JP2004514424A

JP2004514424A - アレルギー反応を起こす個人の傾向を減少させることができる乳酸菌

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Publication number: JP2004514424A
Application number: JP2002529478A
Authority: JP
Inventors: ジェルモン、ジャック、エデュアール; コルテシー、ブレーズ; モレ、ベア; フリッシュ、ロドルフ
Original assignee: ソシエテ　デ　プロデユイ　ネツスル　ソシエテ　アノニム
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2004-05-20
Also published as: NO20031159L; HUP0302585A2; HUP0302585A3; US20040071714A1; AR033574A1; IL154284A0; US7498162B2; NZ524527A; AU2002220561C1; KR20030034178A; EP1379635A2; AU2056102A; SK3642003A3; WO2002024883A2; ZA200301244B; AU2002220561B2; RU2294366C2; BG107657A; PL365246A1; CN1479788A

Abstract

本発明はアレルギー反応が高まる個人の傾向を減少させることができる乳酸菌の新規な菌株に関する。特に、本発明は寛容原性ペプチドを含むたんぱく質を発現する乳酸菌株の生成に関し、アレルギー反応が高まる個人の傾向を減少させることにおけるその使用に関する。本発明はまた、前記微生物又はその活性分画を含有する食品又は医薬組成物にも関する。

Description

【０００１】
本発明はアレルギー反応を起こす個人の傾向を減少させることができる乳酸菌の新規な菌株に関する。特に、本発明は寛容原性ペプチドを含むポリペプチドを発現する乳酸菌の新規菌株に関し、そしてアレルギー反応を起こす個人の傾向を減少させることにおけるその使用に関する。本発明はまた、前記微生物又はその活性分画を含有する食品又は医薬組成物に関する。
【０００２】
アレルギーは、種々の物質（アレルゲン）に対する免疫系の不適当な反応である。一般に個人は、非反応性が免疫系自体の抑制メカニズムに主として起因していると思われる、花粉又は食品材料のような環境において普通に出会う物質に対して実質的な免疫反応を生じない。しかしながら、損傷された状態において免疫系は前記抑制活性（指摘された耐性）を果たさず、アレルゲンに対して特定の免疫反応（即ちアレルギー反応）を生ずる。アレルギー反応は、特定の細胞、主としてマスト細胞及び好塩基細胞顆粒球から、周囲の組織及び血管構造への、炎症媒介物質ヒスタミン、ロイコトリエン類及び酵素類のような生物学的に活性な化合物の放出を包含する。マスト細胞は個人の組織中にわたって分散され、一方好塩基性細胞は血管系内を循環する。ＩｇＥ抗体を包含する事象の続発の際、化合物／媒介物質は標的マスト細胞から放出されて薬理学的反応の状態に達する。
【０００３】
過去において、アレルギーを患っている個人の数は増加してきており、これは多くの場合、例えば排気ガスにより起こされる絶えず増大する大気汚染に起因している。また、たんぱく質含有物質の拡大した消費が、前記発生の一因となっており、特に、食品アレルギーの漸増している発生の一因となっているように思われる。さらに、発展国において出会う微生物感染における弱化（ｄｅｆｉｃｉｔ）は、アトピー性疾患の増大の他の可能な原因として示唆されてきた。
【０００４】
食品アレルギー及び或る種の食品不耐症でさえまったく普通になって来た。患った個人の大部分は食品のある成分に対して不耐性を示すことが見いだされてきており、人口の約５％が摂取した物質への反応さえ示すようになってきており、このことは医療的注意を必要とするほどに十分に重大である。
【０００５】
最近数年において、食品不耐症の主な原因は、通常は排除されるがしかし感受性のある個人の胃腸管により吸収された、身体による物質の吸収にあるとの証拠が示された。この吸収不良は消化管の内側を覆っている組織における欠陥から由来するものと思われる（Ｐｅｔｅｒｓ等、Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２，第１２７頁（１９８８）；Ｏｌａｉｓｏｎ等、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　２５，第３２１頁（１９９０）；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ等、Ａｎｎ．ｏｆ　Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１０５，第８８３頁（１９８６））。処理及び存在する抗原への、ＧＩ管の内側を覆っている上皮細胞の最近確認された能力はまた、炎症及びアレルギーの結果に導く不適当な免疫反応を誘発する理由を説明するものであろう（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７２，第３１５頁（１９９９））。
【０００６】
食品アレルギーの徴候は身体中の実質的にすべての組織を包含するであろう。その大きな吸収領域の故に、胃腸管は有害物質についての吸収の主要な部位であるように思われる。食品アレルギーの多くの症状は消化管自体において現れるが、皮膚及び気道を包含する他の組織もまた冒す可能性がある。
当業界において、アレルギー、特に食品アレルギーを治療するための異なる種々の方法が提案されている。
【０００７】
１つのそのような方法は、そのアレルギーの潜在能力が減少されるように、アレルギー物質自体の源を修飾することを目標としている。このことはそのような問題の原因である食品を制限するか又はその成分を禁止することによって達成することができる。包含する問題は、しばしば各食品材料中の特定の抗原性物質（アレルゲン）が多くの場合に知られてなく、たいていの場合において、どの成分が選択的に除去されるべきか明らかでないことにある。
【０００８】
米国特許第５，４８０，６６０号において、小麦に対するアレルギーを有する患者におけるアレルギーの発症は、３０，０００Ｄａ以下の分子量を有するたんぱく質及び５０，０００〜７０，０００Ｄａの分子量を有するたんぱく質を小麦粉から排除するか又は減少させることにより緩和することができることが報告されている。
【０００９】
特開平１１−４６７２１号において、たんぱく質含有食品材料を小麦粉と混合し、その混合物を１８０℃で３分より長い時間、焼く（ベークする）、該たんぱく質含有食品材料のアレルギー発生性を減少させる方法が開示されている。
【００１０】
米国特許第４，２９３，５７１号において、たんぱく質含有物質を加水分解処理に付し、残っている加水分解されていないたんぱく質を加熱処理により凝固させ、次に限外濾過工程に付して、アレルゲンを構成する可能性がある凝固物質及びマクロペプチドを排除する、低アレルギー発生性組成物の製造が記載されている。
【００１１】
米国特許第５，０３９，５３２号において、乳漿（ホエー）製品が酵素的加水分解に付される、低アレルギー発生性食品材料の製造のための他の方法が開示されている。
【００１２】
なお、食品材料を処理するか、又は毎日の食事からそれを排除することさえ、これらの方法のすべては、それらが厳密な制限手段を通常包含する食事再検討を必要とし、そして生活の質に結局は影響し、及び／又は個人の期待された成長を究極的には阻害する可能性があるので、実施において結局困難であることが判明した。
【００１３】
食品アレルギー及び食品不耐症を治療する異なる方法は、食品アレルゲンが本質的に通過できないように、腸の完全性を修復し、且つ維持することに向けられている。これに関して、米国特許第５，１９２，７５０号は、食品アレルゲンの透過に対する必要な障壁を形成すること、そして通常の機能を維持することを粘膜に可能にさせるためにＮ−アセチルグルコサミンの使用を記載している。
【００１４】
アレルギーを治療するためのなお他の方法に従えば、マスト細胞及び好塩基性細胞の誘発を阻止する、ＩｇＥ分子に対する個人のワクチン化が、示唆されている。この目的のために、ＷＯ９７／３１９４８は、アレルギー反応及び炎症反応の調節に関与する媒介物質の放出に関与する免疫グロブリンであるＩｇＥ分子の部分に、三次元コンホメーションにおいて類似している、ワクチンのための特定のペプチド類を提案している。個人の自分自身の免疫系は、前記ＩｇＥ免疫グロブリンが排除（ｓｃａｖｅｎｇｅ）されるように、前記ＩｇＥ分子に向けられた抗体を究極的に形成することが考えられる。しかしながら、形成された抗体は、個人の本来の防御メカニズムが有害に影響される可能性があるように、他の免疫グロブリンのクラスと交差反応を示す不利な点を、前記方法は宿している。
【００１５】
まだ公開されていない本願出願人自身による特許出願である、ＥＰ９９２００１３０．５において、なお別の方法が開示されている。非アレルギー性の広範に加水分解されたたんぱく質物質及び／又は遊離アミノ酸ベイシス（ｂａｓｉｓ）及び、各々アレルギー発生性たんぱく質の少なくとも１種の寛容原性ペプチドを含有する低アレルギー発生性組成物が提案されている。この組成物は先行技術より優っている多くの利点を提供するけれども、各々の回分について新たに生成されなければならない、寛容原性ペプチドを得ることは依然として困難である。
それ故に、アレルギーを治療するための改良された手段を提供することの必要性が当業界において存在する。
【００１６】
それ故に、本発明の目的はそのような手段を提供することにある。
上記目的は、アレルギー反応を起こす個人の傾向を減少させることができる新規な乳酸菌株を提供することにより解決された。その新規な乳酸菌は、寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）ペプチドの特定の配列及びおそらく立体配置が維持され、安定性が保存され、このようにして個人の免疫系により処理され且つ認識されることができるような前記寛容原性ペプチドを宿すポリペプチドを発現する。
【００１７】
図において、
図１は、β−ラクトグロブリン加水分解物の各々の分画に含有されるペプチド類の一次配列を示す；垂直棒は二硫化物結合を示す。
【００１８】
図２は、種々の実験において、寛容原性ペプチド／ペプチド分画を用いて得られた結果を示す。
【００１９】
乳酸菌、特に乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフイドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、免疫系の調節に関与するメッセンジャー類（サイトカイン類）を生成することによりそれらの管腔生息環境を離れることなしに、免疫系を調整することが示された。乳酸菌は、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１及びＧＭ−ＣＳＦのようなプロ−炎症性サイトカイン類の生産を誘発しないが、しかしむしろ腸免疫生体恒常状態及び上皮障壁完全体の両方の維持に関する重要な暗示（Ｐｌａｎｃｈｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１，第５５頁（１９９９））と共に、ＴＧＦ−βのような炎症抑制サイトカイン類の生産を促進する（Ｂｌｕｍ等、Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ　７６，第１９９頁（１９９９））。一貫して、乳酸杆菌属ホモジェネートの経口投与は、単核細胞のマイトジェン誘導増殖に対して抑制効果を発揮することが示された（Ｐｅｓｓｉ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５，第４７２５頁（１９９９））。
【００２０】
乳酸菌（ＬＡＢ）は染色体組み込み又はエピソームプラスミド要素に基づく異種遺伝子の発現を可能にするためのシステムを有するたんぱく質及びペプチドの異種（過剰）生産のために用いることができる（例えばＫｕｉｐｅｒｓ等、Ｔｉｂｔｅｃｈ　１５，第１４０頁（１９９７）参照）。さらに、乳酸菌は粘膜表面を転移増殖させ、そしてペプチドグリカン分解から生ずるムラミルペプチドと組合わさって固有の補助薬品性を示す潜在的能力を有する。
【００２１】
さらに、或る種の乳酸杆菌属菌株は、特にＩｇＡクラスにおいて抗原特異性免疫応答を促進することが示された（Ｍａｊａｍａａ等、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．２０，第３３３頁（１９８５））。補体を活性化することの、抗原に対して複合化されたヒトＩｇＡの不能力性は、粘膜表面の完全性を維持することにおいて重要なものであり得る。これは、組織の損傷に起因して粘膜浸透性を高める、白血球の流入及び免疫学的エフェクターの放出を包含する、局所的炎症反応を防止するであろう。さらにこの免疫排除メカニズムを介して、ＩｇＡはバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）抗原の吸収をさらに制限し、したがってＩｇＥ及びＩｇＧ同属体の抗体により媒介されるアナフィラシー反応を阻止するであろう。
【００２２】
さらに、乳酸杆菌属は、単離されたＴ細胞、ＩＦＮ−ガンマの生成の効能を高めることが示された（Ｈａｌｐｅｒｎ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．７，第２０５頁（１９９１））。最近、ＩＦＮ−ガンマは腸粘膜マスト細胞のＴＮＦ−アルファ放出を阻止することが示された（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ等、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７，第１５６頁（１９９５））。増大したＩＦＮ−ガンマ分泌は、ＴＮＦ−アルファの有害な作用を防止し（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｎｄｏ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８２，第５９１頁（１９９４））、したがって、食品アレルギーに伴う透過障害に対抗する。例えば、アトピー性湿疹における抗原吸収に対する腸の障壁の損傷は、通常の食事及び環境のアレルゲンに対する異常に拡大された免疫応答における主要な決定因子であり得る。
【００２３】
それ故、本発明に至る徹底的な研究中に、本発明者らは、アレルギー反応に対する個人の傾向を減少させるか又は最小にさえするための強力な薬剤を生成するために、乳酸菌の有利な性質を寛容原性ペプチドの潜在能力と組み合わせる手段を案出した。
【００２４】
本発明において使用されるべき乳酸菌は、好ましくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）グループ、又はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）グループ、又はラクトコカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）グループに属しており、そしてさらに好ましくは、それぞれヒト又は動物由来のすべてである、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、又はＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの群から由来する。
【００２５】
個人においてアレルギーを起こす一定のたんぱく質から誘導されるペプチドである、寛容原性ペプチドは、一般に約２００〜６０００Ｄａの大きさを有しており、それが誘導されるたんぱく質に対して少なくとも耐性を誘導することができるペプチドである。さらに、耐性は、同様に特定の寛容原性ペプチドにより表される決定因子より、同じ抗原決定因子を有する任意の材料に対して誘導されるだろう。本発明に従えば、このペプチドは乳酸菌において合成されたポリペプチド中に、組換え手段により挿入され、このポリペプチドはその菌に対して、内因性又は外因性であることができる。寛容原性ペプチドは、それが免疫系により認識されることができるように、得られた組換え体ポリペプチドの周辺上に提供されるような方法で挿入される。
【００２６】
ポリペプチドは、当業界において周知の方法に従って乳酸菌において発現されることができる。例えば市販のベクターｐＮＺ１２４（Ｐｌａｔｔｅｕｗ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０，第５８７頁（１９９４））、ｐＧＫ１２（Ｗａｌｋｅ等、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８，第２３３頁（１９９６））又はｐＧ＋ｈｏｓｔ９（Ｍａｇｕｉｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７８，第９３１頁（１９９６））はエピソームの発現のために用いることができる。なお、染色体組み込みの優れた安定性を考慮にいれて、この方法を行うことは各々のポリペプチドをコードする組換え遺伝子のために好ましいだろう。染色体中に組み込むために、相同的組換えは、例えば免疫寛容原性ペプチドを含有し、そして内因性遺伝子を置き換えている乳酸菌からの組換え遺伝子を用いることにより適用することができる。なお、宿主の染色体中への組換え遺伝子を導入するための方法は、当業者の技術範囲内に十分に入る。
【００２７】
ポリペプチドは通常細胞内に存在するために発現されたたんぱく質であることができるが、しかし同様に、乳酸菌により分泌されるポリペプチド、又はその細胞壁中に挿入されているポリペプチドであって、その免疫寛容原性ペプチドを含有する部分が細胞外の区分に配置されているポリペプチドであることができる。本発明において使用されるべきポリペプチドの例は、ｐｅｐＮ、ｐｅｐＸ、乳酸デヒドロゲナーゼ若しくはβ−ガラクトシダーゼ、又はバクテリオシン類若しくはＳ−層たんぱく質若しくは細胞壁固定プロテアーゼ（ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ）のクラスの１員である。
【００２８】
寛容原性ペプチドが免疫系について影響を受けやすいように、その寛容原性ペプチドを挿入することができることを条件に、ポリペプチドの種類はさほど重大なものではない。しかしながら、いったん適当な寛容原性ペプチドが確認されたならば、そのような位置に寛容原性ペプチドを配置させることは当業者の技術内に十分に入る。この目的のために、当業者は寛容原性ペプチドが挿入されるべきポリペプチドの三次元モデルを参考にして調べ、そしてそのような情報に基づいて対応する組換えたんぱく質をデザインするだろう。
【００２９】
好ましい態様において、組換えポリペプチドは、寛容原性ペプチドが絶えずその環境に提供されるように、細菌の細胞壁において分泌されるか又は配置される。
【００３０】
寛容原性ペプチドはアレルギー反応を起こす食品材料から誘導される。なお、そのアミノ酸配列がその本来のたんぱく質に見い出されるアミノ酸配列に相当することは必須ではないが、出発ペプチド又は同じ結果を本質的に示す、即ちアレルギー応答において減少を誘導する、それから誘導されたポリペプチドと、本質的に同じアミノ酸配列及びおそらく同じ三次元コンホメーションを有する任意のペプチド配列が、所定の目的のために適当であろう。
【００３１】
寛容原性ペプチドのための好ましい供給源として、例えばβ−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン又はカゼインのような、ミルク、大豆、ピーナッツ、甲殻類、魚、食肉、ごま、又は乳漿を挙げることができる。
【００３２】
寛容原性ペプチド類を確認するために、当該関与のアレルゲン性物質はまず約１０〜５０％の程度までに酵素的加水分解に付され、そしてたんぱく質混合物における残っている酵素的活性は、例えば熱処理により不活性化される。たんぱく質加水分解物溶液は清澄化され、所望に応じて、さらに精製される。このようにして得られたペプチドは、例えば該溶液を沈殿処理に付すか、又はそれをクロマトグラフイカラム中に通過させることにより分離される。
【００３３】
次に、様々なペプチドを含有する分画は、動物モデルにおいてそれらを試験することにより、それらの寛容原性の性質について試験される。この目的のために、マウスのような動物は各々のペプチド分画を有する餌が与えられ、次にアレルゲンで免疫が与えられ、そして例えば、外側の外観における変化により、又は動物におけるＩｇＥ水準を特異的に測定することにより、それに対する応答が測定される。結果として、各々のペプチド（分画）を決定することができるように、免疫寛容原性ペプチドの分画はアレルゲンに対する反応するその動物の傾向を減少するだろう。
【００３４】
いったん寛容原性ペプチド及びそのアミノ酸配列が立証されたならば、乳酸菌において発現されるべきポリペプチドのＤＮＡ配列が細菌たんぱく質キャリアをコードする遺伝子中に、遺伝子工学により挿入される。ＤＮＡ配列を操作し、且つ微生物においてたんぱく質を発現するための方法及び技術はＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９９２）において記載されている。
【００３５】
本発明はまた、そのような組換え乳酸菌の少なくとも１種を含有する食品及び医薬組成物に関する。
【００３６】
細菌株は材料のｇ当たり１０^５〜１０^１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の範囲の量で組成物中に含まれることができる。同様に、乳酸菌の培養の上澄み液又はその活性分画が組成物中に含まれることができる。
【００３７】
食品組成物は、ミルク、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵ミルク、ミルクをベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵された穀類をベースとする製品、ミルクをベースとする粉末、乳児配合食品、又は動物の場合におけるペットフードであることができる。
【００３８】
医薬組成物は、錠剤、液体細菌懸濁液、又は細菌細胞を溶解し、細胞壁成分を集めることにより得られた単なる細胞壁分画のような、細菌の部分を含む製剤、乾燥された経口サプリメント、湿式経口サプリメント、乾燥チューブ給餌（ｄｒｙ　ｔｕｂｅ　ｆｅｅｄｉｎｇ）又は湿式チューブ給餌の形であることができる。
医薬製剤のための投与の経路は経口であるが、しかし経鼻経路であることもできる。
【００３９】
本発明はまた本発明の細菌又はその部分を含むワクチンを念頭に入れている。その細菌は、生きた形であることができ、又は所望に応じて減衰される、即ち
それらの増殖能力において弱化されることができる。細菌の部分として、第一に当該関与の抗原を宿している細胞壁が適用される。細胞壁は、細胞を溶解し、その異なる成分を分離することにより容易に得ることができる。
【００４０】
以下の例は、本発明をそれらの例に限定することなしに、本発明をさらに例示する。
例　１
寛容原性ペプチドの単離
ａ）ペプチドの単離
２２０ｇのβ−ラクトグロブリン（Ｓｉｇｍａ製）を５％（重量／重量）の濃度で二度−蒸留水（ｂｉ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）中に溶解した。得られた溶液に、１／１００（重量／重量）の酵素／基質（Ｅ／Ｓ）比を用いて、ＴＰＣＫ処理されたトリプシンを加え、そして絶えずかき混ぜながら、４０℃、ｐＨ７．６でその溶液をインキュベートした。１時間後に、同じ量の酵素を加えて、２／１００の最終（Ｅ／Ｓ）比を生成した。インキュベーションを更に４時間続け、そして熱処理（８５℃、５分間）により酵素を不活性化して反応を停止させた。次に、全体のトリプシン加水分解物を凍結乾燥させ、得られたペプチド生成物を、カチオン樹脂上で分取クロマトグラフイにより分離した。
【００４１】
約２〜２３アミノ酸（約２４０〜２７２０Ｄａ）の範囲の１５の異なるペプチド分画が得られた。各々の分画は、ナノ級濾過され、ダイアフィルトレーションが行われ、透析され、再び凍結乾燥され、そして使用するまで室温で乾燥貯蔵された。それらの分画はまた、逆相高速液体クロマトグラフイ（ＨＰＬＣ）を用いてそれらのペプチドの含有量について特徴づけられた。主要な成分として、示されたペプチド（Ｔ）を含有する合計１５分画（Ｆ１〜Ｆ１５）が集められた。
【００４２】

【００４３】
それらのペプチドは単離され、そして配列決定された。その配列は図１に示される。種々のペプチドはＰｅｃｑｕｅｔ　Ｒ．、Ｂｏｖｅｔｔｏ　Ｌ．、Ｍａｙｎａｒｄ　Ｆ．、Ｆｒｉｔｓｃｈｅ　Ｒ．、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１０５，第５１４頁〜第５２１頁の「ウシＢ−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解により得られたペプチドはマウスに特異的な経口寛容を誘導する」（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｔｒｙｐｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　Ｂ−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｒａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｍｉｃｅ）（この文献を参照することにより本明細書に組み入れる）において詳細に記載されている、様々な実験において、寛容原性であることを明白に示した。
【００４４】
ｂ）寛容原性ペプチドの合成
上記引例において確認されたとおりのβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）Ｔ６、Ｔ１７、及びＴ６／Ｔ１７の３種の寛容原性ペプチド、ならびに対照ペプチド１３は、下に挙げられるようにＢＬＧ配列からのフランキング残基、ならびにＣｙｓ外の残基（ｅｘｔｒａ　Ｃｙｓ　ｒｅｓｉｄｕｅ）を用いて化学的に合成された：
【００４５】

【００４６】
ｃ）動物試験
種々のペプチドの寛容原性の性質を評価するためにＩＦＦＡ−Ｃｒｅｄｏ（Ｌ’Ａｂｒｅｓｌｅ　Ｆｒａｎｃｅ）から得られた雌のＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。それらの動物は、すべてミルクの存在無しの食事で育てられ、飼育された。実験の開始時にそれらの動物は３週令であった。それらは、生来のβ−ラクトグロブリン（５ｍｇ／ｇ（体重））、種々の量の消化されたβ−ラクトグロブリン、及び上記ａ）において得られた異なるペプチドの種々の量を強制飼養により摂取した。対照マウスは食塩水が与えられた。そのような規定食で５日後に、免疫応答の特異性を評価するために、関連のない抗原としてβ−ラクトグロブリン及び卵アルブミン（等級Ｖ、Ｓｉｇｍａ製）を用いてすべてのマウスに免疫を与えた。左後足底の厚さを、免疫化の前と後とで比較することにより、遅延化タイプ過敏性評価（ＤＴＨ）が全身抗原投与の２１日後に行われた。免疫化の２４時間後に、動物の足底の厚さが測定された（Δ厚さ（ｍｍ）で表す）。次に、すべてのマウスから血液が取り出され、次に脾臓が取り出され、これらはグループ処置に従って貯留された。脾臓細胞特異的増殖アッセイが各々のグループについて行われた。腸内容物が個別に集められた。それぞれのアッセイを行うまで、血清及び腸サンプルを個々に、−８０℃で凍結させた。抗−β−ラクトグロブリンＩｇＥ及び抗−卵アルブミンＩｇＥ水準を、血清及び腸サンプルの両方において決定した。
【００４７】
ｄ）ＩｇＥ抗体アッセイ
血清及び腸液を希釈し、そしてＥＬＩＳＡを用いて抗−β−ラクトグロブリンＩｇＥ抗体及び抗−卵アルブミンＩｇＥ抗体について２回評価した。２０匹の免疫化させていないマウスの貯留サンプルを負の対照として用いた。負の対照の吸収を２回与えたサンプルの希釈を計算することにより力価を決定した。その力価は希釈の逆数のＬｏｇ１０として表された。
【００４８】
ｅ）細胞培養
脾臓細胞溶液をＰＢＳ中で均質化し、精製した。細胞は、β−ラクトグロブリン又はフィトヘマグルチニンＡの存在下に共培養された。トリチウム化チミジン（〔^３Ｈ〕−Ｔｈｙ（チューリッヒのＡｍｅｒｓｈａｍ製））を、培養の最後の６時間中に加え、平板培養物を採取し、そしてシンチレーション計数により分析した。刺激指数は、三重培養により導入された〔^３Ｈ〕−Ｔｈｙの平均ｃｐｍとして表された、ブランク−減算試験水準と対照水準との比として計算された。
【００４９】
ｆ）合成ペプチドの経口投与により誘導された耐性
合成ペプチド類が非経口マウスモデルにおいてそれらの寛容原性能力について分析された。以下の結果が得られた：
【００５０】

【００５１】
合成ペプチドＴ−１７は、ＩｇＥ生成及びＴ細胞増殖の両方を減少させ、一方ペプチドＴ−６は、Ｔ−細胞応答のみを抑制した。それに対して、ペプチドＴ−１３（対照ペプチド）は、ＢＬＧに対して経口耐性を誘導しなかった。
【００５２】
例　２
組換え体ポリペプチドの構築
寛容原性の性質を示すものとして例１において確認されたペプチドＴ６及びＴ１７は細菌の表面で示されるように、細胞表面固定プロテアーゼと融合された。負の対照として、β−ラクトグロブリンのＮ−末端の部分を構成するペプチドＴ１３が使用された。
【００５３】
（上記）細胞表面固定プロテアーゼは、その配列がＧｉｌｂｅｒｔ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，第３０５９頁〜第３０６５頁（１９９６）において発表された、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのものであった。このたんぱく質は、酵素の細胞運び去り（ｃｅｌｌ　ｅｘｐｏｒｔ）に応答性である３３アミノ酸（ｐｒｅ−領域）、次に開裂の際に酵素のたんぱく質分解活性の活性化に応答性である一連の１５４アミノ酸（ｐｒｏ−領域）及び活性部位についての７００〜８００アミノ酸のリーダーペプチドから構成される、２０００アミノ酸たんぱく質として特徴づけられた。あとに続く領域（約１０００アミノ酸）は、生成されたペプチドの、細胞における開裂及び輸送の特異性に役割を演じること、そして細胞壁にも延びていることが示唆された。プロテアーゼは、細胞壁ペプチドグリカン構造への特異的共有結合に応答性である、少なくとも２００アミノ酸とそのカルボキシル末端により固定された細胞壁である。
【００５４】
そのプロテアーゼ遺伝子はまず、以下の２つのプライマーを用いることによりそのプロモータと増幅された：
５’−ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＣＡＣＧ−３’
（ＢａｍＨＩ部位を担持する、遺伝子のプロモーターの上流）
５’−ＡＴＡＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＧＣＣ−３’
（ＸｂａＩ部位を担持する、遺伝子のｒｈｏ−独立ターミネーターの下流）
【００５５】
増幅生成物は、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いて開裂され、そして同じ制限酵素で消化された乳酸菌ベクターｐＮＺ１２４においてクローン化され、プラスミド不含有（ベータ−ガラクトシダーゼ及びプロテアーゼ陰性の）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ中に電気穿孔法（エレクトロポーレーション）により最終的に導入された。
【００５６】
クローン化されたプロテアーゼの活性部位の領域は当該関与のペプチド／ポリペプチドの配列により置き換えられた。これを達成するために、クローン化プロテアーゼは、リーダーペプチドの開裂部位の５０ｂｐ下流に配置されている、ＮｈｅＩ及び８００ｂｐさらに下流のＰｖｕＩで開裂された。当該関与のペプチドをコードするＤＮＡ配列（１０アミノ酸まで）は、それらがいったんハイブリダイゼーションが行われたならば、それらの末端の２つの制限部位を生成するようにデザインされた、２つのオリゴヌクレオチドとして２つの制限部位の間に挿入された。オリゴヌクレオチドのデザインは、プロテアーゼ遺伝子への連結反応の際、組換えたんぱく質のリーデイングフレーム（読み枠）がオープン状態のままにあることを考慮に入れている。
【００５７】
より大きなポリペプチドの挿入は、２つの制限部位を含有するプライマーを用いてＤＮＡ増幅により行われた。増幅生成物は、制限酵素を用いて開裂された。両方の場合において、ＤＮＡ断片は、プロテアーゼ遺伝子に連結され、そして電気穿孔法（エレクトロポーレーション）によりＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ中に導入された。
【００５８】
ペプチドＴ６を含む組換えプラスミド構築物及びペプチドＴ１７を含む組換えプラスミド構築物は、２０００年９月２２日付でブタペスト条約下にパスツール研究所（ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐａｓｔｅｕｒ）に寄託され、そして前者は寄託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−２５６３号を受け取り、後者は寄託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−２５６４号を受け取った。
【００５９】
例　３
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの形質転換
形質転換の目的のために、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｃｔｉｓ菌株（ＭＧ　１３６３、プラスミド不含有）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１（受託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−１２２５下にパスツール研究所から手に入れることができる）をＧａｓＰａｋ嫌気性システム中で３７℃でＭＲＳブロス中で一晩増殖させた。この培養物の分取量（アリコート）は０．５Ｍスクロースを含有する他の培養ブロス（ＭＲＳ）に接種するために用いられた。２００ｍｌのＭＲＳ＋０．５Ｍスクロース中に２％で追加の再接種後にその培養物は０．６のＯＤ_５９５にまで増殖した。細胞は１０分間４℃で５０００ｒｐｍでの遠心分離により集められ、ペレットは１Ｍのスクロース及び２．５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する溶液の１／２容量で１回洗浄され、１Ｍのスクロース及び２．５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する溶液の１／４容量で１回洗浄され、そして遠心分離後に得られたペレットは、１Ｍのスクロース、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２＋８７％グリセロールの０．４５９ｍｌの溶液の３．５ｍｌ（１０％の最終グリセロール濃度）中に再懸濁された。その細胞は形質転換のために直接に用いられたか、又は−８０℃で凍結された。
【００６０】
電気穿孔法（エレクトロポーレーション）のために、４０μｌの細胞は（＜５μｌの容量において）１０〜１００ｎｇのＤＮＡと混合され、氷冷０．２ｃｍ電気穿孔キューベット中に移された。氷冷０．２ｃｍ電気穿孔キューベットにおいて２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶでのパルスが適用された。そのキューベットに、１ｍｌのＭＲＳ＋２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＣａＣｌ_２が加えられ、その懸濁液は、適当な温度（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓについては３０℃、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉについては３７℃である。ｔｓプラスミド（ｐＧ＋ｈｏｓｔ９）が用いられるときはインキュベーションは３０℃である）で２〜３時間インキュベートされた。プラスミドＤＮＡの形質転換の際には、１０μｌ及び１００μｌの分取量（アリコート）が適当な抗生物質を含有するＭＲＳ寒天平板上でそれぞれ平板培養され、そして連結反応混合物を用いての形質転換の際には、１００μｌ及び５００μｌのそれぞれが平板培養された。平板培養物は上記と同じ温度で、２４〜４８時間嫌気的にインキュベートされた。
選択培地として、エリスロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）を有するＭＲＳ又はカナマイシン（５μｇ／ｍｌ）を有するＭＲＳが用いられた。
【００６１】
例　４
免疫寛容原性ＢＬＧペプチドに対するマウス抗血清及び単クローン性抗体の生成
（例１において略述された）ＢＬＧペプチドＴ６、Ｔ１７、Ｔ６／Ｔ１７及びＴ１３は、マレイミド活性化ＫＬＨと一緒にされ、そしてＴｉｔｅｒｍａｘアジュバントと一緒に用いられて、乳性たんぱく質不含有食事が与えられたマウスを免疫化した。第１の免疫化後１１５日まで、２週間間隔で採取された血液サンプルは、ＢＬＧペプチドに特異的な抗体を含有することがＥＬＩＳＡにより示された。
【００６２】
抗−Ｔ６抗血清及び抗−Ｔ１３抗血清はまた、ＢＬＧの生来（ＥＬＩＳＡ）形又はＢＬＧの変性（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＋ウエスタンブロット）形の両方と反応させた。抗−Ｔ６及び抗−Ｔ１７は、組換えＬ．ｌａｃｔｉｓの表面で発現されたＢＬＧペプチドを特異的に認識することが示された。その結果は、表Ｉに示される。
【００６３】

ＥＬＩＳＡ／ＯＤ４９０ｎｍ（１５’／３７℃）
＋＋＋　＞０．３
＋＋　　０．２〜０．３
＋　　　０．１〜０．２
＋／−　０．０５〜０．１
−　　　＜０．１
ＮＴ　　試験せず
ｎａｔ．ＢＬＧ　　ＰＢＳに溶解された３ｘ結晶化ＢＬＧ（Ｓｉｇｍａ製）、
ｄｅｎ．ＢＬＧ　　ＳＤＳサンプル緩衝液中に希釈され且つ煮沸された３ｘ結晶化ＢＬＧ（Ｓｉｇｍａ製）、
ＬＩ／Ｔ　　　　　ＢＬＧペプチド挿入を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓプロテイナーゼを保持する
組換えＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ。
【００６４】
抗−ＢＬＧペプチド単クローン抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために、免疫化マウスから脾臓が採取された。脾臓細胞は標準の技術に従って、骨髄腫細胞と融合され、そしてスクリーニングの第１期間は抗−Ｔ６抗体及び抗−Ｔ１７抗体のいずれかを生成する細胞集団の確認をすでに可能にした。これらの細胞のクローン化は、１つのウエル当たり単一の細胞の存在を確実にするために細胞分離器（ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ）を用いて達成された。
【００６５】
例　５
抗体による寛容原性ペプチドの検出
抗体により手に入れることができ、抗体により認識されるような方法で、乳酸菌が寛容原性ペプチドを発現するかどうかを決定するために、組換え遺伝子を含有する細菌が５０ｍｌ培養液中で増殖され、細胞は遠心分離により集められた。次に、細胞は５０ｍｌのＴＢＳを用いて２回洗浄され、そして最終的にＴＢＳの６ｍｌ中に懸濁された。懸濁液の７５μｌはウエル（半ウエル平底ＥＬＩＳＡ平板）に移され、そしてその平板は、ウエルが乾燥状態になるように、３７℃で２４時間、蓋をしないで放置された。平板は結合されていない細菌が洗い落とされてしまうまでＴＢＳ／ＰＢＳを用いて３回洗浄され、次にウエルは３７℃で２時間ＴＢＳカゼイン（１．５ｇ／リットル）を用いて遮断処理（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に付された。そのウエルに、特定のペプチドに向けられた抗体を含有するマウス抗血清が加えられた。そのウエルは０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ−カゼイン中の希釈液を用いて、室温で一夜インキュベートされた。次に、そのウエルはＴＢＳを用いて３回洗浄され、そして発現性（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）抗体（ＨＲＰ−共役ヤギ抗−ラットＩｇＧ）が、ウエルに加えられ、次に３７℃でインキュベートされ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ−カゼイン溶液中に希釈された。そのウエルは、ＴＢＳで３回洗浄され、そしてＯＰＤ／Ｈ_２Ｏ_２を用いて発現され、そして４９０ｎｍで読み取られた。
【００６６】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの両方の菌株は、寛容原性ペプチドが抗体により認識されることを示す陽性反応を示したことを観察することができた。
【００６７】
例　６
Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ｐｒｔＢプロテイナーゼのアミノ残基４７２−
６５９に向けられたウサギ抗血清の調製
アミノ酸残基４７２−６５９（アミノ酸Ｎｏ．１は開始メチオニンである）をコードするｐｒｔＢ標的配列（ｂｐ１４１４−１９７７）は鋳型としてｐＭＤ１１４を用い、そして
配列の上流プライマー（ｐｒｔＢ５’−１４１４）
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧ−３’
（５’−ＢａｍＨＩ部位含有）、及び
配列の下流プライマー（ｐｒｔＢ３’−１９７７）
５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣ−３’
（５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位含有）
を用いて、ＰＣＲにより増幅された。
【００６８】
特定のＰＣＲ生成物は、９５℃、３０秒間の変性工程、５６℃、３０秒間のプライマーアニーリング工程、及び７２℃、４５秒間の伸長工程からなる３サイクル、次に６０℃にもたらされたアニーリング工程を有する２７サイクルを用いる、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて得られた。
【００６９】
プライマー及びｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ製高純度ＰＣＲ生成物精製キット（Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｐｏｄｕｃｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）の脱塩化及び除去後に、サンプルはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化され、次に、アガロースゲル電気泳動に付され、そして当該関与のＤＮＡバンドが該ゲルから回収された（Ｐｅｑｌａｂ製のＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ゲル抽出キット）。
【００７０】
精製された増幅生成物は、６−ヒスチジンタグをコードする配列まで下流に、ｐＱＥ−９　Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ製）のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間で連結された。
【００７１】
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕はこのベクターを用いて形質転換され、その異種たんぱく質の発現は、培養の１ｍＭ　ＩＰＴＧ−媒介誘導の際に得られた。
【００７２】
１リットル培養液の細胞はペレット化され、そして変性条件（８Ｍの尿素）下に溶解された。清澄化溶解液が遠心分離により得られ、そしてＮｉ^２＋−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ製）上に載せられ、ｐＨ８．０で平衡化され、６−ヒスチジンタグ付きたんぱく質を結合させた。ｐＨ６．３での洗浄工程の後に、組換えたんぱく質はｐＨ４．５で溶離された。
【００７３】
その物質は１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中で中和され（ｐＨ７．５）、ビシンコニン酸たんぱく質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により定量化され、そしてその濃度は同じ緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍｌに調節された。
【００７４】
抗原は完全フロイントアドジュバント中で乳化され、２匹のウサギに複数回の皮内注射により投与された。注射は、０日、１４日、２８日及び５６日に行われた。最終の出血は８０日目に起こった。
【００７５】
驚くべきほどに強かった抗血清の反応性は、それらの細胞表面でのＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ｐｒｔＢプロテイナーゼを発現する組換え体Ｌｃ上で、ＥＬＩＳＡにより、そしてそのプロテイナーゼの分泌された形を発現する組換え体Ｌｃの培養液上澄み上で免疫ブロット法によりその両方で確認された。
【００７６】

【図面の簡単な説明】
【図１】
β−ラクトグロブリン加水分解物の各々の分画に含有されるペプチド類の一次配列を示す；垂直棒は二硫化物結合を示す。
【図２】
種々の実験において、寛容原性ペプチド／ペプチド分画を用いて得られた結果を示す。

Claims

ポリペプチドに対して異種の寛容原性ペプチドを含有するポリペプチドを発現する乳酸菌群の細菌株であって、該ペプチドが胃／十二指腸酵素による劣化に対して安定化され、その寛容原性を維持し、そして該ポリペプチドの周辺において示されるような上記細菌株。
乳酸杆菌属又はビフィドバクテリウム属から選ばれる、請求項１に記載の細菌株。
ポリペプチドが、表面たんぱく質、細胞間たんぱく質又は該細菌から分泌されたんぱく質である、請求項１又は２に記載の細菌株。
寛容原性ペプチドが食品材料から誘導される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌株。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌株又はその上澄み液を含有する食品組成物。
ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ、発酵ミルク、ミルクをベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵された穀類をベースとする製品、ミルクをベースとする粉末、乳児配合食品又はペットフードからなる群から選ばれる、請求項５に記載の食品組成物。
細菌株が１０^７〜１０^１１ｃｆｕ／投与剤型の範囲の量でその中に含有されている、請求項５又は６に記載の食品材料。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌株又はその上澄み液を含有する医薬組成物。
細菌株が１０^１０〜１０^１２ｃｆｕ／投与剤型の範囲の量でその中に含有されている、請求項８に記載の医薬組成物。
アレルギーの治療のための摂取可能なキャリヤの製造のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌株又はその上澄み液の使用。
アレルギーの治療のための摂取可能なキャリヤの製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の食品又は医薬組成物の使用。
組成物が経口又は経鼻の経路で投与される、請求項１１に記載の使用。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌株又はその部分を含むワクチン。
溶解された細菌の細胞膜分画が使用される、請求項１４に記載のワクチン。