JP4194570B2 - フジツボ類の付着期幼生に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明に係るモノクローナル抗体は、フジツボ類以外の甲殻類プランクトンや二枚貝類の付着期幼生、又はそれらの付着期幼生をそれぞれ超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物(以下、「粗抽出液」と称する。)には反応しないが、フジツボ類(特に、アカフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ等)の付着期幼生又はそれらの粗抽出液に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(以下、「本発明に係るハイブリドーマ」と称する。)から得ることができる。本発明に係るハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、公知の手法により行うことができる。具体的には、本発明に係るハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより上述のモノクローナル抗体を得ることができるが、上述のハイブリドーマを哺乳類動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サルなど)の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより上述のモノクローナル抗体を得ることとしてもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、上述のハイブリドーマの培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、又は上述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなど)、ゲル濾過等の方法、又はこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。
本発明に係るハイブリドーマは、例えば、以下の方法により作製することができる。まず、フジツボ類(例えば、アカフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ等)の付着期幼生又はその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原(アジュバンドを使用してもよい。)を哺乳類動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サルなど)の静脈内、皮下、腹腔内等に(1〜複数回)投与して免疫する。その際、1つの種のフジツボを抗原として用いればよいが、複数の種のフジツボを用いてもよい。その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)と融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマから、フジツボ類以外の甲殻類プランクトンや二枚貝類の付着期幼生又はそれらの粗抽出液には反応を示さないが、フジツボ類(特に、アカフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ等)の付着期幼生又はそれらの粗抽出液には反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明に係るフジツボ類の付着期幼生に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。この方法によると、1つの種のフジツボを抗原として用いるだけで、複数の種のフジツボに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを効率よく得ることが可能となる。
本発明に係るモノクローナル抗体は、フジツボ類以外の甲殻類プランクトンや二枚貝類の付着期幼生又はそれらの粗抽出液には反応性を示さないが、フジツボ類(特に、アカフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ等)の付着期幼生又はそれらの粗抽出液に対して特異的に反応性を示すことから、本発明に係るモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、フジツボ類の付着期幼生の特異的な検出に有用であると考えられる。
アカフジツボ(Megabalanus rosa (Pilsbry))キプリス幼生に特異的なモノクローナル抗体を得るために、室内飼育により得られたアカフジツボキプリス幼生を抗原として用いた。
(2)(1)で吸着処理した各ウェルをTBS(0.5 M NaCl及び20 mM Tris-HCl(pH7.5))200μlで洗浄した。
(3)各ウェルを1% BSAを含むTBS 100μlで1時間ブロッキングした。
(4)各ウェルをTTBS(0.05% Tween20を含むTBS)200μlで3回洗浄した。
(5)ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清(1次抗体)50μlを各ウェルに加え、1時間反応させた。
(6)各ウェルをTTBS 200μlで4回洗浄した。
(7)各ウェルに2次抗体(アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)ヤギ抗体;ZYMED laboratory)溶液(TBSで1000倍に希釈した溶液)50μlを加えて1時間反応させた。
(8)各ウェルをTTBS 200μlで5回洗浄した。
(9)各ウェルに基質(アルカリフォスファターゼ基質キット;BIO-RAD)溶液 100μlを加え、1時間振盪することにより発色させた。
(10)マイクロプレートリーダー(BIO-RAD Model550;405nm)を用いて、各ウェルの溶液の吸光度を測定した。
次に、実施例1により得られた4個のハイブリドーマクローン(KA4-5b6P-1(3)a、KA4-5b(5)a、KF1-6a4(1)6P-3、及び10E3-1A11-2(3)b)の各培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、アカフジツボキプリス幼生に対して特異的に反応するか否かを調べるため、アカフジツボキプリス幼生、タテジマフジツボ(Balanus amphitrite Darwin)キプリス幼生、イワフジツボ(Chthamalus challengeri Hoek)キプリス幼生、フジツボ類以外の甲殻類プランクトン(コペポーダ類、アルテミア(Artemia salina)ノープリウス幼生)、及び二枚貝幼生(アサリペディベリジャー幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生)の粗抽出液(タンパク質の濃度;100μg/ml)との反応性を、実施例1に記載のELISA法と同様に確認した。なお、各粗抽出液は、各幼生又はプランクトンを50mM Tris-HCl(PH7.5)に加えて、ホモジナイズ・超音波(数秒×5回)処理し、5000rpm×20分間の遠心を行うことにより調製した。ELISAの結果(OD405値)を表1に示す。
次に、実施例1により得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がフジツボ類のキプリス幼生自体に特異的に反応するかどうかを調べるために、培養上清がフジツボ類のキプリス幼生の粗抽出液に対して特異的に反応したハイブリドーマクローン10E3-1A11-2(3)bのモノクローナル抗体を用いて、アカフジツボキプリス幼生及びタテジマフジツボキプリス幼生に対する免疫染色を以下のように行い、実体顕微鏡及び倒立顕微鏡で各幼生を観察した。なお、特に記載がない過程については室温にて処理(反応を含む)を行った。
(2)各ウェルをPBS 200μlで洗浄した後、PBST(0.05% Tween20を含むPBS)200μlにてさらに洗浄した。
(3)各ウェルに1% BSAを含むPBST200μlを注入し、4℃で8時間ブロッキングした。
(4)各ウェルに10E3-1A11-2(3)bのモノクローナル抗体(1次抗体;1% BSAを含むPBSTで8倍に希釈した溶液)200μlを加え、4℃で一晩反応させた。
(5)各ウェルをPBST 200μlで4回洗浄した。
(6)各ウェルに2次抗体(アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)ヤギ抗体;1% BSAを含むPBSTで400倍に希釈した溶液)200μlを加えて4℃で8時間反応させた。
(7)各ウェルをPBST 200μlで4回洗浄した。
(8)各ウェルに基質(アルカリフォスファターゼ基質キット;BIO-RAD)溶液 200μlを加えて発色させた。
Claims (6)
- フジツボ類の付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマ。
- フジツボ類の付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、
受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とするモノクローナル抗体又はそのフラグメント。 - フジツボ類の付着期幼生の検出用試薬であって、
フジツボ類の付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有する検出用試薬であって、
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする検出用試薬。 - フジツボ類の付着期幼生の検出器であって、
フジツボ付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器であって、
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする検出器。 - フジツボ類の付着期幼生の検出キットであって、
フジツボ類の付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含み、
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする検出キット。 - フジツボ類の付着期幼生の検出方法であって、
試料に、フジツボ類の付着期幼生に特異的に反応し、フジツボ類以外のコペポーダ類や二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを加える工程を含み、
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P−20282で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする検出方法。
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