ES2952741T3 - Métodos para caracterizar composiciones que comprenden antígenos de cacahuete - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan métodos para determinar un perfil de liberación in vitro de alérgenos de maní en una muestra. Se proporcionan métodos para determinar una o más firmas de alérgenos de maní en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para caracterizar composiciones que comprenden antígenos de cacahuete
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para determinar perfiles de liberación y firmas alergénicas de alérgenos de cacahuete.
ANTECEDENTES
La alergia al cacahuete se desarrolla cuando el sistema inmunitario del cuerpo tiene una respuesta de hipersensibilidad anormal a uno o más alérgenos del cacahuete. La alergia al cacahuete es una de las alergias alimentarias más comunes tanto en niños como en adultos. Recibe especial atención debido a que es relativamente común, generalmente de por vida, y puede causar reacciones alérgicas graves. La alergia al cacahuete es la principal causa de anafilaxia y muerte por alergia alimentaria. Puede conducir a una carga significativa para los pacientes y sus familias. El cacahuete es un ingrediente alimentario común lo que hace difícil evitarlo estrictamente. Por lo tanto, existe una tasa relativamente alta de ingestión accidental de cacahuete para aquellos que intentan evitar los cacahuetes. Por estas razones, la alergia al cacahuete se ha convertido en un importante problema de salud pública.
Pedreschi R et al. (Nutrients, 2012 4, 12, 132-150) describe un método para determinar la firma de alérgenos de cacahuete en medio acuoso, que comprende digerir alérgenos de cacahuete para generar un producto de digestión de alérgenos, fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos y determinar la firma de los productos de digestión de alérgenos que comprenden Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6.
Actualmente se están realizando investigaciones centradas en el desarrollo de composiciones para el tratamiento de la alergia al cacahuete. Se necesitan métodos para determinar in vitro datos de liberación de alérgenos de cacahuete de composiciones conocidas y recientemente desarrolladas, tanto para el control de calidad como para predecir in vivo perfiles de liberación.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de métodos altamente sensibles para determinar los perfiles de liberación de alérgenos y/o para determinar las firmas alergénicas de las composiciones que comprenden alérgenos. Los métodos descritos aquí proporcionan la sensibilidad y la precisión necesarias para perfilar los alérgenos de cacahuete presentes en una muestra, tales como un extracto de proteína, una composición terapéutica, o un medio de disolución o liberación, y para permitir la medida de alérgenos relevantes de bajo nivel presentes en la muestra. En realizaciones ejemplares, los métodos incluyen la etapa de detectar productos de digestión de alérgenos que existen en una o más isoformas de uno o más alérgenos en la muestra. La identificación de productos de digestión de alérgenos que se encuentran en múltiples isoformas de un alérgeno de cacahuete proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre una muestra, que puede ser un indicador de la consistencia de lote a lote, y puede proporcionar un perfil de liberación de alérgenos almacenados sobre o en un sustrato, tal como, por ejemplo, una nanopartícula.
En un aspecto, la invención presenta un método altamente sensible para determinar una firma de alérgenos de cacahuete en una composición. El método incluye la etapa de digerir los alérgenos de cacahuete presentes en una composición (por ejemplo, medio u otra muestra) a partir de la composición para generar productos de digestión de alérgenos, fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos, en el que la firma comprende cada uno de los productos de digestión de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6, y en el que los productos de digestión de alérgenos comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:40, SEQ ID SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SeQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SeQ ID NO:237. En realizaciones particulares, los métodos se usan para determinar una firma de uno o más alérgenos de cacahuete que están presentes en bajas concentraciones en una composición. La firma incluye el tipo y la cantidad (por ejemplo, la cantidad relativa) de alérgenos en la composición.
En ciertas realizaciones, la composición es un medio acuoso, tal como una composición farmacéutica acuosa, una muestra analítica, un medio de disolución, o un medio de liberación. En algunas realizaciones, la cantidad total de alérgenos de cacahuete en la composición es muy baja. Por ejemplo, la cantidad de un alérgeno de cacahuete particular (por ejemplo, Ara h1, Ara h2, Ara h3, o Ara h6) puede ser menor que alrededor de 2 μg/ml, menor que alrededor de 1,5 μg/ml, menor que alrededor de 1 μg/ ml, o menor que alrededor de 0,5 μg/ml, por ejemplo alrededor de 0,2 μg/ml.
En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de comparar una firma de alérgeno de cacahuete con un estándar de firma. El estándar de firma puede ser un perfil peptídico establecido por una autoridad reguladora, tal como la FDA (Food and Drug Administration) o EMA (European Medicines Association), un perfil peptídico establecido por los estándares de la industria, o un perfil establecido por las expectativas según se determina mediante
experimentación repetida. El estándar de firma puede especificar los tipos y cantidades relativas de alérgenos de cacahuete que se espera encontrar en una muestra.
En ciertas realizaciones ejemplares, los productos de digestión de alérgenos tienen entre alrededor de 4 aminoácidos y alrededor de 50 aminoácidos de longitud, entre alrededor de 6 aminoácidos y alrededor de 30 aminoácidos de longitud, o entre alrededor de 15 aminoácidos y alrededor de 20 aminoácidos de longitud, o tienen alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos de longitud.
En ciertas realizaciones ejemplares, las etapas de fragmentar los productos de digestión de alérgenos y detectar los fragmentos peptídicos se llevan a cabo mediante un método que incluye espectrometría de masas en tándem, tal como cromatografía de líquidos-espectroscopía de masas en tándem (LC-MS-MS), espectroscopía de masas en tándem a nanoescala (nanoLC-MS-MS), o cromatografía de líquidos de alta resolución-espectroscopía de masas en tándem a nanoescala (nanoHPLC-MS-MS).
En ciertos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma (por ejemplo, la firma de alérgenos de cacahuete y/o estándar de firma) comprende uno o más productos de digestión de alérgeno Ara h1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:93 y SEQ ID NO:40. En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma comprende productos de digestión de alérgenos Ara h1, Ara h2, y Ara h6. En otros ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma comprende productos de digestión de alérgenos Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6. En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma incluye uno o más productos de digestión de alérgenos que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SeQ ID NO:177, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237. En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma incluye uno o más productos de digestión de alérgenos que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consta de SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237.
En algunas realizaciones, los productos de digestión de alérgenos adecuados para uso en establecer un perfil de alérgenos de cacahuete están presentes en más de una isoforma de un alérgeno de cacahuete, tales como en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o más isoformas de un alérgeno particular (por ejemplo, una proteína o polipéptido Ara h). Por ejemplo, un producto de digestión de alérgenos adecuado para uso en un perfil de firma de alérgenos de cacahuete puede estar presente en una o cualquier combinación de en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más isoformas de Ara h1, en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más isoformas de Ara h2, en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de isoformas de Ara h3, y/o en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de isoformas de Ara h6. En algunas realizaciones, un producto de digestión de alérgenos adecuado para uso en un perfil de firma de alérgenos de cacahuete está presente en todas las isoformas de uno o más alérgenos de cacahuete.
En ciertas realizaciones ejemplares, los alérgenos de cacahuete se digieren con una o más proteasas. Por ejemplo, los alérgenos de cacahuete pueden digerirse con una o más proteasas seleccionadas del grupo que consiste en tripsina, endoproteinasa Lys-C, y endoproteinasa Arg-C.
En ciertas realizaciones ejemplares, una composición que comprende alérgenos de cacahuete comprende además un estándar interno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el estándar interno comprende uno o más isótopos pesados, tales como 13C y/o 15N. En ciertas realizaciones, el estándar interno no es un alérgeno completo, sino un fragmento del péptido. El fragmento tiene típicamente menos de 50 aminoácidos de longitud (tal como, por ejemplo, entre alrededor de 4 y alrededor de 50 aminoácidos de longitud, entre alrededor de 6 y alrededor de 30 aminoácidos de longitud, o entre alrededor de 10 y alrededor de 20 aminoácidos de longitud). En algunas realizaciones, el fragmento tiene la secuencia de un producto de digestión de alérgenos esperado o predicho. En una realización, el estándar interno está compuesto por múltiples péptidos de alérgenos de cacahuete, cada uno marcado en el extremo C-terminal con un isótopo pesado. Por ejemplo, un estándar interno ejemplar puede comprender cualquier combinación de dos o más fragmentos marcados con isótopos de un péptido Ara h1, dos o más fragmentos marcados con isótopos de un péptido Ara h2, dos o más fragmentos marcados con isótopos de un péptido Ara h3, y dos o más fragmentos marcados con isótopos de un péptido Ara h6. En una realización, una composición que comprende antígenos de cacahuete se digiere con tripsina, se añade una mezcla estándar que comprende péptidos de alérgenos de cacahuete marcados con 13C y/o 15N a la mezcla digerida, y a continuación, se analiza la composición mediante fragmentación, por ejemplo mediante espectrometría de masas, tales como, por ejemplo, LC-MS, o LC-MS-MS.
En ciertas realizaciones ejemplares, una firma comprende productos de digestión de alérgenos que no contienen sitios de escisión proteolítica perdidos.
En otro aspecto, la invención presenta un método para determinar un perfil de liberación in vitro de uno o más alérgenos de cacahuete desde un sustrato a un medio acuoso. El método incluye obtener una o más muestras del medio acuoso en cada uno de una pluralidad de puntos de tiempo, digerir los alérgenos de cacahuete presentes en la una o más muestras para generar productos de digestión de alérgenos, fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos, y detectar los fragmentos peptídicos durante al menos dos de la pluralidad de puntos de tiempo para identificar los productos de digestión de alérgenos, determinando así el perfil de liberación in vitro de los alérgenos de cacahuete en el medio acuoso, en el que el perfil de liberación comprende cada
uno de los productos de digestión de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6, y en el que los productos de digestión de alérgenos comprenden las secuencias de aminoácidos de SeQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:40, SEQ ID SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ iD NO:236 y SEQ ID NO:237. La composición puede ser, por ejemplo, un extracto de cacahuete, una composición terapéutica que comprende alérgenos de cacahuete, un medio de disolución, o una muestra analítica. En algunas realizaciones, la composición es un medio acuoso. En algunas realizaciones, la cantidad de alérgenos de cacahuete en la composición es muy baja. Por ejemplo, la cantidad de un alérgeno de cacahuete particular (por ejemplo, Ara h1, Ara h2, Ara h3, o Ara h6) puede ser menor que alrededor de 2 μg/ml, menor que alrededor de 1,5 μg/ml, menor que alrededor de 1 μg/ ml, o menor que alrededor de 0,5 μg/ml, por ejemplo alrededor de 0,2 μg/ml, o tienen una longitud de alrededor de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, los alérgenos en una muestra tomada de una composición se digieren para producir productos de digestión de alérgenos de entre alrededor de 4 aminoácidos y alrededor de 50 aminoácidos de longitud, entre alrededor de 6 aminoácidos y alrededor de 30 aminoácidos de longitud, o entre alrededor de 15 aminoácidos ácidos y unos 20 aminoácidos de longitud. El patrón de productos de digestión de alérgenos obtenido después de la digestión crea una firma peptídica para la muestra.
En algunas realizaciones, las etapas de fragmentar los productos de digestión de alérgenos y detectar los fragmentos peptídicos incluyen uno o más de un método de separación y un método de detección de péptidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las etapas para detectar e identificar los fragmentos peptídicos incluyen llevar a cabo métodos tales como LC-MS-MS, nano-LC-MS-MS, HPLC-MS-MS, o nanoHPLC-MS-MS. En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma peptídica incluye una colección de fragmentos de una o más proteínas de cacahuete Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, Ara h7, Ara h8, Ara h9, Ara h10, Ara h11, Ara h12 y Ara h13.
En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, una firma peptídica incluye uno o más productos de digestión del alérgeno Ara h1 que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO:93 y SEQ ID NO:40.
En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma peptídica comprende uno o más productos de digestión de alérgenos de cualquier combinación de Ara h1, Ara h2, y Ara h6, o uno o más productos de digestión de alérgenos de cualquier combinación de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6.
En algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, la firma comprende uno o más productos de digestión de alérgenos que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237.
En ciertas realizaciones, los productos de digestión de alérgenos están presentes en más de una isoforma de un alérgeno de cacahuete, tales como en una, dos, tres, cuatro, o todas las isoformas de un alérgeno de cacahuete, tales como en una, dos, tres, cuatro, o todas las isoformas de Ara h1. En una realización, los productos de digestión de alérgenos están en más de una isoforma de alérgeno de cacahuete.
En ciertas realizaciones ejemplares, los alérgenos de cacahuete se digieren con una o más proteasas, tales como una o más proteasas seleccionadas del grupo que consiste en tripsina, endoproteinasa Lys-C, y endoproteinasa Arg-C.
En ciertas realizaciones, una muestra, por ejemplo una muestra tomada de un extracto o composición farmacéutica, comprende además un estándar interno. Un estándar interno es típicamente un péptido que tiene la secuencia de un producto de digestión de alérgenos esperado o predicho, y típicamente tiene menos de 50 aminoácidos de longitud (tal como entre alrededor de 4 y 50 aminoácidos de longitud, entre alrededor de 6 y alrededor de 30 aminoácidos de longitud, o entre alrededor de 10 y alrededor de 20 aminoácidos de longitud, o alrededor de 10, alrededor de 11, alrededor de 12, alrededor de 13, alrededor de 14, alrededor de 15, alrededor de 16, alrededor de 17, alrededor de 18, alrededor de 19, o alrededor de 20 aminoácidos de longitud). El estándar interno puede añadirse a la composición antes del muestreo, y/o añadirse a la muestra antes de la etapa de digestión enzimática. En ciertas realizaciones ejemplares, el estándar interno comprende uno o más isótopos pesados, tales como, por ejemplo, 13C y/o 15N.
En algunas realizaciones, la firma comprende productos de digestión de alérgenos que no contienen sitios de escisión proteolítica perdidos (no escindidos).
En algunas realizaciones, la composición comprende una partícula que encierra los alérgenos y/o tiene alérgenos unidos a la superficie. La partícula puede ser, por ejemplo, una nanopartícula, una micropartícula, una película, una cápsula, o un hidrogel.
En algunas realizaciones, el perfil de liberación se obtiene durante un período de tiempo, tal como, por ejemplo, durante un período de horas, por ejemplo un período de tiempo de tres horas, un período de tiempo de seis horas, un período de tiempo de doce horas, o un período de tiempo de veinticuatro horas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las anteriores y otras características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas tomadas junto con los dibujos adjuntos.
Las Figuras 1A-1C representan un péptido Ara h1 de alta calidad (SEQ ID NO:70) identificado por digestión tríptica seguida de MS-MS. (A) representa la secuencia, el número de sitios de escisión de tripsina no escindidos ("perdidos"), el porcentaje de Tasa de Descubrimientos Falsos (FDR), el número de sitios de modificación postraduccional ("PTM"), la confirmación en BLAST (Herramienta de Alineación Local Básica) de que la secuencia identificada es única para la proteína diana ("BLAST"), la base de datos buscada, y el número de isoformas en la base de datos que incluían la secuencia identificada. (B) y (C) representan datos de MS-MS en forma de tabla y en forma de gráfico, respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención se basa en parte en el desarrollo de métodos analíticos sensibles para medir y perfilar los alérgenos de cacahuete presentes en una composición, tal como un extracto o una composición terapéutica, y para determinar un perfil de liberación, tal como un perfil de liberación in vitro, a partir de composiciones formuladas que comprenden alérgenos de cacahuete. Los métodos incluyen la detección de péptidos que existen en una o más isoformas de uno o más alérgenos en una muestra. La identificación de péptidos que se encuentran en múltiples isoformas de un alérgeno de cacahuete proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre una muestra, que puede ser un indicador de la consistencia de lote a lote, y puede proporcionar un perfil de liberación de antígenos almacenados sobre o en un sustrato, tal como una nanopartícula. Los métodos son particularmente útiles para perfilar el contenido de alérgenos en composiciones que contienen una cantidad muy baja de alérgenos de cacahuete.
Como se usa aquí, los términos "cacahuete", "maní", y "Arachis hipogea" se usan indistintamente, y se refieren a una leguminosa que pertenece a la familia Leguminosae y a la subfamilia Papillionacea. Se han identificado más de 17 alérgenos de cacahuete diferentes. Los alérgenos de proteína de cacahuete incluyen Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara H4, Ara h5, Ara h6, Ara h7, Ara h8, Ara h9, Ara h10, Ara h11, Ara h12, Ara h13, Ara h14, Ara h15, Ara h16 y Ara h17. Los Números de Acceso de GenBank para las secuencias de ADNc de alérgenos ejemplares incluyen L34402.1 (Ara h1), AY007229.1 (Ara h2.0101), AY158467.1 (Ara h2.0201), AF093541.1 (Ara h3.0101), AF086821.1 (Ara h3.0201), AF059616 (Ara h5), AF092846.1 (Ara h6), AF091737.1 (Ara h7), EU046325.1 (AraH7.0201), AY328088.1 (Ara h8.0101), EF436550.1 (Ara h8.0201), EU159429.1 (Ara h9.0101), y EU161278.1 (Ara h9.0201), AY722694.2 (Ara h10.0101), AY722695.1 (Ara h10.0201), DQ097716.1 (Ara h11), EY396089.1 (Ara h12), EY396019.1 (AraH13), AAK13449 (Ara h14.0101), AAK13450 (Ara h14.0102), AAT11925 (Ara h14.0103), AAU21501 (Ara h15.0101), respectivamente (véase, por ejemplo, Leon et al., The peanut allergy epidemic: allergen molecular characterization and prospects for specific therapy. Expert Rev. Mol. Med. Vol. 9, Publicación 1, enero 2007; véase también Arkwright et al., IgE Sensitization to the Nonspecific Lipid-Transfer Protein Ara h 9 and Peanut-Associated Bronchospasm, BioMed Research International, vol. 2013, Artículo ID 746507; véase la dirección url allergen.org/search.php?allergensource=Arachis+hypogaea).
La firma de los productos de digestión de alérgenos en una muestra se obtiene digiriendo alérgenos de cacahuete presentes en la muestra para generar productos de digestión de alérgenos, fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos, y detectar e identificar los fragmentos peptídicos para obtener la firma de los productos de digestión de alérgenos, en el que la firma comprende cada uno de los productos de digestión de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6, y en el que los productos de digestión de alérgenos comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:40, SEQ ID SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237. Como se usa aquí, un "producto de digestión de alérgenos" se refiere a un alérgeno de cacahuete presente en un extracto o muestra que se digiere, por ejemplo usando una enzima (por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Lys-C, endoproteinasa Arg-C, y similares) para generar un producto que es más pequeño que el alérgeno intacto. La expresión "producto de digestión de alérgenos" también se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido que se produciría si se digiriera enzimáticamente el alérgeno de cacahuete.
Como se usa aquí, un "alérgeno" se refiere a un subconjunto de antígenos (por ejemplo, antígenos peptídicos de cacahuete) que provocan la producción de IgE además de otros isotipos de anticuerpos. Las expresiones "alérgeno", "alérgeno natural" y "alérgeno de tipo salvaje" se pueden usar indistintamente.
Como se usa aquí, un "antígeno" se refiere a una molécula (por ejemplo, un péptido de cacahuete) que provoca la producción de una respuesta de anticuerpos (es decir, una respuesta humoral) y/o una reacción específica de antígeno con células T (es decir, una respuesta celular) en un animal.
Los ejemplos no limitativos de enzimas, específicamente proteasas, que son adecuadas para digerir alérgenos de cacahuete para generar productos de digestión de alérgenos incluyen, pero no se limitan a, tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, endoproteinasa Lys-C, y endoproteinasa Arg-C, pepsina, papaína, termolisina, subtilisina, proteasa K, bromelina, proteasa específica de sulfhidrilo (ficina), y similares.
Como se usa aquí, un "fragmento peptídico" o "fragmento peptídico en fase gaseosa" se refiere a cualquier parte o porción del alérgeno que es más pequeña que el alérgeno natural intacto que se genera mediante un método de fragmentación que no utiliza una enzima. Normalmente, las condiciones de fragmentación se introducen en la fase gaseosa, por ejemplo en una etapa de espectrómetro de masas. En ciertas realizaciones ejemplares, un fragmento peptídico tiene menos de 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo entre alrededor de 2 y alrededor de 50 aminoácidos de longitud, entre alrededor de 6 y alrededor de 30 aminoácidos de longitud, o entre alrededor de 15 y alrededor de 20 aminoácidos de longitud, o cualesquiera valores o subintervalos dentro de estos intervalos. En ciertas realizaciones ejemplares, un fragmento peptídico tiene alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 6, alrededor de 7, alrededor de 8, alrededor de 9, alrededor de 10, alrededor de 11, alrededor de 12, alrededor de 13, alrededor de 14, alrededor de 15, alrededor de 16, alrededor de 17, alrededor de 18, alrededor de 19, alrededor de 20, alrededor de 21, alrededor de 22, alrededor de 23, alrededor de 24, alrededor de 25, alrededor de 26, alrededor de 27, alrededor de 28, alrededor de 29, alrededor de 30, alrededor de 31, alrededor de 32, alrededor de 33, alrededor de 34, alrededor de 35, alrededor de 36, alrededor de 37, alrededor de 38, alrededor de 39, alrededor de 40, alrededor de 41, alrededor de 42, alrededor de 43, alrededor de 44, alrededor de 45, alrededor de 46, alrededor de 47, alrededor de 48, o alrededor de 49 aminoácidos de longitud.
En ciertas realizaciones ejemplares, un fragmento peptídico se genera fragmentando un producto de digestión de alérgenos, y después usando un procedimiento de separación y un método de identificación de péptidos, tales como cromatografía de líquidos-espectroscopía de masas en tándem (LC-MS-MS), nano-LC-MS-MS, cromatografía de líquidos de alta resolución-MS en tándem (HPLC-MS-MS), nanoHPLC-MS-MS, cromatografía de líquidos de ultrarresolución-MS en tándem (UPLC-MS-MS), nanoUPLC-MS-MS, y cromatografía de líquidos de ultra alta resolución-MS en tándem (UHPLC-MS-MS), nanoUHPLC-MS-MS, o similares.
Según ciertas realizaciones ejemplares, un método descrito aquí comprende además analizar en masa productos de digestión de alérgenos y/o fragmentos peptídicos usando un analizador de masas. El analizador de masas normalmente comprende un analizador de masas de triple cuadrupolo. Según otras realizaciones, el analizador de masas puede comprender un analizador de masas seleccionado del grupo que consiste en: (i) un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, (ii) un orbitrap, tal como un orbitrap de transformada de Fourier, tal como un Orbitrap ELITE™ (Thermo Scientific); (iii) un analizador de masas por transformada de Fourier ("FT"); (ii) un analizador de masas de resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier ("FTICR"); (iii) un analizador de masas de tiempo de vuelo ("TOF"); (iv) un analizador de masas de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal ("oaTOF"); (v) un analizador de masas de tiempo de vuelo de aceleración axial; (vi) un espectrómetro de masas de sector magnético;
(vii) un analizador de masas de cuadrupolo Paul o 3D; (viii) un analizador de masas de cuadrupolo lineal o 2D; (ix) un analizador de masas con trampa Penning; (x) un analizador de masas con trampa de iones; y (xiii) un espectrómetro de masas por transformada de Fourier electrostático.
En ciertas realizaciones ejemplares, los métodos descritos aquí utilizan un procedimiento de separación tal como un método de cromatografía, por ejemplo cromatografía de líquidos. Según una realización, la fragmentación de los productos de digestión de alérgenos y/o la detección e identificación de los fragmentos peptídicos se lleva a cabo mediante: (i) cromatografía de líquidos de alta resolución ("HPLC"), (ii) intercambio aniónico, (iii) cromatografía de intercambio aniónico; (iv) intercambio de cationes; (v) cromatografía de intercambio catiónico; (vi) cromatografía de fase inversa de pares de iones; (vii) cromatografía; (viii) electroforesis unidimensional; (ix) electroforesis multidimensional; (x) exclusión por tamaño; (xi) afinidad; (xii) cromatografía de fase inversa; (xiii) cromatografía de electroforesis capilar ("CEC"); (xiv) electroforesis; (xv) separación por movilidad iónica; (xvi) separación o espectrometría de movilidad iónica asimétrica de campo ("FAIMS"); (xvii) electroforesis capilar; y (xviii) cromatografía de fluidos supercríticos.
Según ciertas realizaciones ejemplares, el método comprende además ionizar productos de digestión de alérgenos y/o fragmentos peptídicos en una muestra a analizar. La fuente de iones puede comprender una fuente de iones continua. Según una realización, la fuente de iones se puede seleccionar del grupo que consiste en: (i) una fuente de iones de ionización por electropulverización ("ESI"); (ii) una fuente de iones de ionización por desorción láser asistida por matriz ("MALDI"); (iii) una fuente de iones de ionización por desorción en silicio ("DIOS"); y (iv) una fuente de iones de ionización por electropulverización por desorción ("DESI").
Las firmas de alérgenos de cacahuete descritas aquí generalmente se determinan mediante la medida de transiciones de monitorización de reacción múltiple (MRM) que consisten en el ion precursor del péptido, uno o más iones de fragmento, y un tiempo de retención. Esta medida se lleva a cabo, por ejemplo, en un instrumento de triple cuadrupolo.
La firma también se puede obtener mediante una combinación de tiempo de retención y análisis espectrométrico de masas de alta resolución preciso del péptido intacto. Estos métodos de cuantificación normalmente requieren un estándar interno marcado y una curva de calibración de péptidos sintéticos externos. En una realización, una firma se obtiene mediante un análisis de nano-LC/MS/MS (nLC-MS-MS) en el que se fragmentan tantos péptidos como sea posible y se identifican mediante análisis de bases de datos y los conjuntos de datos de nLC/MS/MS que consisten en tiempo de retención, y los valores de masa/carga e intensidad se miden y se comparan para determinar los cambios globales del proteoma.
En ciertas realizaciones ejemplares, se usan estándares internos que incluyen una combinación de dos o más productos de digestión de alérgenos de alérgenos proteicos, tales como de uno o más de Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, Ara h7, Ara h8, Ara h9, Ara h10, Ara h11, Ara h12, Ara h13, Ara h14, Ara h15, Ara h16 y Ara h17. Los estándares internos suelen tener una secuencia peptídica conocida y se proporcionan en una cantidad conocida. En algunas realizaciones, los estándares internos incluyen una combinación de productos de digestión de alérgenos de los alérgenos de cacahuete Ara h1, Ara h2, y Ara h6. En otras realizaciones, se usan estándares internos que incluyen una combinación de productos de digestión de alérgenos de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6. En ciertas realizaciones ejemplares, una muestra puede incluir uno o más estándares internos que comprenden uno o cualquier combinación de productos de digestión de alérgenos enumerados en las Tablas 19-23. En algunas realizaciones, los estándares están marcados, tal como con uno o más isótopos pesados, por ejemplo 13C o 15N.
En ciertas realizaciones, los productos de digestión de alérgenos escogidos para caracterizar la composición representan únicamente el alérgeno de cacahuete o la familia de isoformas de alérgenos de cacahuete, y están presentes en la mayoría o en todas las isoformas del alérgeno del que derivan, lo que permite su uso para la cuantificación específica del alérgeno en cuestión, por ejemplo alérgenos de cacahuete. En consecuencia, en ciertas realizaciones ejemplares, se genera una firma de productos de digestión de alérgenos. Como se usa aquí, una "firma" o "firma alergénica" se refiere a la presencia de una combinación particular y cantidad de productos de digestión de alérgenos de cacahuete específicos (por ejemplo, productos de digestión de alérgenos Ara h1, Ara h2, Ara h6 y/o Ara h3). En ciertos ejemplos, una firma comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más productos de digestión de alérgenos distintos, teniendo cada producto distinto una secuencia única.
La selección de péptidos para uso en una firma de alérgenos de cacahuete se puede basar en la identificación de isoformas que incluyen los péptidos identificados por las etapas de digestión y fragmentación. Se puede usar una variedad de bases de datos de secuencias para identificar las secuencias de isoformas de alérgenos de cacahuete, incluyendo UniProt (en línea en uniprot.org, y que incluye las bases de datos Swiss-Prot y TrEMBL), la base de datos en Allergen Nomenclature (en línea en allergen.org), GenBank (en línea en ncbi.nlm.nih.gov), GeneCards (en línea en genecards.org), Ensembl (en línea en ensemble.org), y similares.
Puede usarse cualquier algoritmo de alineación de secuencias para identificar las isoformas que incluyen los péptidos identificados después de la digestión y fragmentación de una muestra que comprende alérgenos de cacahuete. Ejemplos de algoritmos de alineación de secuencias incluyen BLAST (en línea en blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Clustal Omega (en línea en ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo), y similares.
Los métodos de perfilado de alérgenos de cacahuete pueden ser útiles para una variedad de fines. Por ejemplo, los métodos descritos aquí son útiles para realizar evaluaciones de reproducibilidad de lote a lote en composiciones que contienen cacahuete. Los métodos descritos aquí también son útiles para medir la liberación o fuga de alérgenos de cacahuete desde la superficie o el interior de un recipiente o sustrato, tal como de una perla o una partícula (por ejemplo, una nanopartícula o micropartícula), una cápsula, una película o una tira (tal como, por ejemplo, para administración sublingual de la composición), o un gel (tal como un hidrogel).
En algunas realizaciones, la firma peptídica incluye péptidos que incluyen uno o más epítopos inmunogénicos, o uno o más epítopos inmunodominantes de uno o más alérgenos de cacahuete. Las firmas peptídicas que comprenden epítopos inmunogénicos o epítopos inmunodominantes pueden proporcionar un estándar para la inmunogenicidad de una composición que comprende alérgenos de cacahuete.
Como se usa aquí, una "muestra" se refiere a cualquier composición que contiene alérgenos de cacahuete. Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, extractos que contienen cacahuete, polvos que contienen cacahuete, muestras analíticas que comprenden uno o más alérgenos de cacahuete, composiciones farmacéuticas (por ejemplo, vacunas terapéuticas), medios de disolución o liberación, y similares. En realizaciones típicas, una muestra será acuosa.
Una muestra para uso en los métodos de perfilado de alérgenos presentados en la invención puede ser un extracto de cacahuete, tal como un extracto hecho de cacahuetes enteros tostados o crudos, o de harina de cacahuete. El extracto se puede usar en una composición farmacéutica, tal como para el tratamiento o la prevención de la alergia al cacahuete. El extracto se puede usar en una composición para inmunoterapia oral (OIT), o inmunoterapia sublingual (SLIT), o en una composición para uso en una composición de nanopartículas, con o sin un adyuvante. Al evaluar la firma de alérgenos de cacahuete del extracto de cacahuete, se pueden monitorizar las consistencias de lote a lote. La firma del alérgeno de cacahuete también se puede usar como factor para deducir la inmunogenicidad del extracto, ya que se espera que los extractos con firmas similares tengan propiedades inmunogénicas similares.
En algunas realizaciones, la cantidad de alérgenos de cacahuete en la composición es muy baja. Por ejemplo, la cantidad de un alérgeno de cacahuete particular (por ejemplo, Ara h1, Ara h2, Ara h3, o Ara h6) puede ser menor que alrededor de 2 μg/ml, menor que alrededor de 1,5 μg/ml, menor que alrededor de 1 μg/ ml, o menor que alrededor de 0,5 μg/ml, por ejemplo alrededor de 0,2 μg/ml.
Los extractos de proteína de cacahuete se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de desengrasado y/o filtración para producir preparaciones de alérgenos de cacahuete.
Una muestra para uso en los métodos de perfilado de alérgenos descritos aquí puede ser una composición terapéutica, tal como una formulación líquida para administración oral, sublingual, mucosal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, parenteral, o por inhalación.
En algunas realizaciones, una composición terapéutica estará en forma de una película o una tira. Una muestra puede incluir una parte de la película disuelta en un amortiguador antes del análisis mediante los métodos de perfilado de alérgenos descritos aquí.
En otras realizaciones, la muestra incluirá un sustrato, tal como una nanopartícula, una cápsula, una película, o un comprimido, o un gel, tal como un hidrogel. Los métodos de perfilado de alérgenos descritos aquí son útiles para evaluar la liberación de alérgenos de cacahuete del sustrato, tal como, por ejemplo, de una nanopartícula o cápsula, o de una película o de un hidrogel. La liberación puede ser desde el interior del sustrato, por ejemplo una partícula, o desde el exterior (por ejemplo, una superficie) de un sustrato. En una realización, el perfil de liberación se evalúa llevando a cabo una liberación completa de alérgenos de cacahuete, y después evaluando la liberación controlada, tal como durante un período de tiempo o en diferentes condiciones de cultivo o solución (por ejemplo, a diferentes temperaturas, pH, o similares). La cantidad de alérgeno liberado en el ensayo de liberación controlada generalmente se informa como una fracción o porcentaje en comparación con la cantidad de alérgeno liberado en las condiciones de liberación completa.
En ciertas realizaciones ejemplares, se pueden usar dos o más firmas obtenidas en puntos específicos en el tiempo para determinar un perfil de liberación in vitro de alérgenos de cacahuete en una muestra que contiene un sustrato (por ejemplo, una muestra acuosa, por ejemplo un medio de disolución o liberación). Un perfil de liberación in vitro puede determinarse durante un período de horas, días o semanas. En ciertas realizaciones ejemplares, un perfil de liberación se obtiene durante un período de tiempo de alrededor de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o alrededor de 24 horas. En ciertas realizaciones ejemplares, un perfil de liberación se obtiene durante un período de tiempo de alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o alrededor de 7 días. En ciertas realizaciones ejemplares, un perfil de liberación se obtiene durante un período de tiempo de alrededor de una semana, alrededor de dos semanas, alrededor de tres semanas, alrededor de cuatro semanas, alrededor de cinco semanas, alrededor de seis semanas, alrededor de siete semanas, o alrededor de ocho semanas. En ciertas realizaciones ejemplares, se obtienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más firmas durante un período de tiempo particular. Por ejemplo, el estallido de liberación de alérgenos de cacahuete se puede evaluar dentro de las primeras 24 horas en puntos de tiempo espaciados uniformemente con datos suficientes para determinar la cinética de estallido seguido de la liberación de la cantidad restante de los mismos alérgenos de la muestra para ayudar a evaluar el comportamiento global de la composición del producto. El perfil de liberación puede incluir tipos de alérgenos liberados del sustrato y/o las cantidades relativas de alérgeno liberadas.
En una realización, los métodos descritos aquí indican la liberación de alérgenos desde la superficie de un sustrato, por ejemplo una nanopartícula, detectando un estallido de péptidos en un medio de disolución o liberación cerca del inicio del ensayo. Si el alérgeno está presente en el interior del sustrato, la detección del alérgeno a lo largo del tiempo será más gradual según la velocidad de liberación. El alérgeno que está presente en la superficie de un sustrato y encapsulado dentro del sustrato puede identificarse mediante una detección del estallido inicial de péptidos en el medio de disolución o liberación cerca del comienzo del ensayo, a medida que el sustrato libera el antígeno de la superficie, seguido de un aumento más gradual en la detección de péptidos en los medios de disolución o liberación a medida que se libera (por ejemplo, se escapa) el alérgeno desde el interior del sustrato.
Como se usa aquí, "medio de disolución", "medios de disolución", "medio de liberación" y "medios de liberación" se refieren a una composición que se usa para proporcionar in vitro información de liberación de fármacos. Los medios de disolución o liberación son útiles, por ejemplo, para los ensayos de control de calidad de una muestra para determinar la liberación y/o la estabilidad del alérgeno en la muestra. Al escoger un medio de disolución o liberación adecuado, es útil determinar el perfil diana analítico del alérgeno (por ejemplo, liberación retardada, liberación constante, liberación prolongada, y similares) y/o el perfil de solubilidad del alérgeno. Para una revisión de la selección de medios de disolución, véase Martin y Gray (Summer 2011) Journal of Validation Technology.
Tal como se usa aquí, "velocidad de liberación" se refiere a la velocidad a la que un agente alérgeno de cacahuete atrapado fluye desde una composición y hacia un medio circundante en un ensayo de liberación in vitro. En una realización ejemplar, la composición se prepara primero para el ensayo de liberación colocando la composición en el medio de liberación in vitro apropiado. Esto generalmente se lleva a cabo intercambiando el amortiguador después de la centrifugación para peletizar el sustrato (por ejemplo, un nanoportador sintético), y reconstituyendo el sustrato usando condiciones suaves. En ciertas realizaciones, el ensayo se inicia colocando la muestra a 37°C en un aparato de temperatura controlada apropiado. Por lo general, se retira una muestra en diversos puntos de tiempo.
Como se usa aquí, un "perfil de liberación" se refiere a los tipos de proteínas y/o péptidos, por ejemplo alérgenos de cacahuete, que se liberan de un sustrato o vasija a lo largo del tiempo, y también puede incluir la velocidad a la que cada proteína, péptido y/o alérgeno particular en o sobre el sustrato o vasija se libera.
"Exhibe una disociación sensible al pH" se refiere a un acoplamiento entre dos entidades, tal como un alérgeno de cacahuete y un sustrato, por ejemplo una molécula portadora, que se reduce o elimina significativamente por la exposición de las dos entidades a un cambio en el pH ambiental. En ciertas realizaciones, las disociaciones sensibles al pH relevantes pueden satisfacer cualquiera de las relaciones o combinaciones de las mismas proporcionadas aquí.
En ciertas realizaciones ejemplares, una composición farmacéutica comprende nanoportadores y/o microportadores, tales como nanoportadores sintéticos y/o microportadores sintéticos. Como se usa aquí, un "nanoportador sintético" o "microportador sintético" se refiere a un objeto discreto que posee al menos una dimensión que es menor o igual a 5 micrómetros de tamaño.
En algunas realizaciones, el balance de masas se compara entre uno o más alérgenos de cacahuete en una o más composiciones a comparar, tal como en un muestreo de una composición durante un período de tiempo a lo largo de diferentes puntos de tiempo, o entre diferentes lotes obtenidos en diferentes momentos, y/o por diferentes métodos. Los datos comparativos se pueden presentar como una cuantificación relativa, y por lo general se expresan como una fracción o un porcentaje.
Las composiciones farmacéuticas que contienen alérgenos de cacahuete generalmente se pueden formular con portadores, excipientes, y otros agentes que proporcionan una transferencia, administración, tolerancia, y similares adecuadas. Las formulaciones ejemplares incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J. Pharm Sci. Technol. 52:238-311.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva añadida a una composición (por ejemplo, una composición terapéutica) para facilitar aún más la administración de la composición. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos diluyentes, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles, y similares.
"Forma de dosificación" se refiere a un fármaco (por ejemplo, uno o más alérgenos de cacahuete) en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para la administración a un sujeto.
"Cantidad eficaz" se refiere a esa cantidad eficaz para un propósito determinado. Por ejemplo, cuando la cantidad eficaz tiene un propósito terapéutico, una cantidad eficaz es una cantidad que trata, alivia, mejora, calma, retrasa el inicio, inhibe la progresión, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección proporcionada aquí, por ejemplo una alergia al cacahuete.
"Sujeto" se refiere a un animal, incluyendo mamíferos tales como seres humanos y primates no humanos; aves; animales domésticos o de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, vacas, caballos, y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas, y cobayas; peces; y similares.
Como se usa aquí, "vacuna" se refiere a una composición de materia que mejora la respuesta inmunitaria a una enfermedad o trastorno particular. Una vacuna normalmente contiene factores que estimulan el sistema inmunitario de un sujeto para que reconozca un antígeno específico (por ejemplo, un antígeno de cacahuete) como extraño y lo elimine del cuerpo del sujeto. Una vacuna también establece una "memoria" inmunológica de manera que el antígeno se reconocerá rápidamente y se le responderá si se vuelve a exponer a un sujeto. Las vacunas pueden ser profilácticas (por ejemplo, para prevenir futuras infecciones por cualquier patógeno) o terapéuticas (por ejemplo, una vacuna contra un antígeno de cacahuete para el tratamiento de la alergia al cacahuete).
"Administrar" o "administración" significa proporcionar un fármaco a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil.
Como se usa aquí, un "epítopo" se refiere a un sitio de unión que incluye un motivo de aminoácidos de entre aproximadamente seis y quince aminoácidos que se puede unir mediante una inmunoglobulina (por ejemplo, IgE, IgG, etc.) o es reconocido por un receptor de célula T cuando se presenta por una APC junto con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Un epítopo lineal es aquel en el que los aminoácidos se reconocen en el contexto de una secuencia lineal simple. Un epítopo conformacional es aquel en el que los aminoácidos se reconocen en el contexto de una estructura tridimensional particular. Las firmas de alérgenos de cacahuete identificadas por los métodos presentados en la invención pueden comprender uno o más epítopos de cacahuete. Un epítopo inmunogénico puede provocar una respuesta inmunitaria en el cuerpo, por ejemplo una respuesta alérgica.
Como se usa aquí, un "epítopo inmunodominante" se refiere a un epítopo que se une mediante anticuerpo en un gran porcentaje de la población sensibilizada o en el que el título del anticuerpo es alto, con respecto al porcentaje o al título de la reacción del anticuerpo a otros epítopos presentes en el mismo antígeno. En una realización, un epítopo inmunodominante se une mediante anticuerpo en más del 50% de la población sensible, más preferiblemente en más del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de la población sensible. Las firmas de alérgenos de cacahuete identificadas por los métodos presentados en la invención comprenderán típicamente uno o más epítopos inmunodominantes de cacahuete.
EJEMPLO I
Firma de alérgenos de cacahuete
A continuación se describe el desarrollo y la validación preliminar inicial de un método para la cuantificación relativa de cuatro alérgenos del cacahuete, Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6. El método utilizó cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem, y se basó en la medida de péptidos trípticos representativos derivados de cada una de estas proteínas. Los péptidos se escogieron en cada caso para incluir la mayoría de las isoformas de proteínas alergénicas informadas.
El método de perfilado dependió de la reproducibilidad y la eficiencia de la digestión para la proteína de interés en una mezcla compleja de proteínas. No todos los péptidos proteolíticos son buenos candidatos para la cuantificación, y aunque la buena eficiencia de ionización y la escisión tríptica consistente, así como la baja probabilidad de que el péptido albergue una modificación postraduccional, son aspectos importantes del procedimiento de selección, cuestiones tales como la interferencia de otros péptidos y otros efectos de matriz en una digestión compleja son más difíciles de predecir. Una vez seleccionados, se obtuvieron una serie de tanto péptidos marcados con isótopos pesados como versiones sintéticas no marcadas de los péptidos seleccionados, y se usaron como estándares internos y para curvas de calibración de amortiguadores, respectivamente.
Los extractos de cacahuete preparados a partir de harina de cacahuete ligeramente tostada (Golden Peanut and T ree Nuts, Alpharetta, GA) se digirieron por cuadruplicado con tripsina, y después se añadió un estándar a la muestra digerida. El estándar contenía dos péptidos Ara h1, dos péptidos Ara h2, dos péptidos Ara h3, y dos péptidos Ara h6. Los péptidos en el estándar interno se marcaron con uno o ambos de 13C y 15N. Las secuencias de los estándares internos se proporcionan en las Tablas 1 y 2 a continuación.
Tabla 1. Péptidos "ligeros" sintéticos no marcados para estándar interno
.
En particular, se podrían haber seleccionado péptidos adicionales, y las características particulares de las proteínas dificultaron satisfacer todas las características deseables para todos los péptidos. Por ejemplo, los dos péptidos para Ara h6 contienen metionina, que es indeseable pero difícil de evitar ya que Ara h6 contiene un contenido inusualmente alto de aminoácidos que contienen S. De manera similar, Ara h3 contiene sitios de escisión "perdidos" N-terminales que se ha encontrado que son estables. A menudo, los sitios de escisión tríptica que están muy cerca entre sí darán como resultado la escisión preferencial de uno de los sitios, no de ambos.
Los estándares internos se usaron para cuantificar los productos digeridos. Las curvas de calibración de amortiguadores de péptidos de firma no marcados sintéticos se generaron con estándares internos marcados con isótopos pesados añadidos tanto a la digestión del extracto de cacahuete como a la curva de calibración. La cuantificación relativa se llevó a cabo aplicando el estándar interno y la curva de calibración para determinar la cantidad relativa de péptidos de firma en la digestión del extracto de cacahuete.
Las muestras que contenían los alérgenos de prueba digeridos y los estándares se analizaron mediante fragmentación en fase gaseosa mediante nanoHPLC-MS-MS (Orbitrap ELITE™, ThermoScientific). Utilizando el método top-15, una muestra (de las cuatro en total) se analizó tres veces, y las tres muestras restantes se analizaron una vez, para generar un total de seis archivos de datos. Estos archivos de datos se analizaron mediante Proteome Discoverer™ Software (Thermo Scientific). La aplicación del método top-15 para identificar las proteínas más abundantes aseguró que los péptidos de alta eficiencia de ionización y fragmentación se identificarían de manera consistente en todos los conjuntos de datos.
Las identidades de los fragmentos resultantes se determinaron usando la base de datos de secuencias UniProt en uniprot.org.
Más del 90% de todos los alérgenos de cacahuete conocidos se detectaron en la muestra de harina de cacahuete, incluyendo Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h5, Ara h6, Ara h7, Ara h8, Ara h10, Ara h11, Ara h14, Ara h15, y Ara h Aglutinina. En las Tablas 3-18 a continuación, se ilustra una visión general de los alérgenos identificados.
Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6 representan los principales alérgenos de cacahuete.
Tabla 3. Isoformas de Ara h1 detectadas en harina de cacahuete.
Tabla 4. Isoformas de Ara h2 detectadas en harina de cacahuete.
Tabla 5. Isoformas de Ara h3 detectadas en harina de cacahuete
Tabla 6. Isoformas de Ara h5 identificadas en harina de cacahuete
Tabla 7. Isoformas de Ara h6 identificadas en harina de cacahuete
Tabla 8. Isoformas de Ara h7 identificadas en harina de cacahuete
Tabla 9. Isoformas de Ara h8 identificadas en harina de cacahuete
Tabla 10. Isoformas de Ara h9 identificadas en harina de cacahuete
Tabla 11. Isoformas de Ara h10 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 12. Isoformas de Ara h11 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 13. Isoformas de Ara h12 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 14. Isoformas de Ara h13 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 15. Isoformas de Ara h14 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 16. Isoformas de Ara h15 identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 17. Isoformas de Ara h Aglutinina identificadas en harina de cacahuete.
Tabla 18. Isoformas hipotéticas de Ara h identificadas en harina de cacahuete.
Los péptidos de los principales alérgenos se identifican para formar una colección de péptidos para uso como indicador del contenido de alérgenos de cacahuete en una composición (por ejemplo, una "firma de péptidos de cacahuete"). Una firma peptídica ideal utiliza péptidos que representan productos de digestión tríptica verdaderos completamente escindidos (con la posible excepción de péptidos que contienen restos secuenciales de arginina y/o lisina), en los que uno u otro sitio de escisión normalmente se escinde preferentemente. Los péptidos seleccionados también suelen tener una conservación de la secuencia con tasa de descubrimientos falsos (FDR) de menos de 1%, y una conservación de la secuencia en múltiples isoformas. Además, los péptidos seleccionados normalmente tienen modificaciones postraduccionales mínimas o nulas, incluyendo la oxidación y la glicosilación, y tienen una alta calidad de detección basada en la curación manual de la espectrometría de masas en tándem (MS-MS). Las isoformas están representadas por variaciones genéticas, incluyendo péptidos generados por secuencias truncadas o eliminadas. Un ejemplo de un péptido de alta calidad identificado por MS-MS es el péptido Ara h1 ilustrado en las Figuras 1A a 1C.
Por ejemplo, la heterogeneidad de Ara hlk se determinó comparando las variaciones de secuencia en los registros de la base de datos UniProt. En la Tabla 19 se muestran productos de digestión de alérgeno Ara h1 ejemplares identificados a partir de la referencia P43238 de UniProt. También se compararon secuencias de otros registros de Ara h1 de UniProt (véase la Tabla 20). Los productos de digestión de alérgeno Ara h1 preferidos se seleccionaron como útiles en una firma de alérgenos de cacahuete en base a: 1) preferentemente ningún sitio de escisión tríptica perdido; 2) presencia en todas las secuencias con una tasa de descubrimientos falsos (FDR) de menos de 1%; 3) sitios de modificación postraduccional nulos o mínimos; 4) fragmentos de alta calidad según lo determinado por la curación manual de datos de espectroscopía de masas en tándem (MS-MS); 5) una indicación mediante búsqueda BLAST de que la secuencia es única dentro del proteoma de cacahuete; y 6) presencia de la secuencia un número máximo de isoformas. La lista inicial resultante de productos de digestión de alérgenos que se determinó que eran los candidatos más útiles para perfilar antígenos de cacahuete en el extracto de harina de cacahuete se muestra en las Tablas 20-23, que representan alérgenos de cacahuete de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6, respectivamente.
Tabla 19. Productos de digestión de alérgeno Ara h1 de UniProt Ref. P43238.
Tabla 20. Secuencias de Ara h1 identificadas en extracto de cacahuete preparado
Tabla 21 Secuencias de Ara h2 identificadas en extracto de cacahuete preparado
Tabla 22. Secuencias de Ara h3 identificadas en extracto de cacahuete preparado
Tabla 23. Secuencias de Ara h6 identificadas en extracto de cacahuete preparado
Claims (14)
1. Un método para determinar una firma de alérgenos de cacahuete en un medio acuoso, que comprende: digerir los alérgenos de cacahuete presentes en un medio acuoso para generar productos de digestión de alérgenos; fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos; y
determinar la firma de productos de digestión de alérgenos de alérgenos de cacahuete del medio acuoso detectando los fragmentos peptídicos, en el que la firma comprende cada uno de los productos de digestión de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6; y
en el que los productos de digestión de alérgenos comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:40, SEQ ID SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el medio acuoso es un medio de disolución, un medio de liberación, o una muestra analítica.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de comparar la firma con un estándar de firma.
4. El método de la reivindicación 1, en el que los productos de digestión de alérgenos tienen entre 4 aminoácidos y 50 aminoácidos de longitud, entre 6 aminoácidos y 30 aminoácidos de longitud, o entre 15 aminoácidos y 20 aminoácidos de longitud.
5. El método de la reivindicación 1, en el que las etapas de fragmentar los productos de digestión de alérgenos y determinar la firma se llevan a cabo mediante un método seleccionado del grupo que consiste en uno o cualquier combinación de LC-MS, LC-MS-MS, nano-LC-MS-MS, y nanoHPLC-MS-MS.
6. El método de la reivindicación 1, en el que los alérgenos de cacahuete se digieren con una o más proteasas seleccionadas del grupo que consiste en tripsina, endoproteinasa Lys-C y endoproteinasa Arg-C.
7. El método de la reivindicación 1, en el que el medio acuoso comprende además un estándar interno que opcionalmente comprende uno o más isótopos pesados.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la firma comprende productos de digestión de alérgenos que no contienen sitios de escisión proteolítica perdidos.
9. Un método para determinar un perfil de liberación in vitro de alérgenos de cacahuete desde un sustrato a un medio acuoso, que comprende:
obtener una muestra del medio acuoso en cada uno de una pluralidad de puntos de tiempo;
digerir los alérgenos de cacahuete presentes en las muestras para generar productos de digestión de alérgenos; fragmentar los productos de digestión de alérgenos para generar fragmentos peptídicos; y
detectar los fragmentos peptídicos durante al menos dos de la pluralidad de puntos de tiempo para identificar los productos de digestión de alérgenos, determinando así el perfil de liberación in vitro de los alérgenos de cacahuete en el medio acuoso, en el que el perfil de liberación comprende cada uno de los productos de digestión de Ara h1, Ara h2, Ara h3, y Ara h6, y
en el que los productos de digestión de alérgenos comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:40, SEQ ID SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:237.
10. El método de la reivindicación 9, en el que el medio acuoso es un medio de disolución, un medio de liberación, o una muestra analítica.
11. El método de la reivindicación 9, en el que las etapas de fragmentar los productos de digestión de alérgenos y detectar los fragmentos peptídicos se llevan a cabo mediante un método seleccionado del grupo que consiste en uno o una combinación de cromatografía de líquidos-espectroscopía de masas en tándem (LC-MS-MS), nanoLC-MS-MS, o cromatografía de líquidos de alta resolución - espectroscopía de masas en tándem a nanoescala (nanoHPLC-MS-MS)
12. El método de la reivindicación 9, en el que los alérgenos de cacahuete se digieren con una o más proteasas seleccionadas del grupo que consiste en tripsina, endoproteinasa Lys-C y endoproteinasa Arg-C.
13. El método de la reivindicación 9, en el que el sustrato comprende una o ambas de nanopartículas y micropartículas.
14. El método de la reivindicación 9, en el que el perfil de liberación se obtiene durante un período de tiempo de tres horas, durante un período de tiempo de seis horas, durante un período de tiempo de doce horas, o durante un período de tiempo de veinticuatro horas.
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