JP2012211777A - ミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することにより得られたハイブリドーマから、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すが、同じ刺胞動物門のミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応するがミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体には反応性を示さないが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体に反応性を示す生物を特定することで、ミズクラゲプラヌラ幼生を検出することができる。
【選択図】 なし
Description
本発明に係るミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すが、同じ刺胞動物門のミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すモノクローナル抗体またはそのフラグメントを試料(例えば、海水若しくは川水またはそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等)に加え、試料中のミズクラゲプラヌラ幼生由来の抗原と反応させ、その抗原を同定することにより行うことができる。
本発明に係るミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法に使用する2種類のモノクローナル抗体のそれぞれは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではない。このような2種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによって、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応するがミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体には反応を示さないが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体には特異的に反応を示す生物がミズクラゲプラヌラ幼生であると特定することができる。
前述の2種類のモノクローナル抗体は、それぞれ、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。
本発明に係る方法に用いられる抗体を産生するハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
上記「モノクローナル抗体またはそのフラグメント」に記載される2種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、すなわち、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによってミズクラゲプラヌラ幼生を特定することができるので、それらの2種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それらの2種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むことを特徴とするミズクラゲプラヌラ幼生の検出用試薬、ミズクラゲプラヌラ幼生の検出器、及び、ミズクラゲプラヌラ幼生の検出キットとして利用可能である。
本実施例では、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
鹿児島県湾竜ヶ水沿岸に設置された養殖生簀、あるいは、播磨新島ヨットハーバーの浮き桟橋裏面からベニクダウミヒドラ群体を採取した。この群体を海水で洗浄した後、雌雄に選別し、オスとメスを約1:9の割合で水温6〜7℃の海水を有する循環式水槽に収容して孵化直後のアルテミアを与えながら飼育した。適宜、幼生遊出直前のメスポリプを選別し、遊出したアクチヌラ幼生を採取した。回収したアクチヌラ幼生をろ過海水で洗浄した後、100個体ずつ冷凍保存した。この冷凍幼生を、以下に記載の免疫、ELISA用抗原試料として使用した。
10週齢のBALB/cマウス(メス)の腹腔内に抗原(ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生100〜200個/300〜400μLのPBS)を5回注射し、マウスを免疫した。具体的には、1回目の投与から168日目に2回目の投与を、2回目の投与から24日目に3回目の投与を、3回目の投与から21日目に4回目の投与を、4回目の投与から39日目に5回目の投与を行った。
(脾臓組織の単離)
最終免疫から4日後に、マウスから脾臓を摘出し、10%のFBS(Fetal Bovine Serum;GIBCO社製)及び1%の抗生物質(Antibiotic-Antimycotic;GIBCO社製)を含むRPMI1640(GIBCO社製)培地中で滅菌ステンレスメッシュを用いて裏漉しし、細胞を分散・懸濁させて脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を10%のFBSを含むRPMI1640培地(FBS+培地)で洗浄・遠心した後、RPMI1640培地(FBS−培地)で3回遠心・洗浄し、脾臓細胞を回収した。
まず、凍結ミエローマ細胞(マウス骨髄癌細胞、P3U1)を融解した後、10%FBS、1%抗生物質を含むRPMI1640で培養し、生存率、増殖性の高い株を選別し、1回移植して融合に備えた。GenomOne-CF(不活化センダイウィルス外膜:HVJ-E、石原産業(株)製)を用いて細胞融合を行った。前述のミエローマ細胞と脾臓細胞を1:2の割合で混合した後、遠心して上清を除去し、細胞ペレット(沈殿)を作製した。これに、氷冷した融合用緩衝液(1倍濃度液)を添加(脾臓細胞108細胞あたり1mL添加)し、細胞群を懸濁させた。氷冷したHVJ-E懸濁液を添加(細胞懸濁液1mLあたり25μLを添加)し、氷上で5分間静置した。その後、遠心(4℃、1000rpm×5分間)を行い、37℃で15分間インキュベーションした。続いて、FBS+培地(37℃)10mLを添加して細胞群を懸濁させた(脾臓細胞108細胞/50mL)。これを、FBS+培地10mLが入った分室シャーレ3枚にそれぞれ2mLずつ播種し、CO2インキュベータ内で静置培養を行った。培養開始から1日後、各シャーレから培地を4mLずつ取り、2×HAT培地6mLとconditioned medium 0.3〜0.4mLを各シャーレに添加し(終濃度0.8×HAT培地)、CO2インキュベータ内で静置培養することにより、HAT選択培養を行った。
HAT選択培養開始から4日(融合処理から5日)〜10日後、各シャーレの各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、シングルコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地[1×HT培地と10%の細胞増殖因子(conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社)を含む]の入った96穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、以下のELISA法により抗体の産生を確認した。
以下の各工程において、特に記載がない場合は室温にて処理、反応を行った。
(1)ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に50mM Tris−HCl(pH 7.5)を加え、氷中でホモジナイズを行い、5000rpmで20分間遠心することにより得たベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液をタンパク質濃度20μg/mLになるように調製した。
(2)(1)で得られたベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液50μLを、96穴イワキELISAプレートの各ウェルに加え、4℃で一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
(3)(2)で吸着処理した各ウェルをTBS(0.5M NaCl及び20mM Tris−HCl;pH7.5)200μLで洗浄した。
(4)各ウェルを1% BSAを含むTBS 100μlで1時間ブロッキングした。
(5)各ウェルをTTBS(0.05% Tween20を含むTBS)200μlで3回洗浄した。
(6)ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清(一次抗体)50μLを各ウェルに加え、2時間反応させた。
(7)各ウェルをTTBS 200μlで4回洗浄した。
(8)各ウェルに2次抗体(アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(Fc)ヤギ抗体、BETHYL社)溶液(TBSで500倍に希釈した溶液)50μlを加えて1時間反応させた。
(9)各ウェルをTTBS 200μlで5回洗浄した。
(10)各ウェルに基質(アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社)溶液 100μlを加え、1時間振盪することにより発色させた。
(11)マイクロプレートリーダー(BIO-RAD Model550)を用いて、各ウェルの溶液の吸光度(405nm)を測定した。
本実施例では、実施例1で得られた10種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に対する反応性を調べた。
循環式水槽を用い、アルテミアを給餌してアカフジツボ成体の維持・飼育を行い、定期的に幼生を孵出させた。幼生には培養した浮遊珪藻 Chaetoceros 等を給餌し、キプリス幼生を生産した。
兵庫県姫路市周辺沿岸からムラサキイガイ成体を採取し、やや低温に制御した水槽を用いて維持・飼育し、定期的に放卵・放精させた。媒精後、発生が進行した初期幼生に、培養したハプト藻 Isochrysis 等を給餌することによって人工飼育し、ペディベリジャー幼生を生産した。
兵庫県姫路市周辺沿岸から、プランクトンネットを用いてプランクトンを採取した。採取したプランクトンをシャーレ内の海水中に移し、ピペットでコペポーダ類のみ選別採取した。
兵庫県東播磨沿岸からタマウミヒドラポリプ群体を採取した後、低温水槽内で維持・飼育し、成熟させた。受精後、胚発生中の雌ポリプ群体を深型シャーレ内の海水中に移し、照明下で静置した。その後、生殖体外へ遊離してきたプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
兵庫県姫路市近辺沿岸から成熟雌クラゲ体を採取した。海水を満たした小型プラスチック容器内でクラゲ体を裏返し、保育嚢の縁辺に存在しているプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
Claims (9)
- ミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法であって、
試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載のミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P−21904で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。 - 請求項2に記載のミズクラゲプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、FERM P−21919で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。 - ミズクラゲプラヌラ幼生の検出用試薬であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出用試薬。 - 請求項4に記載のミズクラゲプラヌラ幼生の検出用試薬であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P−21904で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、FERM P−21919で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出用試薬。 - ミズクラゲプラヌラ幼生の検出器であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。 - 請求項6に記載のミズクラゲプラヌラ幼生の検出器であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P−21904で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、FERM P−21919で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出器。 - ミズクラゲプラヌラ幼生の検出キットであって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出キット。 - 請求項8に記載のミズクラゲプラヌラ幼生の検出キットであって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P−21904で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、FERM P−21919で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出キット。
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