualmente conocido, debe entenderse que pueden hacerse diversos
cambios y modificaciones que serían obvios para los especialistas
en la técnica sin alejarse del alcance de la invención que se expone
en las reivindicaciones adjuntas a la misma.
\newpage
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8. Se obtuvo la cepa CCUG 17875 de H.
pylori de CCUG, Göteborg, Suecia. Cepa A5, un aislado de úlcera
gástrica, que proviene de Astra Arcus, Södertälje, Suecia. Las cepas
P466 y MO19 se describieron previamente (7). La cepa 26695 proviene
del Dr. K A. Eaton, The Ohio State University, y su genoma se
secuenció recientemente por The Institute for
Genomic Research (TIGR), Rockville, Maryland (J.-F.
Tomb, et al, abstract 3B: 059, IX International Workshop on
Gastroduodenal Pathology and Helicobacter pylori, Copenhagen,
Denmark, 1996). El panel de 45 aislados clínicos de H.
pylori proviene de la University Hospital in Uppsala, Suecia.
Las bacterias se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 10% y O_{2} al
5% durante 48 h.
9. Todos los glucoconjugados de antígeno de
grupo sanguíneo usados, es decir, glicoproteínas
semi-sintéticas construidas para la conjugación de
oligosacáridos fucosilados purificados con albúmina sérica (7,25),
eran de IsoSep AB, Tullinge, Suecia. El RIA se realizó de acuerdo
con la ref. 26 con algunas modificaciones; los glucoconjugados
H-1, Le^{b}, Le^{a}, H-2,
Le^{x}, y Le^{y} estaban marcados con ^{125}I por el método
de Cloramina T. Se incubó 1 ml de bacterias (A_{600} = OD 0,10)
con 300 ng de conjugado marcado con ^{125}I (es decir, un exceso
de receptores) durante 30 min en solución salina tamponada con
fosfato (PBS), albúmina al 0,5%, Tween-20 al 0,05%
(tampón BB). Después de la centrifugación, se midió la actividad
^{125}I en el sedimento bacteriano por recuento de centelleo
gamma.
10. A. Covacci, et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A 90, 5791 (1993), M
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15. La microscopía confocal se realizó en un
instrumento Nikon/Multiprobe 2001 (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA). La microscopía electrónico se realizó en un
instrumento JEOL 100 CX.
16. J. Brunner, Trends in Cell
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R. E. W. Hancock and T. J. Trust, J. Bacteriol.
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18. Se usó análisis de secuencia
N-terminal de BabA para preparar oligonucleótidos
degenerados, que se usaron en PCR para obtener un fragmento
amplificado del cromosoma del gen babA. Se identificó un fragmento
de 59 pb y se usó como sonda para la exploración de una biblioteca
de plásmidos de bajo número de copias (pACYC184) de ADN cromosómico
digerido parcialmente con Sau3A de la cepa CCUG 17875.
19. P. Hagblom, E. Segal, E.
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Haslam, M. G. Caparon. Meth. Cel Biol.
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27. Los extractos celulares se prepararon en
tampón de muestra de SDS sin mercaptoetanol y se calentaron a 37ºC
o 97ºC durante 10 min antes de la separación en
SDS-PAGE. Se transfirieron las proteínas a una
membrana PVDF. La membrana se incubó con 1 \mug/ml de
glucoconjugado de Le^{b} biotinilado o albúmina biotinilada
(control negativo) durante una noche, se marcó como se ha descrito
en la ref. 7. Después del lavado en PBS/Tween 20 al 0,05%, las
estructuras biotiniladas unidas por la banda BabA se sondearon por
HRP-estreptavidina y se detectaron usando reactivos
ECL (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra).
28. La suspensión bacteriana se incubó con el
glucoconjugado de Le^{b}, al que se había conjugado el reticulante
Sulfo-SBED (Pierce, Rockville, IL.) por el éster de
N-hidroxisuccinimida (NHS), de acuerdo con las
especificaciones del fabricante. Se activó el grupo reticulante de
aril azida por irradiación UV (360 nm). Las bacterias se lavaron
con PBS pH 7,6, Tween-20 al 0,05% e inhibidores de
proteasa (EDTA y benzamidina) en condiciones reductoras con
ditiotreitol (DTT) 50 mM. Se separaron las bacterias bacterianas en
SDS-PAGE, y se detectó la proteína BabA marcada con
biotina por inmunodetección (membrana
PVDF/HRP-estreptavidina y ECL) (Fig. 3C).
29. Las cepas CCUG 17875 y A5 se procesaron
primero por reticulación y tratamiento con DTT, como anteriormente
(28), seguido por solubilización en tampón de muestra de SDS.
Después se extrajo la proteína BabA marcada con biotina con perlas
magnéticas recubiertas con estreptavidina (Advanced Magnetics Inc.,
Cambridge, MA). Las perlas se hirvieron en tampón de muestra de
SDS, y se eluyeron y alquilaron las proteínas unidas. La preparación
de proteínas se fraccionó adicionalmente por
SDS-PAGE preparativa (Prep-Cell 491,
BioRad, Hercules, CA). Las fracciones con la proteína marcada con
biotina, es decir, las fracciones BabA, se identificaron por
inmunodetección usando estreptavidina/ECL. La preparación de BabA
combinada después se separó en SDS-PAGE y se
transfirió a una membrana PVDF. La banda de BabA se escindió y la
proteína BabA se secuenció en su extremo N terminal usando un
instrumento Procise^{TM} 494 (Applied Biosystems, Foster City,
CA).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\vskip1.000000\baselineskip
<110> Borén, Thomas
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antígeno del grupo de unión a
adhesina de Helicobacter pylori
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT/SE97/01009
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/SE97/01009
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
10-06-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<150> SE 9602287-6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-06-1996
\vskip0.400000\baselineskip
<150> SE 9701014-4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-03-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ser Val Gly Tyr
Gln Ile Gly Glu ala}
\sac{Ala Gln Met Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagacgacg gcttttacac aagcgtaggc tatcaaatcg gtgaagccgc tcaaatggta
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Proteína adhesina de unión a antígeno
de grupo sanguíneo (BAB) bacteriana aislada y purificada o una
fracción inmunológicamente eficaz de la misma de la especie
Helicobacter pylori, caracterizada porque dicha
proteína, o fracción inmunológicamente eficaz de la misma, se una
específicamente a glucoconjugados de antígeno de grupo sanguíneo
Lewis^{b} y H-1 fucosilados y dicha proteína tiene
un peso molecular en el intervalo de 70 a 77 kDa de la proteína no
fraccionada como se determina por electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecil sulfato sódico
(SDS-PAGE) e incluye la siguiente secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque dicha proteína
contiene menos del 20% de impurezas proteicas bacterianas.
3. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque la siguiente
secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV
\vskip1.000000\baselineskip
está en una posición amino terminal.
4. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la
proteína no fraccionada tiene un peso molecular en el intervalo de
73 a 75 kDa determinado por SDS-PAGE.
5. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la
proteína no fraccionada tiene un peso molecular de 73,5 kDa
determinado por SDS-PAGE.
6. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteína es
específica para al menos una cepa de Helicobacter pylori
incluida en el siguiente grupo: CCUG 17875, NCTC 11637, A5, P466,
G109, G56, Ba 185, Ba 99, 931 y 932.
7. Proteína adhesina o fracción
inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizada porque dicha proteína es
específica para todas las cepas de Helicobacter pylori
incluidas en el siguiente grupo: CCUG 17875 y A5.
8. Composición farmacéutica
caracterizada porque comprende una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una proteína adhesina o una fracción inmunológicamente
eficaz de la misma de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente junto con excipientes
farmacéuticamente aceptables.
9. ADN para la expresión de una proteína
adhesina o una fracción inmunológicamente eficaz de la misma de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
10. ADN para la expresión de una proteína
adhesina o una fracción inmunológicamente eficaz de la misma de
acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque incluye
la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-GAAGACGACGGCTTTTACACAAGCGTAGGCTATCAAATCGGTGAAGCCGCTCAAATGGTA-3'.
\newpage
11. ADN para la expresión de una proteína
adhesina o una fracción inmunológicamente eficaz de la misma de
acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque
incluye la secuencia
12. ADN para la expresión de una proteína
adhesina o una fracción inmunológicamente eficaz de la misma de
acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque incluye
la secuencia
13. Antisueros monoespecíficos producidos
usando una proteína adhesina pura o fracción inmunológicamente
eficaz de la misma de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
14. Uso de antisueros monoespecíficos
producidos de acuerdo con la reivindicación 13, para determinaciones
cuantitativas o cualitativas in vitro de la proteína
adhesina en células, tejidos o fluidos corporales.
15. Kit de ensayo que comprende antisueros
monoespecíficos producidos de acuerdo con la reivindicación 13, en
combinación con marcadores y reactivos convencionales.
16. Composición de vacuna para el
tratamiento de una infección por Helicobacter pylori,
caracterizada porque comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de una proteína
adhesina o una fracción inmunológicamente eficaz de la misma de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
17. Uso de una proteína adhesina o una
fracción inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de una
vacuna para tratar y/o prevenir una infección por Helicobacter
pylori, úlceras gástricas y/o la enfermedad ácido péptica en
seres humanos.
18. Uso de ADN de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para la fabricación de
una vacuna para tratar y/o prevenir una infección por
Helicobacter pylori, ulceras gástricas y/o la enfermedad
ácido péptica en seres humanos.
19. Composición de inmunoglobulina
caracterizada porque dicha composición muestra actividad
específica para una proteína adhesina de unión a Lewis^{b} o una
fracción inmunológicamente eficaz de la misma de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
20. Anticuerpo caracterizado porque
dicho anticuerpo muestra actividad específica contra una proteína
adhesina de unión a Lewis^{b} o una fracción inmunológicamente
eficaz de la misma de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7.
21. Anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 20, caracterizado porque dicho anticuerpo es
un anticuerpo monoclonal.
22. Método para fabricar un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque
dicho anticuerpo se expresa por un cultivo de microorganismos
viables en el sistema de expresión que comprende ADN de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 12, en el que dicho
microorganismo u organismos están generalmente reconocidos como
seguros (GRAS) y están genéticamente modificados para expresar dicho
anticuerpo.
23. Método de acuerdo con la reivindicación
22, caracterizado porque dicho microorganismo se elige entre
el grupo compuesto por bacterias de las especies Lactobacillus,
Streptococcus y Enterobacteriaceae.
24. Uso de una composición de
inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 19 para la
fabricación de una preparación farmacéutica para tratar y/o
prevenir una infección por Helicobacter pylori en seres
humanos.
25. Uso de una composición de
inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 19 para la
fabricación de un producto farmacéutico para tratar y/o prevenir
úlceras gástricas y/o la enfermedad ácido péptica.
26. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 20 ó 21 para la fabricación de un producto
farmacéutico para tratar y/o prevenir una infección por
Helicobacter pylori en seres humanos.
27. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 20 ó 21 para la fabricación de un producto
farmacéutico para tratar y/o prevenir úlceras gástricas y/o la
enfermedad ácido péptica.
28. Uso de un cultivo de microorganismos
viables en un sistema de expresión, en el que dicho microorganismo
u organismos están generalmente reconocidos como seguros (GRAS) y
están genéticamente modificados para expresar un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 para la fabricación de una
composición oral para el tratamiento o prevención de una infección
por Helicobacter en seres humanos.
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|---|---|---|---|
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