KR20070002044A - 알레르겐의 검출방법 - Google Patents

알레르겐의 검출방법 Download PDF

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시게키 카토
마코토 나미오카
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뿌리마하무가부시끼가이샤
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Abstract

밀크 알레르겐, 난백, 밀, 메밀, 땅콩의 알레르겐을 포함하는 식품에 있어서, 이들 알레르겐이 변성/미변성의 어떠한 상태에서도 검출할 수 있는 고감도의 면역학적 검출방법 및 그것에 사용되는 검출키트를 제공하는 것이다.
미변성 및 변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐을 인식하는 각 2종류 또는 그 이상의 모노클로널항체를 사용하는 알레르겐의 검출방법으로서, αs1카세인의 주요 단백질인 αs1αs1카세인, 훼이의 주요 단백질인 β락토글로불린, 난백의 주요 단백질인 오브알부민과 오보뮤코이드, 밀의 주요 단백질인 글리아딘, 메밀의 주요 단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 또는 땅콩의 주요 단백질인 Ara h1을 지표로 한다.
알레르겐, 단백질

Description

알레르겐의 검출방법{METHOD OF DETECTING ALLERGEN}
본 발명은, 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 및 변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백(卵白) 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐을 지표(指標)로 한 밀크 알레르겐의 검출방법과 그것에 사용되는 밀크 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 또는 변성의 밀크 알레르겐을 정성적, 정량적으로 고감도로 분석할 수가 있는 카세인의 주요 단백질인 αs1카세인, 또는 훼이(whey)의 주요 단백질인 β락토글로불린을 지표로 한 알레르겐의 검출방법과, 그것에 사용되는 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
또, 본 발명은 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 또는 변성의 오브알부민(ovalbumin)이나 오보뮤코이드(ovomucoid)의 난백 알레르겐을 정성적, 정량적으로 고감도로 분석할 수가 있는 오브알부민 및/또는 오보뮤코이드를 지표로 한 난백 알레르겐의 검출방법과, 그것에 사용되는 난백 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 또는 변성의 밀 알레르겐을 정성적, 정량적으로 고감도로 분석할 수가 있는 밀의 주요 단백질인 글리아 딘을 지표로 한 밀 알레르겐의 검출방법과, 그것에 사용되는 밀 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 또는 변성의 메밀 알레르겐을 정성적, 정량적으로 고감도로 분석할 수가 있는 메밀의 주요 단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질을 지표로 한 메밀 알레르겐의 검출방법과, 그것에 사용되는 메밀 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 식품 등의 시료 중에 포함되는 미변성 또는 변성의 땅콩 알레르겐을 정성적, 정량적으로 고감도로 분석할 수가 있는 땅콩의 주요 단백질인 Ara h1을 지표로 한 땅콩 알레르겐의 검출방법과 그것에 사용되는 땅콩 알레르겐의 검출용 키트에 관한 것이다.
자연환경의 감소, 자동차나 공장 등으로부터의 배기가스, 주택사정 등, 또는 음식물의 변화 등 여러가지 인자로 인해서, 현재, 3명중 1명은 어떤 종류의 알레르기 질환을 가지고 있다고 한다. 특히, 식품 알레르기는, 식품 중에 포함되어 있는 알레르기 유발물질(이하, 식품 알레르겐이라고 한다)의 섭취가 일으키는 유해한 면역반응이며, 피부염, 천식, 소화관 장해, 아나필락시쇼크 등을 일으키고, 이와 같은 식물알레르기의 환자가 증가하는데 따라서 의학적으로, 식품산업적으로 심각한 문제를 야기시키고 있다. 이와 같은 위해는 죽음에 이르게 하는 일도 있기 때문에 미연에 적절한 처치를 실시할 필요가 있다. 그러기 위해서는, 표시를 통해서 소비자에게 정보를 제공할 필요성도 높아지고 있으며, FAO/WHO 합동식품규격 위원회는 알레르기물질로서 알려져 있는 8종의 원재료를 포함하는 식품에 있어서는, 그것을 포함하고 있다는 사실을 표시하는데 대하여 합의하였으며, 가맹국에서는 각국의 제도에 적합한 표시방법을 검토하기로 하였다(1999년6월). 일본에서는 과거의 건강위해 등의 정도, 빈도를 고려하여 중증의 알레르기증상을 일으킨 실적이 있는 24개 품목의 식품에 대하여, 그 표시방법을 결정하였다(2002년4월부터 시행). 알레르기를 유발하는 식품으로서는, 계란류, 우유류, 육류, 어류, 갑각류 및 연체동물류, 곡류, 콩류 및 견과류, 과일류, 야채류, 맥주효모 또는 젤라틴 등이 알려져 있으며, 특히 밀크 알레르겐의 주요성분으로서의 αs1카세인과, 훼이 알레르겐의 주요성분인 β락토글로불린과, 난백 알레르겐성분으로서는 오브알부민과 오보뮤코이드와, 밀 알레르겐의 주요성분으로서 글리아딘과, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질과, 땅콩의 주요단백질인 Ara h1가 알려져 있다.
종래, 알레르겐의 검출방법으로서는, 예를 들면, 알레르겐에 특이적으로 반응하는 면역글로불린을 정량(定量)하는 방법(일본국 특개평 05-249111호 공보 참조)이나, 항원항체복합체를 함유하는 검체 중의 상기 항원항체복합체를 산처리 등에 의해 해리시키고, 필요에 따라서 알칼리를 사용하여 중화처리를 실시한 후, 상기 검체 중의 알레르겐 특이적 IgE항체를 측정하는 방법(일본국 특개평 07-140144호 공보 참조) 등이 알려져 있다.
또, 현재, 밀크, 계란, 밀, 메밀, 땅콩의 특정원재료를 검출하기 위한 공정법(公定法)으로서, 가열·비가열 복합항원으로부터 얻어지는 폴리클로널항체를 사용한 면역학적인 검출방법(일본국 특개 2003-155297호 공보 참조; 이하「시판공정 법A」라고 한다), 또는 정제(精製)항원으로부터 얻어진 폴리클로널항체를 사용한 면역학적인 검출방법(이하「시판공정법B」라고 한다)이 이용되고 있다. 이들 방법은, 특이적으로 알레르겐을 검출하기 위하여 유효한 방법이기는 하지만 문제도 많다. 예를 들면, 상기 시판공정법A에서는 복합항원을 사용하고 있기 때문에, 무엇에 대한 항체인지가 불명확하고, 교차성이 높으며, 예를 들면, 면역글로불린법 등에 의한 항원의 동정(同定)이 불가능하고, 또 비특이반응이 증가할 가능성이 있다. 또, 상기 시판공정법B에서는, 항원이 정제되어 있기 때문에 항체의 특이성은 명확하지만, 미변성의 항원을 사용하여 제작된 항체를 사용하고 있기 때문에, 변성/미변성에 의해 항체가 결합하는 정도에 차이가 있기 때문에, 동일한 첨가량이라도 가열 전, 가열 후의 정량치가 다르다는 문제가 있었다. 특히, 밀은 다른 특정원재료(계란, 밀크, 메밀, 땅콩) 중에서도 과혹한 가열처리가 실시되는 경우가 많기 때문에(예를 들면, 빵, 튀김 등), 밀 알레르겐은 미변성에서부터 가열변성까지 광범위한 상태로 존재한다. 따라서, 밀 알레르겐을 검출하기 위해서는, 어떤 상태의 알레르겐에 대하여 결합하는지를 명확히 밝힌 모노클로널항체를 제작하고, 그 특성에 따라서 이용할 필요가 있다.
또한, 계란의 동정(同定), 정량(定量)에 관해서는, 오보뮤코이드를 지표로 하여 이미 폴리클로널항체를 사용한 방법(예를 들면, Int. Archs. Allergy appl. Immune., 75, 8-15, 1984 참조) 또는 모노클로널항체를 사용한 방법(예를 들면, Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999 참조)이 알려져 있다. 또, 오보뮤코이드를 인식하는 모노클로널항체로서, 미변성 오보뮤코이드와는 반응하나 열변성 오보 뮤코이드와는 반응하지 않는 모노클로널항체, 열변성 오보뮤코이드와는 반응하나 미변성 오보뮤코이드와는 반응하지 않는 모노클로널항체, 및 미변성 오보뮤코이드와 열변성 오보뮤코이드에 반응하는 모노클로널항체를 사용하여, 가열변성상태도 식별하여 오보뮤코이드를 정량하고, 계란 알레르겐의 동정(同定)과 정확한 정량을 가능하게 하는 면역학적 정량방법이 보고되고 있다(예를 들면, 일본국 특개 2002-253230호 공보 참조).
본 발명의 과제는, 밀크 알레르겐, 난백 알레르겐, 밀 알레르겐, 메밀 알레르겐, 또는 땅콩 알레르겐을 포함하는 식품에 있어서, 밀크 알레르겐, 난백 알레르겐, 밀 알레르겐, 메밀 알레르겐, 또는 땅콩 알레르겐을 변성/미변성의 어떤 상태에 있어도 검출할 수 있는 고감도의 면역학적인 검출방법 및 그것에 사용되는 검출키트 등을 제공하는 데에 있다.
본 발명자들은, 특정원재료인 밀크, 난백, 밀, 메밀 또는 땅콩의 각 알레르겐을 검출하는 방법에 대하여 예의검토하여, 미변성 및 변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐을 인식하는 각각 2종류 또는 그 이상의 모노클로널항체를 사용하면, 이들 특정원재료의 각 알레르겐을 검출할 수가 있다는 것을 발견하였다.
특정원재료 중의 하나인 밀크의 검출방법을 검토함에 있어서는, 카세인의 주요단백질인 αs1카세인을 지표로 하여, 이들에 대한 모노클로널항체(이하, MAb로 기재하는 경우가 있다)를 제작하고, 그 중에서 미변성 αs1카세인, 요소처리 αs1카세인, 미변성 카세인나트륨, 및 변성 카세인나트륨을 인식할 수가 있는 MAb를 복수선택하고, 샌드위치 ELISA에 의해 미변성 αs1카세인, 요소처리 αs1카세인, 미변성 카세인나트륨, 및 변성 카세인나트륨을 100~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 MAb의 조합을 발견하였다. 또, 이들 MAb를 사용하면, 식품 중의 밀크 알레르겐이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 사용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터의 밀크 알레르겐을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
또, 특정원재료의 하나인 밀크의 검출방법을 검토함에 있어서, 훼이의 주요단백질인 β락토글로불린을 지표로 하여, 이것에 대한 모노클로널항체를 제작하고, 그 중에서 미변성 β락토글로불린, 요소처리 β락토글로불린, 환원카르복시메틸화 β락토글로불린을 인식할 수가 있는 MAb를 복수선택하여, 샌드위치 ELISA에 의해 미변성 β락토글로불린, 요소처리 β락토글로불린, 환원카르복시메틸화 β락토글로불린을 30~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 MAb의 조합을 발견하였다. 또, 이들 MAb를 사용하는 경우, 식품 중의 밀크 알레르겐이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 이용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터 밀크 알레르겐을 검출할 수가 있다는 것을 확인하였다.
특정원재료의 하나인 난백의 검출방법을 검토함에 있어서는, 정제 오브알부민과 오보뮤코이드에 대한 모노클로널항체를 제작하고, 그 중에서 미변성항원에 결합할 수 있는 MAb와, 변성항원에 결합할 수 있는 MAb를 각각 복수 선택하여, 미변성 항원결합 MAb군과 변성 항원결합 MAb군을 조합시키는 것에 의해, 항원이 되는 오브알부민이나 오보뮤코이드를 변성/미변성의 어떤 상태에 있어도 고감도로 검출할 수 있다는 것을 발견하였으며, 특히 미변성 항원결합 MAb군과 변성 항원결합 MAb군을 조합하여 사용한 경우, 미변성 오브알부민이나 오보뮤코이드 또는 변성 오브알부민이나 오보뮤코이드만이 존재하는 경우라도, 미변성 항원결합 MAb(군) 단독사용이나 변성 항원결합 MAb(군)의 단독사용의 경우보다 우수한 검출감도로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 또, 난백 알레르겐인 오브알부민과 오보뮤코이드에 대한 MAb를 조합하는 것에 의해, 식품 중의 난백이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 사용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터 난백 알레르겐을 검출할 수가 있다는 것을 확인하였다.
특정원재료의 하나인 밀의 검출방법을 검토함에 있어서는, 정제 글리아딘에 대한 모노클로널항체를 제작하고, 그 중에서 미변성 밀 글리아딘, 환원카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70%에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 인식할 수가 있는 MAb를 복수 선택하여, 샌드위치 ELISA에 의해 미변성 밀 글리아딘, 환원카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70% 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 10~100ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있는 MAb의 조합을 발견하였다. 또, 이들 MAb를 이용하면, 식품 중의 밀 알레르겐이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 이용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터 밀 알레르겐을 검출할 수가 있다는 것을 확인하였다.
특정원재료의 하나인 메밀의 검출방법을 검토함에 있어서는, 정제한 24kDa 단백질, 또는 정제한 76kDa 단백질에 대한 모노클로널항체를 제작하고, 그 중에서 24kDa 단백질 또는 76kDa 단백질을 인식할 수가 있는 MAb를 복수 선택하여, 샌드위치 ELISA에 의해 미가열(미변성), 가열(변성)의 어떤 상태의 메밀단백질이라도, 고감도로 분석할 수 있는 미변성 메밀단백질에 결합가능한 MAb와, 변성 메밀단백질에 결합가능한 MAb의 조합을 발견하였다. 또, 이들 MAb를 사용하면, 식품 중의 메밀 알레르겐이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 이용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터의 메밀 알레르겐을 검출할 수가 있는 것을 확인하였다.
특정원재료의 하나인 땅콩의 검출방법을 검토함에 있어서는, 정제한 미변성의 Ara h1(이하,「NAh1」이라고 하는 경우가 있다), 또는 정제한 Ara h1을 요소와 ml2-메르캅토에탄올을 사용하여 변성한 Ara h1(이하,「DAh1」이라고 하는 경우가 있다)에 대한 모노클로널항체를 제작하고, 그 중에서 NAh1, DAh1, 미변성의 땅콩조단백질(이하,「NP-e」라고 하는 경우가 있다), 및/또는 요소처리한 땅콩조단백질(이하,「DP-e」라고 하는 경우가 있다)을 인식할 수가 있는 MAb를 복수 선택하여, 샌드위치 ELISA에 의해 미가열(미변성), 가열(변성)의 어떤 상태의 땅콩단백질이라도 고감도로 분석할 수 있는 MAb의 조합을 발견하였다. 또, 이들 MAb를 사용하면, 식품 중의 땅콩 알레르겐이 어떤 가공공정을 거친 경우에도, 본 발명에 의한 검출방법이나 검출키트의 이용자가 보다 간편하게 검사대상제품으로부터 땅콩 알레르겐을 검출할 수가 있다는 것을 확인하였다.
도 1은, 본 발명(밀크 알레르겐)의 2종류의 항αs1카세인 MAb를 사용한 각종 상태의 αs1카세인에 대한 샌드위치 ELISA의 결과를 나타내는 도면.
도 2는, 본 발명(밀크 알레르겐)의 Pas1CN1 및 Pas1CN2를 인식하는 밀 αs1카세인의 구성단백질의 차이를 나타내는 도면.
도 3은, 본 발명(밀크 알레르겐)의 PLG2와 PLG1의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 β락토글로불린에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 4는, 본 발명(밀크 알레르겐)의 PLG2와 PLG3의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 β락토글로불린에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 5는, 본 발명(밀크 알레르겐)의 MAb혼합계에서의 샌드위치 ELISA에 의한 미변성 락토글로불린에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 6은, 본 발명(밀크 알레르겐)의 MAb혼합계에서의 샌드위치 ELISA에 의한 요소변성 락토글로불린에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 7은, 본 발명(난백 알레르겐)의 시험1에 있어서의 각 단계희석에 대한 항오브알부민 MAb의 반응성을 나타내는 도면.
도 8은, 본 발명(난백 알레르겐)의 시험2에 있어서의 각 단계희석에 대한 항 오브알부민 MAb의 반응성을 나타내는 도면.
도 9는, 본 발명(난백 알레르겐)의 시험3에 있어서의 각 단계희석에 대한 항 오브알부민 MAb의 반응성을 나타내는 도면.
도 10은, 본 발명(난백 알레르겐)의 PNOM1 및 PNOM2의 샌드위치 ELISA에 의한 변성/미변성 오보뮤코이드에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 11은, 본 발명(난백 알레르겐)의 PDOM1 및 PDOM2의 샌드위치 ELISA에 의한 변성/미변성 오보뮤코이드에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 12는, 본 발명(난백 알레르겐)의 PNOM2와 PDOM2 및 PNOM1과 PDOM1에 의한 변성/미변성 오보뮤코이드에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 13은, 본 발명(밀 알레르겐)의 2종류의 항 글리아딘 MAb를 사용한 각종 상태의 글리아딘에 대한 샌드위치 ELISA의 결과를 나타내는 도면.
도 14는, 본 발명(밀 알레르겐)의 PGL1 및 PGL2를 인식하는 밀 글리아딘의 구성단백질의 차이를 나타내는 도면.
도 15는, 본 발명(메밀 알레르겐)의 PBW2 및 PBW3의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 메밀조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 16은, 본 발명(메밀 알레르겐)의 PBW1 및 PBW2의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 메밀조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 17은, 본 발명(메밀 알레르겐)의 PBW1, PBW2 및 PBW3의 MAb혼합계 샌드위치 ELISA에 의한 미변성 메밀조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 18은, 본 발명(메밀 알레르겐)의 PBW1, PBW2 및 PBW3의 MAb혼합계 샌드위치 ELISA에 의한 변성 메밀조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 19는, 본 발명(땅콩 알레르겐)의 PAh1-1 및 PAh1-2의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 땅콩조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 20은, 본 발명(땅콩 알레르겐)의 PAh1-2 및 PAh1-3의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 땅콩조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 21은, 본 발명(땅콩 알레르겐)의 PAh1-1, PAh1-2 및 PAh1-3의 MAb혼합계 샌드위치 ELISA에 의한 미변성 땅콩조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
도 22는, 본 발명(땅콩 알레르겐)의 PAh1-1, PAh1-2 및 PAh1-3의 MAb혼합계 샌드위치 ELISA에 의한 변성 땅콩조단백질에 대한 반응성을 나타내는 도면.
본 발명의 식품 중의 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 및 변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐을 인식하는 각각 2종류 또는 그 이상의 모노클로널항체를 사용하는 알레르겐의 검출방법으로서, αs1카세인의 주요단백질인 αs1카세인, 훼이의 주요단백질인 β락토글로불린, 난백의 주요 단백질인 오브알부민과 오보뮤코이드, 밀의 주요단백질인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 또는 땅콩의 주요단백질인 Ara h1을 지표로 하는 식품 등에 포함되는 알레르겐의 검출방법이라면 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 밀크 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 밀크 알레르겐의 면역학적인 검출방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 또, 본 발명의 밀크 알레르겐 검출용 키트로서는, 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 구비하고, 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 조건하에서 사용되는 면역학적인 알레르겐 검출용 키트라면 특별히 제한되지 않으나, 미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프(epitope)를 인식하는 2이상의 모노클로널항체를 구비한 것이 바람직하다. 이와 같은 미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 항 αs1카세인모노클로널항체나 항 β락토글로불린모노클로널항체를 구체적으로 예시할 수가 있다. 여기서 「밀크 알레르겐」이란, 밀크 카세인의 주요단백질인 αs1카세인 및/또는 훼이의 주요단백질인 β락토글로불린을 함유하는 것을 말한다.
상기 항 αs1카세인모노클로널항체로서는, 미변성 αs1카세인, 요소처리 αs1카세인, 미변성 카세인나트륨, 및 변성 카세인나트륨을 인식하는 항 αs1카세인모노클로널항체, 바람직하게는, 서열번호 1에서 나타내는 αs1카세인의 아미노산 서열의 132번째부터 193번째까지의 영역을 인식하는 모노클로널항체를 들 수가 있고, 구체적으로는, 하이브리도마(hybridoma)(FERM ABP-10263)가 산생하는 항 αs1카세인모노클로널항체 Pas1CN1, 하이브리도마(FERM ABP-10264)가 산생하는 αs1카세인모노클로널항체 Pas1CN2 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, Pas1CN1과 Pas1CN2를 조합시킴으로써, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 이들 항체를 사용함으로써, 샌드위치 ELISA에 의해 식품 중의 미변성 αs1카세인 및 요소처리 αs1카세인을 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
상기 항 β락토글로불린모노클로널항체로서, 미변성 β락토글로불린, 요소처리 β락토글로불린, 환원카르복시메틸화 β락토글로불린을 인식하는 항 β락토글로불린모노클로널항체를 들 수가 있으며, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10281)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG1, 하이브리도마(FERM ABP-10282)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG2, 하이브리도마(FERM ABP-10283)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG3 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, PLG2와 PLG1이나, PLG2와 PLG3이나, PLG2와 PLG1 및 PLG3을 조합시킴으로써, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 이들 항체를 사용함으로써, 샌드위치 ELISA에 의해 식품 중의 미변성 β락토글로불린 및 요소처리 β락토글로불린을 30~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
본 발명의 밀크 알레르겐의 검출방법에 있어서는, 검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 카세인 및/또는 훼이단백질을 추출하는 것이 바람직하고, 또, 미변성 카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체, 및 미변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 밀크 알레르겐 검출용 키트에 있어서는, 카세인 및/또는 훼이단백질을 추출하기 위한 요소와 2-메 르캅토에탄올을 포함하는 것이 바람직하고, 또, 미변성 카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체, 및 미변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명의 난백 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 난백 알레르겐의 면역학적인 검출방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 또, 본 발명의 난백 알레르겐 검출용 키트로서는, 미변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 구비하고, 미변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와 변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 조건하에서 사용되는 면역학적인 알레르겐 검출용 키트라면 특별히 제한되지 않으며, 미변성 난백 알레르겐 및/또는 변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 모노클로널항체를 구비한 것이 바람직하다. 이와 같은 미변성 난백 알레르겐 및/또는 변성 난백 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 항 오브알부민모노클로널항체나 항 오보뮤코이드모노클로널항체를 구체적으로 예시할 수가 있다. 여기서 「난백 알레르겐」이란, 난백의 주요단백질인 오브알부민 및/또는 오보뮤코이드를 함유하는 것을 말한다.
상기한 항 오브알부민모노클로널항체로서는, 미변성 오보알부민 및/또는 환 원카르복시메틸화 오브알부민을 인식하는 항 오브알부민모노클로널항체가 바람직하고, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10265)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PNOA1, 하이브리도마(FERM ABP-10266)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PNOA2, 하이브리도마(FERM ABP-10275)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PDOA1, 하이브리도마(FERM ABP-10276)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PDOA2 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, PNOA1과 PNOA2 등의 항 미변성 오브알부민모노클로널항체나, PDOA1과 PDOA2 등의 항 변성 오브알부민모노클로널항체의 조합, 특히 PNOA1과 PNOA2 등의 항 미변성 오브알부민모노클로널항체와 PDOA1과 PDOA2 등의 항 변성 오브알부민모노클로널항체를 조합함으로써 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 이들 항체를 사용함으로써, 샌드위치 ELISA에 의해 식품 중의 미변성 오브알부민 및/또는 변성 오브알부민을 1.0~10.0ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
상기 항 오보뮤코이드모노클로널항체로서, 미변성 오보뮤코이드 및/또는 요소변성 오보뮤코이드를 인식하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체를 들 수가 있으며, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10279)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PNOM1, 하이브리도마(FERM ABP-10280)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PNOM2, 하이브리도마(FERM ABP-10277)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PDOM1, 하이브리도마(FERM ABP-10278)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PDOM2 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, PNOM1과 PNOM2 등의 항 미 변성 오보뮤코이드모노클로널항체나, PDOM1과 PDOM2 등의 항 변성 오보뮤코이드모노클로널항체의 조합, 특히 PNOM1과 PNOM2 등의 항 미변성 오보뮤코이드모노클로널항체와 PDOM1과 PDOM2 등의 항 변성오보뮤코이드모노클로널항체를 조합시킴으로써, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 이들 항체를 사용함으로써, 샌드위치 ELISA에 의해 식품 중의 미변성 오보뮤코이드 및/또는 변성 오보뮤코이드를 10~100ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
본 발명의 난백 알레르겐의 검출방법에 있어서는, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 오브알부민 및/또는 오보뮤코이드를 추출하는 것이 바람직하고, 또, 미변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체, 및 미변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 난백 알레르겐 검출용 키트에 있어서는, 오브알부민 및/또는 오보뮤코이드를 추출하기 위한 요소와 2-메르캅토에탄올을 함유하는 것이 바람직하고, 또, 미변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체, 및 미변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명의 밀 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 밀 글리아딘 및 변성제 로 가용화(可溶化)시킨 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체를 사용하는 밀 알레르겐의 면역학적인 검출방법이나, 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 인식하고, 또한 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 밀 글리아딘모노클로널항체를 병용하는 밀 알레르겐의 면역학적인 검출방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 또, 본 발명의 밀 알레르겐검출용 키트로서는, 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트나, 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 밀 글리아딘모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트라면 특별히 제한되지 않으며, 상기 항 밀 글리아딘모노클로널항체로서는, 미변성 밀 글리아딘, 환원카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70% 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체가 바람직하고, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10267)가 산생하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체 PGL1, 하이브리도마(FERM ABP-10268)가 산생하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체 PGL2 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 이들 항체를 조합시킴으로써, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 샌드위치 ELISA에 의해 식품 중의 미변성 밀 글리아딘, 환원카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70% 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화시킨 밀 글리아딘을 10~100ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
본 발명의 메밀 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 사용하는 메밀 알레르겐의 면역학적인 검출방법이나, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 병용하는 메밀 알레르겐의 면역학적인 검출방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 또, 본 발명의 메밀 알레르겐검출용 키트로서는, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트나, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트라면 특별히 제한되지 않으며, 항 메밀조단백질 모노클로널항체로서는, 24Da단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체, 또는 76kDa단백질 및 미변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체가 바람직하고, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10272)가 산생하는 항 24kDa단백질 모노클로널항체 PBW1, 하이브리도마(FERM ABP-10273)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW2, 하이브리도마(FERM ABP-10274)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW3 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, PBW1 등의 24Da단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체와, PBW2 등의 76kDa단백질 및 미변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체와의 조합이나, PBW2와 PBW3 등의 미변성 메밀조단백질과 가열변성 메밀조단백질을 함께 인식 하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체와의 조합, 그 중에서도, 이들 모노클로널항체의 혼합계로서 조합시키는 것에 의해, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 샌드위치 ELISA에 의해, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
또한, 본 발명의 메밀 알레르겐의 검출방법에 있어서는, 검체로부터 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 가열변성 메밀조단백질을 추출하는 것이 바람직하고, 또, 본 발명의 메밀 알레르겐검출용 키트로서는, 검체로부터의 메밀조단백질 추출제로서의 요소와 2-메르캅토에탄올이 구비되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 땅콩 알레르겐의 검출방법으로서는, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체를 사용하는 땅콩 알레르겐의 면역학적인 검출방법이나, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 Ara h1단백질 모노클로널항체를 병용하는 땅콩 알레르겐의 면역학적인 검출방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 또, 본 발명의 땅콩 알레르겐검출용 키트로서는, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하는 항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트나, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체를 구비한 면역학적인 알레르겐검출용 키트라면 특별히 제한되지 않으며, 항 Ara h1단백질 모노클로널 항체로서는, 미변성 Ara h1단백질과 미변성 땅콩조단백질, 및/또는, 요소처리 Ara h1단백질과 요소처리 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체가 바람직하고, 구체적으로는, 하이브리도마(FERM ABP-10269)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-1, 하이브리도마(FERM ABP-10270)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-2, 하이브리도마(FERM ABP-10271)가 산생하는 항 가열변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-3 등을 적합하게 예시할 수가 있다. 또, PAh1-1 등의 미변성 Ara h1단백질과 미변성 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체와, PAh1-2 등의 미변성/변성 Ara h1단백질과 미변성/변성 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체와의 조합이나, PAh1-2와 PAh1-3 등의 미변성/변성 Ara h1단백질과 미변성/변성 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체끼리의 조합, 그 중에서도, 이들 모노클로널항체의 혼합계로서 조합시키는 것에 의해, 특히 유리하게 샌드위치 ELISA나 면역크로마토그래피를 실시할 수가 있다. 예를 들면, 샌드위치 ELISA에 의해, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수가 있다.
또한, 본 발명의 땅콩알레르겐의 검출방법에 있어서는, 검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 가열변성 땅콩조단백질을 추출하는 것이 바람직하고, 또, 본 발명의 땅콩 알레르겐검출용 키트로서는, 검체로부터의 가열변성 땅콩조단백질 추출제로서의 요소와 2-메르캅토에탄올이 구비되어 있는 것이 바람직하다.
이상의 본 발명의 면역학적인 알레르겐의 검출방법은, 미변성/변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐(이하,「식품 알레르겐」이라고 하는 경우가 있다)을 포함하는 시료를, 표지화한 항 식품 알레르겐 MAb와 접촉시키거나 또는 표지화한 항체의 존재하에 식품 알레르겐 MAb와 접촉시키고, 항원항체반응에 의해 표지화 면역복합체로서 포착하는 면역반응단계와, 생성한 상기 면역복합체를 그 분자 중에 존재하는 표지물질을 사용하여 분리·측정하는 검출단계로 이루어지며, 이와 같은 면역반응단계에 있어서의 항원항체반응의 방법도 특별히 제한되지 않는바, 예를 들면, 이하의 방법을 예시할 수가 있다.
불용성 담체에 결합한 본 발명의 항 식품 알레르겐 MAb에 시료 중의 식품 알레르겐을 포착시킨 후에 표지화 항 IgG항체를 반응시키는 샌드위치법이나, 불용성 담체에 결합한 항 식품 알레르겐 MAb와 각각 다른 에피토프를 인식하는 표지 항 식품 알레르겐 MAb(제2항체)를 사용하는 샌드위치 2항체법이나, 불용성 담체에 결합한 항 식품 알레르겐 MAb에 시료 중의 식품 알레르겐을 표지화 항원의 존재하에서 반응시키는 경합법이나, 식품 알레르겐을 함유하는 시료에 이들과 특이적으로 반응하는 자기(磁氣) 비즈결합 표지 항 식품 알레르겐 MAb를 작용시킨 후, 자력(磁力)에 의해 분리한 면역복합체 중의 표지물질을 검출하는 자기 비즈법이나, 식품 알레르겐을 함유하는 시료에 이들과 특이적으로 반응하는 표지 항 식품 알레르겐 MAb를 작용시켜서 응집침전시킨 후, 원심분리에 의해 분리한 면역복합체 중의 표지물질을 검출하는 응집침전법이나, 금 콜로이드 등으로 표지된 항 식품 알레르겐 MAb와 식품 알레르겐인 단백질이 결합한 항원항체복합체가 시험스트립상을 모세관현상 등에 의해 이동하는 도중에, 식품 알레르겐과 결합하는 항 식품 알레르겐 MAb를 미리 고정시켜 두고, 항원항체복합체를 보충시키는 것에 의해 나타나는 착색(着色)라인의 유·무에 의해 정성분석하는 면역크로마토그래피법 외에, 2중면역확산법, 방사면역확산법 등 공지의 면역측정법을 이용할 수가 있으나, 항 식품 알레르겐 MAb로서 각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 방법, 예를 들면, 식품 중의 미변성 알레르겐 및/또는 변성 알레르겐이 100~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 고감도라는 점에서 샌드위치 2항체법이, 정성적으로는 간편성이라는 점에서 면역크로마토그래피법이 바람직하다. 또, 식육제품 등의 식품시료 중으로부터 알레르겐을 추출하는 경우, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 항원항체반응에 있어서 사용되는 불용성 담체로서는, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 다당류 등의 고분자화합물, 그 외에, 유리, 금속, 자성입자 및 이들의 조합 등을 들 수가 있으며, 또, 불용성 담체의 형상으로서는, 예를 들면, 트레이 형상, 구형상, 섬유형상, 봉 형상, 판 형상, 용기형상, 셀, 마이크로플레이트, 시험관, 라텍스비즈형상 등의 여러가지의 형상으로 사용할 수가 있다. 또한, 이들 불용성 담체에로의 항원 또는 항체의 고정화 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 물리적 흡착법, 공유결합법(共有結合法), 이온결합법 등을 이용할 수가 있다.
본 발명의 식품 알레르겐의 검출방법이나 식품 알레르겐검출용 키트에 사용되는 항 식품 알레르겐 MAb의 면역 글로불린의 클래스 및 타입은 특별히 제한되지 않으나, 항 식품 알레르겐 MAb로서, IgG클래스, 타입 κ의 항체가 적합하게 사용된다. 또, 모노클로널항체의 형태로서는, 전(全)항체 또는 F(ab')2, Fab 등의 단편(조각)을 사용할 수도 있다. 항체의 유래는 특별히 한정되는 것은 아니나, 마우스(mouse), 쥐(rat), 인간, 토끼, 닭 등을 들 수가 있으나, 제작의 간편성때문에 마우스에서 유래하는 모노클로널항체가 적합하게 사용된다. 또, 항 식품 알레르겐 MAb는, 미변성 또는 변성의 αs1카세인으로 면역한 동물로부터 채취한 항체산생세포와 골수종세포와의 세포융합에 의해 조제되는 하이브리도마를 배지상에서 배양하거나, 또는 동물의 복강내에 투여하여 복수내에서 증식시킨 후, 상기 배양물 또는 복수로부터 채취하는 것에 의해 제조할 수가 있다.
항 식품 알레르겐 MAb산생 하이브리도마는, 예를 들면, 미변성 및/또는 변성의 식품 알레르겐을 사용하여 BALB/c마우스를 면역하고, 면역시킨 마우스의 항체산생세포와 마우스의 골수종세포를 통상적인 방법에 의해 세포융합시켜서, 면역형광염색패턴에 의해 스크리닝함으로써, 항 식품 알레르겐 MAb산생 하이브리도마를 제작할 수가 있다. 상기의 항체산생세포로서는, 예를 들면, 미변성 및/또는 변성의 식품 알레르겐 또는 이것을 함유하는 조성물을 투여하여 면역한 동물로부터 얻어지는 비장세포, 임파절 세포, B-임파구 등을 들 수가 있다. 면역하는 동물로서는 마우스, 쥐, 토끼, 소 등을 들 수가 있다. 면역은, 예를 들면, 미변성 및/또는 변성의 식품 알레르겐을 그대로, 또는 적당한 애쥬번트(보조제)와 함께 동물의 피하, 근육내 또는 복강 내에 1~2회/월, 1~6개월간 투여하여 실시된다. 항체산생세포의 분리는, 최종면역으로부터 2~4일 후에 면역동물로부터 채취하는 것에 의해 실시된다. 골수종세포로서는, 마우스, 쥐 유래의 것 등을 사용할 수가 있다. 항체산생세포와 골수종세포와는 동종동물의 유래인 것이 바람직하다.
세포융합은, 예를 들면, 둘베코 개변 이글배지(DMEM;Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등의 배지 중에서 항체산생세포와 골수종세포를 폴리에틸렌글리콜 등의 융합촉진제의 존재하에서 혼합하는 것에 의해 실시할 수가 있다. 세포융합 종료 후, DMEM 등으로 적당히 희석하고, 원심분리하여, 침전을 HAT배지 등의 선택배지에 현탁하여 배양하는 것에 의해 하이브리도마를 선택하고, 이어서, 배양상청을 사용하여 효소항체법에 의해 항체산생하이브리도마를 검색하고, 한계희석법 등에 의해 클로닝을 실시하여, 항 식품 알레르겐 MAb를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수가 있다. 또, αs1카세인 등의 미변성의 식품 알레르겐만을 사용하여 면역한 항 면역동물로부터, 유리하게 항 변성 식품 알레르겐 MAb를 얻을 수가 있는 경우도 있다. 이 경우, 항 변성 αs1카세인 MAb 등의 항 변성 식품 알레르겐 MAb산생 하이브리도마를 스크리닝하여도 좋고, 또는, 고체상태에서의 ELISA로 미변성의 αs1카세인 등의 미변성의 식품 알레르겐에 대한 모노클로널항체 산생 하이브리도마를 선택하고, 이 항체 산생 하이브리도마가 산생하는 모노클로널항체로부터 액상상태에서 미변성의 식품 알레르겐에 대해서만 특이적으로 반응하는 항 식품 알레르겐 MAb를 얻을 수가 있다. 상기와 같이, 항체산생 하이브리도마를 배지 중 또는 생체 내에서 배양하여 모노클로널항체를 배양물로부터 채취할 수가 있으나, 배양물 또는 복수로부터의 모노클로널항체의 분리·정제방법으로서는, 단백질의 정제에 일반적으로 사 용되는 방법이라면 어떤 방법이라도 좋고, 예를 들면, IgG정제(精製)에 통상적으로 사용되는 황산암모늄분획법, 음이온교환체 또는 프로테인A, G 등의 칼럼에 의한 크로마토그래피에 의해 실시할 수가 있다.
또, 표지화 항체제작에 사용되는 표지물질로서는, 단독으로, 또는 다른 물질과 반응하는 것에 의해 검출이 가능한 시그널을 불러올 수 있는 표지물질이라면 좋고, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 방사성물질, 금 콜로이드 등을 사용할 수가 있으며, 효소로서는 페록시다제, 알칼리포스파타제, β-D-갈락토시다제, 글루코스옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 알코올탈수소효소, 사과산탈수소효소, 페니실리나제, 카탈라제, 아포글루코스 옥시다제, 우레아제, 루시페라제 또는 아세틸콜린에스테라제 등을, 형광물질로서는, 플루오레스세인 이소티오시아네이트, 피코빌리단백, 희토류금속킬레이트, 단실클로라이드 또는 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 등을, 발광물질로서는, 루미놀류, 디옥세탄류, 아크리디늄염류 등을, 방사성물질로서는 3H, 14C, 125I 또는 131I 등을 예시할 수가 있다. 표지물질이 효소인 경우에는, 그 활성을 측정하기 위하여 기질, 필요에 따라 발색제, 형광제, 발광제 등을 사용할 수가 있다.
본 발명의 식품 알레르겐검출용 키트에는, 유효성분으로서의 항 식품 알레르겐 MAb, 바람직하게는 각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 항 식품 알레르겐 MAb를 함유하나, 이들은 보존안정성의 면에서 용액상태보다는 동결건조물로서 수용되어 있는 것이 바람직하고, 검출용키트에는 이와 같은 항 식품 알레르겐 MAb를 용 해하는 완충액이나 배양액 외에, 시료를 조제하기 위한 완충액 등을 함유하고 있어도 좋다. 또, 보다 바람직한 다른 형태의 본 발명의 항 식품 알레르겐검출용 키트로서는, 상기 면역크로마토그래피법에 있어서의 시험스트립을 들 수가 있다. 이 경우, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로널항체의 적어도 하나를, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노클로널항체로서는, 하이브리도마(FERM ABP-10263)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN1과, 하이브리도마(FERM ABP-10264)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN2와, 하이브리도마(FERM ABP-10281)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG1과, 하이브리도마(FERM ABP-10282)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG2와, 하이브리도마(FERM ABP-10283)가 산생하는 항 β락토글로불린모노클로널항체 PLG3과, 하이브리도마(FERM ABP-10265)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PNOA1과, 하이브리도마(FERM ABP-10266)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PNOA2와, 하이브리도마(FERM ABP-10275)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PDOA1과, 하이브리도마(FERM ABP-10276)가 산생하는 항 오브알부민모노클로널항체 PDOA2와, 하이브리도마(FERM ABP-10279)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PNOM1과, 하이브리도마(FERM ABP-10280)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PNOM2와, 하이브리도마(FERM ABP-10277)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PDOM1과, 하이브리도마(FERM ABP-10278)가 산생하는 항 오보뮤코이드모노클로널항체 PDOM2와, 하이브 리도마(FERM ABP-10267)가 산생하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체 PGL1과, 하이브리도마(FERM ABP-10268)가 산생하는 항 밀 글리아딘모노클로널항체 PGL2와, 하이브리도마(FERM ABP-10272)가 산생하는 항 24kDa단백질 모노클로널항체 PBW1과, 하이브리도마(FERM ABP-10273)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW2와, 하이브리도마(FERM ABP-10274)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW3과, 하이브리도마(FERM ABP-10269)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-1과, 하이브리도마(FERM ABP-10270)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-2와, 하이브리도마(FERM ABP-10271)가 산생하는 항 가열변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-3을 들 수가 있고, 이들 하이브리도마는, 2005년 2월 24일(수탁일)자로 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(305-5466, 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시1-1-1 추오 다이6)에 수령되어 있다. 또한, 상기 Pas1CN1(FERM P-20206), Pas1CN2(FERM P-20207), PNOA1(FERM P-20208), PNOA2(FERM P-20209), PGL1(FERM P-20210), PGL2(FERM P-20211)는 2004년 9월 7일(수령일)자로 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁되어 있던 것이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는바, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 항 αs1카세인 모노클로널항체의 확립
1-1 재료 및 방법
1) αs1카세인(이하「αCN」이라고 한다)의 조제
신선한 우유로부터 Zittle(1959)에 따라서, αCN의 조획분(粗劃分)을 얻었다. 이 조획분을 다시 TSK gel DEAE 650S(TOSOH)를 사용하여, 50mM의 이미다졸-HCl완충액(pH6.4), 4M의 요소를 포함하는 NaCl의 리니어 그라디엔트(0~0.3M)에 의해 정제를 실시하였다. 정제한 αCN획분을 증류수에 의해 투석한 후, 동결건조를 실시하였다. 생리식염수로 이 동결건조물의 0.1%용액을 조제하고, 1㎖용량의 에펜돌프튜브에 500㎕씩 분할주입하고, 면역에 사용될 때까지 -20℃에서 동결보관하여 항원용액으로 하였다.
2) 면역
공시동물(시험에 제공되는 동물)로서, 6주령(週齡)의 BALB/c마우스(일본국 쿠레아가부시키가이샤 제품) 5마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 αCN이 500㎕들어있는 에펜돌프튜브에 등량을 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시(시험제공)하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150㎕씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 3주간의 간격으로 2회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 αCN이 500㎕들어있는 에펜돌프튜브에 등량을 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150㎕씩 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가(價)의 측정
첫회 또는 추가면역에서 αCN을 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심 분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 αCN항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H+L)항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1% αCN용액 100μl을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45%폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아(牛胎兒)혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 αCN항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 αCN에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100μg/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, 미변성 αCN(이하「N-αCN」이라고 한다), 요소처리αCN(이하「D-αCN」이라고 한다), 시판의 카세인나트륨의 미변성물(이하「N-CN」이라고 한다) 또는 시판의 카세인나트륨의 요소처리물(이하「D-CN」이라고 한다)의 4종류의 단백질에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써 특이성이 다른 클론을 얻도록 하였다. D-αCN은, 정제 αCN을 1mg 칭량하고, 5% EDTA 100μl, 요소 6.0g, 2-메르캅토에탄올 0.2ml, 50mM 트리스-염산완충액(pH8.6) 1ml, 증류수 1.5ml을 첨가하여 알루미늄 호일로 뚜껑을 덮은 후, 100℃에서 1시간 오일배스에서 가 열, 변성처리를 실시하였다. 배양상청의 N-αCN, D-αCN, N-CN 또는 D-CN에 대한 반응성을 비경합법 ELISA로 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immuno α CNobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)를 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치(靜置)하였다. 그 후, 20mg/ml로 되도록 PBS로 치환하였다.
1-2 결과
1)MAb의 선택
밀크의 주요 알레르겐인 αs1카세인(αCN)을 특이적으로 인식하는 6종류의 MAb가 얻어졌다. 이들 6종류의 MAb에 있어서의, 각각 고상(固相)으로 한 각 항원 N-αCN, D-αCN, N-CN, 또는 D-CN에 대한 특이성을 다이렉트 ELISA에 의해 조사하였다. 또, 이들 MAb의 클래스, 서브클래스에 대해서도 조사하였다. 결과를 표1에 나타낸다. 표1 중, ＋는 각 고체상태의 항원에 대하여 양성인 것을, －는 음성인 것을 나타낸다. 표1에 나타내는 바와 같이, 모든 상태의 항원에 결합하는 MAb인 Pas1CN1, Pas1CN2, Pas1CN3을 선택하였다.
Figure 112006072459670-PCT00001
2) 샌드위치 ELISA에 있어서의 조합조건
다이렉트 ELISA로 선택한 Pas1CN1, Pas1CN2, Pas1CN3을 사용하여, 모든 MAb의 조합에 대하여 샌드위치 ELISA를 실시하였다. Pas1CN1, Pas1CN2, Pas1CN3을 각각 고체상태 또는 비오틴화 항체로 하여, αCN 또는 CN을 검출하기 위한 MAb의 조합을 샌드위치 ELISA에 의해 선출하였다. 그 결과, N-αCN, D-αCN, N-CN, D-CN을 검출할 수 있는 조합으로서 Pas1CN1(FERM ABP-10263)과 Pas1CN2(FERM ABP-10264)를 선택하였다. 결과를 도1에 나타낸다.
2. Pas1CN1과 Pas1CN2를 인식하는 에피토프
αs1카세인용액을 리실엔드프로테아제로 분해하고, 분해물을 트리신 SDS-PAGE(분리겔 16.5%, 농축겔 5%)에 의해 분리하였다. 분리한 겔을 사용하여 일렉트로블로팅에 의해 PVDF막에 전사하였다. 전사한 PVDF막에 Pas1CN1과 Pas1CN2의 배양상청(1/1000)을 반응시킨 후, 발색시켜서 인식하는 에피토프를 확인하였다. 결과를 도2에 나타낸다. 그 결과, 인식부위는 Pas1CN1과 Pas1CN2 모두, 분자량 약 7000, 서열번호 1로 나타내는 αs1카세인의 아미노산 서열의 132번째부터 193번째까지의 영역을 인식하였다.
3. 샌드위치 ELISA에 의한 식품 중의 변성 및 미변성카세인의 검출
상기 1.에서 선택된 Pas1CN1과 Pas1CN2의 조합에 의해, 실제의 식품 중의 카세인을 검출할 수 있는지를 시험하였다.
3-1 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 제작
정량시험을 위한 모델식품으로서 식육제품을 선택하고, 표2에 나타내는 배합으로 각 농도의 카세인나트륨을 포함하는 모델식육제품을 제작하였다. 돼지 정육은, 돼지로스로부터 지방, 힘줄을 제거하고, 5mm로 잘게 간 만육(挽肉)을 사용하였다.
Figure 112006072459670-PCT00002
각 배합에 따라 첨가물을 계량하고, 푸드프로세서로 혼합한 후, 염화비닐튜브에 충전하고, 75℃에서 30분간 가열하였다.
2) 샌드위치 ELISA에 의한 정량분석
각 모델식육제품을, 푸드프로세서로 균일해 질때까지 마쇄(磨碎)하여, 분석용 샘플로 하였다. 샘플 2g을 채취하여 1M의 요소 및 0.1%의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 PBST 38g을 첨가하여 100℃, 1시간 가열처리하였다. 냉각 후, 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청 0.5ml에 PBST를 9.5ml첨가하여, ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 요소·2-메르캅토에탄올처리를 실시한 카세인나트륨의 단계희석을 사용하였다. 또, 분석용 샘플로부터 PBST를 사용하여 추출하고, PBST(PBS에 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트를 0.5% 첨가한 것)에 용해한 카세인나트륨을 검량선으로 한 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용하지 않는 경우와의 비교를 실시하였다.
3-2 결과
샌드위치 ELISA에 의한 모델식육제품 중의 카세인나트륨의 분석에 대하여, 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용한 결과를 표3에, 또, PBST만으로 추출한 결과를 표4에 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00003
Figure 112006072459670-PCT00004
이상의 결과로부터, 요소 및 2-메르캅토에탄올을 추출액에 첨가한 경우에, 높은 회수율로 모델식육제품 중의 카세인나트륨의 검출이 가능하고, PBST추출에서는 상당히 낮은 회수율이 되었다. 이들 결과로부터, 식품으로부터의 카세인나트륨을 추출하기 위해서는, 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용하는 것이 유효하며, 이 경우에 이용하는 MAb의 특성에는, 요소가용화 카세인에 결합가능한 것이 필요하다는 것이 명확해졌다.
4. 면역크로마토그래피에 의한 변성 및 미변성 카세인나트륨의 검출
4-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드지표 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM붕산 완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 Pas1CN1의 MAb용액을 조제하였다. 미리 0.2M탄산 칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb용액을 500μl첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10%BSA용액을 625μl첨가하고, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여, 1% BSA용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다. 글라스울제의 콘쥬게이트패드에 68μl/㎠로 되도록 도포하고 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 Pas1CN2의 MAb용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 1%BSA, 0.1% Tween20을 포함하는 PBS에서 37℃, 2시간 블로킹한 후, PBS로 세정하여 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화 멘브렌, 흡수패드를 각각 부착시켜서 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 상기 조제한 모델식육제품을 적당히 희석하여 사용하였다.
4-2 결과
Pas1CN2 및 금 콜로이드표지 Pas1CN1의 조합에 의해 카세인나트륨은 가열, 비가열과는 상관없이 50ppb(식품중 2ppm)까지 검출할 수가 있었다. 이 결과로부터, 제조공정중에 혼입한 미변성 카세인나트륨이 대상이 되어도, 가열 후의 제품이 대상이 되어도, 어떤 경우에도 대응할 수 있는 면역 크로마토스트립의 설계가 가능해졌다.
시판의 알레르겐검출용 면역크로마토스트립에서는, 블랭크로서 0.01M의 요소만을 포함하는 PBS를 적하한 결과, 비특이적인 밴드가 발생해 버려서, 의사양성(擬似陽性)으로 돼 버렸다. 이것으로는, 가열 등에 의해 변성된 식품단백 중에서 효율적으로 알레르겐을 추출하기 위한 단백질 변성제를 사용할 수가 없기 때문에, 알레르겐으로서 검출할 수 있는 대상이 극히 좁은 범위로 한정되어 버릴 위험성이 고려되었다.
5. 항 β락토글로불린 모노클로널항체의 확립
5-1 재료 및 방법
1) β락토글로불린(이하「βLG」라고 하는 경우가 있다)의 조제
신선한 우유로부터 Zittle(1959)에 따라, 훼이의 조획분을 얻었다. 이 조획분을 다시 TSK gel DEAE 650S(TOSOH)를 사용하여, 50mM의 트리스-HCl완충액(pH6.5), NaCl의 리니어 그라디엔트(0~0.4M)에 의해 정제를 실시하였다. 정제한 βLG획분을 증류수에 의해 투석한 후, 동결건조를 실시하고, 미변성 βLG(이하「N-βLG」라고 하는 경우가 있다)로 하였다. 상기 N-βLG를 10mg 칭량하고, 1.4M의 트리스-HCl완충액(pH8.6) 1ml, 5%의 EDTA 100μl, 요소 1.2g, 2-메르캅토에탄올 33μl을 첨가하여 2.5ml로 정용(定容)한 후, 질소가스 치환을 실시하고, 37℃, 1시간의 환원처리를 실시하고, 다시 1M의 NaOH 300μl에 용해한 89mg의 모노요드아세트산을 첨가하여 질소가스치환한 후, 실온에서 1시간의 카르복시메틸화를 실시하고, 환원카르복시메틸화 βLG(이하「R-βLG」라고 하는 경우가 있다)로 하였다. 생리식염수로 이들 동결건조물의 0.1%용액을 조제하고, 1ml들이 에펜돌프튜브에 500μl씩 분주하고, 면역에 사용될 때까지 -20℃에서 동결보관하여 항원용액으로 하였다.
2) 면역
공시동물로서, 5주령의 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 5마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 N-βLG 또는 R-βLG가 500㎕ 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150㎕씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 2주간의 간격으로 3회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 N-βLG 또는 R-βLG가 500㎕들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150㎕씩 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역으로 N-βLG 또는 R-βLG를 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 N-βLG항체가(抗體價) 및 항 R-βLG항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H+L)항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 N-βLG용액 또는 R-βLG용액 100μl을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사로부터 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45%폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 N-βLG항체 또는 항 R-βLG항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 N-βLG 또는 R-βLG에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100μg/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, N-βLG, R-βLG 및 요소처리 βLG(이하「D-βLG」이라고 한다)의 3종류의 단백질에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써 특이성이 다른 클론을 얻도록 하였다. D-βLG는, N-βLG를 1mg 칭량하고, 6.0g의 요소, 0.2ml의 2-메르캅토에탄올, 1ml의 50mM 트리스-염산완충액(pH8.6), 1.5ml의 증류수를 첨가하여, 알루미늄 호일로 뚜껑을 덮은 후, 100℃에서 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리하였다. 배양상청의 N-βLG, R-βLG 또는 D-βLG에 대한 반응성을 비경합법 ELISA로 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
항 N-βLGMAb 또는 항 R-βLGMAb의 특성을 결정하기 위하여, 고상법(固相法)을 사용하였다. 고상법으로서, N-βLG, R-βLG 또는 D-βLG를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 고정화된 항원에 항 N-βLGMAb 또는 항 R-βLGMAb를 작용시키는 방법을 사용하였다. MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immuno α CNobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)를 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치(靜置)하였다. 그 후, 20mg/ml로 되도록 PBS로 치환하였다.
5-2 결과
1) 항 N-βLGMAb와 항 R-βLGMAb의 특성과 클래스, 서브클래스
N-βLG에 대한 특이성을 갖는 MAb 13종류를 얻었다. 각각 고상의 항원에 대한 특이성을 표5에 나타내었다.
Figure 112006072459670-PCT00005
2) 샌드위치 ELISA에 있어서의 조합조건
고상의 항원에 대하여 양성반응을 나타낸 각 MAb를 각각 고상 또는 비오틴화 항체로서 N-βLG 및 D-βLG를 검출하기 위한 MAb의 조합을, 샌드위치 ELISA에 있어서의 검출감도의 점에서 선출하였다. 그 결과, N-βLG 및 D-βLG를 검출할 수 있는 조합으로서, 플레이트고정화 항체 PLG2(FERM ABP-10282)와, 비오틴화 항체 PLG1(FERM ABP-10281) 또는 PLG3(FERM ABP-10283)를 선택하였다. PLG2와 PLG1의 샌드위치 ELISA에 의한 N-βLG 및 D-βLG에 대한 반응성의 결과를 도3에 나타낸다. 또, PLG2와 PLG3의 샌드위치 ELISA에 의한 N-βLG 및 D-βLG에 대한 반응성도 도4에 나타낸다.
3) MAb혼합계에서의 N-βLG, D-βLG의 검출
샌드위치 ELISA에 의해 선택한 조합(고상에 PLG2, 비오틴화에 PLG1 및 PLG3)을 사용하여, N-βLG와 D-βLG의 검출감도를 확인한 결과, 도5 및 도6에 나타내는 바와 같이, MAb혼합계에서 N-βLG, D-βLG가 모두 MAb혼합계의 쪽이 흡광치는 높고, 검출감도를 향상시키는 것이 가능하다는 것이 명확해졌다.
6. 샌드위치 ELISA에 의한 식품중의 훼이단백질의 검출
상기 1.에서 선택된 PLG2와 PLG1, 및 PLG2와 PLG3의 조합에 의해, 실제의 식품중의 훼이단백질을 검출할 수 있는지를 시험하였다.
6-1 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 제작
정량시험을 위한 모델식품으로서 식육제품을 선택하고, 표6에 나타내는 배합으로 각 농도의 훼이단백질을 포함하는 모델식육제품을 제작하였다. 돼지 정육은, 돼지로스로부터 지방, 힘줄을 제거하고, 5mm로 잘게 간 만육을 사용하였다. 각 배합에 따라 첨가물을 계량하여 푸드프로세서로 혼합한 후, 염화비닐튜브에 충전하고, 75℃에서 30분간의 가열을 실시하였다.
Figure 112006072459670-PCT00006
2) 샌드위치 ELISA에 의한 정량분석
각 모델식육제품을, 푸드프로세서로 균일해 질때까지 마쇄(磨碎)하고, 분석용 샘플로 하였다. 샘플 1g을 칭량 채취하여 10M의 요소 및 0.1%의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 PBST(PBS에 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트를 0.5% 첨가한 것) 19g을 첨가하고, 호모지나이저로 30초 교반하였다. 그 후, 100℃에서 1시간 가열처리를 실시하였다. 냉각 후, 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청 0.5ml에 PBST 9.5ml을 첨가하여, ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 10M 요소 및 0.1%의 2-메르캅토에탄올처리를 실시한 훼이단백질의 단계희석을 사용하였다. 또, 분석용 샘플로부터 PBST를 사용하여 추출하고, PBST에 용해한 훼이단백질을 검량선으로 한 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용하지 않는 경우와의 비교를 실시하였다.
6-2 결과
샌드위치 ELISA에 의한 모델식육제품중의 훼이단백질의 분석에 대하여, 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용하여 추출한 모델식육제품중의 훼이단백질의 분석결과를 표7에, PBST만으로 추출한 모델식육제품중의 훼이단백질의 분석결과를 표8에 각각 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00007
Figure 112006072459670-PCT00008
이상의 결과로부터, 요소 및 2-메르캅토에탄올을 추출액에 첨가한 경우에, 높은 회수율로 모델식육제품중의 훼이단백질의 검출이 가능했으나, PBST추출에서는 검출할 수가 없었다. 이들 결과로부터, 식품중으로부터의 훼이단백질의 추출에는 요소 및 2-메르캅토에탄올을 사용하는 것이 유효하며, 그 경우에 이용하는 MAb의 특성에는, 요소로 변성시킨 βLG에 결합가능한 것이 필요하다는 것이 명백해졌다.
7. 면역크로마토그래피에 의한 변성 및 미변성 카세인나트륨의 검출
7-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml로 되도록 PLG1 및 PLG3의 MAb용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb용액을 500μl첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10%BSA용액 625μl을 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하고, 1% BSA용액으로 OD525=2.0이 되도록 조제하고, 1:1의 비율로 혼합하였다. 글라스울로 제작된 콘쥬게이트패드에 68μl/㎠로 되도록 도포하여, 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 PLG2의 MAb용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1% BSA를 포함하는 10mM의 인산버퍼(pH7.5)로 37℃에서 1시간 블로킹한 후, 10mM의 인산버퍼(pH7.5)로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌, 흡수패드를 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 상기 2.에서 조제한 모델식육제품을 적당히 희석하여 사용하였다.
7-2 결과
멘브렌도포 MAb인 PLG2, 및 금 콜로이드표지 MAb인 PLG1＋PLG3의 조합에 의해, 훼이단백질은 가열, 비가열에 상관없이 50ppb(식품중 2ppm)까지 검출할 수가 있었다. 이 결과로부터, 제조공정중에 혼입한 훼이단백질이 대상이 되어도, 가열 후의 제품이 대상이 되어도, 어떤 경우에도 대응할 수 있는 면역크로마토스트립의 설계가 가능해졌다.
시판의 알레르겐검출용 면역크로마토스트립에서는, 블랭크로서 0.1M의 요소, 0.2%의 2-ME를 포함하는 PBS를 적하한 결과, 비특이적인 밴드가 발생해 버려서, 의사양성으로 돼 버렸다. 이것으로는, 가열 등에 의해 변성된 식품단백 중에서 효율적으로 알레르겐을 추출하기 위한 단백질 변성제를 사용할 수가 없기 때문에, 알레르겐으로서 검출할 수 있는 대상이 극히 좁은 범위로 한정되어 버릴 위험성을 생각할 수 있었다.
실시예 2
1. 변성/미변성 오브알부민에 결합가능한 MAb의 확립
1-1 재료 및 방법
1) 닭 오브알부민(이하「OA」라고 하는 경우가 있다)의 조제
신선한 계란으로부터 난백만을 채취하고, 거품이 일지 않도록 균질화 시킨 후, 등량의 포화황산 암모늄을 첨가하여, 여과용지 No.1(아도반테크 토요사 제)로 여과하였다. 그리고, 얻어진 여과액에 0.5M의 황산을 첨가하여 pH4.6으로 조정한 후, 하룻밤 방치하였다. 8,000rpm×20분의 원심분리에 의해 얻어진 침전을 증류수로 용해하고, 동일한 방법으로 재결정화하여 조OA획분을 얻었다. 조OA는 다시, TSK gel DEAE 650S(Tosoh)를 사용한 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이동상(移動相)으로는 50mM의 이미다졸 염산완충액(pH6.4)을 사용하고, NaCl의 0부터 0.3M의 리니어그라디엔트에 의해 OA를 분획하고, 투석에 의한 탈염 후, 동결건조를 실시하였다. 이 동결건조 OA를 사용하여 생리식염수로 0.1%의 OA용액을 제작하고, 1ml들이 에펜돌프튜브에 500μl씩 분주하여 항원용액으로 하고, 면역에 사용될 때까지 -20℃에서 동결보관하였다.
2) 면역
공시동물로서, 6주령의 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 4마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 OA가 500㎕ 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150㎕씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 3주간의 간격으로 2회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 OA가 500μl들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다. 또한, 항변성 OAMAb를 얻는 경우, 최종 면역에만 후술하는 환원카르복시메틸화OA를 사용하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역에서 OA를 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 OA항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H＋L)항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 OA용액 100μl을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사로부터 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분간의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45%폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 OA항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 OA에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100g/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, 미변성 OA(이하「NOA」이라고 하는 경우가 있다) 또는 환원카르복시메틸화 OA(이하「RCMOA」이라고 하는 경우가 있다)에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써 특이성이 다른 클론을 얻도록 하였다. RCMOA는, 정제OA(상기 동결건조물)를 10mg 칭량하고, 1.4M트리스-염산완충액(pH8.6) 1ml, 5%의 EDTA 100μl, 1.2g의 요소, 33μl의 2-메르캅토에탄올을 첨가하여 2.5ml로 용해한 후, 질소가스치환을 실시하고, 37℃, 1시간의 환원처리를 실시하였다. 또한, 1M의 NaOH 300μl에 용해한 89mg의 모노요드아세트산을 첨가하여 질소가스치환한 후, 실온에서 1시간의 카르복시메틸화를 실시하여, RCMOA로 하였다. 배양상청의 NOA 또는 RCMOA에 대한 반응성을 비경합법 ELISA에 의해 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 특성과 MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
항 OAMAb의 특성을 결정하기 위하여, 고상법(固相法)과 액상법(液相法)을 사용하였다. 고상법으로서, NOA 또는 RCMOA를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 고정화된 항원(NOA 또는 RCMOA)에 항 미변성/변성 OAMAb를 작용시키는 방법을 사용하고, 또, 액상법으로서, 토끼 항 OA폴리클로널항체를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 폴리클로널항체에 NOA 또는 RCMOA를 결합시킨 상태로, 항 미변성/변성 OAMAb를 작용시키는 방법을 사용하였다. 또, MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)을 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치(靜置)하였다. 그 후, 20mg/ml로 되도록 PBS로 치환하였다.
1-2 결과
1) 항 OAMAb의 특성과 클래스, 서브클래스
NOA에 대한 특이성을 갖는 MAb 9종류 및 RCMOA에 대한 특이성을 갖는 MAb 10종류를 얻었다. 각각 액상 또는 고상의 항원에 대한 특이성을 표9에 나타내었다.
Figure 112006072459670-PCT00009
2) 조합조건
NOA를 검출하기 위한 MAb 또는 RCMOA를 검출하기 위한 MAb의 조합은, 샌드위치 ELISA에 있어서의 검출감도의 점에서 선출하였다. 그 결과, NOA에서는, 301B5와 316G1이나 304E4(PNOA1;FERM ABP-10265)와 306B2(PNOA2;FERM ABP-10266), RCMOA에서는 117F9와 119D11이나 948G11(PDOA1;FERM ABP-10275)와 962B8(PDOA2;FERM ABP-10276)을 높은 조합으로서 선택하였다.
이하의 실시예를, 301B5와 316G1/117F9와 119D11로부터, 304E4와 306B2/948G11과 962B8로 고쳐 쓰는 편이 좋겠습니까?
2. 샌드위치 ELISA에 의한 변성 및 미변성 항원의 검출
2-1 재료 및 방법
NOA용액은, 정제OA를 PBS로 100ppb용액이 되도록 조제하고, 3배의 단계희석을 제작하였다(단계희석A). 한편, 유리시험관에 정제OA를 1mg칭량하고, 6g의 요소, 0.2ml의 2-메르캅토에탄올, 1ml의 50mM 트리스-염산완충액(pH8.6), 1.5ml의 증류수를 첨가하고, 알루미늄호일로 뚜껑을 덮은 후, 100℃로 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리를 실시하였다. 냉각 후, 100ml들이 메스플라스크로 옮기고, PBS에서 100ml로 메스업하였다. 이것을 다시 PBS에서 100배 희석하고, 요소변성 OA(이하「UDOA」라고 한다) 100ppb용액으로 하였다. 또, 요소농도를 0.01M으로 유지하면서 3배의 단계희석을 제작하였다(단계희석B). 또, NOA 100ppb용액과 UDOA 100ppb용액을 등량씩 혼합하여(NOA 및 UDOA는 각 50ppb용액이 된다), 요소농도를 0.005M으로 유지하면서 3배의 단계희석을 제작하였다(단계희석C). 또, 샌드위치 ELISA에 공시한 조건을 표10에 나타낸다. 코팅 MAb농도는 단독의 경우는 25μg/ml로, 또 혼합한 경우에는 각 12.5μg/ml로 하여, 합계 25μg/ml이 되도록 하였다.
Figure 112006072459670-PCT00010
2-2 결과
도7에 나타내는 바와 같이, 미변성 OA를 대상으로 한 (시험1)에서는, 301B5 단독과, 301B5와 119D11의 혼합의 곡선은 거의 겹쳐졌지만, 10ppb 이하의 보다 희박한 상태에 있어서 301B5 단독보다도 301B5와 119D11의 혼합의 곡선에서는 약간 혼합한 쪽이 흡광치(吸光値)가 높고, 검출감도가 높아질 가능성이 보였다. 또, 변성 OA를 대상으로 한 (시험2)의 UDOA에서는, 301B5단독에서는 흡광치가 인정되지 않아서, 301B5 및 316G1은 UDOA에 관여하지 않는 것으로 생각되었으나, 119D11 단독과 301B5와 119D11의 혼합의 곡선에서는 명백히 혼합의 쪽이 흡광치가 높아서, MAb를 혼합하는 것에 의해 검출감도를 높일 수가 있는 것으로 생각되었다(도8). 이것은, 미변성/변성OA를 대상으로 한 (시험3)에서도 인정되고, 301B5 단독보다도 301B5와 119D11의 혼합의 쪽이 명백히 흡광치가 높았다(도9). 시험1~3의 어떤 경우도, 단독으로 코팅된 항체농도는 25g/ml이고, 혼합에서는 각각 절반의 농도인 12.5mg/ml인 것으로부터, MAb의 종류를 늘리는 혼합계를 사용함으로써, 항체농도가 동일하거나 또는 적어도, 항원의 검출감도를 보다 향상시킬 수가 있다는 것이 명백해졌다.
3. 면역 크로마토그래피에 의한 변성 및 미변성 OA의 검출
3-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM의 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 119D11 및 316G1의 MAb 단독 또는 혼합용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl첨가하고, 실온에서 30분간 반응한 후, 10%의 BSA용액 625μl을 첨가하고, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여, 1%의 BSA용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다. 글라스울로 제작된 콘쥬게이트패드(일본 미리포아사 제품)에 68μl/㎠로 되도록 도포하여 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 117F9 및 301B5의 MAb 단독 또는 혼합용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1% BSA, 0.1%의 Tween20을 포함하는 PBS에서 37℃, 2시간 블로킹한 후, PBS로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌에 추가하여, 피검액 스폿용의 글라스울로 제작된 샘플패드, 피검액 흡수용의 글라스울로 제작된 흡수패드를 별도로 준비하고, 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화 멘브렌, 흡수패드의 순서로 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 상기 2.에서 조제한 NOA 및 UDOA를 적당히 희석하여 사용하였다.
3-2 결과
301B5 및 금 콜로이드표지 316G1의 조합에 의해 NOA는 10ppb까지 검출할 수가 있었으나, UDOA는 1ppm에서도 검출할 수가 없었다. 한편, 117F9 및 금 콜로이드표지 119D11의 조합에 의해, UDOA는 10ppb까지 검출할 수가 있었으나, NOA는 1ppm에서도 검출할 수가 없었다. 이에 대하여, 301B5 및 117F9의 고정화항체혼합물, 및 316G1 및 119D11의 금 콜로이드 항체혼합물을 사용한 면역크로마토스트립을 제작할 경우, 변성 OA 또는 미변성 OA를 10ppb까지 검출할 수가 있었다. 이와 같이 변성 OA에 결합가능한 MAb와 미변성 OA에 결합가능한 MAb를 조합하는 것에 의해, 제조공정중에 혼입한 미변성 난백이 대상으로 되어도, 가열 후의 제품이 대상이 되어도, 어떤 경우에서도 대응할 수 있는 면역크로마토스트립의 설계가 가능해졌다.
시판의 계란 알레르겐검출용 면역크로마토스트립에서는, 블랭크로서 0.01M의 요소만을 포함하는 PBS를 적하한 결과, 비특이적인 밴드가 발생되어, 의사양성으로 돼 버렸다. 이와 같은 경우는, 난백 알레르겐검사에 있어서, 열 등에 의해 불용화한 난백 알레르겐을 추출하기 위한 단백질 변성제인 요소를 사용할 수가 없기 때문에, 알레르겐으로서 검출할 수 있는 대상이 극히 좁은 범위로 한정되어 버릴 위험성이 고려되었다.
4. 변성/미변성 오보뮤코이드에 결합가능한 MAb의 확립
4-1 재료 및 방법
1) 닭 오보뮤코이드(이하「OM」라고 한다)의 조제
신선한 계란으로부터 난백만을 채취하고, 거품이 일지 않도록 균질화 시킨 후, 등량의 0.1M의 아세트산완충액(pH3.8)과 혼합하였다. 다시, 0.1M의 아세트산완충액에 대하여 투석한 후, 8,000rpm×20분간 원심하고, 상청을 회수하였다. 또, TSK gel DEAE 650S(Tosoh)를 사용한 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이동상으로는 50mM의 이미다졸 염산완충액(pH6.4)을 사용하고, NaCl의 0부터 0.3M의 리니어그라디엔트에 의해 OM을 분획하고, 투석에 의한 탈염 후, 동결건조를 실시하여 이것을 미변성 OM(이하「NOM」이라고 하는 경우가 있다)으로 하였다. 이 정제 OM 1mg을 칭량하고, 6g의 요소, 0.2ml의 2-메르캅토에탄올, 1ml의 50mM 트리스-염산완충액(pH8.6), 1.5ml의 증류수를 첨가하고, 알루미늄호일로 뚜껑을 덮은 후, 100℃로 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리를 실시하여 요소변성 OM(이하「DOM」이라고 하는 경우가 있다)으로 하였다. 생리식염수로 이들 동결건조물의 0.1%용액을 조제하고, 1ml들이 에펜돌프튜브에 500μl씩 분주하여 항원용액으로 하고, 면역에 사용될 때까지 -20℃에서 동결보관하였다.
2) 면역
공시동물로서, 각각 6주령의 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 4마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 NOM 또는 DOM이 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 3주간의 간격으로 2회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 NOM 또는 DOM이 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역에서 NOM 또는 DOM을 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 OM항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H＋L) 항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 NOM용액 또는 DOM용액 100ml을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사로부터 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45%폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 NOM항체 또는 항 DOM항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 NOM 또는 DOM에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100g/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
7) MAb의 특성과 MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
항 NOMMAb 및 DOMMAb의 특성을 결정하기 위하여, 고상법(固相法)과 액상법(液相法)을 사용하였다. 고상법으로서, NOM 또는 DOM을 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 고정화된 NOM 또는 DOM에 MAb를 작용시키는 방법을 사용하고, 또, 액상법으로서, 토끼 항 오보뮤코이드 폴리클로널항체를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 폴리클로널항체에 NOM 또는 DOM을 결합시킨 상태로, MAb를 작용시키는 방법을 사용하였다. 또, MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)을 결정하였다.
8) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10ml첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치(靜置)하였다. 그 후, 20mg/ml로 되도록 PBS로 치환하였다.
4-2 결과
1) 항 NOMMAb 및 항 DOMMAb의 특성과 클래스, 서브클래스
NOM에 대한 특이성을 갖는 MAb 7종류, DOM에 대한 특이성을 갖는 MAb 10종류를 얻었다. 각각 액상 또는 고상의 항원에 대한 특이성을 표11에 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00011
2) 조합조건
NOM을 검출하기 위한 MAb의 조합은, 샌드위치 ELISA에 있어서의 검출감도의 점에서 선출하였다. 그 결과, 47E5(PNOM1;FERM ABP-10279)와 50A12(PNOM2;FERM ABP-10280)를 높은 조합으로서 선택하였다. 또, 상기 10개의 모노클로널항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 실시하고, 가장 감도가 높은 628E1(PDOM1;FERM ABP-10277)과 648A9(PDOM2;FERM ABP-10278)를 높은 조합으로서 선택하였다.
3) 샌드위치 ELISA에 의한 각 모노클로널항체와 OM의 반응성
PNOM1 및 PNOM2의 샌드위치 ELISA에서는, 미변성 오보뮤코이드는 검출할 수 있었으나, 변성 오보뮤코이드는 전혀 검출할 수가 없었다(도10). 또, PDOM1 및 PNOM2의 샌드위치 ELISA에서는, 변성 OM을 검출할 수 있었으나, 미변성OM에서는 10~100ppb의 사이에서, 감도가 낮았다(도11). 그러나, 플레이트항체로서 PNOM2 및 PDOM2를 사용하고, 비오틴항체로서 PNOM1 및 PDOM1을 사용하는 각 모노클로널항체를 조합한 샌드위치 ELISA에서는, 특히 미변성OM의 10~100ppb에서 검출감도의 향상이 인정되었다(도12).
5. 면역크로마토그래피에 의한 OM을 지표로 한 난백의 검출
5-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM의 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 PNOM1의 MAb용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb용액을 500μl첨가하여, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10% BSA용액을 625μl를 첨가하여, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다. 글라스울로 제작된 콘쥬게이트패드(일본 미리포아사 제품)에 68μl/㎠이 되도록 도포하여 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 PNOM2의 MAb용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1% BSA, 0.1%의 Tween20을 포함하는 PBS로 37℃, 2시간 블로킹한 후, PBS로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌에 추가하여, 피검액 스폿용의 글라스울로 제작된 샘플패드, 피검액 흡수용의 글라스울로 제작된 흡수패드를 별도로 준비하고, 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화 멘브렌, 흡수패드의 순서로 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 동결건조 난백분말의 0.1% 용액을 각각 실온, 50℃, 75℃, 100℃에서 1시간 처리한 것을 적당히 희석하여 사용하였다.
5-2 결과
PNOM1 및 금 콜로이드표지 PNOM2의 조합에 의해, 실온 및 50℃에서 1시간 처리한 난백용액은 10ppb까지 검출할 수가 있었다. 또, 75, 100℃에서 1시간 처리한 난백은, 100ppb까지 검출할 수가 있었다. 이 결과로부터, 100℃에서 1시간에 상당하는 가열처리된 식품에서는, 요소와 같은 변성제를 사용하지 않아도, 이 항 OMMAb의 면역크로마토스트립을 사용함으로써, 난백으로서 100ppb까지는 간편한 추출에 의해 검출할 수가 있었다. 그러나, 100℃를 초과한 열처리에서는 OM의 면역크로마토그래피에서는 검출할 수가 없기 때문에, 상기와 같이 요소에 의한 가용화처리가 필요한 것이었다.
6. 항 OAMAb와 항 OMMAb와의 병용효과
6-1 방법
상기의 결과로부터, PNOA1, PDOA1 및 PNOM1의 고정화항체혼합물, 및 PNOA2, PDOA2 및 PNOM2의 금 콜로이드항체 혼합물을 사용한 면역크로마토스트립을 상기와 같이 제작하고, 난백의 검출을 시험하였다.
6-2 결과
PNOA1과 PNOA2, PDOA1과 PDOA2 및 PNOM1과 PNOM2의 조합은, 각각 상기에 나타낸 바와 같이 목적의 변성/미변성 OA 또는 OM을 각각의 감도로 검출할 수가 있었다. 이와 같은 점으로부터, 가공식품의 제조과정에 있어서 미가열상태의 경우에는 미변성OA 및 OM에 대한 MAb가 반응하고, 50에서 100℃의 경우에는, 미변성/변성OA, 및 OM에 대한 MAb가 반응하고, 그 이상의 경우에는 요소에 의한 가용화처리에 의해 변성 OA가 반응하는 난백의 검출방법을 개발할 수가 있었다.
실시예 3
1. 변성/미변성 밀 글리아딘에 결합가능한 MAb의 확립
1-1 재료 및 방법
1) 밀 글리아딘(이하「GL」이라고 한다)의 조제
밀가루에 2배 분량의 n-부탄올을 첨가하여 탈지(脫脂)를 실시하고, 하룻밤 바람에 건조시켰다. 얻어진 탈지밀가루에 0.1% 염화나트륨용액을 2배 분량 첨가하여 10,000rpm×15분 원심분리하였다. 얻어진 침전에 20배 분량의 0.01N아세트산을 첨가, 교반 후, 10,000rpm×15분 원심분리하였다. 얻어진 상청을 증류수로 투석하고, 동결건조를 실시하였다. 얻어진 동결건조물에 70%가 되도록 에탄올을 첨가하고, 10,000rpm×15분 원심분리하였다. 얻어진 상청을 증류수로 투석하여, 조GL획분을 얻었다. 조GL획분은 다시, Sephacryl S-200HR(Amersham Biosciences)을 사용한 겔의 여과에 의해 정제하였다. 이동상으로는 0.1N 아세트산을 사용하여 GL을 분획하고, 증류수에 투석한 후, 동결건조를 실시하였다. 생리식염수로 이 동결건조물의 0.1% 용액을 조제하고, 1ml들이 에펜돌프튜브에 500μl씩 분주하여, 면역에 사용될 때까지 -20℃에서 동결보관하고, 항원용액으로 하였다.
2) 면역
공시동물로서, 5주령의 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 5마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 GL이 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 3주간의 간격으로 2회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 GL이 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역에서 GL을 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 GL항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H＋L) 항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 GL용액 100μl을 꼬리부의 정맥으로부터 주사하였다. 정맥주사한 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45% 폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 GL항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 GL에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100μg/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, 미변성 GL(이하「NGL」이라고 한다) 또는 환원카르복시메틸화 GL(이하「RCMGL」이라고 한다), 0.1M 아세트산 가용화GL(이하「AGL」이라고 한다), 70% 에탄올가용화GL(이하「EGL」이라고 한다), 변성제로 가용화한 GL(이하「DGL」이라고 한다)에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써 특이성이 다른 클론을 얻도록 하였다. RCMGL은, 정제GL 10mg을 칭량하고, 1.4M트리스-염산완충액(pH8.6) 1ml, 5%의 EDTA 100μl, 1.2g의 요소, 33μl의 2-메르캅토에탄올을 첨가하여 2.5ml로 정용(定容)한 후, 질소가스치환을 실시하고, 37℃, 1시간의 환원처리를 실시하였다. 또한, 1M의 NaOH 300μl에 용해한 89mg의 모노요드아세트산을 첨가하여 질소가스치환한 후, 실온에서 1시간의 카르복시메틸화를 실시하여, RCMGL로 하였다. 배양상청의 NGL, RCMGL, AGL, EGL 및 DGL에 대한 반응성을 비경합법 ELISA에 의해 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)을 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치하였다. 그 후, 20mg/ml이 되도록 PBS로 치환하였다.
2-2 결과
1) MAb의 선택
밀의 주요알레르겐인 글리아딘(GL)은, 물에 불용성이며, 아세트산이나 에탄올에 용해되는 단백질이다. 그래서, PBS에 용해시킨 GL(NGL), 환원카르복시메틸화 GL(RCMGL), 0.1M의 아세트산가용화GL(AGL), 70%의 에탄올가용화GL(EGL), 변성제로 가용화시킨 GL(DGL)을 조제하고, 어떤 상태의 GL에 특이적으로 결합하는 MAb인가를 검증하였다. 항 GLMAb의 각 상태의 GL에 대한 다이렉트 ELISA의 결과를 표12에 나타낸다. 표1에 나타내는 바와 같이, 모든 상태의 GL에 결합하는 MAb인 PGL1(FERM ABP-10267), PGL2(FERM ABP-10268), PGL4, PGL7을 선택하였다.
Figure 112006072459670-PCT00012
2) 샌드위치 ELISA에 있어서의 조합조건
다이렉트 ELISA로 선택한 PGL1, PGL2, PGL4, PGL7을 사용하여, 모든 MAb의 조합에 대하여 샌드위치 ELISA를 실시하였다. 글리아딘은 NGL, RCMGL, AGL, EGL, DGL을 사용하였다. 그 결과, 모든 상태의 GL에서 가장 높게 검출할 수 있었던 것은, PGL1과 PGL2의 조합이었다. PGL1과 PGL2를 사용한 샌드위치 ELISA의 결과를 도13에 나타낸다. 그 외의 조합에 대해서는 샌드위치 ELISA로 모든 GL을 검출할 수 없거나, 또는, 검출감도가 극히 낮았다. 이상의 결과로부터, 식품에 여러가지 상태로 포함되는 GL을 검출하는 MAb로서, PGL1과 PGL2를 선택하였다.
2. PGL1과 PGL2를 인식하는 에피토프의 상이
면역블로팅으로, 각 항체가 인식하는 에피토프를 한정하기 위하여, A-PAGE와 일렉트로블로팅에 이어서 면역블로팅을 실시하였다. 우선, 밀 글리아딘을 Lafiandra,D.&Kasarda,D.D.에 따라 A-PAGE(Cereal Chemistry,,62,314-319,1985)에 의해 분리하였다. 분리한 겔을 사용하여, 일렉트로블로팅에 의해 PVDF막에 전사하였다. 전사한 PVDF막에 PGL1과 PGL2의 배양상청(1/1000)을 반응시킨 후, 발색시켜서, 인식하는 에페토프를 확인하였다. 그 결과, 도14에 나타내는 바와 같이, PGL1로 인식되는 단백질분해밴드가 PGL2에서는 인식되지 않았다. 이와 같은 결과로부터, PGL1과 PGL2는 다른 에피토프를 인식한다는 것을 알았다.
3. 면역크로마토그래피에 의한 변성 및 미변성 GL의 검출
3-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM의 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 PGL1(또는 PGL2)용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10%의 BSA용액 625μl을 첨가하고, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여, 1%의 BSA용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다. 글라스울로 제작한 콘쥬게이트패드(일본 미리포아사 제품)에 68μl/㎠로 되도록 도포하고, 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 PGL2(또는 PGL1)용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1% BSA, 0.1%의 Tween20을 포함하는 PBS로 37℃, 2시간 블로킹한 후, PBS로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌에 추가하여, 피검액 스폿용의 글라스울로 제작된 샘플패드, 피검액 흡수용의 글라스울로 제작된 흡수패드를 별도로 준비하고, 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화 멘브렌, 흡수패드의 순서로 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다.
피검액으로서는, 밀가루에 20배 분량의 PBST(PBS에 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트를 0.5%첨가한 것)를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 교반하고, 원심분리 후에 탈지처리한 상청을 회수하고, 투석한 후, 동결건조한 것을 밀가루추출물로서 조제하였다. 조제한 밀가루 추출물을 사용하여, 미변성의 것으로서 PBS로 희석한 것, 변성의 것으로서 변성제로 가용화한 것을 사용하였다.
3-2 결과
샌드위치 ELISA에 의해 여러가지 상태의 GL을 검출할 수 있었던 것으로부터, 보다 간편한 검출방법으로서 면역크로마토그래피에 의한 검출계를 구축하고, 평가하였다. 평가에 있어서는, 현재 시판되고 있는 알레르겐검출키트와 동일한 항체를 사용하고 있는 시판A 및 시판B와 비교하였다. 결과를 표13에 나타낸다. 또한, 표 13중, 「비특이반응」은, 완충액만을 사용하였을 때에 양성으로 판정되면「있음」으로 하였다. 그 결과, 시판A에서는, 미변성 밀가루추출물은 검출할 수 있었으나, 변성 밀가루추출물은 비특이반응을 보여 판정할 수가 없었다. 또, 시판B에서는, 미변성 밀가루추출물에서는 1ppm으로도 검출할 수 없었으며, 변성 밀가루추출물은 비특이반응을 보여 판정할 수가 없었다. 본 발명의 키트를 사용하는 방법에서는, 미변성 밀가루추출물, 변성 밀가루추출물의 어느 쪽도 50ppb정도까지 검출할 수가 있었다. 또, 변성 밀가루추출물에서의 비특이반응은 보이지 않았다.
Figure 112006072459670-PCT00013
다음에, 실제의 식품으로부터의 알레르겐검출을 상정(想定)하여, 시판의 식빵을 사용하여 평가하였다. 평가에 있어서는, 현재 시판되고 있는 알레르겐검출키트를 사용하는 시판A 및 시판B와 비교하였다. 결과를 표14에 나타낸다. 또한, 표14 중, 「비특이반응」은, 완충액만을 사용하였을 때에, 양성으로 판정되면 「있음」으로 하였다. 식빵의 단백질은 약 8%이기 때문에, 이하의 농도는 8%를 전량 추출했다고 가정한 숫자가 된다. 평가한 결과, 시판A에서는, 미변성 식빵을 4ppm이하의 농도에서는 검출할 수 없었고, 변성 식빵에서는 비특이반응을 보여서 판정할 수 없었다. 시판B에서는, 4ppm정도는 검출할 수 있었으나, 그 이외의 농도에서는 검출할 수 없었고, 또 변성 식빵에서는 비특이반응이 보여 판정할 수가 없었다. 본 발명의 키트를 사용하는 방법에서는, 미변성 식빵, 변성 식빵의 어느 쪽도 40ppb정도의 저농도에서도 검출할 수 있었고, 변성에서는 비특이반응도 없이 검출할 수 있다는 것을 알았다.
Figure 112006072459670-PCT00014
실시예4
1. 항 24kDa단백질 MAb 및 항 76kDa단백질 MAb의 확립
1-1 재료 및 방법
1) 메밀 24kDa단백질 MAb 및 항 76kDa단백질의 조제
시판의 메밀분말에 5배 분량의 정제수를 첨가하고, 교반 후 12000rpm으로 원심분리를 실시하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전에 1M의 염화나트륨을 5배 분량 첨가하고, 교반 후 12000rpm으로 원심분리를 실시하여 상청을 얻었다. 상청을 투석에 의해 탈염하고, 동결건조를 실시하여 얻어진 획분을 메밀 조단백질 획분으로 하였다. 그 메밀 조단백질의 획분을 다시 프렙셀 960(BioRad)을 사용하여 정제를 실시하였다. 24kDa단백질의 정제는, 메밀 조단백질 획분을 2.0%의 SDS와 5%의 2-메르캅토에탄올이 포함되는 샘플버퍼에 용해한 후, 95℃에서 4분간 가열한 것을 샘플로 하여 공시하고, 아크릴아미드 12% 분리겔을 사용한 프렙셀960으로 분획하여, 24kDa단백질을 얻었다. 76kDa단백질의 정제는, 메밀 조단백질 획분을 2.0%의 SDS가 포함되고, 2-메르캅토에탄올이 포함되지 않는 샘플버퍼에 용해한 것을 샘플로 하여 공시하고, 아크릴아미드 12% 분리겔을 사용한 프렙셀960으로 분획하여, 76kDa단백질을 얻었다. 얻어진 각 획분은 투석 후, 동결건조를 실시하였다. 이들 동결건조를 사용하여, 생리식염수로 0.1%의 24kDa단백질용액 및 0.1%의 76kDa단백질용액 각각을 제작하고, 1ml들이 엔펜톨프튜브에 500μl씩 분주하여 항원용액으로 하고, 면역에 사용할 때까지 -20℃에서 동결보관하였다.
2) 면역
공시동물로서, 5주령 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 5마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트애쥬번트(Difco)를 0.1%의 24kDa단백질용액 및 0.1%의 76kDa단백질용액이 각각 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하여, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 3주간의 간격으로 2회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 24kDa단백질용액 및 0.1%의 76kDa단백질용액이 각각 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역에서 24kDa단백질용액 또는 76kDa단백질용액을 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 24kDa단백질 항체가 및 항 76kDa단백질 항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H＋L) 항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 24kDa단백질용액 또는 0.1%의 76kDa단백질용액 각각 100ml을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사로부터 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45% 폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 24kDa단백질항체 또는 76kDa단백질항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 24kDa단백질 또는 76kDa단백질에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서, 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100g/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, 24kDa단백질, 76kDa단백질, PBS로 희석한 메밀 조단백질(이하「NBW」라고 하는 경우가 있다), 또는 변성제에 의해 가용화한 메밀 조단백질(이하「DBW」라고 하는 경우가 있다)에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써, 특이성이 다른 클론을 얻는 것으로 하였다. 메밀 조단백질은, 메밀가루에 20배 분량의 PBST를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 교반하고, 원심분리 후에 탈지처리한 상청을 회수하여 투석한 후, 동결건조한 것을 메밀가루 추출물로서 조제하였다. 변성제에 의한 가용화는, 메밀 조단백질을 10mg 칭량하고, 요소 6g, 2-메르캅토에탄올 0.2ml, 50mM의 Tris-HCl완충액(pH8.6) 1ml, 증류수 1.5ml을 첨가하여, 알루미늄호일로 뚜껑을 한 후에, 100℃에서 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리를 실시하고, 이것을 DBW로 하였다. 배양상청의 24kDa단백질, 76kDa단백질, NBW, 및 DBW에 대한 반응성을 비경합법 ELISA로 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 특성과 MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
항 24kDa단백질 MAb 또는 항 76kDa단백질 MAb의 특성을 결정하기 위하여, 고상법을 사용하였다. 고상법으로서, 24kDa단백질, 76kDa단백질, NBW 또는 DBW를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 고정화된 항원에 항 24kDa단백질 MAb 또는 76kDa단백질 MAb를 작용시키는 방법을 사용하였다. 또, MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)을 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치하였다. 그 후, 20mg/ml이 되도록 PBS로 치환하였다.
1-2 결과
1) 항 24kDa단백질 MAb와 76kDa단백질 MAb의 특성과 클래스, 서브클래스
24kDa단백질에 대한 특이성을 갖는 MAb 5종류, 및, 76kDa단백질에 대한 특이성을 갖는 MAb 4종류를 얻었다. 각각 고상의 항원에 대한 특이성을 표15 및 표16에 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00015
Figure 112006072459670-PCT00016
2) 조합조건
고상(固相)의 항원에 대하여 양성반응을 나타낸 각 MAb를 각각 고상 또는 비오틴화항체로하여, NBW 및 DBW를 검출하기 위한 MAb의 조합을, 샌드위치 ELISA에 있어서의 검출감도의 점으로부터 선출하였다. 그 결과, NBW를 검출할 수 있는 조합으로서, 플레이트공정화항체 PBW2(FERM ABP-10273)와 비오틴화항체 PBW3(FERM ABP-10274)를, 또 DBW를 검출할 수 있는 조합으로서, 플레이트고정화항체 PBW1(FERM ABP-10272)와 비오틴화항체 PBW2를 선택하였다. PBW2 및 PBW3의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 메밀 조단백질에 대한 반응성의 경과를 도15에 나타낸다. 또, PBW1 및 PBW2의 샌드위치 ELISA에 의한 각종 메밀 조단백질에 대한 반응성을 도16에 나타낸다.
3) MAb혼합계에서의 NBW, DBW의 검출
샌드위치 ELISA에 의해 선택한 MAb를 혼합하고, NBW, DBW의 검출감도를 확인하였다. 즉, NBW에서는, 플레이트고정화항체를 PBW2 단독으로 한 경우와, PBW1 및 PBW2를 혼합한 경우에서, 비오틴화 PBW3를 2차항체로 하여 비교하였다. 또, DBW에서는, 높은 검출감도였던 플레이트고정화항체 PBW1, 비오틴화 PBW2의 조합과, PBW1 및 PBW2를 혼합한 플레이트고정화항체와, 비오틴화 PBW3를 2차항체로 한 경우를 비교하였다. 도17 및 도18에 나타내는 바와 같이, NBW, DBW 모두 플레이트항체를 혼합한 쪽이 흡광치가 높고, 검출감도를 높일 수 있다는 것이 명백해졌다.
Figure 112006072459670-PCT00017
2. 샌드위치 ELISA에 의한 식품 중의 NBW, DBW의 검출
상기 1.에서 선택된 PBW1, PBW2, PBW3의 조합에 의해, 실제의 식품 중의 메밀 조단백질을 검출할 수 있는지를 시험하였다.
2-1 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 제작
정량시험을 위한 모델식품으로서 식육제품을 선택하고, 표17에 나타내는 배합으로 각 농도의 메밀 조단백질을 포함하는 모델식육제품을 제작하였다. 돼지 정육은, 돼지로스육으로부터 지방, 힘줄을 제거하고, 5mm로 잘게 간 만육으로 한 것을 사용하였다. 각 배합에 따라 첨가물을 계량하여 푸드프로세서로 혼합한 후, 염화비닐튜브에 충전하고, 75℃에서 30분간의 가열을 실시하였다.
Figure 112006072459670-PCT00018
2) 샌드위치 ELISA에 의한 정량분석
(모델 소금절임육)
각 모델 소금절임육을, 푸드프로세서로 균일해질때까지 마쇄하고, 분석용 샘플로 하였다. 샘플 1g을 칭량채취하고, PBST 19g을 첨가하여 호모지나이저로 30초간 교반하였다. 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청을 여과용지로 여과한 것을 0.5ml 칭량채취하고, PBST를 9.5ml첨가하여 ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 PBST를 사용한 메밀 조단백질의 단계희석을 사용하였다.
(모델가열제품)
각 모델가열제품을, 푸드프로세서로 균일해질때까지 마쇄하여, 분석용 샘플로 하였다. 샘플 1g을 칭량채취하여, 1%의 SDS, 1%의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 PBS 19g을 첨가하여 호모지나이저로 30초간 교반하였다. 그 후, 100℃에서 1시간 가열처리를 실시하였다. 냉각 후 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청을 여과용지로 여과한 것을 0.5ml 칭량채취하고 PBST를 9.5ml첨가하여, ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 SDS, 2-메르캅토에탄올처리를 실시한 메밀 조단백질의 단계희석을 사용하였다.
2-2 결과
샌드위치 ELISA에 의한 모델식육제품 중의 메밀 조단백질의 분석에 대하여, 모델 소금절임육의 결과를 표18에, 또, 모델가열제품의 결과를 표19에 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00019
Figure 112006072459670-PCT00020
이상의 결과로부터, 모델 소금절임육과 같이 미가열의 메밀 조단백질에서도, 모델가열제품과 같은 가열변성한 메밀 조단백질에서도, 높은 회수율로 메밀 조단백질을 검출할 수가 있었다. 이들 결과로부터, 미변성 메밀단백질에 결합가능한 MAb와 변성 메밀단백질에 결합가능한 MAb를 조합시킴으로써, 미가열(미변성), 가열(변성)의 어떤 상태의 메밀단백질에서도, 고감도로 분석할 수 있다는 것을 알았다.
3. 면역크로마토그래피에 의한 변성 및 미변성 메밀 조단백질의 검출
3-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM의 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 PBW3 MAb용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10%의 BSA용액 625μl을 첨가하고, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여, 1%의 BSA용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다. 글라스울로 제작한 콘쥬게이트패드(일본 미리포아사 제품)에 68μl/㎠로 되도록 도포하고, 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 8mg/ml이 되도록 PBW1과 PBW2의 MAb용액을 조제하고, 1:1의 비율로 혼합한 것을 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1%의 스킴밀크를 포함하는 10mM 인산버퍼(pH7.5)로 37℃, 1시간 블로킹한 후, 10mM 인산버퍼(pH7.5)로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌, 흡수패드를 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 상기 2.에서 조제한 모델식육제품을 적당히 희석하여 사용하였다.
3-2 결과
멘브렌도포 MAb PBW1＋PBW2, 및 금 콜로이드표지 MAb PBW3의 조합에 의해, 메밀단백질은 가열, 비가열에 관계없이 50ppb(식품 중 2ppm)까지 검출할 수가 있었다. 이와 같은 결과로부터, 제조공정 중에 혼입한 메밀단백이 대상이 되어도, 가열 후의 제품이 대상이 되어도, 어떤 경우에도 대응할 수 있는 면역크로마토스트립의 설계가 가능해졌다.
시판의 알레르겐검출용 면역크로마토스트립에서는, 블랭크로서 0.1M의 요소＋0.2%의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 PBS를 적하한 결과, 비특이적인 밴드가 발생되어, 의사양성으로 돼 버렸다. 이와 같은 경우에는, 가열 등에 의해 변성한 식품단백 중에서 효율적으로 알레르겐을 추출하기 위한 단백질변성제를 사용할 수가 없기 때문에, 알레르겐으로서 검출할 수 있는 대상이 극히 좁은 범위로 한정되어버릴 위험성을 고려하게 되었다.
실시예 5
1. 항 Ara h1MAb의 확립
1-1 재료 및 방법
1) Ara h1단백질의 조제
시판되고 있는 생땅콩에 5배 분량의 20mM bis-tris-propane buffer(pH7.2)를 첨가하고, 실온에서 2시간 교반한 후 3000×g으로 원심분리를 실시하여 침전 및 유분을 제거하였다. 얻어진 수용성 획분을 다시 10000×g으로 원심분리를 실시하여 상청을 얻었다. 상청을 다시 Source Q(아머샴·파마시아)를 사용하여, 20mM의 bis-tris-propane buffer(pH7.2), NaCl의 리니어그라디엔트(0~1M)에 의해 정제를 실시하였다. 정제한 Ara h1획분을 증류수에 의해 투석한 후, 동결건조를 실시하고, 미변성 Ara h1(이하, NAh1으로 표기한다)으로 하였다. 또, 변성 Ara h1(이하, DAh1으로 표기한다)는, NAh1을 10mg 칭량하고, 요소 6g, 2-메르캅토에탄올(이하, 2-ME로 표기한다) 0.2ml, 50mM의 Tris-HCl완충액(pH8.6) 1ml, 증류수 1.5ml을 첨가하여, 알루미늄호일로 뚜껑을 한 후, 100℃에서 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리를 실시하였다. 그 후, 투석하여 동결건조를 실시하였다. 이들 동결건조를 이용하여, 생리식염수로 0.1%의 NAh1용액 및 0.1%의 DAh1용액 각각을 제작하고, 1ml들이 에펜돌프튜브에 500μl씩 분주하여 항원용액으로 하고, 면역에 이용할 때까지 -20℃에서 동결보관하였다.
2) 면역
공시동물로서, 5주령 BALB/c마우스(일본 쿠레아가부시키가이샤 제품) 5마리를 사용하였다. 첫회 면역에는, 완전 프로인트애쥬번트(Difco)를 0.1%의 NAh1용액 및 0.1%의 DAh1용액이 각각 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하여, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다. 또, 추가면역은, 2주간의 간격으로 3회 실시하였다. 면역에는, 불완전 프로인트 애쥬번트(Difco)를 0.1%의 NAh1용액 및 0.1%의 DAh1용액이 각각 500μl 들어있는 에펜돌프튜브에 등량씩 첨가하고, 볼텍스믹서로 교반하여 제작한 에멀젼을 공시하였다. 상기 에멀젼을 1마리당 150μl씩 복강내에 주사하였다.
3) 혈중항체가의 측정
첫회 또는 추가면역에서 NAh1용액 또는 DAh1용액을 주사한 1주일 후에, 각 BALB/c마우스의 꼬리부 정맥으로부터 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 실온에 2시간 방치한 후, 원심분리를 실시하여 혈청을 얻었다. 이들 혈청의 10배 단계희석을 제작하고, 비경합법 ELISA에 의해 마우스혈중의 항 NAh1항체가 및 항 DAh1항체가를 조사하였다. 또한, 2차 항체에는 알칼리포스파타제표지 항 마우스 IgG(H＋L) 항체(Jackson immunoresearch Laboratories Inc. 제품)를 사용하였다.
4) 하이브리도마의 제작
하이브리도마의 제작은, 쾰러와 밀슈타인의 방법(1975)에 따랐다. 즉, 충분히 항체가가 높아진 마우스에, 0.1%의 NAh1용액 또는 0.1%의 DAh1용액 각각 100μl을 꼬리부의 정맥에서 주사하였다. 정맥주사로부터 4일 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다. 비장을 가늘게 절단한 후, RPMI1640으로 세정하여 멸균 나일론메시(Cell Strainer, 70㎜, Becton Dickinson)를 통과시켜서 비장세포 현탁액을 얻었다. 1,000rpm×10분의 원심분리에 의해 비장세포를 모으고, 다시 RPMI1640으로 재현탁하여 세포수를 계산하였다. 이 비장세포 현탁액과 마우스 골수종세포(P3X63Ag8.653) 현탁액을 세포수가 10:1이 되도록 혼합하고, 다시 1,000rpm×10분의 원심분리를 실시하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 평균분자량 3,350의 45% 폴리에틸렌글리콜을 적하하여 세포융합을 실시하였다. 세포용액에 RPMI1640을 첨가하여 희석한 후, 원심분리하여 펠릿으로 하였다. 이 펠릿에, 하이브리도마용 배지(10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100㎎/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640배지)에 100μM의 히폭산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μM의 티미딘을 함유하는 HAT선택배지를 첨가하고, 5×106cells/well이 되도록 24웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)에 분주하여 5% CO2하 37℃에서 배양하였다.
5) 한계희석법에 의한 클로닝
세포배양용 플레이트의 각 웰의 배양상청에 대하여, ELISA의 1차항체로서 공시하고, 항 NAh1항체 또는 DAh1항체를 산생하고 있는 하이브리도마의 존재를 조사하였다. ELISA에 의해 NAh1 또는 DAh1에 대하여 양성을 나타낸 웰의 하이브리도마에 대하여, 0.9cell/well이 되도록 96웰의 세포배양용 플레이트(Becton Dickinson)로 옮기고, 한계희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 또한, 피더세포로서, 4주령 BALB/c마우스의 흉선세포를 5×106cells/well이 되도록 96웰 세포배양용 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 클로닝된 하이브리도마의 배양에는, 10%우태아혈청, 40mM의 2-메르캅토에탄올, 100U/ml의 페니실린, 100g/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640배지를 사용하였다.
6) 항체의 스크리닝
모노클로널항체의 스크리닝은, NAh1, DAh1, 또는 땅콩 조단백질의 미변성물(이하 NP-e로 기재한다), 요소처리(이하 DP-e로 기재한다)의 4종류에 대한 반응성의 차이를 조사함으로써, 특이성이 다른 클론을 얻는 것으로 하였다. 또한, NP-e는 땅콩에 5배 분량의 20mM bis-tris-propane buffer(pH7.2)를 첨가하여, 실온에서 2시간 교반한 후 원심분리를 2회 실시하여 얻어진 상청을 투석한 후, 동결건조한 것으로 하였다. 또, DP-e는 NP-e를 10mg 칭량하고, 요소 6g, 2-ME 0.2ml, 50mM의 Tris-HCl완충액(pH8.6) 1ml, 증류수 1.5ml을 첨가하여 알루미늄호일로 뚜껑을 한 후, 100℃에서 1시간 오일배스에서 가열, 변성처리를 실시한 것으로 하였다. 배양상청의 NAh1, NP-e, DAh1 또는 DP-e에 대한 반응성을 비경합법 ELISA로 조사하였다.
7) 복수의 채취 및 MAb의 정제
Jones(1990) 등에 따라, 우선, BALB/c마우스에 불완전 프로인트애쥬번트 0.2ml를 복강내에 주사하였다. 1주일 후, 한마리당 5×106cells의 클로닝된 하이브리도마를 접종하였다. 복수에 저류시킨 후, 실린지에 의해 복수를 채취하였다. 채종한 복수를 Protein G 칼럼(아머샴·파마시아)에 의해 정제하였다.
8) MAb의 특성과 MAb의 클래스, 서브클래스 및 타입
항 NAh1 MAb 또는 항 DAh1 MAb의 특성을 결정하기 위하여, 고상법을 사용하였다. 고상법으로서, NAh1, DAh1, NP-e 또는 DP-e를 미리 세포배양용 플레이트의 웰 내에 고정시키고, 이 고정화된 항원에 항 NAh1 MAb 또는 DAh1 MAb를 작용시키는 방법을 사용하였다. 또, MAb의 클래스 및 서브클래스에 대해서는, Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)에 의해, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgL(κ) 및 IgL(γ)을 결정하였다.
9) MAb의 비오틴화
정제한 MAb에 대하여, 샌드위치 ELISA에 공시하기 위하여, 각각 비오틴화처리를 실시하였다. 50mM의 탄산완충액(pH8.5)을 사용하여 20mg/ml이 되도록 조제하고, DMSO에 3mg/100μl로 용해한 NHS-비오틴용액을 10μl첨가하여, 교반한 후, 빙냉시키면서 2시간 정치하였다. 그 후, 20mg/ml이 되도록 PBS로 치환하였다.
1-2 결과
1) 항 NAh1 MAb와 DAh1 MAb의 특성과 클래스, 서브클래스
NAh1에 대한 특이성을 갖는 MAb 7종류, 및, DAh1에 대한 특이성을 갖는 MAb 3종류를 얻었다. 각각 고상의 항원에 대한 특이성을 표20 및 표21에 나타내었다.
Figure 112006072459670-PCT00021
Figure 112006072459670-PCT00022
2) 조합조건
고상의 항원에 대하여 양성반응을 나타낸 각 MAb를 각각 고상 또는 비오틴화항체로하여, NP-e 및 DP-e를 검출하기 위한 MAb의 조합을, 샌드위치 ELISA에 있어서의 검출감도의 점으로부터 선출하였다. 그 결과, NP-e를 검출할 수 있는 조합으로서, 플레이트항체에 PAh1-2(FERM ABP-10270)와 비오틴항체에 PAh1-1(FERM ABP-10269), 또 DP-e를 검출할 수 있는 조합으로서, 플레이트항체에 PAh1-2와 비오틴항체에 PAh1-3(FERM ABP-10271)의 조합을 선택하였다.(도19와 도20)
3) MAb혼합계에서의 NP-e, DP-e의 검출
고상에 PAh1-2(세포기탁번호), 비오틴화에 PAh1-1(세포기탁번호) 및 PAh1-3(세포기탁번호)을 혼합하고, NP-e, DP-e의 검출감도를 확인하였다. 각각의 MAb농도는 50μg/ml로 설정하였다. 그 결과, MAb혼합계에서 NP-e, DP-e 모두 검출할 수가 있었다(도21과 도22).
2. 샌드위치 ELISA에 의한 식품 중의 땅콩 조단백질의 검출
상기1.에서 선택된 PAh1-1, PAh1-2 및 PAh1-3의 조합에 의해, 실제 식품중의 땅콩 조단백질을 검출할 수 있는지를 시험하였다.
2-1 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 제작
정량시험을 위한 모델식품으로서 식육제품을 선택하고, 표22에 나타내는 배합으로 각 농도의 땅콩 조단백질을 포함하는 모델식육제품을 제작하였다. 돼지 정육은, 돼지로스육으로부터 지방, 힘줄을 제거하고, 5mm로 갈아서 만육으로 한 것을 사용하였다. 각 배합에 따라 첨가물을 계량하여 푸드프로세서로 혼합한 후, 염화비닐튜브에 충전하고, 75℃에서 30분간의 가열을 실시하였다.
Figure 112006072459670-PCT00023
2) 샌드위치 ELISA에 의한 정량분석
(모델 소금절임육)
각 모델 소금절임육을, 푸드프로세서로 균일해질때까지 마쇄하여 분석용 샘플로 하였다. 샘플 1g을 칭량채취하고, PBST 19g을 첨가하여 호모지나이저로 30초간 교반하였다. 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청을 여과용지로 여과한 것을 0.5ml 칭량채취하고, PBST를 9.5ml첨가하여 ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 PBST에 용해한 땅콩 조단백질의 단계희석을 사용하였다.
(모델가열제품)
각 모델가열제품을, 푸드프로세서로 균일해질때까지 마쇄하여, 분석용 샘플로 하였다. 샘플 1g을 칭량채취하여, 1M의 요소 및 0.1%의 2-ME를 포함하는 PBS 19g을 첨가하여 호모지나이저로 30초간 교반하였다. 그 후, 100℃에서 1시간 가열처리를 실시하였다. 냉각 후 3,000rpm×20분의 원심분리를 실시하고, 상청을 여과용지로 여과한 것을 0.5ml 칭량채취하고 PBST를 9.5ml첨가하여, ELISA용 샘플로 하였다. 검량선에는 동일하게 1M의 요소 및 0.1%의 2-ME처리를 실시한 땅콩 조단백질의 단계희석을 사용하였다. 또, 분석용 샘플로부터 PBST를 사용하여 추출하고, PBST에 용해한 땅콩 조단백질을 검량선으로 한 요소 및 2-ME를 사용하지 않는 경우와의 비교를 실시하였다.
2-2 결과
샌드위치 ELISA에 의한 모델식육제품 중의 땅콩 조단백질의 분석에 대하여, 모델 소금절임육의 결과를 표23에, 또, 모델가열제품의 결과를 표24에, 또, PBST만으로 추출한 결과를 표25에 나타낸다.
Figure 112006072459670-PCT00024
Figure 112006072459670-PCT00025
Figure 112006072459670-PCT00026
이상의 결과로부터, 모델 소금절임육과 같이 미가열의 땅콩 조단백질에서도, 모델 가열제품과 같이 가열변성한 땅콩 조단백질에서도, 높은 회수율로 땅콩 조단백질을 검출할 수가 있었다. 이들 결과로부터, 미변성단백질에 결합가능한 MAb와 변성단백질에 결합가능한 MAb를 조합하는 것에 의해, 미가열(미변성), 가열(변성)의 어떤 상태의 땅콩단백질에서도, 고감도로 분석할 수 있다는 것을 알았다. 또, 식품중으로부터의 땅콩 조단백질의 추출에는 요소 및 2-ME를 사용하는 것이 유효하며, 요소로 변성시킨 Ah1에 결합가능한 것이 필요하다는 것이 명백해졌다.
3. 면역크로마토그래피에 의한 미변성 및 변성 땅콩 조단백질의 검출
3-1 재료 및 방법
1) 금 콜로이드표지 및 콘쥬게이트패드의 제작
2mM의 붕산완충액(pH9.0)으로 1mg/ml이 되도록 PAh1-1과 PAh1-3의 MAb용액을 조제하였다. 미리 0.2M의 탄산칼륨용액으로 pH9.0으로 조제한 금 콜로이드용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb용액을 500ml첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 10%의 BSA용액 625μl을 첨가하여, 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여, 1%의 BSA용액으로 OD525=2.0이 되도록 조제하고, 1:1의 비율로 혼합하였다. 글라스울로 제작한 콘쥬게이트패드에 68μl/㎠로 되도록 도포하고, 건조시켰다.
2) 항체고정화 멘브렌의 제작
PBS로 4mg/ml이 되도록 PAh1-2의 MAb용액을 조제하고, 니트로셀룰로스 멘브렌에 직선상으로 도포하고 건조시켰다. 그 후, 1%의 스킴밀크를 포함하는 10mM 인산버퍼(pH7.5)로 37℃, 1시간 블로킹한 후, 10mM 인산버퍼(pH7.5)로 세정하고 건조시켰다.
3) 면역크로마토스트립의 조립과 평가
상기에서 제작한 샘플패드, 콘쥬게이트패드, 항체고정화멘브렌, 흡수패드를 각각 부착하여, 면역크로마토스트립으로 하였다. 피검액으로서는, 상기 2.에서 조제한 모델식육제품을 적당히 희석하여 사용하였다.
3-2 결과
멘브렌도포 MAb PAh1-2, 및 금 콜로이드표지 MAb PAh1-1과 PAh1-3의 조합에 의해, 땅콩 조단백질은 가열, 비가열에 관계없이 50ppb(식품 중 2ppm)까지 검출할 수가 있었다. 상기 결과로부터, 제조공정 중에 혼입한 땅콩단백질이 대상이 되어도, 가열 후의 제품이 대상이 되어도, 어떤 경우에서도 대응할 수 있는 면역크로마토스트립의 설계가 가능해졌다.
시판의 알레르겐검출용 면역크로마토스트립에서는, 블랭크로서 0.01M의 요소, 0.2%의 2-ME를 포함하는 PBS를 적하한 결과, 비특이적인 밴드가 발생하여, 의사양성으로 돼 버렸다. 이와 같은 경우에는, 가열 등에 의해 변성한 식품단백 중에서 효율적으로 알레르겐을 추출하기 위한 단백질변성제를 사용할 수가 없기 때문에, 알레르겐으로서 검출할 수 있는 대상이 극히 좁은 범위로 한정되어버릴 위험성을 고려하게 되었다.
본 발명에 의하면, 식품 등에 포함되는 밀크 알레르겐, 난백 알레르겐, 밀 알레르겐, 메밀 알레르겐, 땅콩 알레르겐에 대한 면역학적인 검출방법에 있어서, 이들 알레르겐이, 변성/미변성의 어떤 상태에 있어서도 정확하게 정성(定性), 정량적(定量的)으로 검출할 수가 있다.
Figure 112006072459670-PCT00027
Figure 112006072459670-PCT00028
Figure 112006072459670-PCT00029
Figure 112006072459670-PCT00030
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Figure 112006072459670-PCT00032
Figure 112006072459670-PCT00033
Figure 112006072459670-PCT00034
Figure 112006072459670-PCT00035
Figure 112006072459670-PCT00036
Figure 112006072459670-PCT00037
Figure 112006072459670-PCT00038
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<110> Prima Meat Packers, Ltd. <120> Method of detecting allergen <130> PI-6K1058JP <150> JP2004-063071 <151> 2004-03-05 <150> JP2004-285542 <151> 2004-09-29 <150> JP2004-285543 <151> 2004-09-29 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> cow <400> 1 Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu 1 5 10 15 Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Gln Val Phe 20 25 30 Gly Lys Glu Leu Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Gln Gln Lys His 65 70 75 80 Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu 85 90 95 Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val 100 105 110 Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His 115 120 125 Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr 130 135 140 Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Thr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala 165 170 175 Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu 180 185 190 Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 195

Claims (102)

  1. 미변성 및 변성의 밀크 알레르겐, 미변성 및 변성의 난백 알레르겐, 미변성 및 변성의 밀 알레르겐, 미변성 및 변성의 메밀 알레르겐, 또는 미변성 및 변성의 땅콩 알레르겐을 인식하는 각 2종류 또는 그 이상의 모노클로널항체를 사용하는 알레르겐의 검출방법으로서, αs1카세인의 주요단백질인 αs1αs1카세인, 훼이의 주요단백질인 β락토글로불린, 난백 주요단백질인 오브알부민과 오보뮤코이드, 밀의 주요단백질인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 또는 땅콩의 주요단백질인 Ara h1을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 알레르겐의 검출방법.
  2. 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  3. 제2항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2이상의 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 αs1카세인 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 미변성 αs1카세인, 요소처리 αs1카세인, 미변성 카세인나트륨, 및 변성 카세인나트륨을 인식하는 항 αs1카세인 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 서열번호 1로 나타내는 αs1카세인의 아미노산 서열의 132번째부터 193번째까지의 영역을 인식하는 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10263)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10264)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN2인 것을 특징으로 하는 밀크알레르 겐의 검출방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 식품중의 미변성 αs1카세인 및 요소처리 αs1카세인을, 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적(定性的), 정량적(定量的)으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 β락토글로불린 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    항 β락토글로불린 모노클로널항체가, 미변성 β락토글로불린, 요소처리 β락토글로불린, 환원 카르복시메틸화 β락토글로불린을 인식하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    항 β락토글로불린 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10281)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP- 10282)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10283)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG3인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 식품중의 미변성 β락토글로불린 및 요소처리 β락토글로불린을, 30~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 카세인 및/또는 훼이단백질을 추출하는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    미변성카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 미변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출방법.
  15. 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 구비하고, 미변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 조건하에서 사용되는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2이상의 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 αs1카세인 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 미변성 αs1카세인, 요소처리 αs1카세인, 미변성 카세인나트륨, 및 변성 카세인나트륨을 인식하는 항 αs1카세인 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 서열번호 1로 나타내는 αs1카세인의 아미노산 서열의 132번째부터 193번째까지의 영역을 인식하는 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 αs1카세인 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10263)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10264)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN2인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    미변성 밀크 알레르겐 및/또는 변성 밀크 알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 β락토글로불린 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    항 β락토글로불린 모노클로널항체가, 미변성 β락토글로불린, 요소처리 β락토글로불린, 환원 카르복시메틸화 β락토글로불린을 인식하는 항β락토글로불린 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    항 β락토글로불린 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10281)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10282)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10283)가 산생하는 항β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG3인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로널항체의 적어도 하나가, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐 검출용 키트.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    미변성카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성카세인을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 미변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 β락토글로불린을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 구비하는 것을 특징으로 하는 밀크알레르겐의 검출용 키트.
  26. 하이브리도마(FERM ABP-10263)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN1.
  27. 하이브리도마(FERM ABP-10264)가 산생하는 항 αs1카세인 모노클로널항체 Pas1CN2.
  28. 하이브리도마(FERM ABP-10281)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG1.
  29. 하이브리도마(FERM ABP-10282)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG2.
  30. 하이브리도마(FERM ABP-10283)가 산생하는 항 β락토글로불린 모노클로널항체 PβLG3.
  31. 미변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  32. 제31항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 오브알부민 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  34. 제33항에 있어서,
    항 오브알부민 모노클로널항체가, 미변성 오브알부민 및/또는 환원카르복시메틸화 오브알부민을 인식하는 항 오브알부민 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    항 오브알부민 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10265)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10266)이 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10275)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10276)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA2인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 식품중의 미변성 오브알부민 및/또는 변성 오브알부민을, 1.0~10.0ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  37. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 오보뮤코이드 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  38. 제37항에 있어서,
    항 오보뮤코이드 모노클로널항체가, 미변성 오보뮤코이드 및/또는 요소변성 오보뮤코이드를 인식하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서,
    항 오보뮤코이드 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10279)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10280)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10277)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10278)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM2인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  40. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 식품중의 미변성 오보뮤코이드 및/또는 변성 오보뮤코이드를, 10~100ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 오브알부민 및/또는 오보뮤코이드를 추출하는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    미변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 미변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐의 검출방법.
  43. 미변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와, 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 구비하고, 미변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체와 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체를 병용하는 조건하에서 사용되는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  44. 제43항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체로서, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 오브알부민 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  46. 제45항에 있어서,
    항 오브알부민 모노클로널항체가, 미변성 오브알부민 및/또는 환원카르복시메틸화 오브알부민을 인식하는 항 오브알부민 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    항 오브알부민 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10265)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10266)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10275)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10276)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA2인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  48. 제39항 또는 제44항에 있어서,
    미변성 난백알레르겐 및/또는 변성 난백알레르겐을 인식하는 모노클로널항체가, 항 오보뮤코이드 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  49. 제48항에 있어서,
    항 오보뮤코이드 모노클로널항체가, 미변성 오보뮤코이드 및/또는 요소변성 오보뮤코이드를 인식하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    항 오보뮤코이드 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10279)가 산생하 는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10280)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10277)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10278)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM2인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 모노클로널항체의 적어도 하나가, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    미변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오브알부민을 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 미변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체 및 변성 오보뮤코이드를 인식하는 1 또는 2 이상의 모노클로널항체를 구비하는 것을 특징으로 하는 난백알레르겐 검출용 키트.
  53. 하이브리도마(FERM ABP-10265)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA1.
  54. 하이브리도마(FERM ABP-10266)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PNOA2.
  55. 하이브리도마(FERM ABP-10275)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA1.
  56. 하이브리도마(FERM ABP-10276)가 산생하는 항 오브알부민 모노클로널항체 PDOA2.
  57. 하이브리도마(FERM ABP-10279)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM1.
  58. 하이브리도마(FERM ABP-10280)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PNOM2.
  59. 하이브리도마(FERM ABP-10277)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM1.
  60. 하이브리도마(FERM ABP-10278)가 산생하는 항 오보뮤코이드 모노클로널항체 PDOM2.
  61. 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐의 검출방법.
  62. 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하고, 또한 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 밀 글리아딘 모노클로널항체를 병용하는 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐의 검출방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서,
    항 밀 글리아딘 모노클로널항체가, 미변성 밀 글리아딘, 환원카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M의 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70%의 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐의 검출방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 밀 글리아딘 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10267)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10268)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL2인 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐의 검출방법.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 식품중의 미변성 밀 글리아딘, 환원 카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M의 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70%의 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을, 10~100ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐의 검출방법.
  66. 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐 검출용 키트.
  67. 미변성 밀 글리아딘 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 밀 글리아딘 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐 검출용 키트.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서,
    항 밀 글리아딘 모노클로널항체가, 미변성 밀 글리아딘, 환원 카르복시메틸화 밀 글리아딘, 0.1M의 아세트산가용화 밀 글리아딘, 70%의 에탄올가용화 밀 글리아딘, 및 변성제로 가용화한 밀 글리아딘을 인식하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐 검출용 키트.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 밀 글리아딘 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10267)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10268)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL2인 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐 검출용 키트.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로널항체의 적어도 하나가, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 밀 알레르겐 검출용 키트.
  71. 하이브리도마(FERM ABP-10267)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL1.
  72. 하이브리도마(FERM ABP-10268)가 산생하는 항 밀 글리아딘 모노클로널항체 PGL2.
  73. 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  74. 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하고, 또한 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 병용하는 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서,
    항 메밀조단백질 모노클로널항체가, 24Da단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체, 또는 76kDa단백질 및 미변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 메밀조단백질 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10272)가 산생하는 항 24kDa단백질 모노클로널항체 PBW1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10273)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10274)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW3인 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을, 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 가열변성 메밀조단백질을 추출하는 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐의 검출방법.
  79. 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  80. 미변성 메밀조단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 메밀조단백질 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서,
    항 메밀조단백질 모노클로널항체가, 24Da단백질 및 가열변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체, 또는 76kDa단백질 및 미변성 메밀조단백질을 인식하는 항 메밀조단백질 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  82. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 메밀조단백질 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10272)가 산생하는 항 24kDa단백질 모노클로널항체 PBW1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10273)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10274)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW3인 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로널항체의 적어도 하나가, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터의 메밀조단백질 추출제로서의, 요소와 2-메르캅토에탄올이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 메밀알레르겐 검출용 키트.
  85. 하이브리도마(FERM ABP-10272)가 산생하는 항 24kDa단백질 모노클로널항체 PBW1.
  86. 하이브리도마(FERM ABP-10273)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW2.
  87. 하이브리도마(FERM ABP-10274)가 산생하는 항 76kDa단백질 모노클로널항체 PBW3.
  88. 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  89. 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하고, 또한 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 Ara h1단백질 모노클로널항체를 병용하는 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서,
    항 Ara h1단백질 모노클로널항체가, 미변성 Ara h1단백질과 미변성 땅콩조단백질, 및/또는, 요소처리 Ara h1단백질과 요소처리 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10269)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10270)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10271)가 산생하는 항 가열변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-3인 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    샌드위치 ELISA에 의해, 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을, 10~1000ppb의 농도범위에 있어서도 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터, 요소와 2-메르캅토에탄올을 사용하여 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 추출하는 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐의 검출방법.
  94. 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하는 항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  95. 미변성 땅콩 Ara h1단백질 및 가열변성 땅콩 Ara h1단백질을 인식하고, 또한, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체를 구비한 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서,
    항 Ara h1단백질 모노클로널항체가, 미변성 Ara h1단백질과 미변성 땅콩조단백질, 및/또는, 요소처리 Ara h1단백질과 요소처리 땅콩조단백질을 인식하는 항 Ara h1단백질 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 땅콩 Ara h1단백질 모노클로널항체가, 하이브리도마(FERM ABP-10269)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-1 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10270)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-2 및/또는 하이브리도마(FERM ABP-10271)가 산생하는 항 가열변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-3인 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로널항체의 적어도 하나가, 면역크로마토그래피용으로 사용되는 금 콜로이드로 표지된 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체로부터의 훼이단백질 추출제로서의, 요소와 2-메르캅토에탄올이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 땅콩알레르겐 검출용 키트.
  100. 하이브리도마(FERM ABP-10269)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-1.
  101. 하이브리도마(FERM ABP-10270)가 산생하는 항 미변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-2.
  102. 하이브리도마(FERM ABP-10271)가 산생하는 항 가열변성 Ara h1단백질 모노클로널항체 PAh1-3.
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