CN106918709B - 检测过敏原的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供使用质谱检测过敏原的系统和方法。在一些方面中，可通过使用所选多反应监测MRM转换检测所关注过敏原所特有的一种或一种以上肽来筛选试样中以下过敏原的存在或量：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、高和低谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种类型的坚果，包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。

Description

检测过敏原的系统和方法
本申请是申请日为2012年9月4日、申请号为201280053386.1、发明名称为“检测过敏原的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明一般来说涉及使用质谱对试样(例如食物试样)中的过敏原进行检测和定量的试剂盒和方法。
背景技术
食物过敏可诱发有害免疫反应，例如，如皮炎、哮喘、胃肠损伤、过敏性休克等。用于对食物试样中的过敏原进行检测和/或定量的常规方法一般采用免疫分析，其可具有许多缺点。例如，一种称作酶联免疫吸附分析(ELISA)的此类方法需要使用昂贵的试剂盒并且最多进行半定量。另外，常规免疫分析在每次筛选中一般限于单一过敏原并且因缺乏特异性而频繁地造成假阳性。
因此，所属领域内需要对食物试样中的过敏原进行检测和定量的改进的试剂盒和方法。
发明内容
根据各实施例，本文提供使用质谱对试样中的过敏原进行检测和/或定量的方法和试剂盒。如下文所述，这些方法和试剂盒可使得能够通过利用所关注过敏原所特有的一种或一种以上氨基酸序列来对试样中的至少一种过敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麦谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果，包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)进行检测和/或定量。例如，可使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来检测过敏原特有的胰蛋白酶肽。在许多实施例中，可观察每一肽中的所选多反应监测(MRM)转换以使得能够对例如食物试样中的过敏原进行可靠定量。
根据各实施例，揭示各种过敏原所特有的一组肽。例如，可使用所述过敏原所特有的经分离肽来对过敏原卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、含有高和低分子量麦谷蛋白的谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果中的每一者进行检测和/或定量。在一些情况下，这些过敏原术语为广泛定义，其涵盖来自不同蛋白质的各种类型的肽且在一些情况下涵盖不同属和/或种的过敏原。例如，术语芥子涵盖从芸苔属(Brassica)和芥属(Sinapis)两者中的种获得的过敏原，这两个属均应理解为芥子的形式。举例来说，在鸡卵中发现的过敏原卵白蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ IDNO:1-7中的一者或一者以上。也在鸡卵中发现的过敏原溶菌酶所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:8-11中的一者或一者以上。牛乳蛋白质酪蛋白S1所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.12-18中的一者或一者以上。牛乳蛋白质酪蛋白另一同种型酪蛋白S2所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.24-29中的一者或一者以上。大麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.30-33中的一者或一者以上。低分子量麦谷蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.34-59中的一者或一者以上。高分子量麦谷蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.60-79中的一者或一者以上。归类为芥子的各物种的蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.80-112中的一者或一者以上。燕麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.113-116中的一者或一者以上。黑麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.117-123中的一者或一者以上。芝麻蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.124-132中的一者或一者以上。小麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.133-138中的一者或一者以上。巴西坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.139-155中的一者或一者以上。榛子蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.156-172中的一者或一者以上。澳大利亚坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.173-181中的一者或一者以上。花生蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.182-187中的一者或一者以上。阿月浑子坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.188-203中的一者或一者以上并且最后核桃蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO 204-212中的一者或一者以上。
上述肽中的每一者可使用与每一过敏原特有肽相关的特定MRM转换来检测和/或定量。根据各实施例，每一肽的优化MRM转换在下文论述于表1-19中。
在一个方面中，提供筛选试样中的过敏原的方法。所述方法包括获得试样和用至少一种蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)消化所述试样以将所述试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽。所述过敏原可为以下蛋白质中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白和从小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种类型的坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)获得的蛋白质。所述方法另外包括通过使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定至少一种肽的量来对至少一种过敏原进行定量。多种肽中的至少一者具有如序列表中所显示的氨基酸序列SEQ ID NO:1-212，所述序列的全部内容以引用方式并入本文中。
在一些实施例中，上述过敏原中的两者或两者以上是通过经由LC-MS/MS检测多种肽(例如上文所论述的那些)来检测和/或定量，其中对于每一肽片段来说，监测多个MRM转换，例如上文所论述的那些。已发现过敏原(例如，卵蛋白质(例如卵白蛋白)、溶菌酶或牛乳蛋白质(例如酪蛋白和乳球蛋白)、高和低麦谷蛋白、从小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果获得的蛋白质)的精确鉴别和/或定量可通过使用LC-MS/MS对过敏原的一组特有肽(例如本文所揭示的那些)的至少一种且优选若干种(例如，全部)和每一肽的特定MRM转换(例如本文所揭示的那些)进行监测和定量来完成。
在一个实施例中，可监测多种肽中的每一者的至少一个所选MRM转换。例如，可监测所述肽中的每一者的两个、三个或任一其它数量的MRM转换。在一个实施例中，可例如使用相同轮次的串联质谱仪来对两种或两种以上过敏原进行检测和/或定量。在另一实施例中，测定两种或两种以上肽的的量以对所关注过敏原进行定量。
在一些实施例中，所述方法可包含在消化所述试样之前添加已知量的以下蛋白质中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻、澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子的蛋白质。例如，可在消化试样之前将已知量的卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白和乳球蛋白中的每一者添加到所述试样。
本文还揭示检测试样中的卵白蛋白的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分卵白蛋白(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-7的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对卵白蛋白的所选肽进行检测和/或定量。例如，可监测一个所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:1-7的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表1中。可通过LC-MS/MS来监测卵白蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的溶菌酶的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分溶菌酶(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:8-11的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对溶菌酶的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:8-11的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表2中。可通过LC-MS/MS来监测溶菌酶的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的酪蛋白(例如，酪蛋白同种型S1或S2)的方法。在一个实施例中，所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分酪蛋白同种型S1(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽。在另一实施例中，所述方法可包括将蛋白水解酶添加到试样以将试样中存在的至少一部分酪蛋白同种型S2(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对酪蛋白的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:12-23的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表3或4中。可通过LC-MS/MS来监测酪蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的乳球蛋白的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分乳球蛋白(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对乳球蛋白的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:24-29的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表5中。可通过LC-MS/MS来监测乳球蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的大麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分大麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:30-33的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对大麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:30-33的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表6中。可通过LC-MS/MS来监测大麦的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的高和低分子量麦谷蛋白的方法。在一个实施例中，所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分高或低分子量麦谷蛋白(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ IDNO:34-79的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对低或高分子量麦谷蛋白的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:34-79的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表7和8中。可通过LC-MS/MS来监测高或低分子量谷蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测高或低分子量麦谷蛋白的一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的芥子的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分芥子蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:80-112的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对芥子蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:80-112的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表9中。可通过LC-MS/MS来监测芥子的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的燕麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分燕麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:113-116的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对燕麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:113-116的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表10中。可通过LC-MS/MS来监测燕麦的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的黑麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分黑麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:117-123的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对黑麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:117-123的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表11中。可通过LC-MS/MS来监测黑麦的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的芝麻的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分芝麻蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:124-132的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对芝麻蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:124-132的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表12中。可通过LC-MS/MS来监测芝麻的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的小麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分小麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:133-138的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对小麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:133-138的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表13中。可通过LC-MS/MS来监测小麦的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的巴西坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分巴西坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:139-155的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对巴西坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:139-155的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表14中。可通过LC-MS/MS来监测巴西坚果的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的榛子的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分榛子蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:156-172的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对榛子蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:156-172的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表15中。可通过LC-MS/MS来监测榛子的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的澳大利亚坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分澳大利亚坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:173-181的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对澳大利亚坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:173-181的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表16中。可通过LC-MS/MS来监测澳大利亚坚果的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的花生的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分花生蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:182-187的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对花生蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:182-187的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表17中。可通过LC-MS/MS来监测花生的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的阿月浑子坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分阿月浑子坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:188-203的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对阿月浑子坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:188-203的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表18中。可通过LC-MS/MS来监测阿月浑子坚果的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的核桃的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分核桃蛋白质(如果有)裂解成多种肽，所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:203-212的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中，可监测所选MRM转换以对核桃蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如，可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:203-212的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表19中。可通过LC-MS/MS来监测核桃的肽的任一数量的优化转换。例如，可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
在一些实施例中，上述方法可利用氨基酸序列与所选肽相同的至少一种同位素富集肽来校准所述肽的定量。在一些实施例中，可利用具有已知浓度的所选肽的标准物来校准所选肽的定量。在一些实施例中，可在添加蛋白水解酶之前将已知量的所关注过敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白或来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质)添加到试样以校准所选所关注的肽和/或蛋白质的定量。在一些实施例中，可在添加蛋白水解酶之前将已知量的以下蛋白质中的每一者添加到试样：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。
试样可来自多种来源。在一个实施例中，例如，试样可为食物试样。
在另一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:113，m/z值为约989/998、989/1085或989/1234；ii)SEQ ID NO:114，m/z值为约777/984、777/1112或777/1226；iii)SEQ ID NO:115，m/z值为约627/642或627/1013；iv)SEQ ID NO:116，m/z值为约419/642。
在又一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:124，m/z值为约465/472、465/728或465/815；ii)SEQ ID NO:125，m/z值为约397/679、397/417或397/580；iii)SEQ ID NO:126，m/z值为约717/743、717/957或717/372；iv)SEQ ID NO:127，m/z值为约380/589、380/476或380/377；v)SEQ ID NO:128，m/z值为约419/522、419/637或419/409；vi)SEQ ID NO:129，m/z值为约582/795、582/866或582/980；vii)SEQ ID NO:130，m/z值为约806/869、806/1070或806/957；viii)SEQ ID NO:132，m/z值为约685/901、685/1089或685/1238。
在又一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:156，m/z值为约582/666、582/852或582/999；ii)SEQ ID NO:157，m/z值为约514/729、514/800或514/914；iii)SEQ ID NO:158，m/z值为约882/1033、882/580或882/806；iv)SEQ ID NO:159，m/z值为约567/449、567/684或567/799；v)SEQ ID NO:160，m/z值为约539/763、539/948或539/635；vi)SEQ ID NO:161，m/z值为约374/619、374/490或374/304；vii)SEQ ID NO:162，m/z值为约576/689、576/852或576/588；viii)SEQ ID NO:163，m/z值为约721/900、721/1014或721/484；ix)SEQ ID NO:164，m/z值为约502/703、502/816或502/575；x)SEQ ID NO:165，m/z值为约807/874、807/988或807/1089；xi)SEQ ID NO:166，m/z值为约700/984、700/464或700/365；xii)SEQ ID NO:167，m/z值为约679/841、679/600或679/713；xiii)SEQ ID NO:168，m/z值为约815/906、815/835或815/724；xiv)SEQ ID NO:169，m/z值为约424/589、424/718或424/488；xv)SEQ ID NO:170，m/z值为约601/973、601/616或601/731；xvi)SEQ ID NO:171，m/z值为约791/935或791/1212；和xvii)SEQ ID NO:172，m/z值为约528/614。
在又一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:173，m/z值为约729/921或729/1050；ii)SEQ ID NO:174，m/z值为约438/626或438/725；iii)SEQ ID NO:175，m/z值为约585/892或585/763；iv)SEQ ID NO:176，m/z值为约545/821或545/952；v)SEQ ID NO:177，m/z值为约537/786或537/935；vi)SEQ ID NO:178，m/z值为约493/743或493/580；vii)SEQ ID NO:179，m/z值为约344/500或344/401；viii)SEQ ID NO:180，m/z值为约392/566或392/437；和ix)SEQ ID NO:181，m/z值为约500/743或500/580。
在又一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:188，m/z值为约397/515、397/572或397/416；ii)SEQ ID NO:189，m/z值为约518/556或518/797；
iii)SEQ ID NO:190，m/z值为约802/1078、802/802或802/931；iv)SEQ ID NO:191，m/z值为约746/1157、746/941或746/683；v)SEQ ID NO:192，m/z值为约569/821、569/557、569/658；vi)SEQ ID NO:193，m/z值为约713/1012或713/470；vii)SEQ ID NO:194，m/z值为约502/703、502/816或502/575；
viii)SEQ ID NO:195，m/z值为约479/680、479/809或479/381；ix)SEQ ID NO:196，m/z值为约702/790、702/904或702/1088；x)SEQ ID NO:197，m/z值为约838/1020、838/835或838/906；xi)SEQ ID NO:198，m/z值为约961/1027、961/899或961/671；xii)SEQ IDNO:199，m/z值为约790/1054、790/492或790/925；xiii)SEQ ID NO:200，m/z值为约777/694、777/807或777/579；xiv)SEQ ID NO:201，m/z值为约279/500或279/274；xv)SEQ IDNO:202，m/z值为约837/1080、837/966、837/753；和xvi)SEQ ID NO:203，m/z值为约598/747、598/848、598/634。
在又一实施例中，所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：i)SEQ ID NO:204，m/z值为约813/1142；ii)SEQ ID NO:205，m/z值为约805/900、805/623或805/345；iii)SEQ ID NO:206，m/z值为约698/820、698/949或698/461；iv)SEQ ID NO:207，m/z值为约683/1136、683/796、683/925、683/1039或683/569；v)SEQ ID NO:208，m/z值为约515/729、515/487或515/616；vi)SEQ ID NO:209，m/z值为约955/692、955/905或955/577；vii)SEQ ID NO:210，m/z值为约502/703、502/816或502/575；viii)SEQ ID NO:211，m/z值为约792/904或792/1017；ix)SEQ ID NO:212，m/z值为约529/1017。
本文还揭示用于质谱测试试样中的过敏原的试剂盒。所述试剂盒可包括至少一种用于将试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽的蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)。过敏原可例如为卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质，并且多种肽中的至少一者可为具有氨基酸序列SEQ IDNO:1-212的肽。试剂盒还可包括至少一种使用质谱仪对所述多种肽中的至少一者的试剂进行定量。
在一个方面中，用于对多种肽中的至少一者进行定量的试剂可为氨基酸序列与多种肽中的一者相同的同位素富集肽。在一个实施例中，同位素富集肽可包括例如C13或N15中的至少一者。在另一方面中，用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂可包括所选浓度的用于校准质谱仪的多种肽中的至少一者。在一些实施例中，用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂可包含用于校准质谱仪的以下蛋白质中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如，试剂盒可包括已知量的以下蛋白质中的每一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。在其它实施例中，仅包括一些过敏原。
试剂盒可另外包括用于制备将使用质谱仪分析的试样、运行所制备的试样穿过LC柱或执行质谱的各种试剂。作为非限制性实例，试剂盒可包括例如将用作标准物的以下蛋白质中的一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒还可包括烷基化剂(例如，甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)、碘乙酰胺)和/或还原剂。
在一个方面中，试剂盒可包括关于使用质谱仪对至少一种过敏原进行定量的说明书。举例来说，试剂盒可包括关于待用作质谱仪中的设置的转换对或所预计片段离子的信息。
根据不同方面，提供可控制过程和/或执行本文所述的计算的软件。例如，所述软件可向质谱仪提供指令以监测一个或一个以上特定前体-产物离子对转换或片段离子。
具体实施方式
所属领域技术人员应理解，本文所述的方法和试剂盒是非限制性实例性实施例并且申请者揭示内容的范围仅由权利要求书界定。尽管结合各实施例对申请者的教示内容进行了说明，但并不打算将申请者的教示内容限定于所述实施例。相反，申请者的教示内容涵盖各种替代、修改和等效形式，如所属领域技术人员所应了解。结合一个实例性实施例说明或描述的特征可与其它实施例的特征组合使用。所述修改和变化形式打算包括在申请者的揭示内容的范围内。
根据各实施例，提供使用质谱通过检测一种或一种以上所关注过敏原所特有的氨基酸序列来筛选试样中以下蛋白质的存在或量的方法：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子的蛋白质)。例如，可使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来检测过敏原特有肽。可观察每一肽中的所选MRM转换以使得能够对试样中的过敏原进行定量。
所述方法可利用所属领域内已知的多种质谱技术。例如，质谱技术可为串联质谱(MS/MS)技术和/或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术。在一些实施例中，所述技术包含LC-MS/MS技术和使用三相四极仪器和多反应监测(MRM)。
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测卵白蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:1-7的肽)来对试样中的卵白蛋白进行检测和/或定量。例如，LC-MS/MS可用于测定试样中卵白蛋白特有肽的存在和/或量。在一个实例性实施例中，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换。在一些实施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且所述方法可包括监测至少一个具有约391/504、391/667或391/433的m/z值的前体-产物离子对转换，其中如本文所使用的术语“约”意指在+/-一(1)原子质量单位范围内。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述方法可包括监测至少一个具有约762/1036、762/487、762/1150的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:3，并且所述方法可包括监测至少一个具有约605/419、605/621或605/749的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且所述方法可包括监测至少一个具有约673/1096、673/1024、673/1209、449/526、449/608或449/639的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述方法可包括监测至少一个具有约791/1052、791/951或791/1239的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:6，并且所述方法可包括监测至少一个具有约844/666、844/1332或844/1121的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:7，并且所述方法可包括监测至少一个具有约930/1017、930/1118、930/1303或930/888的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一卵白蛋白特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的卵白蛋白特有肽可通过监测具有约391/504、391/667或391/433的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中，对试样中的卵白蛋白进行检测或定量的方法可包括检测多种卵白蛋白特有肽。作为非限制性实例，卵白蛋白可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQID NO:1-7的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表1显示根据申请者的教示内容测定为卵白蛋白所特有的肽的序列SEQ ID NO:1-7，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的卵白蛋白进行可靠定量。卵白蛋白所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中，其全部内容以引用方式并入本文中。
在下表中，片段离子具有对电荷以及常规片段化命名的引用。例如，标记2y4将指示带双电荷并且为y4片段(来自C-末端的4个单元)的片段。同样，标记2b4将指示带双电荷并且为b4片段(来自N-末端的4个单元)的片段。这些命名规则为所属领域技术人员已知。
表1
Figure BDA0001158794190000131
Figure BDA0001158794190000141
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测溶菌酶所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:8-11的肽)来对试样中的溶菌酶进行检测和/或定量。例如，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中溶菌酶特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:8，并且所述方法可包括监测至少一个具有约438/737、438/452或438/680的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:9，并且所述方法可包括监测至少一个具有约497/621、497/847或497/807的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:10，并且所述方法可包括监测至少一个具有约715/804、715/951或715/1065的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，溶菌酶特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，并且所述方法可包括监测至少一个具有约878/901、878/1064或878/1178的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一溶菌酶特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的溶菌酶特有肽可通过监测具有约438/737、438/452或438/680的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中，对试样中的溶菌酶进行检测或定量的方法可包括检测多种溶菌酶特有肽。作为非限制性实例，溶菌酶可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ IDNO:8-11的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表2显示根据本教示内容测定为溶菌酶所特有的肽的序列SEQ ID NO:8-11，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的溶菌酶进行可靠定量。溶菌酶所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中，其在此处以引用方式并入其表2中。
表2
Figure BDA0001158794190000151
Figure BDA0001158794190000161
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测酪蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-23的肽)来对试样中的酪蛋白进行检测和/或定量。例如，所述方法可包含通过检测酪蛋白S1所特有的经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽)来对试样中的酪蛋白S1同种型进行检测和/或定量。举例来说，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中酪蛋白S1特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述方法可包括监测至少一个具有约693/921、693/992或693/1091的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:13，并且所述方法可包括监测至少一个具有约584/763、584/706、584/650或438/600的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:14，并且所述方法可包括监测至少一个具有约416/488、416/587或416/702的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:15，并且所述方法可包括监测至少一个具有约634/992、634/771或634/934的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:16，并且所述方法可包括监测至少一个具有约880/1325、880/1495、880/1438、880/436、587/758、587/871或587/790的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:17，并且所述方法可包括监测至少一个具有约345/590、345/476或345/573的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S1特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:18，并且所述方法可包括监测至少一个具有约416/488、416/587或416/702的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一酪蛋白S1特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的酪蛋白S1特有肽可通过监测具有约693/921、693/992或693/1091的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中，对试样中的酪蛋白S1同种型进行检测或定量的方法可包括检测多种酪蛋白S1特有肽。作为非限制性实例，酪蛋白S1可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表3显示根据申请者的教示内容测定为酪蛋白S1同种型所特有的肽的序列SEQID NO:12-18，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的酪蛋白S1同种型进行可靠定量。酪蛋白S1同种型所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中，其全部内容以引用方式并入本文中。
表3
Figure BDA0001158794190000171
Figure BDA0001158794190000181
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测酪蛋白S2所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽)来对试样中的酪蛋白S2同种型进行检测和/或定量。举例来说，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中酪蛋白S2特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19，并且所述方法可包括监测至少一个具有约373/534或373/437的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:20，并且所述方法可包括监测至少一个具有约598/912、598/701、598/814、598/436的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:21，并且所述方法可包括监测至少一个具有约438/629、438/558或438/445的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S2特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述方法可包括监测至少一个具有约490/648、490/761、490/833的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:23，并且所述方法可包括监测至少一个具有约694/1187、694/811或694/940的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一酪蛋白S2特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的酪蛋白S2特有肽可通过监测两个具有约373/534或373/437的m/z值的前体-产物离子对转换来鉴别。关于具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的酪蛋白S2特有肽，可监测任两个、三个或全部具有约598/912、598/701、598/814或598/436的m/z值的经鉴别前体-产物离子对。
在一个实施例中，对试样中的酪蛋白S2同种型进行检测或定量的方法可包括检测多种酪蛋白S2特有肽。作为非限制性实例，酪蛋白S2可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表4显示根据申请者的教示内容测定为酪蛋白S2同种型所特有的肽的序列SEQID NO:19-23，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的酪蛋白S2同种型进行可靠定量。
表4
Figure BDA0001158794190000191
Figure BDA0001158794190000201
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测对乳球蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽)来对试样中的乳球蛋白进行检测和/或定量。例如，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中乳球蛋白特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24，并且所述方法可包括监测至少一个具有约533/853、533/754或533/641的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述方法可包括监测至少一个具有约458/803、458/688或458/504的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:26，并且所述方法可包括监测至少一个具有约1158/1453、1158/1581、1158/1255、772/1026、772/977或772/912的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:27，并且所述方法可包括监测至少一个具有约623/573、623/918、623/819、623/1047的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:28，并且所述方法可包括监测至少一个具有约561/806、561/935或561/692的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQID NO:29，并且所述方法可包括监测至少一个具有约419/653、419/556或419/425的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一乳球蛋白特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的乳球蛋白特有肽可通过监测具有约533/853、533/754或533/641的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中，对试样中的乳球蛋白进行检测或定量的方法可包括对多种乳球蛋白特有肽进行检测和/或定量。作为非限制性实例，乳球蛋白可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽的任一组合或甚至全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表5显示根据申请者的教示内容测定为乳球蛋白所特有的肽的序列SEQ ID NO:24-29，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的乳球蛋白进行可靠定量。乳球蛋白所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中，其全部内容以引用方式并入本文中。
表5
Figure BDA0001158794190000211
Figure BDA0001158794190000221
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测至少一种大麦所特有的经分离肽(例如B1-大麦醇溶蛋白或B3-大麦醇溶蛋白)来对试样中的大麦(barley,Hordeum vulgare)进行检测和/或定量，所述试样可具有例如一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQID NO:30-33的肽。例如，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中大麦特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:30，并且所述方法可包括监测至少一个具有约835/948、835/1097或835/1228的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:31，并且所述方法可包括监测至少一个具有约336/515、336/554或336/497的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述方法可包括监测至少一个具有约820/1097、820/548或820/713的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中，大麦特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:33，并且所述方法可包括监测至少一个具有约499/785、499/575或499/393的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中，所述方法可包括监测与每一大麦特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的大麦特有肽可通过监测具有约835/948、835/1097或835/1228的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。同样，氨基酸序列SEQ ID NO:31-33可以类似方式使用。
在一个实施例中，对试样中的大麦进行检测或定量的方法可包括检测多种大麦特有肽。作为非限制性实例，大麦可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:30-33的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表6显示根据本教示内容测定为大麦所特有的肽的序列SEQ ID NO:30-33，以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的大麦蛋白质进行可靠定量。
表6
Figure BDA0001158794190000231
所属领域技术人员理解，在一些情况下，所述序列中存在的个别氨基酸可通过在试样制备过程中使用常规方法来修饰。在另一实施例中，还打算捕获所述经修饰序列。例如，SEQ ID NO:30含有可在试样制备过程中利用封端剂封端的半胱氨酸部分，所述封端剂例如甲烷硫代磺酸甲酯，其可产生其中半胱氨酸已经封端而免于进一步反应的序列。其它封端剂为所属领域内已知并且可包括碘乙酰胺。因此应认识到，SEQ ID NO:30-33在其范围内包括经修饰的肽序列，其中个别氨基酸已经修饰而包括所述封端剂。所属领域技术人员将认识到，尽管序列将与封端剂的添加大体上类似，但质量将相应地改变。所述修饰也适合本文所揭示的所有过敏原的所有序列。
根据其它实施例，所述方法还可用于对除上文所揭示的过敏原以外的其它过敏原进行鉴别和定量，所述其它过敏原包括低和高分子量麦谷蛋白和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质。如上文针对例如卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白同种型S1、酪蛋白同种型S2、乳球蛋白和大麦等过敏原所例示，此也可通过检测过敏原所特有的至少一种经分离肽序列(例如，一种或一种以上具有先前所述或如表7-19中所概述的特定过敏原的氨基酸序列的肽)来实现。
根据一些实施例，所述方法可包含通过检测过敏原所特有的至少一种经分离肽(例如，一种或一种以上具有表7-19中所揭示的特定过敏原的氨基酸序列的肽)来对所述过敏原进行检测和/或定量。例如，三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中过敏原特有肽的存在和/或量。在一些实施例中，过敏原特有肽可具有表7-19中所述的氨基酸序列，并且所述方法可包括监测至少一个具有所述过敏原所特有的m/z值且描述于表7-19中的前体-产物离子对转换，并且还可包括监测如表7-19中所述的所述过敏原(如果可用)所特有的片段离子。
在一个实例性实施例中，当每一过敏原特有肽具有一个以上与其相关的前体-产物离子对转换时，所述方法可包括监测与其相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说，具有表7-19中所述的氨基酸序列的过敏原特有肽可通过监测任两个(如果可用)在表7-19中发现的特定过敏原的前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中，且如果可用，如果可用，可监测三个或三个以上所鉴别前体-产物离子对。
在一个实施例中，对其它过敏原(包括低和高分子量麦谷蛋白和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质)进行检测或定量的方法可包括检测多种过敏原特有肽。作为非限制性实例，过敏原可通过使用具有本文所鉴别的表7-19中所述的特定过敏原的氨基酸序列的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述，对于每一肽来说，可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表7-19显示根据本教示内容测定为低和高分子量麦谷蛋白的过敏原和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质的过敏原所特有的肽的序列，以及其最佳MRM Q1,Q3转换和片段离子。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的过敏原进行可靠定量。
为了进一步明晰，根据本教示内容，表7-19中所述的每一过敏原显示所测定的所述过敏原的肽的序列，以及其最佳MRM Q1,Q3转换和片段离子信息。根据各实施例，这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的所述过敏原进行可靠定量。
表7
Figure BDA0001158794190000251
Figure BDA0001158794190000261
Figure BDA0001158794190000271
Figure BDA0001158794190000281
Figure BDA0001158794190000291
Figure BDA0001158794190000301
表8
Figure BDA0001158794190000302
Figure BDA0001158794190000311
Figure BDA0001158794190000321
Figure BDA0001158794190000331
Figure BDA0001158794190000341
Figure BDA0001158794190000351
表9
Figure BDA0001158794190000361
Figure BDA0001158794190000371
Figure BDA0001158794190000381
Figure BDA0001158794190000391
Figure BDA0001158794190000401
表10
Figure BDA0001158794190000402
表11
Figure BDA0001158794190000403
Figure BDA0001158794190000411
表12
Figure BDA0001158794190000412
Figure BDA0001158794190000421
表13
Figure BDA0001158794190000431
表14
Figure BDA0001158794190000441
Figure BDA0001158794190000451
Figure BDA0001158794190000461
表15
Figure BDA0001158794190000462
Figure BDA0001158794190000471
Figure BDA0001158794190000481
表16
Figure BDA0001158794190000482
Figure BDA0001158794190000491
表17
Figure BDA0001158794190000492
Figure BDA0001158794190000501
表18
Figure BDA0001158794190000502
Figure BDA0001158794190000511
Figure BDA0001158794190000521
表19
Figure BDA0001158794190000522
Figure BDA0001158794190000531
在一些实施例中，上述过敏原中的两者或两者以上可通过经由LC-MS/MS检测每一过敏原所特有的一种或一种以上肽(例如上文所论述的那些)来检测和/或定量，其中对于每一肽来说，可监测多个MRM转换，例如上文所论述的那些。在一个实施例中，例如，可通过监测卵白蛋白所特有的两种肽的多个MRM转换(例如，监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.1的肽的MRM转换930/1116、930/888和930/1017和监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.7的肽的MRM转换390/667、390/504和390/433)和溶菌酶所特有的一种肽的多个MRM转换(例如，监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.8的肽的MRM转换437/452、437/680和437/737)在试样中检测卵蛋白质。在一个实施例中，例如，可通过监测酪蛋白同种型S1所特有的两种肽的多个MRM转换(例如，监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.12的肽的MRM转换693/920、693/991和693/1090和监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.16的肽的MRM转换880/1324、880/436、587/758、587/871和587/790)、酪蛋白同种型S2所特有的一种肽的多个MRM转换(例如，监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.20的肽的MRM转换598/911和598/456)和乳球蛋白所特有的一种肽的多个MRM转换(例如，监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.27的肽的MRM转换623/1047、623/918、623/819)在试样中检测牛乳蛋白质。在其它实施例中，表1到19中所揭示的任何过敏原的任一组合可使用类似程序进行检测和/或定量。
根据一些实施例，提供用于质谱测试试样中以下蛋白质中至少一者的试剂盒：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒可包括以下物质所特有的一种或一种以上经分离肽：鸡卵白蛋白、鸡溶菌酶、牛酪蛋白或牛乳球蛋白、高或低麦谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果，包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。例如，试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的经分离卵白蛋白特有肽。在一个方面中，试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的经分离溶菌酶特有肽。在一个实施例中，试剂盒可包括一种或一种以上经分离酪蛋白特有肽。例如，试剂盒可包括酪蛋白的S1同种型所有的一种或一种以上经分离肽，例如那些具有氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的肽。或者或另外，试剂盒可包括酪蛋白的S2同种型所特有的一种或一种以上经分离肽，例如那些具有氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的肽。在一个实施例中，试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:29的经分离乳球蛋白特有肽。在一些实施例中，试剂盒可包含以下蛋白质中的每一者所特有的至少一种经分离肽：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(S1和/或S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如，试剂盒可包含每一本文所鉴别的对应于SEQ ID NO:1-212的经分离肽中的一者。或者，试剂盒可包含一种选自对应于SEQ ID NO.1-7的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.8-11的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.12-18的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.19-23的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.24-29的群组的肽和一种选自表6-19中的每一过敏原的肽。在一些实施例中，所述肽可经同位素标记(例如，使用15N、13C)。在其它实施例中，一种或一种以上肽可选自本文所揭示的一些但非全部过敏原。
根据一些实施例，提供用于质谱测试试样中以下蛋白质中至少一者的试剂盒：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒可包括例如至少一种用于将以下蛋白质中的一者或一者以上片段化成多种肽的蛋白水解酶：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如，蛋白水解酶可效地将过敏原片段化成多种肽，其中至少一者具有氨基酸序列SEQ ID NO.1-212。试剂盒还可包括至少一种用于使用质谱仪对多种肽中的至少一者进行定量的试剂，所述肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-212。
各种方法和试剂可有效地制备用于质谱分析的试样和/或将过敏原片段化成多种肽。例如，在一个实例性实施例中，蛋白水解酶可为胰蛋白酶，其可将过敏原裂解成多种肽。在一些实施例中，试剂盒可包括LC柱，在其上面固定有蛋白水解酶，例如胰蛋白酶。试剂盒还可包含消化组份，包括缓冲液、酶、烷基化剂、还原剂和任选地其它试剂和/或组份。在一些实施例中，试剂盒可包含例如均匀分析，使得使用者只需要添加试样。
在一些实施例中，试剂盒可包含校准或归一化试剂或标准物。例如，试剂盒可包含以下蛋白质中的每一者所特有的至少一种肽：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(S1和/或S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质，其用于校准过敏原特有肽的定量。作为非限制性实例，试剂盒可含有已知浓度的每一过敏原特有肽的溶液，使得可构建校准曲线。在一些实施例中，试剂盒可含有至少一种用于校准过敏原特有肽或过敏原本身的定量的所关注过敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质)。例如，试剂盒可包括已知量的以下蛋白质中的每一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。或者或另外，可通过向试样掺加氨基酸序列与所关注肽相同的至少一种同位素富集肽来执行校准。因此，试剂盒可包括一种或一种以上对应于SEQ ID NO.1-212中的每一者或一些的同位素富集肽。
根据一些实施例，可根据各种因素使用不同转换来测量和用基准问题测试(benchmark)分析结果。因此，试剂盒可包含不同转换值和/或建议设置，其可用于使得能够在试样与一种或一种以上对照试剂之间进行比较测量。试剂盒可包括与每一过敏原特有肽的Q1和Q3转换值有关的信息。例如，在一个实施例中，试剂盒可包含每一本文所鉴别的经分离肽SEQ ID NO:1-2，并且进一步可包含关于使用质谱仪对至少一种肽进行定量的说明书。在试剂盒中还可包括关于可以或应当用于执行分析的仪器设置的信息。试剂盒可包括关于试样制备、操作条件、体积量、温度设置等的信息。
根据一些实施例，可根据各种因素使用不同转换来测量和用基准问题测试分析结果。因此，试剂盒可包含不同转换值和/或建议设置，其可用于在试样与一种或一种以上对照试剂之间进行比较测量。试剂盒可包括测量特定转换对值(例如，Q1/Q3转换对或一个或一个以上不同转换对的值)的说明书。
试剂盒可包装在含有一个或一个以上试剂器皿和合适说明书的气密密封容器中。电子媒介也可含于试剂盒内并且可储存和/或提供关于一种或一种以上分析、测量值、转换对、操作说明书、用于实施操作的软件、其组合等的电子信息。
根据一些方面，提供本文所述的可控制过程和/或执行计算的软件。例如，软件可向质谱仪提供指令以监测一个或一个以上特定前体-产物离子对转换。
软件可包括例如基于对与试剂盒一起提供的校准标准物的质谱分析生成校准数据的模块和接收并分析质谱数据(例如，LC-MS/MS数据)以鉴别一种或一种以上上述肽和MRM转换的模块。在鉴别上述过敏原中一者所特有的一种或一种以上肽后，软件可利用校准数据来对那些肽和相关过敏原进行定量。
在其它实施例中，提供可实现针对过敏原筛选试样的方法，其包含：获得试样；
用至少一种蛋白水解酶消化所述试样以将所述试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽，其中所述至少一种过敏原选自由以下组成的群组：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻、澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子；和通过使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定所述多种肽中至少一者的量来对所述试样中存在的所述过敏原中的至少一者进行定量，其中所述多种肽中的至少一者包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-212的肽。在其它实施例中，对两种或两种以上过敏原进行定量。在另一实施例中，测定所述多种肽中的两者或两者以上以对所述过敏原中的所述至少一者进行定量。在另一实施例中，监测所述多种肽中每一者的所选MRM转换中的至少一个。在替代实施例中，监测所述多种肽中每一者的两个或两个以上所选MRM转换。在又一实施例中，蛋白水解酶为胰蛋白酶。
附图说明
图1显示由面包的实例性“空白”试样产生的实例性色谱图。
图2显示由掺加有牛乳且含有牛乳肽的面包试样产生的实例性色谱图。
图.3A、3B、3C描绘获得的三种特定牛乳肽的信号。
图4显示含有芥子的试样的质谱。
图5显示肽EQ ID NO.20的校准线。
图6显示肽EQ ID NO.16的校准线。
图7显示肽EQ ID NO.12的校准线。
图8显示肽EQ ID NO.27的校准线。
图9显示肽EQ ID NO.7的校准线。
实例
申请者的教示内容可参考下面的实例和所得数据得到甚至更全面地理解。所属领域技术人员通过考虑本说明书和实践本文所揭示的本教示内容将明了申请者的教示内容的其它实施例。这些实例仅打算视为实例性。
实例1
溶液的制备
提取缓冲液–将Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇，3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480mL)中，制备50mM Tris缓冲液/2M尿素提取溶剂。所得溶液具有约10的pH值。
消化缓冲液–将碳酸氢铵(3.16g)溶解于水(400mL)中。所得溶液具有约7.8的pH值。
酶溶液–将胰蛋白酶(1g)溶解于消化缓冲液(20mL)中，制备50mg/mL浓度的储备液。将储备液(100μL)进一步稀释于10mL消化缓冲液中，制备500μg/mL溶液的最终胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷冻储存并且在使用前解冻。
碘乙酰胺溶液–将碘乙酰胺(0.925g)添加到10mL水中并且进行声波处理以溶解固体。在使用前新制备0.5M碘乙酰胺溶液并且在使用后丢弃。
混合过敏原掺加溶液的制备–将20.0mg(0.0200g)每一蛋白质(卵溶菌酶、卵白蛋白、牛乳α-酪蛋白和牛乳β-乳球蛋白)于15mL聚丙烯离心管中溶解于10.0mL提取缓冲液中，制备含有2000μg/mL每一过敏原的组合掺加溶液。当储存于冷冻器中时，所得混合过敏原掺加溶液稳定1个月。尚未测定更长期稳定性。
试样制备
如上文所论述，试样可得自多种来源。在此实例中，从干烘食物获得试样。在离心管(50mL)中混合微细粉末试样(5.0g)与30mL提取缓冲液并通过剧烈振荡打碎混合物并且使用辊式混合器进一步搅动(60分钟)。将离心管以3500rpm和15℃旋转沉淀5分钟。将200μL1M DTT溶液添加到6mL上清液。将试样混合并在37℃下加热60分钟。然后将试样冷却到室温并且添加2.0mL新制备的0.5M碘乙酰胺水溶液。振荡试样以进行混合并且避光储存(30分钟，在室温下)。向每一试样中添加6mL消化缓冲液(0.1M碳酸氢钠)，之后添加400μL胰蛋白酶酶溶液(200μg总酶/试样)。在37℃下将试样培育过夜。离心试样(5分钟，10℃，以3000rpm)并且通过0.45μRC过滤器过滤。用0.5mL甲酸酸化滤液。
依次用6mL含有0.1％甲酸的乙腈和6mL含有0.5％TFA(三氟乙酸)的水对StrataTMX SPE筒体进行条件处理。将来自经离心试样的上清液以1-2滴/秒的速率加载到SPE筒体上。用3mL 0.5％TFA水溶液洗涤SPE筒体。用6mL乙腈洗脱过敏原肽并且使用离心蒸发器将其蒸发到干燥。
通过添加300μL水/乙腈溶液(95％具有5％乙腈和0.5％甲酸的水)将试样残余物重构。将试样涡旋20-30秒并且声波处理30分钟以完成材料的溶解。将内容物转移到1.5mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)并且离心(5分钟，以13000rpm)。移出上清液并且将其转移到300μL带有压力配合帽的聚丙烯HPLC小瓶中以供HPLC分析。
使用岛津卓越LC系统(Shimadzu Prominence LC system)，使用菲罗门分析柱(Phenomenex Analytical Column)(4μm)、赛内吉海德鲁-RP 80A柱(Synergi Hydro-RP80A Column)(150×2.1mm)，使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸存于999ml乙腈中的流动相溶液执行色谱。流动速率为0.300ml/min，柱炉温度为30℃。
使用
Figure BDA0001158794190000581
离子源在应用生物系统(Applied Biosystems)
Figure BDA0001158794190000582
LC/MS/MS系统上分析试样。使用MRM检测窗口为90s且目标扫描时间为0.40s的预定MRM(sMRM)来分析化合物。将Q1设定为低并且将Q3设定为单位分辨率以获得最大信号反应。
实例2
此实例中描述了制备试样的另一方法。纳诺色谱10k亚米茄(NANOSEP 10k OMEGA)(100/pk)和菲尼克斯(Phenex)RC膜(0.45μm)，26mm注射器式过滤器。另外，利用以下HPLC溶剂和消耗品：水、甲醇(MeOH)、乙腈(CAN)、50mL聚丙烯离心管、15mL聚丙烯离心管、一次性玻璃培养管(13×100mm)、聚丙烯微型离心管(1.5mL)、锥形聚丙烯HPLC小瓶和帽(300μL)、一次性注射器、10mL容量鲁尔端(luer end)。此外，提取和试样处理需要以下设备：用于50mL管的超速离心机、用于1.5mL管的微型离心机；用于试样处理的SPE歧管(具有真空泵)；强迫通风培育器(设定为37℃)、辊式振荡器、离心蒸发器/浓缩器。
溶液的制备
提取缓冲液–将Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇，3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480ml)中并且搅拌直到完全溶解以制备50mM Tris缓冲液/2M尿素提取溶剂。
消化缓冲液–将碳酸氢铵(3.16g)溶解于水(378mL)中。向其中添加2ml 1M氯化钙和20ml乙腈。pH值为约7.8。
酶溶液–将胰蛋白酶(1g)溶解于消化缓冲液(20mL)中以制备50mg/mL浓度的储备液。将储备液(100μL)进一步稀释于10mL消化缓冲液中以制备500μg/mL溶液的最终胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷冻储存并且在使用前解冻。
个别过敏原储备液的制备–通过将30.0mg每一卵白蛋白、牛乳酪蛋白和乳球蛋白于5ml埃彭道夫管中溶解于3.0ml提取缓冲液中来制备10mg/ml储备液。当在-20℃或更低下储存时，所得过敏原储备液稳定3个月，但尚未测定更长期稳定性。
混合过敏原掺加溶液的制备–将1.0ml每一过敏原储备液(10mg/ml)(卵白蛋白、牛乳酪蛋白和牛乳乳球蛋白)转移到5ml埃彭道夫管中且向其中添加2.0ml提取缓冲液并且混合。混合过敏原储备液含有2mg/ml每一过敏原并且当在-20℃或更低下储存时稳定1个月，但尚未测定更长期稳定性。
混合过敏原掺加溶液的制备–将100μL混合过敏原储备液(2mg/ml)添加到2mL含有900μL提取缓冲液的埃彭道夫管。所得溶液含有200μg/ml每一过敏原蛋白质。
试样制备
将1.00g微细粉末试样称量到15ml离心管中。从下表20中的每一个别试样制备来自每一个别试样的连续添加校准试样。
表20
Figure BDA0001158794190000591
剧烈振荡每一混合物以打碎混合物并且然后使用辊式混合器进一步搅动60分钟。将离心管以3500rpm和15℃旋转沉淀20分钟。将500μL每一上清液添加到2ml埃彭道夫管和50μL TCEP溶液并且在60C下在培育中涡旋混合60分钟。然后将管冷却到室温，并添加25μLMMTS，再次涡旋以进行混合并培育10分钟。将500μL消化缓冲液添加到每一试样，之后添加20μL胰蛋白酶酶溶液(含有20μg总酶/试样)。通过旋涡将溶液充分混合。然后在37℃下将试样培育过夜。第二天，将30μL甲酸添加到每一试样并充分混合。然后将试样以13000rpm离心5分钟。将500μL上清液加入10K-MwCO过滤器中并且以13000rpm离心20分钟。将200μL滤液转移到合适的聚丙烯HPLC自动取样器小瓶中以供LC/MS/MS分析，将剩余部分储存在-20℃下以供在需要时进行进一步分析。
使用岛津卓越LC系统，使用菲罗门分析柱(4μm)、赛内吉海德鲁-RP 80A柱(150×2.1mm)，使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸存于999ml乙腈中的流动相溶液执行色谱。系统也由系统控制器(CBM-20A)、2个等度泵LC-20AD(具有半微量50μL混合器)、自动取样器SIL-20AC和柱炉CTO-20AC组成。另外，利用保护柱(菲罗门捕集筒体(trapcartridge)(4μm)、赛内吉海德鲁-RP 80A墨丘利(Mercury)(20×2.0mm))、筒体固定器(菲罗门墨丘利MS 20mm筒体固定器)并且利用95:5(v:v)乙腈:水+0.05％TFA的针头冲洗，其中流动速率：0.300mL/min，平衡时间：0.5min，柱炉温度：30℃，和注入体积：30μL。自动取样器针头冲洗顺序包括冲洗体积：1000μL，针头行程：52mm，冲洗速度：35μL/sec，取样速度：2.0μL/sec，冲洗浸渍时间：5sec，冲洗模式：抽吸之前和之后。
使用具有正极性的
Figure BDA0001158794190000601
离子源在应用生物系统
Figure BDA0001158794190000602
LC/MS/MS系统上分析试样。使用MRM检测窗口为90s且目标扫描时间为0.40s的预定MRM(sMRM)来分析化合物。将Q1设定为低并且将Q3设定为单位分辨率以获得最大信号反应。所用其它参数包括来源/气体参数IS：5500，CUR：30psi，TEM：500℃，GS1：35psi，GS2：46psi，Ihe：On，和CAD：高。
化合物MRM参数和保留时间包括DP：可变，EP：10，CXP：可变，停留时间：可变，Q1分辨率：低，Q3和分辨率：单位
使用连续掺加试样的面积对标称浓度的最小二乘方由回归从绝对峰面积获得校准曲线。通过使用回归方程反算每一掺加水平下的浓度来计算与回归线的偏差。由未掺加试样的表观浓度计算的回归曲线获得靶肽的浓度。卵白蛋白、卵溶菌酶、牛乳酪蛋白和乳球蛋白中每一者的线性范围在介于10μg/g与100μg/g之间的范围内。
每一试样具有其特有的定量用线性范围。应从回归中排除完整校准曲线中的校准标准物以满足适用范围。校准曲线描绘于图5到9中。
图5描绘当将200ppm掺加到面包中时，酪蛋白肽SEQ ID NO.20的校准线。图6描绘当将200ppm掺加到面包中时，酪蛋白肽SEQ ID NO.16的校准线。图7描绘当将200ppm掺加到面包中时，酪蛋白肽SEQ ID NO.12的校准线。图8描绘当将200ppm掺加到面包中时，牛肽SEQID NO.27的校准线。图8描绘当将200ppm掺加到面包中时，卵白蛋白肽SEQ ID NO.7的校准线。
实例3
将一包芥子与100mM Tris和2M尿素组合。使用氢氧化铵将pH调节到pH值为9和9.5以提取相关蛋白质。使试样经受如实例1或2中所述的类似制备和分析技术与添加碘乙酰胺以封阻半胱氨酸的额外过程。分离半胱氨酸经碘乙酰胺修饰的肽序列SEQ ID NO.103并进行分析。图4描绘此试样的质谱。很明显，于对应于2/y4片段离子的380/499处、于对应于2/y5片段离子的380/659处、于对应于2/b5片段离子的380/584(次峰)处和于对应于2/b4片段离子的380/487处鉴别质谱峰。
所关注肽和/或过敏原的定量可利用各种校准技术。例如，可在质谱分析前将含有已知量的所选肽的校准标准物添加到试样以生成校准曲线，所述标准曲线允许对随后运行经过LC-MS/MS的试样进行定量。在一些实施例中，可在制备用于质谱分析的试样前将已知量的所关注过敏原添加到试样。举例来说，可在用蛋白水解酶消化试样前将已知量的以下蛋白质中的一者或一者以上添加到所述试样：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果，包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。通过向试样中掺加已知浓度的所关注过敏原，可校准过敏原或其特有肽的定量。在一些实施例中，可迭代地测试掺加有各种已知量的所关注过敏原的多种试样以生成校准曲线，例如，使用连续稀释物或标准物添加方法进行。从质谱分析得到的数据的校准曲线可用于计算例如“未掺加”试样中的肽和/或过敏原的表观浓度。关于校准方案的一个实施例的各种校准曲线和进一步细节进一步显示于图5到9中，所述图描绘各种肽的校准曲线，其全部内容以引用方式并入本文中。
在一些实施例中，可例如通过同位素稀释质谱测定肽的量，其中向所制备的试样中掺加所关注肽的同位素富集形式。在一个实例性实施例中，可将校准标准物“掺加”到试样中，对于不同运行使用不同浓度(例如，连续稀释)。从质谱分析得到的数据的校准曲线可用于计算例如“未掺加”试样的表观浓度。
所属领域技术人员根据上述实施例将了解根据申请者的教示内容的方法和系统的其它特征和优点。因此，除非在所附权利要求书中指明，否则申请者的揭示内容不受限于特别显示和描述的内容。本文所引用的所有出版物和参考文献的全部内容均以引用方式明确地并入本文中。
序列表
<110> DH科技发展私人贸易有限公司
<120> 检测过敏原的系统和方法
<130> ABS-0047PCT
<141> 2012-xx-xx
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<151> 2011-09-02
<160> 212
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Leu Tyr Ala Glu Glu Arg
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<223> 从大麦获得
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<223> 从大麦获得
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Gln Pro Phe Pro Gln Thr Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Ser
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Thr Thr Thr Ser Val Pro Phe Gly Val Gly Thr Gly Val Gly
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Thr Thr Thr Ser Val Pro Phe Gly Val Gly Thr Gly Val Gly Ala
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Cys Gln Gln Leu Pro Gln Ile Pro Gln Gln Ser Arg
20 25
<210> 51
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 51
Ser Gln Met Leu Gln Gln Ser Ser Cys His Val Met Gln Gln Gln Cys
1 5 10 15
Cys Gln Gln Leu Pro Gln Ile Pro Gln Gln Ser Arg Tyr Glu Ala Ile
20 25 30
Arg
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 52
Ala Pro Phe Ala Ser Ile Val Ala Gly Ile Gly Gly Gln
1 5 10
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 53
Ala Pro Phe Ala Ser Ile Val Ala Gly Ile Gly Gly Gln
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 54
Arg Ala Pro Phe Ala Ser Ile Val Ala Gly Ile Gly Gly Gln
1 5 10
<210> 55
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 55
Ser Leu Val Leu Gln Thr Leu Pro Ser Met Cys Asn Val Tyr Val Pro
1 5 10 15
Pro Glu Cys Ser Ile Met Arg
20
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 56
Gln Gln Pro Phe Pro Gln Thr Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln
1 5 10 15
Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Thr Gln Gln Pro
20 25
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 57
Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg His Glu Ser Ile Arg
1 5 10
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 58
Val Phe Leu Gln Gln Gln Cys Ile Pro Val Ala Met Gln Arg
1 5 10
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 59
Gln Gln Gln Ile Pro Val Ile His Pro Ser Val Leu Gln Gln Leu Asn
1 5 10 15
Pro Cys Lys
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 60
Glu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Arg
1 5
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 61
Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 62
Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 63
Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 64
Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 65
Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu Arg
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 66
Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 67
Glu Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu Arg
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 68
Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Met Cys Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 69
Ser Val Ala Val Ser Gln Val Ala Arg
1 5
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 70
Gln Val Val Asp Gln Gln Leu Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 71
Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg
1 5 10
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 72
Ala Gln Gln Pro Ala Thr Gln Leu Pro Thr Val Cys Arg
1 5 10
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 73
Gln Leu Gln Cys Glu Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys
1 5 10 15
Arg
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 74
Gln Val Val Asp Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly
1 5 10 15
Leu Gln Met Arg
20
<210> 75
<211> 37
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 75
Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gln Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Leu Gly Gln
20 25 30
Gly Gln Gln Pro Arg
35
<210> 76
<211> 35
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 76
Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln
1 5 10 15
Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Thr
20 25 30
Gly Gln Arg
35
<210> 77
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 77
Gln Trp Leu Gln Pro Arg
1 5
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 78
Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Leu Ala Ser Gln
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 79
Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Leu Ala Ser Gln
1 5 10
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 80
Pro Ala Gly Pro Phe Arg
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 81
Pro Ala Gly Pro Phe Arg Ile Pro Lys
1 5
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 82
Ile Tyr Gln Thr Ala Thr His Leu Pro Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 83
Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 84
Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys Lys
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 85
Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys Lys
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 86
Pro Ala Gly Pro Phe Gly Ile Pro Lys
1 5
<210> 87
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 87
Gln Gln Leu Glu Gln Gln Gly Gln Gln Gly Pro His Leu Gln His Val
1 5 10 15
Ile Ser Arg
<210> 88
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 88
Gln Gln Leu Glu Gln Gln Gly Gln Gln Gly Pro His Leu Gln His Val
1 5 10 15
Ile Ser Arg
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 89
Ile Tyr Gln Thr Ala Thr His Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 90
Ile Tyr Gln Thr Ala Thr His Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 91
Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Gln Lys
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 92
Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Gln Lys
1 5
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 93
Val Cys Asn Ile Pro Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 94
Val Cys Asn Ile Pro Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 95
Val Cys Asn Ile Pro Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 96
Val Cys Asn Ile Pro Gln Val Ser Val Cys Pro Phe Lys Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 97
Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gly Gln Gln Gly Pro Gln Val Gln His Val
1 5 10 15
Ile Ser Arg
<210> 98
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 98
Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gly Gln Gln Gly Pro Gln Val Gln His Val
1 5 10 15
Ile Ser Arg
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 99
Ile Tyr Gln Thr Ala Thr His Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 100
Ala Gly Pro Phe Arg
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 101
Ala Val Lys Gln Gln Ile Arg
1 5
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 102
Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Gln His Glu
1 5 10 15
Ile Ser Arg
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 103
Val Cys Asn Ile Pro Arg
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 104
Val Ser Ile Cys Pro Phe Gln Lys
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 105
Val Ser Ile Cys Pro Phe Gln Lys
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 106
Glu Phe Arg Gln Ala Gln His Leu Arg
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 107
Glu Phe Arg Gln Ala Gln His Leu Arg
1 5
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 108
Gln Ala Gln His Leu Arg
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 109
Ala Cys Gln Gln Trp Leu His Arg
1 5
<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 110
Gln Gln Val Arg Gln Gln Gly His Gln Gln Gln Met Gln His Val Ile
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 111
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 111
Gln Gln Val Arg Gln Gln Gly His Gln Gln Gln Met Gln His Val Ile
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芸苔属和芥属的混合物获得
<400> 112
Ile Tyr Gln Thr Ala Thr His Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从燕麦获得
<400> 113
Gln Phe Leu Val Gln Gln Cys Ser Pro Val Ala Val Val Pro Phe Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从燕麦获得
<400> 114
Ser Gln Ile Leu Gln Gln Ser Ser Cys Gln Val Met Arg
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从燕麦获得
<400> 115
Gln Leu Glu Gln Ile Pro Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从燕麦获得
<400> 116
Gln Leu Glu Gln Ile Pro Glu Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 117
Asn Val Leu Leu Gln Gln Cys Ser Pro Val Ala Leu Val Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 118
Asn Val Leu Leu Gln Gln Cys Ser Pro Val Ala Leu Val Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 119
Glu Gly Val Gln Ile Leu Leu Pro Gln Ser His Gln Gln His Val Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Leu Ala Gln Val Gln Gly Ile Ile Gln Pro Gln Gln Leu
20 25 30
Ser Gln Leu Glu Val Val Arg
35
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 120
Ser Leu Val Leu Gln Asn Leu Pro Thr Met Cys Asn Val Tyr Val Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 121
Ser Leu Val Leu Gln Asn Leu Pro Thr Met Cys Asn Val Tyr Val Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 122
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 122
Gln Cys Ser Thr Ile Gln Ala Pro Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Ile
1 5 10 15
Val Gly His
<210> 123
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从黑麦属获得
<400> 123
Gln Cys Ser Thr Ile Gln Ala Pro Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Ile
1 5 10 15
Val Gly His
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 124
Ile Ser Gly Ala Gln Pro Ser Leu Arg
1 5
<210> 125
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 125
Leu Val Tyr Ile Glu Arg
1 5
<210> 126
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 126
Ala Phe Asp Ala Glu Leu Leu Ser Glu Ala Phe Asn Val Pro Gln Glu
1 5 10 15
Thr Ile Arg
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 127
Gly Leu Ile Val Met Ala Arg
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 128
Glu Ala Asp Ile Phe Ser Arg
1 5
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 129
Ser Pro Leu Ala Gly Tyr Thr Ser Val Ile Arg
1 5 10
<210> 130
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 130
Ala Met Pro Leu Gln Val Ile Thr Asn Ser Tyr Gln Ile Ser Pro Asn
1 5 10 15
Gln Ala Gln Ala Leu Lys
20
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 131
His Cys Met Gln Trp Met Arg
1 5
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从芝麻属获得
<400> 132
Met Cys Gly Met Ser Tyr Pro Thr Glu Cys Arg
1 5 10
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 133
Ser Val Ala Val Ser Gln Val Ala Arg
1 5
<210> 134
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 134
Glu His Gly Ala Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe Pro Arg
1 5 10 15
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 135
Gln Val Val Asp Gln Gln Leu Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 136
Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 137
Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从小麦属获得
<400> 138
Tyr Asp Pro Thr Ala Tyr Asn Thr Ile Leu Arg
1 5 10
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 139
Gln Gln Met Leu Ser His Cys Arg
1 5
<210> 140
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 140
Gly Met Glu Pro His Met Ser Glu Cys Cys Glu Gln Leu Glu Gly Met
1 5 10 15
Asp Glu Ser Cys Arg
20
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 141
Met Met Met Met Arg
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 142
Met Gln Gln Glu Glu Met Gln Pro Arg
1 5
<210> 143
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 143
Leu Ala Glu Asn Ile Pro Ser Arg
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 144
Cys Asn Leu Ser Pro Met Arg
1 5
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 145
Gln Gln Gln Leu Asn His Cys Arg
1 5
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 146
Met Asp Glu Met Cys Arg
1 5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 147
Cys Asn Leu Ser Pro Gln Arg
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 148
Cys Ala Gly Val Ala Ala Leu Arg
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 149
Leu Tyr Tyr Val Thr Gln Gly Arg
1 5
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 150
His Phe Phe Leu Ala Gly Asn Ile Gln Arg
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 151
Gly Gly Gln Gln Ile Leu Ala Asp Asn Val Phe Lys
1 5 10
<210> 152
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 152
Gly Phe Asn Met Glu Ala Leu Ala Asp Val Leu Gly Phe Gly Met Asp
1 5 10 15
Thr Glu Thr Ala Arg
20
<210> 153
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 153
Gly Val Leu Tyr Glu Asn Ala Met Met Ala Pro Leu Trp Arg
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 154
Gly Ile Pro Val Gly Val Leu Ala Asn Ala Tyr Arg
1 5 10
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从巴西坚果获得
<400> 155
Asp Glu Ala Val Leu Phe Gln Pro Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从欧榛获得
<400> 156
Tyr Phe Gly Glu Cys Asn Leu Asp Arg
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 157
Leu Asn Ala Leu Glu Pro Thr Asn Arg
1 5
<210> 158
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 158
Thr Ile Glu Pro Asn Gly Leu Leu Leu Pro Gln Tyr Ser Asn Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Ile Tyr Ile Glu Arg
20
<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 159
His Phe Tyr Leu Ala Gly Asn Pro Asp Asp Glu His Gln Arg
1 5 10
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 160
Gln Gly Gln Gln Gln Phe Gly Gln Arg
1 5
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 161
Gln Glu Trp Glu Arg
1 5
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 162
Ala Asp Ile Tyr Thr Glu Gln Val Gly Arg
1 5 10
<210> 163
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 163
Ile Asn Thr Val Asn Ser Asn Thr Leu Pro Val Leu Arg
1 5 10
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 164
Trp Leu Gln Leu Ser Ala Glu Arg
1 5
<210> 165
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 165
Gln Gly Gln Val Leu Thr Ile Pro Gln Asn Phe Ala Val Ala Lys
1 5 10 15
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 166
Ala Glu Ser Glu Gly Phe Glu Trp Val Ala Phe Lys
1 5 10
<210> 167
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 167
Thr Asn Asp Asn Ala Gln Ile Ser Pro Leu Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 168
Ala Leu Pro Asp Asp Val Leu Ala Asn Ala Phe Gln Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 169
Gln Glu Thr Thr Leu Val Arg
1 5
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 170
Val Glu Glu Ile Asp His Ala Asn Phe Lys
1 5 10
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 171
Ala Val Glu Ala Tyr Leu Leu Ala His Pro Asp Ala Tyr Cys
1 5 10
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从榛属获得
<400> 172
Ala Val Glu Ala Tyr Leu Leu Ala His Pro Asp Ala Tyr Cys
1 5 10
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 173
Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr Ser Gly Gln Met Arg
1 5 10
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 174
Cys Val Ser Gln Cys Asp Lys
1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 175
Phe Glu Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys
1 5
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 176
His Met Gln Ile Cys Gln Gln Arg
1 5
<210> 177
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 177
His Cys Glu Gln Gln Glu Pro Arg
1 5
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 178
Leu Gln Tyr Gln Cys Gln Arg
1 5
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 179
Glu Gly Val Ile Ile Arg
1 5
<210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 180
Glu Ser Glu Phe Asp Arg
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从澳大利亚坚果属获得
<400> 181
Gln Gln Tyr Gln Cys Gln Arg
1 5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 182
Asn Leu Pro Gln Gln Cys Gly Leu Arg
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 183
Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg
1 5
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 184
Thr Ala Asn Asp Leu Asn Leu Leu Ile Leu Arg
1 5 10
<210> 185
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 185
Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys
1 5 10
<210> 186
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 186
Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Ala Gly Ser Leu Lys
1 5 10
<210> 187
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从花生获得
<400> 187
Val Leu Leu Glu Glu Asn Ala Gly Gly Glu Gln Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 188
Cys Ala Gly Val Ala Val Ala Arg
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 189
His Thr Ile Gln Pro Asn Gly Leu Arg
1 5
<210> 190
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 190
Ile Leu Ala Glu Val Phe Gln Val Glu Gln Ser Leu Val Lys
1 5 10
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 191
Gly Phe Glu Ser Glu Glu Glu Ser Glu Tyr Glu Arg
1 5 10
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 192
Ser Asp Ile Tyr Thr Pro Glu Val Gly Arg
1 5 10
<210> 193
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 193
Ile Thr Ser Leu Asn Ser Leu Asn Leu Pro Ile Leu Lys
1 5 10
<210> 194
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 194
Trp Leu Gln Leu Ser Ala Glu Arg
1 5
<210> 195
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 195
Phe Glu Trp Ile Ser Phe Lys
1 5
<210> 196
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 196
Ala Met Ile Ser Pro Leu Ala Gly Ser Thr Ser Val Leu Arg
1 5 10
<210> 197
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 197
Ala Met Pro Glu Glu Val Leu Ala Asn Ala Phe Gln Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 198
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 198
Phe Gln Thr Gln Cys Gln Ile Gln Asn Leu Asn Ala Leu Glu Pro Lys
1 5 10 15
<210> 199
<211> 27
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 199
Ile Glu Ser Glu Ala Gly Val Thr Glu Phe Trp Asp Gln Asn Glu Glu
1 5 10 15
Gln Leu Gln Cys Ala Asn Val Ala Val Phe Arg
20 25
<210> 200
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 200
Leu Val Leu Val Ala Leu Ala Asp Val Gly Asn Ser Glu Asn Gln Leu
1 5 10 15
Asp Gln Tyr Leu Arg
20
<210> 201
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 201
Gly Ile Ile Val Arg
1 5
<210> 202
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 202
Gly Leu Pro Leu Asp Val Ile Gln Asn Ser Phe Asp Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从阿月浑子获得
<400> 203
Ser Glu Met Thr Ile Phe Ala Pro Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 204
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 204
Gln Gln Asn Leu Asn His Cys Gln Tyr Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 205
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 205
Gln Cys Cys Gln Gln Leu Ser Gln Met Asp Glu Gln Cys Gln Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Arg
<210> 206
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 206
Gly Glu Glu Met Glu Glu Met Val Gln Ser Ala Arg
1 5 10
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 207
Asp Leu Pro Asn Glu Cys Gly Ile Ser Ser Gln Arg
1 5 10
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 208
Leu Asp Ala Leu Glu Pro Thr Asn Arg
1 5
<210> 209
<211> 27
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 209
Gly Leu Gly Asn Asn Val Phe Ser Gly Phe Asp Ala Asp Phe Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Phe Asn Val Asp Thr Glu Thr Ala Arg
20 25
<210> 210
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 210
Trp Leu Gln Leu Ser Ala Glu Arg
1 5
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 211
Ala Leu Pro Glu Glu Val Leu Ala Thr Ala Phe Gln Ile Pro Arg
1 5 10 15
<210> 212
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 从核桃获得
<400> 212
Ala Leu Pro Glu Glu Val Leu Ala Thr Ala Phe Gln Ile Pro Arg
1 5 10 15

Claims (3)

1.一种检测食物试样中作为过敏原的酪蛋白的方法，所述方法包括：
将蛋白水解酶添加到所述食物试样以将所述食物试样中存在的酪蛋白的至少一部分裂解成多种肽；和
利用液相色谱串联质谱LC-MS/MS来测定所述多种肽的至少一种肽是否在所述食物试样中，并且所述测定包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换：
i)SEQ ID NO:13，m/z值为约584/763、584/706、584/650或438/600；
ii)SEQ ID NO:14，m/z值为约416/488、416/587或416/702；
iii)SEQ ID NO:17，m/z值为约345/590、345/476或345/573；
iv)SEQ ID NO:19，m/z值为约373/534或373/437；
v)SEQ ID NO:21，m/z值为约438/629、438/558或438/445；以及
vi)SEQ ID NO:23，m/z值为约694/1187、694/811或694/940。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白水解酶包含胰蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中利用LC-MS/MS来测定所述至少一种肽是否在所述食物试样中包含：对所述至少一种肽在所述食物试样中的量进行定量，利用氨基酸序列与所述至少一种肽相同的至少一种同位素富集肽来校准所述至少一种肽的所述定量，并且利用包含已知浓度的所述至少一种肽的标准物来校准所述至少一种肽的所述定量。
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