CN1930474B

CN1930474B - 变应原的检测方法

Info

Publication number: CN1930474B
Application number: CN2005800069932A
Authority: CN
Inventors: 秋元政信; 加藤重城; 浪冈真
Original assignee: PURIMA FOOD CO Ltd
Current assignee: PURIMA FOOD CO Ltd
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2025-03-04
Also published as: EP1731907B1; WO2005085847A1; AU2005218391B2; CN1930474A; JP2009244276A; JP5043078B2; NZ549638A; CA2558612C; DE602005024119D1; JP2009244277A; AU2005218391A1; CA2558612A1; AU2009200519B2; US7943334B2; JP5043077B2; JPWO2005085847A1; JP5043073B2; JP5283228B2; JP2009271091A; JP4427541B2

Abstract

本发明提供在含有乳变应原、卵清、小麦、荞麦、花生的变应原的食品中，这些变应原即使是变性/未变性的任何状态，也可以进行检测的高灵敏度免疫学检测方法以及使用该方法的检测试剂盒。该方法是使用识别未变性和变性的乳变应原、未变性和变性的卵清变应原、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或未变性和变性的花生变应原的各2种或多种单克隆抗体的变应原检测方法，以乳酪蛋白的主要蛋白质αs1酪蛋白、乳清的主要蛋白质β乳球蛋白、卵清的主要蛋白质卵白蛋白和卵类粘蛋白、小麦的主要蛋白质麦醇溶蛋白、荞麦的主要蛋白质——分子量24kDa和76kDa的蛋白质，或者花生的主要蛋白质Ara h1为指标。

Description

变应原的检测方法

技术领域

本发明涉及以食品等试样中所含的未变性和变性的乳变应原、未变性和变性的卵清变应原(卵白アレルゲン)、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或者未变性和变性的花生变应原为指标的乳变应原的检测方法，以及其中所使用的乳变应原检测试剂盒。

本发明涉及可定性且定量、高灵敏度地对食品等试样中所含的未变性或变性的乳变应原进行分析，并以酪蛋白的主要蛋白质——αs1酪蛋白、或者乳清的主要蛋白质——β乳球蛋白为指标的变应原的检测方法，以及其中所使用的变应原的检测试剂盒。

本发明还涉及可定性且定量、高灵敏度对食品等试样中所含的未变性或变性的卵白蛋白或卵类粘蛋白的卵清变应原进行分析的、并以卵白蛋白(オボアルブミン)和/或卵类粘蛋白为指标的卵清变应原的检测方法，以及其中所使用的卵清变应原的检测试剂盒。

本发明还涉及可定性且定量、高灵敏度对食品等试样中所含的未变性或变性的小麦变应原进行分析的、以小麦的主要蛋白质——麦醇溶蛋白为指标的小麦变应原的检测方法，以及其中所使用的小麦变应原的检测试剂盒。

本发明还涉及可定性且定量、高灵敏度对食品等试样中所含的未变性或变性的荞麦变应原进行分析的、以荞麦的主要蛋白质——分子量24kDa和76kDa蛋白质为指标的荞麦变应原的检测方法，以及其中所使用的荞麦变应原的检测试剂盒。

本发明还涉及可定性且定量、高灵敏度对食品等试样中所含的未变性或变性的花生变应原进行分析的、以花生的主要蛋白质——Arah1为指标的花生变应原的检测方法，以及其中所使用的花生变应原的检测试剂盒。

背景技术

由于自然环境的恶化、车辆或工厂等的排气、住宅的开发等、或者食物的变化等各种因素，目前每3人中即有1人患有各种变态反应疾病。特别是食物变态反应是由于摄取了食品中所含的变态反应诱发物质(以下称为食物变应原)而引起的有害免疫反应，引发皮肤炎、哮喘、消化道障碍、过敏性休克等，上述食物变态反应的患者逐渐增加，因此在医学上和食品工业上产生了深刻的问题。这些危害甚至威胁到生命，必需采取措施防患于未然。因此，通过标识向消费者提供信息的必要性提高，FAO/WHO食品规格起草联合委员会同意在含有已知为变态反应物质的8种原材料的食品上进行上述内容的标识，成员国分别研讨了适合各国制度的标识方法(1999年6月)。日本研讨了以往的健康危害等的程度、频率，对于有引起严重的变态反应症状的实例的24种食品规定了其标识方法(自2002年4月起实行)。已知引起变态反应的食品有卵类、牛乳类、肉类、鱼类、贝壳类和软体动物类、谷类、豆类和干果类、果实类、蔬菜类、啤酒酵母或明胶等，还特别已知乳变应原的主要成分是αs1酪蛋白、乳清变应原的主要成分是β乳球蛋白、卵清变应原成分是卵白蛋白和卵类粘蛋白、小麦变应原的主要成分是麦醇溶蛋白、荞麦的主要蛋白质是分子量24kDa和76kDa的蛋白质、花生的主要蛋白质是Ara h1。

以往，变应原的检测方法例如有：对与变应原特异性反应的免疫球蛋白进行定量的方法(参照日本特开平05-249111号公报)、或者对含有抗原抗体复合物的检样中的该抗原抗体复合物进行酸处理等，使其解离，根据需要用碱进行中和处理，然后测定该检样中的变应原特异性IgE抗体的方法(参照日本特开平07-140144号公报)等。

现在检测乳、卵、小麦、荞麦、花生的特定原材料的公定方法是：使用由加热·非加热复合抗原得到的多克隆抗体进行的免疫学检测方法(参照日本特开2003-155297号公报；以下称为“市售公定法A”)，或者使用由纯化抗原得到的多克隆抗体进行的免疫学检测方法(以下称为“市售公定法B”)。它们都是特异性检测变应原的有效的方法，但是也存在很多问题。例如，在市售公定法A中，由于使用复合抗原，是针对何种物质的抗体不明确，交叉性高，例如无法通过免疫印迹法等进行抗原的鉴定，另外有非特异性反应增加的可能性。而市售公定法B中，抗原得到纯化，因此抗体的特异性是明确的，但是由于使用了用未变性的抗原制备的抗体，而变性/未变性导致的抗体结合程度有很大差别，因此即使相同的添加量，在加热前、加热后，其定量值也不同。特别是小麦在其它特定原材料(卵、乳、荞麦、花生)中常被实施严酷的加热处理(例如面包、油炸等)，小麦变应原由未变性至加热变性，以广范的状态存在。因此为了检测小麦变应原，必须制备明确了与何种状态的变应原结合的单克隆抗体，根据其特性加以利用。

关于卵的鉴定、定量，已知有以卵类粘蛋白为指标，使用多克隆抗体的方法(例如参照Int.Archs.Allergy appl.Immun.，75，8-15，1984)或者使用单克隆抗体的方法(例如参照Nutr.Sci.Vitaminol.45，491-500，1999)。还有报告提出了：作为识别卵类粘蛋白的单克隆抗体，使用与未变性卵类粘蛋白反应但不与热变性卵类粘蛋白反应的单克隆抗体、与热变性卵类粘蛋白反应但不与未变性卵类粘蛋白反应的单克隆抗体、以及与未变性卵类粘蛋白和热变性卵类粘蛋白反应的单克隆抗体，也识别加热变性状态，并对卵类粘蛋白进行定量，由此可以对卵变应原进行鉴定和正确的定量的免疫学定量方法(例如参照日本特开2002-253230号公报)。

发明内容

本发明的目的在于提供：在含有乳变应原、卵清变应原、小麦变应原、荞麦变应原或花生变应原的食品中，在变性/未变性的任何状态都可以检测乳变应原、卵清变应原、小麦变应原、荞麦变应原或花生变应原的高灵敏度的免疫学检测方法和其中所使用的检测试剂盒等。

本发明人对于检测特定原材料乳、卵清、小麦、荞麦或花生的各变应原的方法进行了深入研究，发现：使用识别未变性和变性的乳变应原、未变性和变性的卵清变应原、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或未变性和变性的花生变应原的各两种或以上单克隆抗体，则可以检测这些特定原材料的各变应原。

在对特定原材料之一的乳的检测方法进行研究时，以酪蛋白的主要蛋白质αs1酪蛋白为指标，制备了抗该蛋白的单克隆抗体(以下可称为MAb)，从其中选择多个可识别未变性αs1酪蛋白、尿素处理αs1酪蛋白、未变性酪蛋白钠、和变性酪蛋白钠的MAb，通过夹层ELISA，发现了可在100-1000ppb的浓度范围内对未变性αs1酪蛋白、尿素处理αs1酪蛋白、未变性酪蛋白钠、和变性酪蛋白钠进行定性且定量分析的MAb的组合。还确认：使用这些MAb，无论食品中的乳变应原经受任何加工步骤，利用本发明检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便地从检查对象制品中检测出乳变应原。

在对特定原材料之一的乳的检测方法进行研究时，以乳清的主要蛋白质β乳球蛋白为指标，制备抗该蛋白的单克隆抗体，从其中选择多个可识别未变性β乳球蛋白、尿素处理β乳球蛋白、还原羧甲基化β乳球蛋白等的MAb，通过夹层ELISA，发现了可在30-1000ppb的浓度范围内对未变性β乳球蛋白、尿素处理β乳球蛋白、还原羧甲基化β乳球蛋白进行定性且定量分析的MAb的组合。并确认：使用这些MAb，则不管食品中的乳变应原经过任何加工步骤，利用本发明的检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便的从检查对象制品中检测出乳变应原。

在对特定原材料之一的卵清的检测方法进行研究时，制备抗纯化卵白蛋白或卵类粘蛋白的单克隆抗体，从其中分别选择多个可与未变性抗原结合的MAb和可与变性抗原结合的MAb，发现：通过未变性抗原结合MAb群和变性抗原结合的MAb群的组合，不管作为抗原的卵白蛋白或卵类粘蛋白处于变性/未变性的任何状态，都可高灵敏度检测，特别是将未变性抗原结合MAb群和变性抗原结合MAb群组合使用时，即使只存在未变性卵白蛋白或卵类粘蛋白、或者只存在变性卵白蛋白或卵类粘蛋白，也可以以比单独使用未变性抗原结合Mab(群)或单独使用变性抗原结合Mab(群)更优异的检测灵敏度进行检测。通过将卵清变应原——卵白蛋白和卵类粘蛋白的MAb组合使用，无论食品中的卵清经过任何加工步骤，利用本发明的检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便地从检查对象制品中检测出卵清变应原。

在对特定原材料之一的小麦的检测方法进行研究中，制备抗纯化麦醇溶蛋白的单克隆抗体，从其中选择多个可识别未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麦麦醇溶蛋白、以及变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的MAb，通过夹层ELISA，发现了可在10-100ppb的浓度范围内对未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麦麦醇溶蛋白、和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白进行定性且定量的分析的MAb的组合。使用这些MAb，食品中的小麦变应原无论经过任何加工步骤，利用本发明的检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便的从检查对象制品中检测出小麦变应原。

在对特定原材料之一的荞麦的检测方法进行研究时，制备抗纯化的24kDa蛋白质或纯化的76kDa蛋白质的单克隆抗体，从其中选择多个可识别24kDa蛋白质或76kDa蛋白质的MAb，通过夹层ELISA，发现了即使是未加热(未变性)、加热(变性)的任何状态的荞麦蛋白质，都可以进行高灵敏度分析的、可与未变性荞麦蛋白质结合的MAb和可与变性荞麦蛋白质结合的MAb的组合。使用这些MAb，无论食品中的荞麦变应原经过任何加工步骤，利用本发明的检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便的从检查对象制品中检测出荞麦变应原。

在对特定原材料之一的花生的检测方法进行研究时，制备抗纯化的未变性Ara h1(以下可称为“NAh1”)或用尿素和2-巯基乙醇对纯化的Ara h1进行变性的Ara h1(以下可称为“DAh1””)的单克隆抗体，从其中选择多个可识别NAh1、DAh1、未变性的花生粗蛋白(以下可称为“NP-e”)、和/或尿素处理的花生粗蛋白(以下可称为“DP-e”)的MAb，通过夹层ELISA，发现了对未加热(未变性)、加热(变性)的任何状态的花生蛋白质都可以高灵敏度分析的MAb的组合。使用这些MAb，无论食品中的花生变应原经过任何加工步骤，利用本发明的检测方法或检测试剂盒的人都可以更简便的从检查对象制品中检测出花生变应原。

附图简述

图1是表示使用本发明(乳变应原)的两种抗αs1酪蛋白MAb对各种状态的αs1酪蛋白的反应的夹层ELISA结果图。

图2是表示本发明(乳变应原)的Pas1CN1和Pas1CN2所识别的小麦αs1酪蛋白的构成蛋白质的差异的图。

图3是通过夹层ELISA，表示本发明(乳变应原)的PLG2和PLG1对各种β乳球蛋白的反应性的图。

图4是通过夹层ELISA，表示本发明(乳变应原)的PLG2和PLG3对各种β乳球蛋白的反应性的图。

图5是通过夹层ELISA，表示本发明(乳变应原)的MAb混合系对未变性乳球蛋白的反应性的图。

图6是通过夹层ELISA，表示本发明(乳变应原)的MAb混合系对尿素变性的乳球蛋白的反应性的图。

图7是抗卵白蛋白MAb对本发明(卵清变应原)试验1中各稀释梯度的反应性的图。

图8是表示抗卵白蛋白MAb对本发明(卵清变应原)试验2中各稀释梯度的反应性的图。

图9是表示抗卵白蛋白MAb对本发明(卵清变应原)的试验3中各稀释梯度的反应性的图。

图10是通过夹层ELISA，表示本发明(卵清变应原)的PNOM1和PNOM2对变性/未变性卵类粘蛋白的反应性的图。

图11是通过夹层ELISA，表示本发明(卵清变应原)的PDOM1和PDOM2对变性/未变性卵类粘蛋白的反应性的图。

图12是表示本发明(卵清变应原)的PNOM2和PDOM2以及PNOM1和PDOM1对变性/未变性卵类粘蛋白的反应性的图。

图13是使用本发明(小麦变应原)的两种抗麦醇溶蛋白MAb对各种状态的麦醇溶蛋白的反应的夹层ELISA结果图。

图14是表示本发明(小麦变应原)的PGL1和PGL2所识别的小麦麦醇溶蛋白的构成蛋白质的差异的图。

图15是通过夹层ELISA，表示本发明(荞麦变应原)的PBW2和PBW3对各种荞麦粗蛋白的反应性的图。

图16是通过夹层ELISA，表示本发明(荞麦变应原)的PBW1和PBW2对各种荞麦粗蛋白的反应性的图。

图17是通过夹层ELISA，表示本发明(荞麦变应原)的PBW1、PBW2和PBW3的MAb混合系对未变性荞麦粗蛋白的反应性的图。

图18是通过夹层ELISA，表示本发明(荞麦变应原)的PBW1、PBW2和PBW3的MAb混合系对变性荞麦粗蛋白的反应性的图。

图19是通过夹层ELISA，表示本发明(花生变应原)的PAh1-1、PAh1-2对各种花生粗蛋白的反应性的图。

图20是通过夹层ELISA，表示本发明(花生变应原)的PAh1-2和PAh1-3对各种花生粗蛋白的反应性的图。

图21是通过夹层ELISA，表示本发明(花生变应原)的PAh1-1、PAh1-2和PAh1-3的MAb混合系对未变性花生粗蛋白的反应性的图。

图22是过夹层ELISA，表示本发明(花生变应原)的PAh1-1、PAh1-2和PAh1-3的MAb混合系对变性花生粗蛋白的反应性的图。

实施发明的最佳方式

本发明的食品中的变应原的检测方法是使用识别未变性和变性的乳变应原、未变性和变性的卵清变应原、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或者未变性和变性的花生变应原的各两种或以上单克隆抗体进行的变应原的检测方法，只要是以乳酪蛋白的主要蛋白质αs1酪蛋白、乳清的主要蛋白质β乳球蛋白、卵清的主要蛋白质卵白蛋白和卵类粘蛋白、小麦的主要蛋白质麦醇溶蛋白、荞麦的主要蛋白质——分子量24kDa和76kDa的蛋白质、或花生的主要蛋白质Ara h1为指标的、食品等中所含的变应原的检测方法即可，没有特别限定。

本发明的乳变应原的检测方法只要是将识别未变性乳变应原的单克隆抗体和识别变性乳变应原的单克隆抗体结合使用的乳变应原的免疫学检测方法即可，没有特别限定，另外本发明的乳变应原检测试剂盒只要是具备识别未变性乳变应原的单克隆抗体、识别变性乳变应原的单克隆抗体，在将识别未变性乳变应原的单克隆抗体和识别变性乳变应原的单克隆抗体结合使用的条件下使用的免疫学变应原检测试剂盒即可，没有特别限定，但优选具备分别识别不同表位的2种或以上的单克隆抗体作为识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体。所述识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体，可具体例如抗αs1酪蛋白单克隆抗体或抗β乳球蛋白单克隆抗体。这里，“乳变应原”是指含有乳酪蛋白的主要蛋白质αs1酪蛋白和/或乳清的主要蛋白质β乳球蛋白的物质。

上述抗αs1酪蛋白单克隆抗体可以是识别未变性αs1酪蛋白、尿素处理αs1酪蛋白、未变性酪蛋白钠和变性酪蛋白钠的抗αs1酪蛋白单克隆抗体，优选例如识别SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列中从第132号-第193号的区域的单克隆抗体，具体来说，优选例如杂交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1、杂交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2等。将Pas1CN1和Pas1CN2组合，可特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如，使用这些抗体，通过夹层ELISA，可以在10-1000ppb的浓度范围内对食品中的未变性αs1酪蛋白和尿素处理αs1酪蛋白进行定性且定量的分析。

上述抗β乳球蛋白单克隆抗体可以是识别未变性β乳球蛋白、尿素处理β乳球蛋白、还原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白单克隆抗体，具体可优选例如：杂交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG1、杂交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG2、杂交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG3等。另外，通过将PLG2和PLG1、PLG2和PLG3、PLG2和PLG1和PLG3组合，可特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如使用这些抗体，通过夹层ELISA，可以在30-1000ppb的浓度范围内对食品中的未变性β乳球蛋白和尿素处理β乳球蛋白进行定性且定量的分析。

本发明的乳变应原的检测方法中，优选使用尿素和2-巯基乙醇从检样中萃取酪蛋白和/或乳清蛋白，还优选使用识别未变性酪蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性酪蛋白的1种或多种单克隆抗体，以及识别未变性β乳球蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性β乳球蛋白的1种或多种单克隆抗体。本发明的乳变应原检测试剂盒中，优选含有用于萃取酪蛋白和/或乳清蛋白的尿素和2-巯基乙醇，还优选具备识别未变性酪蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性酪蛋白的1种或多种单克隆抗体，以及识别未变性β乳球蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性β乳球蛋白的1种或多种单克隆抗体。

作为本发明的卵清变应原的检测方法，只要是将识别未变性卵清变应原的单克隆抗体和识别变性卵清变应原的单克隆抗体结合使用的卵清变应原的免疫学检测方法即可，没有特别限制，另外本发明的卵清变应原检测试剂盒只要是具备识别未变性卵清变应原的单克隆抗体和识别变性卵清变应原的单克隆抗体，在将识别未变性卵清变应原的单克隆抗体和识别变性卵清变应原的单克隆抗体结合使用的条件下使用的免疫学变应原检测试剂盒即可，没有特别限定，优选具备识别分别不同的表位的2种或以上的单克隆抗体，作为识别未变性卵清变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体。所述识别未变性卵清变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体可具体例如抗卵白蛋白单克隆抗体或抗卵类粘蛋白单克隆抗体。这里“卵清变应原”是指含有卵清的主要蛋白质卵白蛋白和/或卵类粘蛋白的物质。

上述抗卵白蛋白单克隆抗体优选为识别未变性卵白蛋白和/或还原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白单克隆抗体，具体例子有：杂交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA1、杂交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA2、杂交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA1、杂交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA2等。通过PNOA1和PNOA2等抗未变性卵白蛋白单克隆抗体、或者PDOA1和PDOA2等抗变性卵白蛋白单克隆抗体的组合，特别是将PNOA1和PNOA2等抗未变性卵白蛋白单克隆抗体与PDOA1和PDOA2等抗变性卵白蛋白单克隆抗体组合，可特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如，使用这些抗体，通过夹层ELISA，可以在1.0-10.0ppb的浓度范围内对食品中的未变性卵白蛋白和/或变性卵白蛋白进行定性且定量的分析。

上述抗卵类粘蛋白单克隆抗体可例如识别未变性卵类粘蛋白和/或尿素变性卵类粘蛋白的抗卵类粘蛋白单克隆抗体，具体例子有：杂交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM1、杂交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM2、杂交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM1、杂交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM2等。通过PNOM1和PNOM2等抗未变性卵类粘蛋白单克隆抗体、或者PDOM1和PDOM2等抗变性卵类粘蛋白单克隆抗体的组合，特别是通过将PNOM1和PNOM2等抗未变性卵类粘蛋白单克隆抗体与PDOM1和PDOM2等抗变性卵类粘蛋白单克隆抗体组合，可特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如，使用这些抗体，通过夹层ELISA，可以在10-100ppb的浓度范围内对食品中的未变性卵类粘蛋白和/或变性卵类粘蛋白进行定性且定量的分析。

本发明的卵清蛋白变应原的检测方法中，优选使用尿素和2-巯基乙醇对卵白蛋白和/或卵类粘蛋白进行萃取，还优选使用识别未变性卵白蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性卵白蛋白的1种或多种单克隆抗体，以及识别未变性卵类粘蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性卵类粘蛋白的1种或多种单克隆抗体。本发明的卵清蛋白变应原检测试剂盒中，优选含有用于萃取卵白蛋白和/或卵类粘蛋白的尿素和2-巯基乙醇，还优选具备识别未变性卵白蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性卵白蛋白的1种或多种单克隆抗体，以及识别未变性卵类粘蛋白的1种或多种单克隆抗体和识别变性卵类粘蛋白的1种或多种单克隆抗体。

本发明的小麦变应原的检测方法只要是使用识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体进行的小麦变应原的免疫学检测方法，或者是识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白、且将识别不同表位的两种抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体结合使用的小麦变应原的免疫学检测方法即可，没有特别限制，本发明的小麦变应原检测试剂盒只要是具备识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒，或者是具备识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白、且识别不同表位的两种抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒即可，没有特别限制，上述抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体优选为识别未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麦麦醇溶蛋白、以及变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体，具体例子有：杂交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1、杂交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2等。将这些抗体组合，特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如通过夹层ELISA，可以在10-100ppb的浓度范围内对食品中的未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麦麦醇溶蛋白、和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白进行定性且定量的分析。

本发明的荞麦变应原的检测方法只要是使用识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体进行的荞麦变应原的免疫学检测方法，或者是将识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白、且识别不同表位的两种抗荞麦粗蛋白单克隆抗体结合使用的荞麦变应原的免疫学检测方法即可，没有特别限制，本发明的荞麦变应原检测试剂盒只要是具备识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒，或者是具备识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白、且识别不同表位的2种抗荞麦粗蛋白单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒即可，没有特别限制，抗荞麦粗蛋白单克隆抗体优选识别24kDa蛋白质和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体、或者识别76kDa蛋白质和未变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体，具体例子有：杂交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW1、杂交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2、杂交瘤(FERM ABP-10274)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW3等。通过PBW1等识别24kDa蛋白质和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体和PBW2等识别76kDa蛋白质和未变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体的组合，或者PBW2和PBW3等均识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体的组合，其中，以这些单克隆抗体的混合系的形式的组合，特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如通过夹层ELISA，可在10-1000ppb的浓度范围内对未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白进行定性且定量的分析。

本发明的荞麦变应原的检测方法中，优选使用尿素和2-巯基乙醇从检样中萃取加热变性荞麦粗蛋白，本发明的荞麦变应原检测试剂盒优选具备尿素和2-巯基乙醇，以作为从检样中萃取荞麦粗蛋白的萃取剂。

本发明的花生变应原的检测方法只要是使用识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体进行的花生变应原的免疫学检测方法，或者是将识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质、且识别不同表位的2种抗Ara h1蛋白质单克隆抗体结合使用的花生变应原的免疫学检测方法即可，没有特别限定，本发明的花生变应原检测试剂盒只要是具备识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质的抗花生Ara h1蛋白质单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒，或者是具备识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质、且识别不同表位的2种抗花生Ara h1蛋白质单克隆抗体的免疫学变应原检测试剂盒即可，没有特别限定，抗Ara h1蛋白质单克隆抗体优选识别未变性Ara h1蛋白质和未变性花生粗蛋白、和/或尿素处理的Ara h1蛋白质和尿素处理的花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体，具体例子有：杂交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-1、杂交瘤(FERM ABP-10270)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-2、杂交瘤(FERMABP-10271)生成的抗加热变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-3等。通过PAh1-1等识别未变性Ara h1蛋白质和未变性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体、和PAh1-2等识别未变性/变性Ara h1蛋白质和未变性/变性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体的组合，或者PAh1-2和PAh1-3等识别未变性/变性Ara h1蛋白质和未变性/变性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体之间的组合，其中通过以这些单克隆抗体的混合系的形式的组合，特别有利于进行夹层ELISA或免疫色谱。例如通过夹层ELISA，可以在10-1000ppb的浓度范围内对未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质进行定性且定量的分析。

本发明的花生变应原的检测方法中，优选使用尿素和2-巯基乙醇从检样中萃取加热变性花生粗蛋白，本发明的花生变应原检测试剂盒优选具备尿素和2-巯基乙醇，以作为从检样中萃取加热变性花生粗蛋白的萃取剂。

以上本发明的免疫学变应原检测方法包含以下阶段：将含有未变性/变性的乳变应原、未变性和变性的卵清蛋白变应原、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或未变性和变性的花生变应原(以下可称为“食物变应原”)的试样与标记的抗食物变应原MAb接触，或者在标记抗体存在下与食物变应原MAb接触，通过抗原抗体反应，标记免疫复合物的形式捕捉的免疫反应阶段；使用存在于该分子中的标记物质对生成的该免疫复合物进行分离·测定的检测阶段，所述免疫反应阶段中的抗原抗体反应方法没有特别限定，例如有以下方法。

将试样中的食物变应原捕捉到与不溶性载体结合的本发明的抗食物变应原Mab上，然后与标记抗IgG抗体反应的夹层法；使用标记抗食物变应原MAb(第二抗体)的夹层双抗法，其中所述第二抗体识别与抗食物变应原MAb不同的表位，所述抗食物变应原Mab与不溶性载体结合；在标记抗原存在下，使与不溶性载体结合的抗食物变应原Mab与试样中的食物变应原反应的竞争法；使含有食物变应原的试样和与其特异性反应的磁珠结合标记抗食物变应原MAb作用，然后通过磁力进行分离的检测免疫复合物中的标记物质的磁珠法；使含有食物变应原的试样和与其特异性反应的标记抗食物变应原MAb作用，凝集沉淀，然后通过离心进行分离的检测免疫复合物中的标记物质的凝集沉淀法；用胶体金等标记的抗食物变应原MAb与作为食物变应原的蛋白质结合，所得抗原抗体复合物通毛细管现象等在测试条上移动，在这个过程中，预先将与食物变应原结合的抗食物变应原MAb固定，通过捕捉抗原抗体复合物而出现染色条带，通过该染色条带的有无进行定性分析的免疫色谱法；除此之外还可利用双重免疫扩散法、放射免疫扩散法等公知的免疫测定法，优选使用分别识别不同的表位的2种或以上单克隆抗体作为抗食物变应原MAb的方法，例如从可在100-1000ppb的浓度范围内对食品中的未变性变应原和/或变性变应原进行定性且定量分析的高灵敏度方面考虑，优选夹层双抗法，从定性简便性考虑，优选免疫色谱法。另外，从肉食制品等食品试样中萃取变应原时，优选使用尿素和2-巯基乙醇。

上述抗原抗体反应中使用的不溶性载体例如有：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等高分子化合物，其它有玻璃、金属、磁性颗粒及它们的组合等，不溶性载体的形状例如可使用托盘状、球状、纤维状、棒状、盘状、容器状、胞状、微孔板状、试管、胶乳珠状等各种形状。抗原或抗体向这些不溶性载体上固体的方法没有特别限定，可以使用物理吸附法、共价键法、离子键法等。

本发明的食物变应原检测方法或食物变应原检测试剂盒中所使用的抗食物变应原MAb的免疫球蛋白的类和型没有特别限定，抗食物变应原MAb优选使用IgG类κ型的抗体。单克隆抗体的形式可以采用完整抗体或F(ab’)₂、Fab等片段。抗体的来源没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、人、兔、鸡等。从制备的简便性考虑，优选使用来自小鼠的单克隆抗体。抗食物变应原MAb可如下制备：用未变性或变性的αs1酪蛋白免疫动物，将从中采集的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，将制备的杂交瘤在培养基上培养，或者施用于动物腹腔内，在腹水内增殖，然后从该培养物或腹水中采集。

生成抗食物变应原Mab的杂交瘤可如下制备：例如使用未变性和/或变性的食物变应原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的抗体生成细胞与小鼠杂交瘤细胞按照常规方法进行细胞融合，通过免疫荧光染色图谱进行筛选，制备生成抗食物变应原Mab的杂交瘤。上述抗体生成细胞可以是：例如施用未变性和/或变性的食物变应原或含有该变应原的组合物，从免疫动物得到的脾脏细胞、淋巴结细胞、B-淋巴细胞等。免疫动物有：小鼠、大鼠、兔、马等。免疫可如下进行：例如将未变性和/或变性的食物变应原直接或与适当的佐剂一起施用于动物的皮下、肌肉或腹腔内，以1-2次/月、1-6个月的频率和期间施用。抗体生成细胞的分离可通过从最终免疫2-4天后的免疫动物中采集。骨髓瘤细胞可使用来自小鼠、大鼠的骨髓瘤细胞等。优选抗体生成细胞和骨髓瘤细胞来自同种动物。

细胞融合可如下进行：例如在Dulbecco’s改良eagle培养基(DMEM)等培养基中、在聚乙二醇等融合促进剂存在下，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞混合。细胞融合结束后，用DMEM等适当稀释、离心，将沉淀悬浮于HAT培养基等选择性培养基中进行培养，选择杂交瘤，接着使用培养上清，通过酶抗体法选择生成抗体的杂交瘤，通过有限稀释法等进行克隆，可得到生成抗食物变应原MAb的杂交瘤。另外也可以从只使用αs1酪蛋白等未变性的食物变应原进行免疫的抗免疫动物中有效地得到抗变性食物变应原MAb。此时，可以筛选抗变性αs1酪蛋白MAb等生成抗变性食物变应原Mab的杂交瘤，或者通过固相状态的ELISA，选择生成抗未变性的αs1酪蛋白等未变性食物变应原的单克隆抗体的杂交瘤，从该生成抗体的杂交瘤所生成的单克隆抗体中，可以得到只在液相状态下与未变性的食物变应原特异性反应的抗食物变应原MAb。如上所述，可以将生成抗体的杂交瘤在培养基中或生物体内培养，从培养物中采集单克隆抗体，不过从培养物或腹水中分离·纯化单克隆抗体的方法只要是蛋白质纯化常用的方法即可，可以是任何方法，例如可以通过IgG纯化中通常使用的硫酸铵分离法、阴离子交换物或蛋白A、G等的柱层析法进行。

另外，标记抗体制备中所使用的标记物只要是通过单独或与其它物质反应产生可检测的信号的标记物即可，可以使用酶、荧光物质、化学发光物质、放射性物质、胶体金等，酶有：过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖过氧化物酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、脱辅基葡糖氧化酶(アポグルコ一スオキシダ一ゼ)、脲酶、萤光素酶或乙酰胆碱酯酶等，荧光物质有荧光素异硫氰酸酯、藻胆蛋白、稀土金属螯合物、丹磺酰氯或四甲基罗丹明异硫氰酸酯等，发光物质有：鲁米诺类、ジオキセタン、吖啶鎓盐类等，放射性物质有³H、¹⁴C、¹²⁵I或¹³¹I等。标记物质为酶时，为测定其活性，可以使用底物、根据需要使用显色剂、荧光剂、发光剂等。

本发明的食物变应原检测试剂盒含有作为有效成分的抗食物变应原MAb，优选分别识别不同的表位的2种或以上的抗食物变应原MAb，从保存稳定性角度考虑，与溶液状态相比，优选以冻干物的形式保存，检测试剂盒除含有所述抗食物变应原MAb溶解所需的缓冲液或培养液之外，还可以含有用于制备试样的缓冲液等。更优选的本发明抗食物变应原检测试剂盒方案是上述免疫色谱法中的测试条。这种情况下，优选将识别不同表位的两种单克隆抗体的至少一种制成免疫色谱中使用的胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体有：杂交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1、杂交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2、杂交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG1、杂交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG2、杂交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PLG3、杂交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA1、杂交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA2、杂交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA1、杂交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA2、杂交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM1、杂交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM2、杂交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM1、杂交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM2、杂交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1、杂交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2、杂交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW1、杂交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2、杂交瘤(FERMABP-10274)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW3、杂交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-1、杂交瘤(FERM ABP-10270)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-2、杂交瘤(FERM ABP-10271)生成的抗加热变性Arah1蛋白质单克隆抗体PAh1-3，这些杂交瘤于2005年2月14日(领受日)被独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(

305-5466日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第六)领受。上述Pas1CN1(FERM P-20206)、Pas1CN2(FERM P-20207)、PNOA1(FERM P-20208)、PNOA2(FERM P-20209)、PGL1(FERMP-20210)、PGL2(FERM P-20211)于2004年9月7日(受托日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。

以下通过实施例更具体的说明本发明，本发明的技术范围并不受这些举例的限定。

实施例1

1.抗αs1酪蛋白单克隆抗体的确立

1-1材料和方法

1)αs1酪蛋白(以下称为“αCN”)的制备

按照Zittle(1959)的方法，从新鲜的牛乳中得到αCN的粗组分。再使用TSK凝胶DEAE 650S(TOSOH)，通过含有50mM咪唑-HCl缓冲液(pH 6.4)、4M尿素的NaCl线性梯度(0-0.3M)，对该粗组分进行纯化。将纯化的αCN组分用蒸馏水进行透析，然后冷冻干燥。用生理盐水制成该冻干物的0.1％溶液，分别以500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，在免疫之前在-20℃冷冻保存，作为抗原溶液。

2)免疫

使用5只6周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫时，将完全弗氏佐剂(Difco制造)等量加入到装有500μl 0.1％的αCN的Eppendorf管中，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。另外以3周的间隔进行两次追加免疫。免疫时，将不完全弗氏佐剂(Difco)等量加入到装有500μl 0.1％的αCN的Eppendorf管中，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

在初次或追加免疫中，在注射αCN一周后，从各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温下放置两小时，然后离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA，检测小鼠血液中的抗αCN抗体效价。二次抗体采用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照

和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠由尾部静脉注射100μl 0.1％αCN溶液。静脉注射4天后，从小鼠体内无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1000rpm×10分钟的离心，收集脾细胞，再次悬浮于RPMI1640，进行细胞计数。将该脾细胞悬浮液和骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液按照细胞数10∶1混合，再次进行1000rpm×10分钟的离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量为3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，稀释后通过离心得到颗粒。向该颗粒中加入HAT选择性培养基，分注到24孔细胞培养板(Becton Dickinson)中，使细胞数为5×10⁶个细胞/孔，在5％CO₂下、在37℃培养。其中所述HAT选择性培养基是杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素等RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体用于试验，测定生成抗αCN抗体的杂交瘤的存在。将ELISA测定中对αCN显示阳性的孔的杂交瘤转移到96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，使细胞数为0.9个细胞/孔，进行有限稀释法克隆。将4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，以5×10⁶个细胞/孔加入到96孔细胞培养板的各孔中。克隆的杂交瘤的培养使用含有10％胎牛血清、40mM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对未变性αCN(以下称为“N-αCN)”、尿素处理αCN(以下称为“D-αCN”)、市售的酪蛋白钠的未变性物(以下称为“N-CN”)或市售的酪蛋白钠的尿素处理物(以下称为“D-CN”)四种蛋白质的反应性的不同来得到特异性不同的克隆。D-αCN如下获得：称量1mg纯化αCN，加入100μl 5％EDTA、6.0g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇、1ml 50mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，在100℃油浴中加热1小时，进行变性处理。培养上清对N-αCN、D-αCN、N-CN或D-CN的反应性通过非竞争法ELISA检测。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先对BALB/c小鼠腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆的杂交瘤。腹水潴留后，用针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的类、亚类和型

通过Monoclonal mouse immunoαC N obulin isotyping kit(Pharmingen)，MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

将纯化的Mab用于夹层ELISA，分别进行生物素化处理。用50mM的碳酸缓冲液(pH 8.5)制成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌，然后一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换为20mg/ml。

1-2结果

1)MAb的选择

得到了6种特异性识别乳的主要变应原αs1酪蛋白(αCN)的MAb。通过直接ELISA检测这6种MAb对于分别制成固相的各抗原N-αCN、D-αCN、N-CN、或D-CN的特异性。还对这些MAb的类、亚类进行了检测。结果如表1所示。表1中，+表示对各固相抗原为阳性，—表示阴性。如表1所示，选择出与所有状态的抗原结合的MAb——Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3。

[表1]

MAb名	N-αCN	D-αCN	N-CN	D-CN	类、亚类和型
						Pas1CN1	+	+	+	+	IgG1(κ)
Pas1CN2	+	+	+	+	IgG1(κ)
						Pas1CN3	+	+	+	+	IgG1(κ)
Pas1CN4	+	-	+	-	IgG1(κ)
						Pas1CN5	+	-	+	-	IgG1(κ)
Pas1CN6	+	-	+	-	IgG1(κ)

2)夹层ELISA中的组合条件

使用通过直接ELISA选择的Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3，对全部的MAb的组合进行夹层ELISA。将Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3分别制成固相或生物素化抗体，通过夹层ELISA选出了用于检测αCN或CN的MAb的组合。结果选择出Pas1CN1(FERMABP-10263)和Pas1CN2(FERM ABP-10264)作为可以检测N-αCN、D-αCN、N-CN、D-CN的组合。结果如图1所示。

2.Pas1CN1、Pas1CN2所识别的表位

将αs1酪蛋白溶液用赖氨酰内切蛋白酶分解，通过トリミン-SDS-PAGE(16.5％分离凝胶、5％浓缩凝胶)分离分解物。使用分离的凝胶，通过电印迹转印PVDF膜。将Pas1CN1和Pas1CN2的培养上清(1/1000)与转印的PVDF膜反应，然后显色，确认所识别的表位。结果如图2所示。结果，Pas1CN1和Pas1CN2均识别分子量约7000、SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白氨基酸序列第132号-193号的区域。

3.通过夹层ELISA检测食品中变性或未变性酪蛋白

通过上述1中选择的Pas1CN1和Pas1CN2的组合，尝试检测实际食品中的酪蛋白。

3-1材料和方法

1)模型肉食制品的制备

选择肉食制品作为定量试验的模型食品，按照表2所示的配比制备含有各浓度酪蛋白钠的模型肉食制品。猪瘦肉是从猪上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm绞肉使用。

[表2]

模型肉食制品的配比表

原材料	测试1	测试2	测试3	对照
					猪瘦肉(％)	83.0	83.0	83.0	83.0
NaCl(％)	2.0	2.0	2.0	2.0
					多磷酸钠(％)	0.2	0.2	0.2	0.2
亚硝酸钠(ppm)	120	120	120	120
					抗坏血酸钠(ppm)	300	300	300	300
水	14.5	14.5	14.5	14.5
					酪蛋白钠(ppm)	200	20	2	0
合计(％)	99.762	99.744	99.7422	99.742

按照各配比称量添加物，用食品加工机混合，进行氯乙烯管的填充，在75℃加热30分钟。

2)通过夹层ELISA进行定量分析

将各模型肉食制品用食物处理机均匀磨碎，作为分析用样品。称量2g样品，加入38g含有1M尿素和0.1％2-巯基乙醇的PBST，在100℃进行1小时加热处理。冷却后，进行3,000rpm×20分钟的离心，向0.5ml上清中加入9.5ml PBST，作为ELISA用样品。校正曲线使用同样进行了尿素、2-巯基乙醇处理的酪蛋白钠的梯度稀释品。与用PBST从分析样品中进行萃取、使用溶解于PBST(向PBS中加入0.5％聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯)的酪蛋白钠作为校正曲线、但不使用尿素和2-巯基乙醇的情况进行比较。

3-2结果

关于通过夹层ELISA对模型肉食制品中的酪蛋白钠进行的分析，使用尿素和2-巯基乙醇的结果如表3所示，只用PBST萃取的结果如表4所示。

[表3]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	235.4	16.4	1.5	N.D.*2
					回收率(％)*1	117.7	82.0	75.0	-

^*1：(分析值/添加量)×100

^*2：未检出

[表4]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	16.1	1.7	N.D.*2	N.D.
					回收率(％)*1	8.1	8.5	-	-

^*1：(分析值/添加量)×100

^*2：未检出

由以上结果可知：将尿素和2-巯基乙醇加入到萃取液中时，可以以高回收率检测模型肉食制品中的酪蛋白钠，而用PBST萃取则回收率非常低。由此可知：使用尿素和2-巯基乙醇对从食品中萃取酪蛋白钠非常有效，这种情况下可利用的MAb的特性必须是可以与尿素增溶的酪蛋白结合。

4.通过免疫色谱检测变性和未变性酪蛋白钠

4-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)制备成1mg/ml Pas1CN1的MAb溶液。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制备成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶制成OD525＝1.0。在玻璃纤维制的结合垫上涂布成68μl/cm²，进行干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS制成4mg/ml的Pas1CN2的MAb溶液，呈直线状涂布于硝基纤维素膜上，干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐温20的PBS、在37℃封闭2小时，然后用PBS清洗，干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

分别贴装上述制备的样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。将上述制备的模型肉食制品进行适当稀释，作为被检液使用。

4-2结果

通过Pas1CN2和胶体金标记Pas1CN1的组合，无论酪蛋白钠加热或非加热，都可以以最低50ppb(食品中2ppm)检测。该结果表明，不管是以制造工艺中混入的未变性酪蛋白钠为对象，还是以加热后的制品为对象，可以设计出在任何情况下都可以应对的免疫色谱条。

作为对照，在市售的变应原检测用免疫色谱条中滴加只含有0.01M尿素的PBS，此时产生非特异性条带，为假阳性。这表明：如果不使用蛋白质变性剂，那么可作为变应原检测的对象可能被限制在极狭窄的范围内。其中所述蛋白质变性剂用于有效从因加热等而变性的食品蛋白质中萃取变应原。

5.抗β乳球蛋白单克隆抗体的确立

5-1材料和方法

1)β乳球蛋白(以下可称为“βLG”)的制备

按照Zittle(1959)的方法，从新鲜的牛乳中得到乳清的粗组分。再使用TSK凝胶DEAE 650S(TOSOH)，通过50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 6.5)、NaCl的线性梯度(0-0.4M)对该粗组分进行纯化。通过蒸馏水对该纯化的βLG组分进行透析，然后冷冻干燥，制成未变性βLG(以下可称为“N-βLG”)。称量10mg该N-βLG，加入1ml 1.4M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、100μl 5％ EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巯基乙醇，定容为2.5ml，然后进行氮气置换，在37℃进行1小时的还原处理，再加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，用氮气置换，然后在室温下进行1小时的羧甲基化，制成还原羧甲基化βLG(以下可称为“R-βLG”)。用生理盐水将这些冻干物制成0.1％的溶液，分别以500μl分注于1ml容量的Eppendorf管中，在进行免疫之前在-20℃冷冻保存，作为抗原溶液。

2)免疫

使用5只5周龄的BALB/c小鼠作为供试动物。初次免疫时，向装有500μl 0.1％N-βLG或R-βLG的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。追加免疫以2周的间隔进行3次。免疫是将不完弗氏佐剂(Difco)等量加入装有500μl 0.1％N-βLG或R-βLG的Eppendorf管中，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

在初次或追加免疫中，在注射N-βLG或R-βLG一周后，分别从各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温下放置2小时，然后进行离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA，测定小鼠血液中抗N-βLG抗体效价和抗R-βLG抗体效价。二次抗体采用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(JacksonImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照

和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠由尾部静脉注射100μl 0.1％N-βLG溶液或R-βLG溶液。静脉注射4天后，从小鼠体中无菌摘除脾脏。将脾脏切细，然后用RPMI1640清洗，过无菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心，收集脾细胞，再悬浮于RPMI1640，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液按照细胞数10∶1混合，再次进行1,000rpm×10分钟的离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量为3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，稀释，通过离心制成颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，以5×10⁶个细胞/孔分注到24孔细胞培养板上(BectonDickinson)，在5％CO₂下、在37℃培养。其中所述HAT选择培养基是杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体用于试验，检测生成抗N-βLG或抗R-βLG抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对N-βLG或R-βLG显示阳性的孔的杂交瘤转移到96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，形成0.9个细胞/孔，进行有限稀释法克隆。另外将4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，以5×10⁶个细胞/孔加入到96孔细胞培养板的各孔中。克隆的杂交瘤的培养使用含有10％胎牛血清、40mM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基进行。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对N-βLG、R-βLG和尿素处理βLG(以下称为“D-βLG”)三种蛋白质的反应性的不同来获得特异性不同的克隆。D-βLG如下制备：称量1mg N-βLG，加入6.0g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇，1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，然后在100℃的油浴中加热1小时，进行变性处理。通过非竞争法ELISA，检测培养上清对N-βLG、R-βLG或D-βLG的反应性。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等的方法(1990)，首先向BALB/c小鼠腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的类、亚类和型

为了确定抗N-βLG MAb或抗R-βLG MAb的特性，采用固相法。固相法是将N-βLG、R-βLG或D-βLG预先固定于细胞培养板的孔内，使抗N-βLG MAb或抗R-βLG MAb作用于该固定化抗原的方法。通过Monoclonal mouse immunoα C N obulin isotyping kit(Pharmingen)，MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

为了用于夹层ELISA，分别将纯化的MAb进行了生物素化处理。用50mM的碳酸缓冲液(pH 8.5)制备成20mg/ml，加入10μl以3mg/100ml溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌，然后一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换成20mg/ml。

5-2结果

1)抗N-βLG MAb和抗R-βLG MAb的特性和类、亚类

得到了13种对N-βLG具有特异性的MAb。表5表示它们分别对固相抗原的特异性。

[表5]

MAb名	N-βLG	R-βLG	D-βLG	类、亚类和型
					751(P βLG1)	+	+	+	IgG1(κ)
752	+	-	-	IgG1(κ)
					753	+	-	-	IgG1(κ)
756	+	-	-	IgG1(κ)
					758	+	-	-	IgG1(κ)
759	+	-	-	IgG1(κ)
					761	+	+	-	IgG2a(κ)
763(P βLG2)	+	+	+	IgG1(κ)
					773	+	+	+	IgG1(κ)
778	+	-	-	IgG1(κ)
					781	+	-	+	IgG1(κ)
788	+	+	-	IgG1(κ)
					790	-	+	-	IgG1(κ)
796(P βLG3)	-	+	+	IgG1(κ)

2)夹层ELISA中的组合条件

将对固相抗原显示阳性的各MAb分别制成固相或生物素化抗体，从夹层ELISA的检测灵敏度考虑，选择出用于检测N-βLG和D-βLG的MAb的组合。结果，选择出平板固定化抗体PLG2(FERMABP-10282)、生物素化抗体PLG1(FERM ABP-10281)或PLG3(FERM ABP-10283)作为可检测N-βLG和D-βLG的组合。PLG2和PLG1对N-βLG和D-βLG的反应性的夹层ELISA结果如图3所示。PLG2和PLG3对N-βLG和D-βLG的反应性的夹层ELISA结果如图4所示。

3)通过MAb混合系检测N-βLG、D-βLG

使用通过夹层ELISA选择的组合(固相化PLG2、生物素化PLG1和PLG3)确认N-βLG和D-βLG的检测灵敏度，如图5和图6所示，MAb混合系中，MAb混合系对N-βLG、D-βLG的吸光值高，表明可以提高检测灵敏度。

6.通过夹层ELISA检测食品中的乳清蛋白

通过上述1中选择的PLG2和PLG1、以及PLG2和PLG3的组合，尝试是否可以检测实际食品中的乳清蛋白。

6-1材料和方法

1)模型肉食制品的制备

选择肉食制品作为定量试验的模型食品，按照表6所示的配比制备含有各浓度的乳清蛋白的模型肉食制品。猪瘦肉是从猪上等肉中去除脂肪、筋，制成5mm的绞肉使用。按照各配比称量添加物，用食品加工机混合，然后进行氯乙烯管的充填，在75℃加热30分钟。

[表6]

2)通过夹层ELISA进行定量分析

将各模型肉食制品用食品加工机均匀磨碎，作为分析样品。称量1g样品，加入19g含10M尿素和0.1％2-巯基乙醇的PBST(向PBS中加入0.5％聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯所得)，用匀浆器搅拌30秒，然后在100℃进行1小时加热处理。冷却后，进行3,000rpm×20分钟的离心，向0.5ml上清中加入9.5ml PBST，用作ELISA样品。校正曲线同样使用经10M尿素和0.1％2-巯基乙醇处理的乳清蛋白的梯度稀释品。还与用PBST从分析样品中萃取、以溶解于PBST的乳清蛋白作为检量线、不使用尿素和2-巯基乙醇的情况进行了比较。

6-2结果

对于通过夹层ELISA对模型肉食制品中的乳清蛋白的分析，使用尿素和2-巯基乙醇萃取的模型肉食制品中的乳清蛋白分析结果如表7所示，仅用PBST萃取的模型肉食制品中的乳清蛋白分析结果如表8所示。

[表7]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	170.5	18.7	2.3	N.D.^*2
					回收率(％)^*1	85.3	93.5	115.0	-

^*1：(分析值/添加量)×100

^*2：未检出

[表8]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	0.1	N.D.^*2	N.D.	N.D.
					回收率(％)^*1	0.05	-	-	-

^*1：(分析值/添加量)×100

^*2：未检出

以上结果可知：将尿素和2-巯基乙醇加入到萃取液中时，可以以高回收率检测模型肉食制品中的乳清蛋白，用PBST萃取则不能检测。由此表明：使用尿素和2-巯基乙醇对于从食品中萃取乳清蛋白是有效的，此时要利用的MAb的特性必须是可与尿素变性的βLG结合。

7.通过免疫色谱检测变性和未变性酪蛋白钠

7-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)制备成1mg/ml的PLG1和PLG3的MAb溶液。在5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制备成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制备成OD525＝2.0，以1∶1的比例混合。以68μl/cm²涂布于玻璃纤维制的结合垫上，进行干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS制备成4mg/ml的PLG2的MAb溶液，呈直线状涂布于硝基纤维素膜上，干燥。然后用含有1％BSA的10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)在37℃封闭1小时，用10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)清洗，干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

分别贴装上述制备的样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。将上述2中制备的模型肉食制品适当稀释，作为被检液使用。

7-2结果

通过涂布于膜上的MAb-PLG2和胶体金标记MAb——PLG1+PLG3的组合，不管乳清蛋白加热或非加热，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)检测。该结果可知：无论是以制造工艺中混入的乳清蛋白为对象，还是以加热后的制品为对象，可以设计出在任何情况下都可以对应的免疫色谱条。

在市售的变应原检测用免疫色谱条中，作为对照滴加含有0.1M尿素、0.2％2-ME的PBS时，会产生非特异性条带，结果为假阳性。这表明：如果不使用蛋白质变性剂，则可作为变应原检测的对象被限制在极狭窄的范围内，该蛋白质变性剂有效地从因加热等而变性的食品蛋白质中萃取变应原。

实施例2

1.可与变性/未变性卵白蛋白结合的MAb的确立

1-1材料和方法

1)鸡卵白蛋白(以下可称为“OA”)的制备

从新鲜的鸡蛋中只取蛋白，匀浆至不发泡，然后加入等量的饱和硫酸铵，用滤纸No.1(アドバンテツク东洋)过滤。然后向得到的滤液中添加0.5M的硫酸，调节至pH 4.6，然后放置过夜。通过8,000rpm×20分钟的离心得到沉淀，将沉淀溶解于蒸馏水，用相同方法重结晶，得到粗OA组分。粗OA再通过使用TSK凝胶DEAE 650S(Tosoh)的离子交换色谱进行纯化。使用50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.4)作为移动相，通过NaCl的0-0.3M的线性梯度分离OA，通过透析进行脱盐，然后进行冷冻干燥。使用该冷冻干燥OA，用生理盐水制备0.1％的OA溶液，分别将500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作为抗原溶液，在免疫前在-20℃冷冻保存。

2)免疫

使用4只6周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫时，向加入有500μl 0.1％的OA的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。对每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液，另外追加免疫以每3周的间隔进行2次。免疫时，向加入有500μl 0.1％OA的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。向每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。要获得抗变性OAMAb，则只在最终免疫时使用后述的还原羧甲基化OA。

3)血液中抗体效价的测定

在初次或追加免疫中，在注射OA一周后，从各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温下放置2小时，进行离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA检测小鼠血液中的抗OA抗体效价。二次抗体采用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠由尾部静脉注射100μl 0.1％OA溶液。静脉注射4天后，从小鼠体内无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心，收集脾细胞，再次悬浮于RPMI1640，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液按照细胞数10∶1混合，再次以1,000rpm×10分钟进行离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量为3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞液中加入RPMI1640进行稀释，然后离心得到颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，以5×10⁶个细胞/孔分注到24孔细胞培养板(BectonDickinson)中，在5％CO₂下、在37℃培养。其中所述HAT选择培养基是在杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶所得培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体用于试验，检测生成抗OA抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对OA显示阳性的孔的杂交瘤转移至96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，进行有限稀释法克隆，形成0.9个细胞/孔。向96孔细胞培养板的各孔中加入4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，形成5×10⁶个细胞/孔。克隆的杂交瘤的培养采用含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640培养基。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对未变性OA(以下可称为“NOA”)或还原羧甲基化OA(以下可称为“RCMOA”)的反应性的不同来获得特异性不同的克隆。RCMOA如下获得：称量10mg纯化OA(上述冻干物)，加入1ml 1.4M Tris-盐酸缓冲液(pH 8.6)、100μl 5％EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巯基乙醇，定容为2.5ml，然后进行氮气置换，在37℃进行1小时的还原处理。再加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，进行氮气置换，然后在室温下进行1小时的羧甲基化，制成RCMOA。通过非竞争法ELISA检测培养上清对NOA或RCMOA的反应性。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆的杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的的特性和MAb的类、亚类和型

为了确定抗OAMAb的特性，使用固相法和液相法。固相法是将NOA或RCMOA预先固定于细胞培养板的孔内，将抗未变性/变性OAMAb与该固定化抗原(NOA或RCMOA)作用的方法，液相法是将兔抗OA多克隆抗体预先固定在细胞培养板的孔内，在NOA或RCMOA与该多克隆抗体结合的状态下使抗未变性/变性OAMAb与其作用的方法。通过单克隆小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒(Pharmingen)确定了MAb的类和亚类为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

为了用于夹层ELISA试验，对纯化的MAb分别进行了生物素化处理。使用50mM的碳酸缓冲液(pH 8.5)制备成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌，然后一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换为20mg/ml。

1-2结果

1)抗OAMAb的特性和类、亚类

得到了9种与NOA具有特异性的MAb，10种与RCMOA具有特异性的MAb。它们分别对液相或固相抗原的特异性表示在表9中。

[表9]

MAb名	固相NOA	液相NOA	固相RCMOA	液相RCMOA	类、亚类和型
						301B5	+	+	-	-	IgG1(κ)
304E4(PNOA1)	+	+	-	-	IgG1(κ)
						305G5	+	+	-	-	IgG1(κ)
306B2(PNOA2)	+	+	-	-	IgG1(κ)
						307G4	+	-	-	-	IgG1(κ)
310G7	+	+	-	-	IgG1(κ)

311E11	+	-	-	-	IgG1(κ)
						314E12	+	+	-	-	IgG1(κ)
316G1	+	+	-	-	IgG1(κ)
						63E5	+	-	+	+	IgG1(κ)
65F2	+	-	+	+	IgG1(κ)
						68G4	+	-	+	+	IgG1(κ)
69H6	+	-	+	+	IgG1(κ)
						74G2	+	-	+	+	IgG1(κ)
115F8	+	-	+	+	IgG1(κ)
						117F9	+	-	+	+	IgG1(κ)
119D11	+	-	+	+	IgG1(κ)
						948G11(PDOA1)	+	-	+	+	IgG1(κ)
962B8(PDOA2)	+	-	+	+	IgG1(κ)

2)组合条件

考虑到夹层ELISA的检测灵敏度，选择出用于检测NOA的MAb或用于检测RCMOA的MAb的组合。结果NOA中，选择了301B5和316G1或304E4(PNOA1；FERM ABP-10265)和306B2(PNOA2；FERM ABP-10266)的高组合，在RCMOA中选择了117F9和119D11或948G11(PDOA1；FERM ABP-10275)和962B8(PDOA2；FERMABP-10276)的高组合。

以下实施例中，可以将301B5和316G1/117F9和119D11改写成304E4和306B2/948G11和962B8。

2.通过夹层ELISA检测变性和未变性抗原

2-1材料和方法

NOA溶液是用PBS将纯化OA制备成100ppb溶液，制备3倍的稀释梯度(稀释梯度A)。另一方面在玻璃试管中称量1mg纯化OA，加入6g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇，1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，在100℃的油浴中加热1小时，进行变性处理。冷却后，转移至100ml容量的容量瓶中，用PBS定容为100ml。再用PBS将其稀释100倍，制成100ppb尿素变性OA(以下称为“UDOA”)。再将尿素浓度保持0.01M，制备3倍的稀释梯度(稀释梯度B)。将100ppb NOA溶液和100ppb UDOA溶液等量混合(形成NOA和UDOA各为50ppb的溶液)，将尿素浓度保持0.005M，制备3倍的稀释梯度(稀释梯度C)。用作夹层ELISA的条件如表10所示。包被MAb的浓度单独情况下为25μg/ml，混合时各为12.5μg/ml，合计为25μg/ml。

[表10]

2-2结果

如图7所示，以未变性OA为对象的试验(试验1)中，301B5单独、301B5和119D11的混合的曲线几乎重叠，但在10ppb或以下更稀薄的状态下，301B5与119D11的混合的曲线与301B5单独的曲线相比，混合的吸光值高，可认为可提高检测灵敏度。在以变性OA为对象的试验2的UDOA中，301B5单独未见吸光值，可认为301B5和316G1未参与UDOA，但119D11单独以及301B5和119D11的混合曲线中，混合的吸光值明显高，可认为通过将MAb混合，可提高检测灵敏度(图8)。这在以来变性/变性OA为对象的的(试验3)中也可以得到确认，301B5与119D11的混合与301B5单独相比，吸光值明显高(图9)。在试验1-3的任何情况下，单独包被的抗体浓度为25mg/ml，如果是混合则分别为一半的浓度12.5mg/ml，因此通过使用使MAb种类的混合系，抗体浓度即使相同或减少，也可以进一步提高抗原的检测灵敏度。

3.通过免疫色谱检测变性和未变性的OA

3-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)制成1mg/ml的119D11和316G1的MAb单独或混合溶液。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制备成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制备成OD525＝1.0。以68μl/cm²涂布于玻璃纤维制结合垫上，进行干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS以4mg/ml制备117F9和301B5的MAb单独或混合溶液，呈直线状涂布于硝基纤维素膜上，进行干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐温20的PBS在37℃封闭两小时，然后用PBS清洗并干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

除上述制备的结合垫、抗体固定化膜之外，另外准备被检液点样用的玻璃纤维制样品垫、被检液吸收用的玻璃纤维制吸收垫，分别贴装样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。将上述2中制备的NOA和UDOA适当稀释，用作被检液。

3-2结果

通过301B5和胶体金标记316G1的组合，可以以最低10ppb的浓度检测NOA，但对于UDOA，即使是1ppm也无法检测。而通过117F9和胶体金标记119D11的组合，可以以最低10ppb检测UDOA，但对于NOA，即使是1ppm也不能检测。与其相对，制作使用301B5和117F9的固定化抗体混合物、以及316G1和119D11的胶体金抗体混合物的免疫色谱条，则可以以最低10ppb检测变性OA或未变性OA。这样，通过将可与变性OA结合的MAb和可以与未变性OA结合的MAb组合，无论是以制备工艺中混入的未变性卵清为对象，或以加热后的制品为对象，可设计出在任何场合都可对应的免疫色谱条。

在市售的卵变应原检测用免疫色谱条中，作为对照滴加只含有0.01M尿素的PBS，结果产生非特异性条带，成假阳性。这可以认为，如果在卵清变应原检查中不使用作为蛋白质变性剂的尿素，则可作为变应原检测的对象就被限定在极狭窄的范围内，该蛋白质变性剂用于萃取因热等而变得不溶的卵清变应原。

4.可与变性/未变性卵类粘蛋白结合的MAb的确立

4-1材料和方法

1)鸡卵类粘蛋白(以下称为“OM”)的制备

从新鲜的鸡蛋中只采集蛋白，匀浆至不发泡，然后与等量的0.1M乙酸缓冲液(pH 3.8)混合。再用0.1M乙酸缓冲液进行透析，然后进行8,000rpm×20的离心，回收上清。再通过使用TSK凝胶DEAE650S(Tosoh)的离子交换色谱进行纯化。移动相使用50mM咪唑-HCl缓冲液(pH 6.4)，通过NaCl的0-0.3M线性梯度，分离OM组分，通过透析进行脱盐，然后冷冻干燥，将其作为未变性OM(以下可称为“NOM”)。称量1mg该纯化OM，加入6g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇、1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，然后在100℃油浴中加热1小时，过行变性处理，制成尿素变性OM(以下可称为“DOM”)。用生理盐水将这些冻干物制成0.1％的溶液，分别将500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作为抗原溶液，在免疫之前于-20℃进行冷冻保存。

2)免疫

分别使用4只6周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫中，向装有500μl 0.1％NOM或DOM的Eppendorf管中分别等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。另外，追加免疫以每3周的间隔进行两次。免疫时，向加入有500μl0.1％NOM或DOM Eppendorf管中分别等量加入不完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

初次或追加免疫时，在注射DOM或NOM一周后，从各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温中放置2小时，然后进行离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA检测小鼠血液中的抗OM抗体效价。二次抗体使用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照

和Milstein的方法(1975)进行。对抗体效价充分提高的小鼠由尾部静脉注射100μl 0.1％NOM溶液或DOM溶液。静脉注射4天后，从小鼠体中无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，BectonDickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心，收集脾细胞，再悬浮于RPMI1640，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液按照细胞数10∶1混合，再次以1,000rpm×10分钟进行离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量为3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，然后通过离心制成颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，分注到24孔细胞培养板上，在5％CO₂下、在37℃培养，形成5×10⁶个细胞/孔。其中所述HAT选择培养基是在杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板的各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体，用于试验，检测生成抗NOM抗体或DOM抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对NOM或DOM显示阳性的孔的杂交瘤转移至96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，进行有限稀释法克隆，形成0.9个细胞/孔。向96孔细胞培养板的各孔中加入4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，形成5×10⁶个细胞/孔。克隆的杂交瘤的培养使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640培养基。

6)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先对BALB/c小鼠腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆的杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

7)MAb的特性和MAb的类、亚类和型

采用固相法和液相法确定抗NOMMAb和抗DOMMab的特性。固相法采用将NOM或DOM预先固定在细胞培养板的孔内，使MAb与该固定化NOM或DOM作用的方法，液相法采用预先将兔抗卵类粘蛋白多克隆抗体固定在细胞培养板的孔内，在NOM或DOM与该多克隆抗体结合的状态下，使MAb与其作用的方法。另外通过单克隆小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒，对MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgG(γ)。

8)MAb的生物素化

为了进行夹层ELISA试验，对纯化的MAb分别进行生物素化处理。使用50mM的碳酸缓冲液(pH 8.5)制备成20mg/ml，加入10ml以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌后，一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换成20mg/ml。

4-2结果

1)抗NOMMAb和抗DOMMab的特性和类、亚类

得到7种与NOM具有特异性的MAb、10种与DOM具有特异性的MAb。它们对液相或固相抗原的特异性分别如表11所示。

[表11]

2)组合条件

从夹层ELISA的检测灵敏度考虑，选择出用于检测NOM的MAb的组合。结果选择出47E5(PNOM1；FERM ABP-10279)和50A12(PNOM2；FERM ABP-10280)的高组合。还使用上述10个单克隆抗体进行夹层ELISA，选择出灵敏度最高的628E1(PDOM1；FERMABP-10277)和648A9(PDOM2；FERM ABP-10278)作为高组合。

3)通过夹层ELISA测定各单克隆抗体与OM的反应性

在PNOM1和PNOM2的夹层ELISA中，检测出未变性卵类粘蛋白，但完全未检测出变性卵类粘蛋白(图10)。另外在PDOM1和PNOM2的夹层ELISA中，检测出变性OM，但未变性OM在10-100ppb之间灵敏度低(图11)。但是在使用PNOM2和PDOM2作为抗体、使用PNOM1和PDOM1作为生物素化抗体的各单克隆抗体组合的夹层ELISA中，特别可见未变性的OM在10-100ppb下检测灵敏度提高(图12)。

5.通过免疫色谱检测以OM为指标的卵清

5-1材料和方法

1)胶体金和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)将PNOM1的MAb溶液制备成1mg/ml。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制成OD525＝1.0。以68μl/cm²涂布于玻璃纤维制结合垫上，进行干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS将PNOM2的MAb溶液制备成4mg/ml，呈直线状涂布于硝基纤维素膜，并干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐温20的PBS、在37℃封闭2小时，然后用PBS洗涤并干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

除上述制备的结合垫、抗体固定化膜之外，另外准备被检液点样用玻璃纤维制样品垫、被检液吸收用玻璃纤维制吸收垫，分别依次贴装样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。将冷冻干燥卵清粉末的0.1％溶液分别在室温、50℃、75℃、100℃处理1小时，将其适当稀释，用作被检液。

5-2结果

通过PNOM1和胶体金标记PNOM2的组合，在室温和50℃处理1小时的卵清溶液可以以最低10ppb检测出来。在75、100℃处理1小时的卵清可以以最低100ppb检测出来。该结果表明，对于相当于在100℃处理1小时的加热处理食品，即使不使用尿素等变性剂，通过使用该抗OMMAb的免疫色谱条，也可以通过简便的萃取，检测出最低100ppb的卵清。但是，进行超过100℃的热处理，则OM的免疫色谱不能检测，需要如上所述，进行尿素增溶处理。

6.抗OAMAb和OMMAb的联合使用效果

6-1方法

根据上述结果，如上制备了采用PNOA1、PDOA1和PNOM1的固体化混合物，以及PNOA2、PDOA2和PNOM2的胶体金抗体混合物的免疫色谱条，尝试进行卵清的检测。

6-2结果

分别如上所示，PNOA1和PNOA2、PDOA1和PDOA2以及PNOM1和PNOM2的组合可以以各不同灵敏度检测出目标变性/未变性OA或OM。由此可开发出在加工食品的制造过程中，在未加热状态下，MAb与未变性OA和OM反应，在50-100℃时，MAb与未变性/变性OA和OM反应，在上述温度以上时，通过尿素增溶处理，变性OA反应的卵清检测方法。

实施例3

1.可与变性/未变性小麦麦醇溶蛋白结合的MAb的确立

1-1材料和方法

1)小麦麦醇溶蛋白(以下称为“GL”)的制备

向小麦粉中加入2倍量的正丁醇，进行脱脂，风干过夜。向所得脱脂小麦粉中加入2倍量0.1％NaCl溶液，进行10,000rpm×15分钟的离心。向所得沉淀中加入20倍量的0.01N乙酸，搅拌，然后以10,000rpm×15分钟离心。将所得上清用蒸馏水透析，进行冷冻干燥。向所得冻干物中加入乙醇至70％，以10,000rpm×15分钟离心。将所得上清用蒸馏水透析，得到粗GL组分。粗GL组分再通过使用Sephacryl S-200HR(Amersham Biosciences)的凝胶过滤进行纯化。移动相使用0.1N乙酸，分离GL，用蒸馏水透析，然后冷冻干燥。用生理盐水制成该冻干物制成0.1％溶液，分别以500μl分注入1ml容量的Eppendorf管中，免疫前在-20℃冷冻保存，作为抗原溶液。

2)免疫

使用5只5周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫时，向装有500μl 0.1％GL的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。将每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。另外，追加免疫时，以3周的间隔进行两次。免疫时，向装有500μl 0.1％GL的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

初次或追加免疫时，在注射了GL一周后，从各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温下放置2小时，然后进行离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA，检测小鼠血液中的抗GL抗体效价。二次抗体采用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠由尾部静脉注射100μl 0.1％GL溶液。静脉注射4天后，从小鼠体内无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心收集脾细胞，再次悬浮于RPMI1640，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液以细胞数10∶1混合，再次进行1,000rpm×10分钟的离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，然后离心得到颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，分注到24孔细胞培养板(Becton Dickinson)中，在5％CO₂下、在37℃培养，形成5×10⁶个细胞/孔。其中所述HAT选择培养基是在杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板的各孔中的培养上清作为ELISA的一次抗体，用于试验，检测生成抗GL抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对GL显示阳性的孔的杂交瘤转移到96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，进行有限稀释法克隆，形成0.9个细胞/孔。向96孔细胞培养板的各孔中加入4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，形成5×10⁶个细胞/孔。克隆的杂交瘤的培养采用含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对未变性GL(以下称为“NGL”)或还原羧甲基化GL(以下称为“RCMGL”)、0.1M乙酸增溶GL(以下称为“AGL”)、70％乙醇增溶GL(以下称为“EGL”)、变性剂增溶的GL(以下称为“DGL”)的反应性的不同，得到特异性不同的克隆。RCMGL如下制备：称量10mg纯化GL，加入1ml 1.4M Tris-HCl缓冲液(pH8.6)、100μl 5％EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巯基乙醇，定容至2.5ml，然后进行氮气置换，在37℃进行1小时的还原处理。在加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，进行氮气置换，然后在室温下进行1小时的羧甲基化，得到RCMGL。通过非竞争法ELISA检测培养上清对NGL、RCMGL、AGL、EGL和DGL的反应性。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠中腹腔内注射0.2mL不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆的杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的类、亚类和型

通过单克隆小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒，MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

为了进行夹层ELISA试验，对纯化的MAb分别进行生物素化处理。使用50mM碳酸缓冲液(pH 8.5)制备成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌，然后一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换为20mg/ml。

2-2结果

1)MAb的选择

小麦的主要变应原麦醇溶蛋白(GL)是不溶于水但溶解于乙酸和乙醇的蛋白质。制备溶解于PBS的GL(NGL)、还原羧甲基化GL(RCMGL)、0.1M乙酸增溶GL(AGL)、70％乙醇增溶GL(EGL)、变性剂增溶GL(DGL)，验证为与哪种状态的GL特异性结合的MAb。抗GLMAb与各状态的GL的直接ELISA结果如表12所示。如表1所示，选择了与所有状态的GL结合的MAb——PGL1(FERMABP-10267)、PGL2(FERM ABP-10268)、PGL4、PGL7。

[表12]

NGL

RGL

AGL

EGL

DGL

类、亚类和型

PGL1

○

IgG1(κ)

PGL2

○

IgG1(κ)

PGL3

○

△

○

×

○

IgG1(κ)

PGL4

○

IgG1(κ)

PGL5

○

△

○

△

IgG1(κ)

PGL6

○

×

○

IgG1(κ)

PGL7

○

IgG1(κ)

PGL8

○

△

○

×

○

IgG1(κ)

2)夹层ELISA中的组合条件

使用通过直接ELISA选择的PGL1、PGL2、PGL4、PGL7，对于全部的MAb的组合进行夹层ELISA。麦醇溶蛋白使用NGL、RCMGL、AGL、EGL、DGL。结果，对任何状态的GL均可以以最高灵敏度检测的是PGL1和PGL2的组合。使用PGL1和PGL2进行的夹层ELISA的结果如图13所示。对其它组合进行夹层ELISA，都不能检测全部的GL，或者检测灵敏度极低。从以上结果选择出了PGL1和PGL2作为检测食品以各种状态含有的GL的MAb。

2.PGL1和PGL2所识别的表位的区别

通过免疫印迹法限定各抗体所识别的表位，因此在A-PAGE和电印迹之后在进行免疫印迹。首先按照Lafiandra，D.&Kasarda，D.D.的方案，通过A-PAGE(Cereal Chemistry，，62，314-319，1985)进行小麦麦醇溶蛋白的分离。使用分离出的凝胶，通过电印迹转印到PVDF膜上。使PGL1和PGL2的培养上清(1/1000)与转印的PVDF膜反应，然后显色，确认所识别的表位。结果如图14所示，PGL1所识别的蛋白质分解条带不能被PGL2识别。由此可知PGL1和PGL2识别不同的表位。

3.通过免疫色谱检测变性和未变性GL

3-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)将PGL1(或PGL2)溶液制备成1mg/ml。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制备成OD525＝1.0。以68μl/cm²涂布在玻璃纤维制结合垫(日本ミリポア)上并干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS将PGL2(或PGL1)溶液制成4mg/ml，呈直线状涂布于硝基纤维素膜上并干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐温20的PBS、在37℃封闭2小时，然后用PBS清洗并干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

除上述制备的结合垫、抗体固定化膜之外，另外准备被检液点样用的玻璃纤维制样品垫、被检液吸收用的玻璃纤维制吸收垫，依次分别贴装样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。

向小麦粉中加入20倍量的PBST(PBS中加入0.5％聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯所得)，在4℃搅拌过夜，离心后进行脱脂处理，回收上清，透析后进行冷冻干燥，得到小麦粉萃取物。使用制备的小麦粉萃取物，未变性的用PBS稀释，变性的用变性剂增溶，以此作为被检液。

3-2结果

可以通过夹层ELISA检测各种状态的GL，由此构建并评价了免疫色谱检测系统，以此作为更简易的检测方法。评价时，对于使用与目前市场销售的变应原检测试剂盒相同的抗体的市售A和市售B进行了比较。结果如表13所示。表13中，“非特异反应”是仅供给缓冲液时也判定为阳性，此时为“有非特异反应”。结果，市售A中，可以检测出未变性小麦粉萃取物，但是对于变性小麦粉萃取物则可见非特异反应，无法判断。市售B中，未能检测1ppm的未变性小麦粉萃取物，对于变性小麦粉萃取物可见非特异反应，因此无法判断。而使用本发明的试剂盒的方法中，对于未变性小麦粉萃取物、变性小麦粉萃取物都可以检测到最低50ppb左右。并且对于变性小麦粉萃取物未见非特异反应。

[表13]

小麦粉萃取物(未改性)

小麦粉萃取物(改性)

接着考虑从实际的食品中检测变应原，使用市场销售的食用面包进行评价。评价时，与使用目前市售的变应原检测试剂盒的市售A和市售B进行了比较。结果如表14所示。表14中，“非特异反应”是只供给缓冲液时却判定为阳性，此时为“有非特异反应”。食用面包的蛋白质约为8％，因此以下的浓度是假定将8％作为全部萃取的数字。评价结果如下：市售A中，对于未变性面包无法检测出4ppm或以下的浓度，对于变性面包则可见非特异反应，无法判定。市售B中，可检测出4ppm左右，但是除此以外的浓度无法检测，对于变性面包可见非特异反应，无法判定。使用本发明的试剂盒的方法中，对于未变性面包、变性面包都以40ppb左右的低浓度检测出，变性中没有非特异反应，可以进行检测。

[表14]

未改性食用面包(浓度换算为蛋白质浓度)

改性食用面包(浓度换算为蛋白质浓度)

实施例4

1.抗24kDa蛋白质MAb和抗76kDa蛋白质MAb的确立

1-1材料和方法

1)荞麦24kDa蛋白质MAb和抗76kDa蛋白质的制备

向市售荞麦粉中加入5倍量的纯净水，搅拌后以12000rpm离心，得到沉淀。向所得沉淀中加入5倍量1M NaCl，搅拌后以12000rpm离心，得到上清。通过透析使上清脱盐，进行冷冻干燥，将所得组分作为荞麦粗蛋白组分。再使用プレツプセル960(BioRad)对该荞麦粗蛋白组分进行纯化。24kDa蛋白质的纯化如下进行：将荞麦粗蛋白组分溶解于含有2.0％SDS和5％2-巯基乙醇的样品缓冲液中，然后在95℃加热4分钟，以此作为样品用于试验，通过采用12％丙烯酰胺分离凝胶的プレツプセル960进行分离，得到24kDa蛋白质。76kDa蛋白质的纯化如下进行：将荞麦粗蛋白组分溶解于含有2.0％SDS但不含有2-巯基乙醇的样品缓冲液中，以此作为样品用于试验，通过采用了12％丙烯酰胺分离凝胶的プレツプセル960进行分离，得到76kDa蛋白质。所得各组分在透析后进行冷冻干燥。使用这些冻干物，用生理盐水分别制备0.1％的24kDa蛋白质溶液和0.1％的76kDa蛋白质溶液，以500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作为抗原溶液，免疫前在-20℃冷冻保存。

2)免疫

使用5只5周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫时，向分别装有500μl 0.1％24kDa蛋白质溶液和0.1％ 76kDa蛋白质溶液的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。另外，追加免疫时，以3周的间隔进行两次。免疫时，向分别装有500μl 0.1％的24kDa蛋白质溶液和0.1％的76kDa蛋白质溶液的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

初次或追加免疫时，在注射了24kDa蛋白质溶液或76kDa蛋白质溶液一周后，由各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温中放置2小时，然后离心，得到血清。制备这些血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA检测小鼠血液中抗24kDa蛋白质抗体效价和抗76kDa蛋白质抗体效价。二次抗体采用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照

和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠从尾部静脉分别以100μl注射0.1％的24kDa蛋白质溶液或0.1％的76kDa蛋白质溶液。静脉注射4天后，由小鼠体内无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心，收集脾细胞，再次悬浮于RPMI1640，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液以细胞数10∶1混合，再以1,000rpm×10分钟进行离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，稀释后，离心得到颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，分注到24孔细胞培养板(Becton Dickinson)中，在5％CO₂下、在37℃培养，形成5×10⁶细胞/孔。其中所述HAT选择培养基是在杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体，用于试验，检测生成抗24kDa蛋白质抗体或76kDa蛋白质抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对24kDa蛋白质或76kDa蛋白质显示阳性的孔的杂交瘤转移至96孔细胞培养板(Becton Dickinson)，进行有限稀释法克隆，形成0.9个细胞/孔。向96孔细胞培养板的各孔中加入4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，形成5×10⁶个细胞/孔。克隆的杂交瘤的培养使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml的链霉素的RPMI1640培养基。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对24kDa蛋白质、76kDa蛋白质、用PBS稀释的荞麦粗蛋白(以下可称为“NBW”)或者变性剂增溶的荞麦粗蛋白(以下可称为“DBW”)的反应性的不同来获得特异性不同的克隆。荞麦粗蛋白如下制备：向荞麦粉中加入20倍量的PBST，在4℃搅拌过夜，离心后进行脱脂处理，回收上清，透析，然后冷冻干燥，制备成荞麦粉萃取物。变性剂增溶如下进行：称量10mg荞麦粗蛋白，加入6g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇、1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，然后在100℃油浴加热1小时，进行变性处理，将其作为DBW。通过非竞争法ELISA检测培养上清对24kDa蛋白质、76kDa蛋白质、NBW、DBW的反应性。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠中腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞的克隆杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的特性和MAb的类、亚类和型

使用固相法确定抗24kDa蛋白质MAb或抗76kDa蛋白质MAb的特性。固相法是采用预先将24kDa蛋白质、76kDa蛋白质、NBW或DBW固定在细胞培养板的孔内，使抗24kDa蛋白质MAb或76kDa蛋白质MAb与该固定化抗原作用的方法。通过单克隆小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒(Pharmingen)，对MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

为了进行夹层ELISA试验，对纯化的MAb分别进行生物素化处理。使用50mM的碳酸缓冲液(pH 8.5)制备成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，搅拌，然后一边冰冷却一边静置2小时。然后用PBS置换为20mg/ml。

1-2结果

1)抗24kDa蛋白质MAb和76kDa蛋白质MAb的特性和类、亚类

得到了5种对24kDa蛋白质具有特异性的MAb、4种对76kDa蛋白质具有特异性的MAb。它们分别对固相抗原的特异性如表15和表16所示。

[表15]

MAb名	24kDa	NBW	DBW	类、亚类和型
					376(PBW1)	+	-	+	IgG1(κ)
384	+	-	+	IgG1(κ)
					389	+	-	+	IgG1(κ)
398	+	-	+	IgG1(κ)
					401	+	-	+	IgG1(κ)

[表16]

MAb名	76kDa	NBW	DBW	类、亚类和型
					505(PBW2)	+	+	+	IgG1(κ)
506(PBW3)	+	+	+	IgG1(κ)
					504	+	+	-	IgG1(κ)
512	+	+	-	IgG1(κ)
					501	+	+	-	IgG1(κ)

2)组合条件

以对固相抗原显示阳性反应的各MAb分别作为固相或生物素化抗体，从夹层ELISA的检测灵敏度考虑，选择出用于检测NBW和DBW的MAb的组合。结果，选择出平板固定化抗体PBW2(FERMABP-10273)和生物素化抗体PBW3(FERM ABP-10274)作为可检测NBW的组合，选择出平板固定化抗体PBW1(FERM ABP-10272)和生物素化抗体PBW2作为可检测DBW的组合。通过夹层ELISA进行的PBW2和PBW3对各种荞麦粗蛋白的反应性结果如图15所示。通过夹层ELISA进行的PBW1和PBW2对各种荞麦粗蛋白的反应性如图16所示。

3)通过MAb混合系对NBW、DBW的检测

将通过夹层ELISA选择的MAb混合，确认NBW、DBW的检测灵敏度。即，对于NBW，以生物素化PBW3作为二次抗体，将以单独PBW2作为平板固定化抗体的情况、将PBW1和PBW2混合的情况的情况进行比较。对于DBW，以生物素化PBW3为二次抗体，将高检测灵敏度的平板固定化抗体PBW1和生物素化PBW2的组合、将PBW1和PBW2混合的平板固定化抗体的情况进行了比较。如图17和图18所示，将平板抗体(プレ一ト抗体)混合的情况对于NBW、DBW都显示吸光值高，表明可提高检测度。

2.通过夹层ELISA检测食品中的NBW、DBW

通过上述1中选择的PBW1、PBW2、PBW3的组合，尝试是否可以检测实际食品中的荞麦粗蛋白

2-1材料和方法

1)模型肉食制品的制备

选择肉食制品作为定量试验的模型食品，按照表17所示的配比制备含有各浓度荞麦粗蛋白的模型肉食制品。猪瘦肉是从猪上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm的绞肉使用。按照各配比称量添加物，用食品加工机混合，然后充填到氯乙烯管中，在75℃加热30分钟。

[表17]

原材料	测试1	测试2	测试3	对照
					猪瘦肉(％)	83.0	83.0	83.0	83.0
NaCl(％)	2.0	2.0	2.0	2.0
					多磷酸钠(％)	0.2	0.2	0.2	0.2
亚硝酸钠(％)	120	120	120	120
					抗坏血酸钠(ppm)	300	300	300	300
水	14.5	14.5	14.5	14.5
					荞麦粗蛋白(ppm)	200	20	2	0
合计(％)	99.762	99.744	99.7422	99.742

2)通过夹层ELISA进行定量分析

(模型咸肉)

将各模型咸肉用食品加工机均匀磨碎，作为分析样品。称量1g样品，加入19g PBST，用匀浆器搅拌30秒。进行3,000rpm×20分钟的离心，用滤纸过滤上清，称量0.5ml该上清，加入9.5ml PBST，作为ELISA用样品。校正曲线同样采用使用PBST的荞麦粗蛋白的梯度稀释品。

(模型加热制品)

将各模型加热制品用食品加工机均匀磨碎，作为分析用样品。称量1g样品，加入19g含有1％SDS、1％2-巯基乙醇的PBS，用匀浆器搅拌30秒。然后在100℃加热1小时。冷却后进行3,000rpm×20分钟的离心，用滤纸过滤上清，量取0.5ml该上清，加入9.5mlPBST，作为ELISA用样品。校正曲线同样使用经SDS、2-巯基乙醇处理的荞麦粗蛋白的梯度稀释品。

2-2结果

通过夹层ELISA对模型肉食制品中的荞麦粗蛋白进行分析，模型咸肉的结果如表18所示，模型加热制品的结果如表19所示。

[表18]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	189.3	16.2	1.8	N.D.*2
					回收率(％)*1	94.6％	81.0％	90.5％	-

*1：(分析值/添加量)×100

*2：未检出

[表19]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	156.6	18.0	2.6	N.D.
					回收率(％)*1	78.3％	90.0％	133％	-

*1：(分析值/添加量)×100)

*2：未检出

由以上结果表明：不管是像模型咸肉那样未加热的荞麦粗蛋白，还是像模型加热制品那样加热变性的荞麦粗蛋白，都可以以高回收率检测出荞麦粗蛋白。由此可知：通过可与未变性荞麦蛋白结合的MAb和可与变性荞麦粗蛋白结合的MAb的组合，对于未加热(未变性)、加热(变性)的任何状态的荞麦蛋白都可以以高灵敏度进行分析。

3.通过免疫色谱检测变性和未变性荞麦粗蛋白

3-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)将PBW3 MAb溶液制备成1mg/ml。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制备成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制成OD525＝1.0。以68μl/cm²涂布在玻璃纤维制结合垫(日本ミリポア)上并干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS将PBW1和PBW2的MAb溶液制备成8mg/ml，以1∶1的比例混合，将其呈直线状涂布于硝基纤维素膜上并干燥。然后用含有1％脱脂乳的10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)、在37℃封闭1小时，用10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)清洗并干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

分别贴装上述制备的样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫，制成免疫色谱条。将上述2中制备的模型肉食制品适当稀释，用作被检液。

3-2结果

通过膜涂布MAb PBW1+PBW2和胶体金标记MAb PBW3的组合，无论荞麦蛋白加热、非加热，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)检测。该结果表明：不管是以制造工艺中混入的荞麦蛋白为对象，还是以加热后的制品为对象，可以设计出可对应上述任何情况的免疫色谱条。

在市售的变应原检测用免疫色谱条中滴加含有0.1M尿素+0.2％2-巯基乙醇的PBS，以此作对照，则产生非特异性条带，为假阳性。这说明如果不使用蛋白质变性剂，则可作为变应原检测的对象被限制在极狭窄的范围内，该蛋白质变性剂用于从因加热等而变性的食品蛋白中有效萃取变应原。

实施例5

1.抗Ara h1MAb的确立

1-1材料和方法

1)Ara h1蛋白质的制备

向市售花生中加入5倍量的20mM双tris-丙烷缓冲液(pH 7.2)，在室温下搅拌2小时，然后进行3000×g的离心，除去沉淀和油分。将所得水溶性组分再次进行10000×g离心，得到上清。再用SourceQ(アマシヤム·フアルマシア)、通过20mM双tris-丙烷缓冲液(pH 7.2)、NaCl的线性梯度(0-1M)对上清进行纯化。将纯化的Ara h1组分用蒸馏水透析，然后冷冻干燥，制成未变性Ara h1(以下称为“NAh1”)。变性Ara h1(以下称为“DAh1”)如下获得：称量10mg NAh1、6g尿素、0.2ml 2-巯基乙醇(以下称为2-ME)、1ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，然后在100℃油浴中加热1小时，进行变性处理。然后透析，冷冻干燥。用该冻干物、用生理盐水分别制备0.1％的DAh1溶液和0.1％的DAh1溶液，以500μl分别分注到1ml容量的Eppendorf管中，免疫前在-20℃冷冻保存。

2)免疫

使用5只5周龄的BALB/c小鼠(日本クレア株式会社)作为供试动物。初次免疫时，向分别装入有500μl 0.1％NAh1溶液和0.1％DAh1溶液的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。追加免疫时，以每2周的间隔进行3次。免疫时，向分别装有0.1％NAh1溶液和0.1％DAh1溶液的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐剂(Difco)，用漩涡混合器搅拌，将制备的乳液用于试验。每只小鼠以150μl腹腔内注射该乳液。

3)血液中抗体效价的测定

初次或追加免疫时，在注射NAh1溶液或DAh1溶液一周后，由各BALB/c小鼠的尾部静脉采血。采集的血液在室温下放置2小时，进行离心，得到血清。制备该血清的10倍稀释梯度，通过非竞争法ELISA检测小鼠血液中抗NAh1抗体效价和抗DAh1抗体效价。二次抗体使用碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(JacksonImmunoReserch Laboratories Inc.)。

4)杂交瘤的制备

杂交瘤的制备按照

和Milstein的方法(1975)进行。即，对抗体效价充分提高的小鼠，从尾部静脉分别注射100μl 0.1％的NAh1溶液或0.1％的DAh1溶液。静脉注射4天后，从小鼠体内无菌摘除脾脏。将脾脏切细后，用RPMI1640清洗，过灭菌尼龙网(细胞筛网，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾细胞悬浮液。通过1,000rpm×10分钟的离心收集脾细胞，再次悬浮于RPMI1640中，计数细胞数。将该脾细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8.653)悬浮液按照细胞数10∶1混合，再次以1,000rpm×10分钟进行离心，得到颗粒。向该颗粒中滴加平均分子量为3,350的45％聚乙二醇，进行细胞融合。向细胞溶液中加入RPMI1640，然后离心得到颗粒。向该颗粒中加入HAT选择培养基，分注到24孔细胞培养板(Becton Dickinson)中，在5％CO₂下、在37℃培养，使细胞数为5×10⁶个细胞/孔。其中所述HAT选择培养基是在杂交瘤用培养基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基)中加入100μM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培养基。

5)有限稀释法克隆

将细胞培养板各孔的培养上清作为ELISA的一次抗体，用于试验，检测生成抗NAh1抗体或DAh1抗体的杂交瘤的存在。将通过ELISA对NAh1或DAh1显示阳性的孔的杂交瘤转移至96孔细胞培养板(Becton Dickinson)上，进行有限稀释法克隆，形成0.9个细胞/孔。向96孔细胞培养板的各孔中加入4周龄BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，形成5×10⁶个细胞/孔。克隆的杂交瘤的培养使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml的链霉素的RPMI1640培养基。

6)抗体的筛选

单克隆抗体的筛选通过检测对NAh1、DAh1、或花生粗蛋白的未变性物(以下称为“NP-e”)、尿素处理(以下称为“DP-e”)四种的反应性的不同而得到特异性不同的克隆。NP-e如下获得：向花生中加入5倍量的20mM双Tris-丙烷缓冲液(pH 7.2)，在室温下搅拌2小时，然后进行2次离心，将所得上清进行透析，冷冻干燥。DP-e如下制备：称量10mg NP-e，加入6g尿素、0.2ml 2-ME、1ml 50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.6)、1.5ml蒸馏水，用铝箔覆盖，然后在100℃油浴中加热1小时，进行变性处理。通过非竞争法ELISA检测培养上清对NAh1、NP-e、DAh1或DP-e的反应性。

7)腹水的采集和MAb的纯化

按照Jones等人(1990)的方法，首先对BALB/c小鼠腹腔内注射0.2ml不完全弗氏佐剂。一周后，对每只小鼠接种5×10⁶个细胞克隆的杂交瘤。腹水潴留后，通过针筒采集腹水。通过蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)对采集的腹水进行纯化。

8)MAb的的特性和MAb的类、亚类和型

使用固相法确定抗NAh1MAb或抗DAh1MAb的特性。固相法采用将NAh1、DAh1、NP-e或DP-e预先固定在细胞培养板的孔中，使抗NAh1MAb或抗DAh1MAb与该固定化抗原作用的方法。通过单克隆小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒(Pharmingen)对MAb的类和亚类确定为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL和IgL(γ)。

9)MAb的生物素化

1-2结果

1)抗NAh1MAb和DAh1MAb的特性和类、亚类

得到7种对NAh1具有特异性的MAb、3种对DAh1具有特异性的MAb。它们对固相抗原的特异性分别如表20和表21所示。

[表20]

MAb名	NAh1	DAh1	NP-e	DP-e	类、亚类和型
						203	+*	-	+	-	IgG1(κ)
217(PAh1-1)	+	-	+	-	IgG1(κ)
						223	+	-	+	-	IgG1(κ)
236(PAh1-2)	+	+	+	+	IgG1(κ)
						427	+	-	+	-	IgG1(κ)
432	+	+	+	+	IgG1(κ)
						451	+	+	+	+	IgG1(κ)

[表21]

MAb名	NAh1	DAh1	NP-e	DP-e	类、亚类和型
						967	-*	+	-	+	IgG1(κ)
970	-	+	-	+	IgG3(κ)
						971(PAh1-3)	-	+	-	+	IgG1(κ)

2)组合条件

以对固相抗原显示阳性的各MAb分别作为固相或生物素化抗体，从夹层ELISA的检测灵敏度考虑，选择出用于检测NP-e和DP-e的MAb的组合。结果选择出平板抗体PAh1-2(FERM ABP-10270)和生物素化抗体PAh1-1(FERM ABP-10269)作为可检测NP-e的组合，选择出平板抗体PAh1-2和生物素化抗体PAh1-3(FERMABP-10271)作为可检测DP-e的组合(图19和图20)。

3)通过MAb混合系检测NP-e、DP-e

在固相中混合PAh1-2(细胞保藏号)、生物素化PAh1-2(细胞保藏号)和PAh1-3(细胞保藏号)，确认NP-e、DP-e的检测灵敏度。各MAb的浓度设定为50μg/ml。结果，通过MAB混合系均可检测出NP-e、DP-e(图21和图22)。

2.通过夹层ELISA检测食品中的花生粗蛋白

通过上述1中选择的PAh1-1、PAh1-2、PAh1-3的组合，尝试是否可检测出实际食品中的花生粗蛋白。

2-1材料和方法

1)模型肉食制品的制备

选择肉食制品作为定量试验的模型食品，按照表22所示配比制备含有各浓度的花生粗蛋白的模型肉食制品。猪瘦肉是从猪上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm的绞肉使用。按照各配比称量添加物，用食品加工机混合，然后充填到氯乙烯管中，在75℃加热30分钟。

[表22]

原材料	测试1	测试2	测试3	对照
					猪瘦肉(％)	83.0	83.0	83.0	83.0
NaCl(％)	2.0	2.0	2.0	2.0
					多磷酸钠(％)	0.2	0.2	0.2	0.2
亚硝酸钠(％)	120	120	120	120
					抗坏血酸钠(ppm)	300	300	300	300
水	14.5	14.5	14.5	14.5
					花生粗蛋白(ppm)	200	20	2	0
合计(％)	99.762	99.744	99.7422	99.742

2)通过夹层ELISA进行定量分析

(模型咸肉)

将各模型咸肉用食品加工机均匀磨碎，制成分析样品。称量1g样品，加入19g PBST，用匀浆器搅拌30秒。进行3000rpm×20分钟的离心，用滤纸过滤上清，量取0.5ml所得上清，加入9.5ml PBST，作为ELISA用样品。校正曲线同样使用溶解于PBST的花生粗蛋白的梯度稀释品。

(模型加热制品)

用食品加工机将各模型加热制品均匀磨碎，作为分析样品。称量1g样品，加入19g含有1M尿素、1％2-ME的PBS，用匀浆器搅拌30秒。然后在100℃进行1小时加热处理。冷却后进行3000rpm×20分钟的离心，用滤纸过滤上清，量取0.5ml上清，加入9.5mlPBST，作为ELISA用样品。校正曲线同样使用进行了1M尿素和0.1％2-ME处理的花生粗蛋白的梯度稀释品。还与用PBST从分析用样品中萃取并溶解于PBST的花生粗蛋白作为校正曲线、但不使用尿素和2-ME的情况进行比较。

2-2结果

关于通过夹层ELISA对模型肉食制品中的花生粗蛋白的分析，模型咸肉的结果如表23所示，模型加热制品的结果如表24所示，仅由PBST萃取的结果如表25所示。

[表23]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	206.0	18.4	1.8	N.D.*2
					回收率(％)*1	103.0	92.0	90.0	-

*1：(分析值/添加量)×100

*2：未检出

[表24]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	137.0	19.5	10.3	N.D.*2
					回收率(％)*1	68.5	97.5	515.0	-

*1：(分析值/添加量)×100

*2：未检出

[表25]

	测试1	测试2	测试3	对照
					添加量(ppm)	200.0	20.0	2.0	0.0
分析值(ppm)	N.D.*2	N.D.	N.D.	N.D.
					回收率(％)*1	-	-	-	-

以上结果表明：不管是像模型咸肉的未加热的花生粗蛋白，还是如模型加热制品的加热变性花生粗蛋白，都可以以高回收率检测出花生粗蛋白。由此可知：通过将可与未变性蛋白质结合的MAb和与变性蛋白质结合的MAb组合，对于未加热(未变性)、加热(变性)的任何状态的花生蛋白，都可以以高灵敏度分析。还得知：将尿素和2-ME用于食品中花生粗蛋白的萃取是有效的，并且必须可与尿素变性的Ah1结合。

3.通过免疫色谱检测未变性和变性花生粗蛋白

3-1材料和方法

1)胶体金标记和结合垫的制备

用2mM硼酸缓冲液(pH 9.0)将PAh1-1和PAh1-3的MAb溶液制备成1mg/ml。向5ml预先用0.2M碳酸钾溶液制备成pH 9.0的胶体金溶液(シグマ制造)中加入500ml MAb溶液，在室温下反应30分钟，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反应15分钟。进行离心，用1％BSA溶液制成OD525＝2.0，以1∶1的比例混合。以68μl/cm²涂布于玻璃纤维制结合垫上并干燥。

2)抗体固定化膜的制备

用PBS将PAh1-2的MAb溶液制成4mg/ml，呈直线状涂布于硝基纤维素膜上并干燥。然后用含有1％脱脂乳的10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)、在37℃封闭1小时，然后用10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)清洗并干燥。

3)免疫色谱条的组装和评价

3-2结果

通过膜涂布MAb PAh1-2、胶体金标记MAb PAh1-1和PAh1-3的组合，不管加热或非加热，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)检测出花生粗蛋白。该结果表明：无论以制造工艺中混入的花生粗蛋白为对象或加热后的制品为对象，可以设计出可以对应任何情况的免疫色谱条。

在市售的变应原检测用免疫色谱条中滴加含有0.01M尿素、0.2％2-ME的PBS，以此作为对照，则产生非特异性条带，为假阳性。这说明：如果不使用蛋白质变性剂，则可作为变应原检测的对象被限制在极狭窄的范围内，该蛋白质变性剂用于从因加热而变性的食品蛋白中有效萃取变应原。

产业实用性

根据本发明，在食品等中所含的乳变应原、卵清变应原、小麦变应原、荞麦变应原、花生变应原的免疫学检测方法中，在变性/未变性的任何状态下，都可以定性且定量的检测出这些变应原。

基于条约第7条第1项

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保藏人普里马肉类包装株式会社社长貴納順二殿

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通知编号：16产生寄第 206号

通知年月日：平成16年9月7日

普里马肉类包装株式会社

社长貴納順二先生

基于条约第7条

领受证明

通知编号：16产生寄第207号

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社长貴納順二先生

2005C2482

8/10

PCT

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不构成国际申请的一部分，不计入国际申请负数

2005C2482

9/10

PCT 该纸件副本(以电子数据为准)

不构成国际申请的一部分，不计入国际申请页数

受理局记入

Claims

1.变应原的检测方法，该变应原检测方法是使用识别未变性和变性的乳变应原、未变性和变性的卵清变应原、未变性和变性的小麦变应原、未变性和变性的荞麦变应原、或未变性和变性的花生变应原的各2种或多种单克隆抗体进行的，其特征在于：以乳酪蛋白的主要蛋白质αs1酪蛋白、乳清的主要蛋白质β乳球蛋白、卵清的主要蛋白质卵白蛋白和卵类粘蛋白、小麦的主要蛋白质麦醇溶蛋白、荞麦的主要蛋白质——分子量24kDa和76kDa的蛋白质，或者花生的主要蛋白质Ara h1为指标。

2.变应原的检测方法，其特征在于：将识别未变性乳变应原的单克隆抗体和识别变性乳变应原的单克隆抗体结合使用。

3.权利要求2的乳变应原的检测方法，其特征在于：使用分别识别不同表位的2种或以上单克隆抗体作为识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体。

4.权利要求2或3的乳变应原的检测方法，其特征在于：识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体是抗αs1酪蛋白单克隆抗体。

5.权利要求4的乳变应原的检测方法，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是识别未变性αs1酪蛋白、尿素处理αs1酪蛋白、未变性酪蛋白钠和变性酪蛋白钠的抗αs1酪蛋白单克隆抗体。

6.权利要求4或5的乳变应原的检测方法，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是识别SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列第132号-第193区域的单克隆抗体。

7.权利要求4-6中任一项的乳变应原的检测方法，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10263)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1和/或杂交瘤(FERM BP-10264)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2。

8.权利要求4-7中任一项的乳变应原的检测方法，其特征在于：通过夹层ELISA，可以在10-1000ppb的浓度范围内对食品中的未变性αs1酪蛋白和尿素处理αs1酪蛋白进行定性且定量的分析。

9.权利要求2或3的乳变应原的检测方法，其特征在于：识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体是抗β乳球蛋白单克隆抗体。

10.权利要求9的乳变应原的检测方法，其特征在于：抗β乳球蛋白单克隆抗体是识别未变性β乳球蛋白、尿素处理β乳球蛋白、还原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白单克隆抗体。

11.权利要求9或10的乳变应原的检测方法，其特征在于：抗β乳球蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10281)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG1和/或杂交瘤(FERM BP-10282)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG2和/或杂交瘤(FERM BP-10283)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG3。

12.权利要求9-11中任一项的乳变应原的检测方法，其特征在于：可通过夹层ELISA，在30-1000ppb的浓度范围内对食品中的未变性β乳球蛋白和尿素处理β乳球蛋白进行定性且定量的分析。

13.权利要求2-12中任一项的乳变应原的检测方法，其特征在于：使用尿素和2-巯基乙醇，从检样中萃取酪蛋白和/或乳清蛋白。

14.权利要求1-13中任一项的乳变应原的检测方法，其特征在于：该方法使用识别未变性酪蛋白的一或多种单克隆抗体和识别变性酪蛋白的一或多种单克隆抗体，以及使用识别未变性β乳球蛋白的一或多种单克隆抗体和识别变性β乳球蛋白的一或多种单克隆抗体。

15.乳变应原检测试剂盒，该试剂盒具备识别未变性乳变应原的单克隆抗体和识别变性乳变应原的单克隆抗体，并在将识别未变性乳变应原的单克隆抗体和识别变性乳变应原的单克隆抗体结合使用的条件下使用。

16.权利要求15的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中的识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体是具备分别识别不同表位的两种或以上的单克隆抗体。

17.权利要求15或16的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体是抗αs1酪蛋白单克隆抗体。

18.权利要求17的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是识别未变性αs1酪蛋白、尿素处理αs1酪蛋白、未变性酪蛋白钠和变性酪蛋白钠的抗αs1酪蛋白单克隆抗体。

19.权利要求17或18的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是识别SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列第132号-193号区域的单克隆抗体。

20.权利要求17-19中任一项的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：抗αs1酪蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10263)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1和/或杂交瘤(FERM BP-10264)生成的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2。

21.权利要求15或16的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：识别未变性乳变应原和/或变性乳变应原的单克隆抗体是抗β乳球蛋白单克隆抗体。

22.权利要求21的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：抗β乳球蛋白单克隆抗体是识别未变性β乳球蛋白、尿素处理β乳球蛋白、还原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白单克隆抗体。

23.权利要求21或22的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：抗β乳球蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10281)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG1和/或杂交瘤(FERM BP-10282)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG2和/或杂交瘤(FERM BP-10283)生成的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG3。

24.权利要求15-23中任一项的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：识别不同表位的2种单克隆抗体中的至少一种是在免疫色谱中使用的胶体金标记的单克隆抗体。

25.权利要求15-24中任一项的乳变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性酪蛋白的一或多种单克隆抗体和识别变性酪蛋白的一或多种单克隆抗体、以及识别未变性β乳球蛋白的一或多种单克隆抗体和识别变性β乳球蛋白的一或多种单克隆抗体。

26.抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10263)生成的。

27.抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10264)生成的。

28.抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG1，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10281)生成的。

29.抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG2，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10282)生成的。

30.抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG3，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10283)生成的。

31.卵清变应原的检测方法，其特征在于：将识别未变性卵清变应原的单克隆抗体和识别变性卵清变应原的单克隆抗体结合使用。

32.权利要求31的卵清变应原的检测方法，其特征在于：使用分别识别不同的表位的2种或以上的单克隆抗体作为识别未变性卵清蛋白变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体。

33.权利要求31或32的卵清变应原的检测方法，其特征在于：识别未变性卵清蛋白变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体是抗卵白蛋白单克隆抗体。

34.权利要求33的卵清变应原的检测方法，其特征在于：抗卵白蛋白单克隆抗体是识别未变性卵白蛋白和/或还原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白单克隆抗体。

35.权利要求33或34的卵清变应原的检测方法，其特征在于：抗卵白蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10265)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA1和/或杂交瘤(FERM BP-10266)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA2和/或杂交瘤(FERM BP-10275)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA1和/或杂交瘤(FERM BP-10276)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA2。

36.权利要求33-35中任一项的卵清变应原的检测方法，其特征在于：该方法可通过夹层ELISA，在1.0-10.0ppb浓度范围内对食品中的未变性卵白蛋白和/或变性卵白蛋白进行定性且定量的分析。

37.权利要求31或32的卵清变应原的检测方法，其特征在于：识别未变性卵清变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体是抗卵类粘蛋白单克隆抗体。

38.权利要求37的卵清变应原的检测方法，其特征在于：抗卵类粘蛋白单克隆抗体是识别未变性卵类粘蛋白和/或尿素变性卵类粘蛋白的抗卵类粘蛋白单克隆抗体。

39.权利要求37或38的卵清变应原的检测方法，其特征在于：抗卵类粘蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10279)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM1和/或杂交瘤(FERM BP-10280)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM2和/或杂交瘤(FERM BP-10277)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM1和/或杂交瘤(FERM BP-10278)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM2。

40.权利要求34-36中任一项的卵清变应原的检测方法，其特征在于：该方法可通过夹层ELISA，在10-100ppb浓度范围内对食品中的未变性卵类粘蛋白和/或变性卵类粘蛋白进行定性且定量的分析。

41.权利要求31-40中任一项的卵清变应原的检测方法，其特征在于：该方法是使用尿素和2-巯基乙醇，从检样中萃取卵白蛋白和/或卵类粘蛋白。

42.权利要求31-41中任一项的卵清变应原的检测方法，其特征在于：该方法使用识别未变性卵白蛋白的1或多种单克隆抗体和识别变性卵白蛋白的1或多种单克隆抗体、以及识别未变性卵类粘蛋白的1或多种单克隆抗体和识别变性卵类粘蛋白的1或多种单克隆抗体。

43.卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性卵清蛋白变应原的单克隆抗体和识别变性卵清蛋白变应原的单克隆抗体，在将识别未变性卵清蛋白变应原的单克隆抗体和识别变性卵清蛋白变应原的单克隆抗体结合使用的条件下使用。

44.权利要求43的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中的识别未变性卵清变应原和/或变性卵清蛋白变应原的单克隆抗体具备分别识别不同的表位的两种或以上的单克隆抗体。

45.权利要求43或44的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：识别未变性卵清变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体是抗卵白蛋白单克隆抗体。

46.权利要求45的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：抗卵白蛋白单克隆抗体是识别未变性卵白蛋白和/或还原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白单克隆抗体。

47.权利要求45或46的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：抗卵白蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10265)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA1和/或杂交瘤(FERM BP-10266)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA2和/或杂交瘤(FERM BP-10275)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA1和/或杂交瘤(FERM BP-10276)生成的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA2。

48.权利要求43或44的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：识别未变性卵清蛋白变应原和/或变性卵清变应原的单克隆抗体是抗卵类粘蛋白单克隆抗体。

49.权利要求48的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：抗卵类粘蛋白单克隆抗体是识别未变性卵类粘蛋白和/或尿素变性卵类粘蛋白的抗卵类粘蛋白单克隆抗体。

50.权利要求48或49的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：抗卵类粘蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10279)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM1和/或杂交瘤(FERM BP-10280)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM2和/或杂交瘤(FERM BP-10277)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM1和/或杂交瘤(FERM BP-10278)生成的抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM2。

51.权利要求43-50中任一项的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：识别不同表位的2种或以上的单克隆抗体中的至少一种是免疫色谱中使用的胶体金标记的单克隆抗体。

52.权利要求43-51中任一项的卵清变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性卵白蛋白的1或多种单克隆抗体和识别变性卵白蛋白的1或多种单克隆抗体、以及识别未变性卵类粘蛋白的1或多种单克隆抗体和识别变性卵类粘蛋白的1或多种单克隆抗体。

53.抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA1，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10265)生成的。

54.抗卵白蛋白单克隆抗体PNOA2，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10266)生成的。

55.抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA1，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10275)生成的。

56.抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA2，该抗体是由杂交瘤(FERMBP-10276)生成的。

57.抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM1，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10279)生成的。

58.抗卵类粘蛋白单克隆抗体PNOM2，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10280)生成的。

59.抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM1，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10277)生成的。

60.抗卵类粘蛋白单克隆抗体PDOM2，该抗体是由杂交瘤(FERM BP-10278)生成的。

61.小麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法使用识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体。

62.小麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法将识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白、且识别不同表位的两种抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体结合使用。

63.权利要求61或62的小麦变应原的检测方法，其特征在于：抗小麦麦醇溶单克隆抗体是识别未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麦麦醇溶蛋白、和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体。

64.权利要求61-63中任一项的小麦变应原的检测方法，其特征在于：抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10267)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1和/或杂交瘤(FERM BP-10268)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2。

65.权利要求61-64中任一项的小麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法可通过夹层ELISA，在10-100ppb的浓度范围内对食品中的未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麦麦醇溶蛋白、和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白进行定性且定量的分析。

66.小麦变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体。

67.小麦变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性小麦麦醇溶蛋白和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白、且识别不同表位的2种抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体。

68.权利要求66或67的小麦变应原检测试剂盒，其特征在于：抗小麦麦醇溶单克隆抗体是识别未变性小麦麦醇溶蛋白、还原羧甲基化小麦麦醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麦麦醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麦麦醇溶蛋白、和变性剂增溶的小麦麦醇溶蛋白的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体。

69.权利要求66-68中任一项的小麦变应原检测试剂盒，其特征在于：抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10267)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1和/或杂交瘤(FERM BP-10268)生成的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2。

70.权利要求66-69中任一项的小麦变应原检测试剂盒，其特征在于：识别不同表位的2种单克隆抗体的至少一种是在免疫色谱中使用的用胶体金标记的单克隆抗体。

71.抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1，该抗体由杂交瘤(FERM BP-10267)生成。

72.抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2，该抗体由杂交瘤(FERM BP-10268)生成。

73.荞麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法使用识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体。

74.荞麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法将识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白、且识别不同的表位的2种抗荞麦粗蛋白单克隆抗体结合使用。

75.权利要求73或74的荞麦变应原的检测方法，其特征在于：抗荞麦粗蛋白单克隆抗体是识别24kDa蛋白质和加热变性荞麦粗蛋白单的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体，或者是识别76kDa蛋白质和未变性荞麦粗蛋白单的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体。

76.权利要求73-75中任一项的荞麦变应原的检测方法，其特征在于：抗荞麦粗蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10272)生成的抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW1和/或杂交瘤(FERM BP-10273)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2和/或杂交瘤(FERM BP-10274)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW3。

77.权利要求73-76中任一项的荞麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法可通过夹层ELISA，在10-1000ppb的浓度范围内对未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白进行定性且定量的分析。

78.权利要求73-77中任一项的荞麦变应原的检测方法，其特征在于：该方法是使用尿素和2-巯基乙醇，从检样中萃取加热变性荞麦粗蛋白。

79.荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体。

80.荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性荞麦粗蛋白和加热变性荞麦粗蛋白、且识别不同的表位的2种抗荞麦粗蛋白单克隆抗体。

81.权利要求79或80的荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：抗荞麦粗蛋白单克隆抗体是识别24kDa蛋白质和加热变性荞麦粗蛋白单的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体，或者是识别76kDa蛋白质和未变性荞麦粗蛋白单的抗荞麦粗蛋白单克隆抗体。

82.权利要求79-81中任一项的荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：抗荞麦粗蛋白单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10272)生成的抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW1和/或杂交瘤(FERM BP-10273)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2和/或杂交瘤(FERM BP-10274)生成的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW3。

83.权利要求79-82中任一项的荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：识别不同表位的2种单克隆抗体的至少一种是免疫色谱中使用的胶体金标记的单克隆抗体。

84.权利要求79-83中任一项的荞麦变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备尿素和2-巯基乙醇，作为从检样中萃取荞麦粗蛋白的萃取剂。

85.抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW1，该抗体是杂交瘤(FERMBP-10272)生成的。

86.抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2，该抗体是杂交瘤(FERMBP-10273)生成的。

87.抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW3，该抗体是杂交瘤(FERMBP-10274)生成的。

88.花生变应原的检测方法，其特征在于：该方法使用识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体。

89.花生变应原的检测方法，其特征在于：该方法是将识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质、且识别不同表位的2种抗Ara h1蛋白质单克隆抗体结合使用。

90.权利要求88或89的花生变应原的检测方法，其特征在于：抗Ara h1蛋白质单克隆抗体是识别未变性Ara h1蛋白质和未变性花生粗蛋白、和/或尿素处理Ara h1蛋白质和尿素处理花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体。

91.权利要求88-90中任一项花生变应原的检测方法，其特征在于：抗花生Ara h1蛋白质单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10269)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-1和/或杂交瘤(FERMBP-10270)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-2和/或杂交瘤(FERM BP-10271)生成的抗加热变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-3。

92.权利要求88-91中任一项的花生变应原的检测方法，其特征在于：该方法通过夹层ELISA，在10-1000ppb的浓度范围内对未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质进行定性且定量的分析。

93.权利要求88-92中任一项花生变应原的检测方法，其特征在于：该方法是用尿素和2-巯基乙醇，从检样中萃取加热变性花生Arah1蛋白质。

94.花生变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质的抗花生Arah1蛋白质单克隆抗体。

95.花生变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备识别未变性花生Ara h1蛋白质和加热变性花生Ara h1蛋白质、且识别不同表位的2种抗花生Ara h1蛋白质单克隆抗体。

96.权利要求94或95的花生变应原检测试剂盒，其特征在于：抗Ara h1蛋白质单克隆抗体是识别未变性Ara h1蛋白质和未变性花生粗蛋白、和/或尿素处理Ara h1蛋白质和尿素处理花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体。

97.权利要求94-96中任一项的花生变应原检测试剂盒，其特征在于：抗花生Ara h1蛋白质单克隆抗体是杂交瘤(FERM BP-10269)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-1和/或杂交瘤(FERM BP-10270)生成的抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-2和/或杂交瘤(FERM BP-10271)生成的抗加热变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-3。

98.权利要求94-97中任一项的花生变应原检测试剂盒，其特征在于：识别不同的表位的2种单克隆抗体的至少一种是免疫色谱中使用的胶体金标记的单克隆抗体。

99.权利要求94-98中任一项的花生变应原检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒具备尿素和2-巯基乙醇，作为从检体中萃取乳清蛋白的萃取剂。

100.抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-1，该抗体由杂交瘤(FERM BP-10269)生成。

101.抗未变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-2，该抗体由杂交瘤(FERM BP-10270)生成。

102.抗加热变性Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-3，该抗体由杂交瘤(FERM BP-10271)生成。