JPH02131574A - ミニクローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗体の産生に関する。

〔背　景〕

多くの診断アッセイは、特定の分子又は特定の分子に関
係する有機体を同定するために特定の態様で反応する試
薬の能力による。啼乳顛の免疫システムは、アミノ酸及
び糖の配列により見出されるような試薬として使用する
ために、特別な空間及び極性構造を有する他の分子に対
する特異性及び結合活性を有する分子を生成する無比の
能力を有する。長い間、生体内免疫システムを用いるこ
とによってポリクローナル抗体を含む抗血清を産生ずる
ことに依存して来た。抗血清を産生ずる動物は、特異的
抗原に対する高い特異性を示すボリクローナル抗体を付
与するために選択されるが、しかしそのような動物から
の抗血清は、それが種々の特異性及び結合活性の抗体の
混合物を含む場合、抗原上の種々の部位を通常区別する
ことができない。従って、全組成物にわたっての平均的
な抗体一抗原の相互作用は観察されるが、しかし特異的
抗体の性質は観察されない。抗血清としての抗体産生は
、免疫化された動物により産生され得る量によりさらに
制限される。さらに、抗血清の性質は、動物により異な
り、そしてこれらは特異的抗体に依存する標準アッセイ
を提供することにおいて問題を引き起こす。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＫｏｈｌｅｒによる可能性ある発
見によれば、ハイブリドーマとして言及される細胞を産
生ずるためにＢ−１）ンパ球と骨髄腫細胞とを融合する
ことによって抗体の均質組成物が調製され得る。初めに
調製された細胞は、一定の収集体中のすべての細胞が単
一の親細胞から生じることを確保する限界希釈法又は他
の技法にゆだねられる。

従って、その得られた抗体産生細胞は、モノクローナル
として言及される。モノクローナル抗体は一定の特異性
及び結合活性を有し、そして類似する抗原又は単一抗原
上の順似するエビトープを区別するために高い特異性を
必要とする診断アッセイのために特に有用である。他方
、単一の抗原決定基とモノクローナル抗体との反応性は
、通常の臨床的適用のためのイムノアッセイ、特に多型
性物質（たとえば、抗体が複数の抗原形に結合すべきで
あることが所望される複数形のインフルエンザウィルス
又は他のウィルス）のためのアッセイを開発することに
何らかの問題を引き起こして来た。

多くの場合、モノクローナル抗体の混合物が、結合特異
性の範囲を高めるために調躯されて来た。

しかしながら、そのような技術は一般的に、最終イ％用
組成物が得られる前に行なうべき実験室摸作の数及び量
を有意に高めるので、満足のいくものではない。従って
、従来のボリクローナル抗体に存在する変動性を避けな
がら、高い親和性及び広い特異性を有する抗体を提供す
る新規の技法が、この分野における多くの研究者の研究
にもかかわらず、所望する目的である。

〔発明の要約〕

従って、本発明は、多型性又は複合性決定抗原を包含す
る診断又は治療に使用するた杓の抗体を調製するための
方法を提供し、該方法とは、前記抗原により感作された
Ｂ−ＩＪンパ球がら不滅化された抗体産生細胞の収集体
を創造し；前記収集体を、モノクローナル段階を通過し
ないで、多くの抗体産生細胞を含有するミニクローンに
分離し；そして前記ミニクローンから、前記抗原と反応
性の種々の特異性を有する多くの抗体を産生ずるミニク
ローンを選択することを含んで成る。その選択されたミ
ニクローンは容易に増殖され、所望する高い特異性を有
し、そして多型性又は複合性決定抗原を包含する診断又
は治療を提供するために十分に不均質である抗体（ミニ
クローナル抗体として言及される）の混合物が付与され
る。抗原と反応性の複合性ミニクローンは、所望により
組合され、そして増殖され得る。

〔特定の態様の記載〕

抗体産生細胞の収集体から単一クローンを単離する限界
希釈法及び類似する技法が、所望する抗体を産生ずるた
めに必要とされない本発明を導びく１つの要因が本発明
者により実現された。従って、本発明は、抗体分泌性ク
ローンの産生を包含する技法による有用な抗体の産生の
だ必にこれまで必須であると思われた段階の排除を示す
。

Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの｛−／クローナル
抗体の産生のための典型的な方法におし１ては、所望す
る特異性を有する抗体を産生ずるために、Ｂ−ＩＪンパ
球が対象の抗原により感作される。本発明において使用
される場合、特異的結合とは、抗体分子上の他の位置で
生じる非特異的結合に対立するものとして、抗体の特異
的結合部位で生じる結合を言及する。Ｂ−ＩＪンパ球は
、末梢リンパ球、牌臓細胞又は生体内で得られる他の細
胞のいずれかであり、又は生体外感作技法に使用される
リンパ球である。Ｂ−ＩＪンパ球を感作する抗原の使用
は、当業界において良く知られており、そして本発明の
一部を表わすものではない。

Ｂ−リンパ球は骨髄細胞と融合し、生体外複製及び抗体
産生のための無限の能力を有する不滅化されたハイブリ
ドーマ細胞を産生ずる。他方、Ｂリンパ球は、適切な形
質転換ベクター、たとえばエプスクインーバールウィル
スにより不滅化され得る。抗体産生細胞の収集体を調製
するための、骨髄細胞との融合又はウィルス形質転換に
よるＢリンパ球の不滅化は、古く且つ従来技術に存在す
る。

ハイブリドーマを使用するモノクローナル抗体の産土の
ための従来技術の技法においては、典型的な融合方法が
、３種の異なったタイプのハイブリドーマ：１）非抗体
生成体、２〉非特異的抗体生成体及び３）特異的抗体生
成体の産生をもたらすであろう。これらの３種のタイプ
のハイブリドーマのうち、後者のタイプのみが所望され
、そして多くの従来技術は、他の２種のタイプの細胞か
らこれらの特異的抗体生成体の単離を教授する。

抗体産生ハイブリドーマを選択する第１段階は、典型的
には、ハイブリドーマ細胞のみが連続して増殖するであ
ろう選択培地を用いて、非ハイブリドーマ細胞からハイ
ブリドーマ細胞の分離を行なうことであった。次に、生
存細胞が、対象の抗原との結合により所望する抗体の産
生について試験される細胞のかたまりに分けられた。

しかしながら、本発明においては、非抗体生成体及び非
特異的生成体をたぶん生せしめるこれらのＢ−リンパ球
は、融合又は不滅化の前、全体のＢ−ＩＪンパ球集団か
ら減じられ又は排除される。

この分離は、リンパ球の表面上に存在する抗体の特異的
結合を認識し、そして他の細胞から特異的リンパ球を分
離するた約にその認識を使用することができるいづれか
の技法により、たとえば抗原被覆固体吸着剤（たとえば
プラスチック組織培養皿）にＢ−リンパ球を特異的に結
合せしめることによって行なわれる。抗原被覆吸着剤に
結合することによって特異的抗原の認識を示すこれらの
リンパ球は、抗体産生のために所望する特性（たとえば
特異性及び抗体分泌）を有し、そして次に不滅化された
Ｂ−リンパ球を調製することに使用するために集められ
る。

本発明の技法においては、リンパ球が、骨髄腫細胞又は
リンパ芽球細胞との融合（ハイブリドーマ技法）により
又は形質転換ベクター、たとえばウィルスにより不滅化
され得る。これらの不滅化された細胞は、次に多数の別
々の集団に再分される。その再分は、個々の単離された
集団が制限されたクローン組成物の集団であるが、しか
しモノクローナルではないように計画され、そこで前記
個々の単離された集団は、１〜数種の異なったタイプの
抗体分子を産生ずるための可能性ある能力を有する。適
切な試験技法（下記に説明される）を用いることによっ
て、所望する抗体を産生ずることができる個々の集団が
使用のために同定され、そして／又は抗体産生細胞の混
合集団を形成するために一緒にプールされ、そして所望
するタイプの抗体を産生じない集団は捨てられる。

個々の集団をプールすることによって形成された混合集
団（又は複数の抗体タイプ生成体をすでに含む未混合の
個々の集団）内に、所望する抗体を産生ずる多くの細胞
が存在する。しかしながら、いくつかの細胞は、抗体又
は非特異的抗体を産生じない混合集団内に存在すること
ができる。これらの所望しない細胞は、抗原被覆固体表
面に結合することができるこれらの細胞のみを選択し、
そして保護することによって減じられ又は排除され得る
。その保護された細胞は、精製されたミニクローンとし
て本明細書において言及され、そしてこの追加の選択技
法が使用されたことを示唆する。

所望するリンパ球集団の選択のためにこの抗原結合生成
体を用いることにより、所望しない大部分のクローンを
排除しながら、対象の特異的抗体を産生ずるこれらのク
ローン細胞を卓越して選択することが可能である。さら
に、クローニング工程及びモノクローンの産生を通さな
いで前記所望とするクローンを選択することが可能であ
る。

モノクローン細胞とクローン又はミニクローン細胞とを
区別するために化合物クローン又はミニクローンとして
言及されるこれらの細胞群は、対象の抗原と反応する複
数抗体の存在を確保するであろういずれかの技法により
特異的に選択される。

そのようにして産生されたミニクローナル抗体は、抗原
が単型性もしくは多型性であり、又は複合性決定基を含
もうとも、その抗原と反応するであろう。たとえば、多
型性ウイルスが対象の抗原である場合、複数株のウィル
スと結合する特定のミニクローンからの上清液（抗体を
含む）の能力が試験され得る。それぞれ個々のアツセイ
は、モノクローナル抗体におけるクローンを選択するた
めに使用される典型的なアッセイであろう。しかしなが
ら、その選択方法によるミニクローンは、対象の抗原と
反応する種々の特異性を有する多くの抗体を有するであ
ろう。

モノクローナル抗体の産生はまた、特定の抗原と反応す
る抗体の収集体の初期認識を含むけれども、抗体産生細
胞への拡張のための多くの細胞の特異的選択は、モノク
ローナル抗体の産主において故意に避けられる段階であ
る。代わりに、限界希釈法又は類似する技法が、また存
在するであろう、抗体の非生成体及び非特異的生成体に
関連する問題を避けるために、単一細胞から生じる細胞
系の産生を確保するために意識的に使用される。

モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体の混合物の
後での生成のために調製される場合でさえ、そのような
すべての選択は、本発明の技法に比べてモノクローナル
段階を通過している。

本発明のミニクローナル抗体は、便利な脊椎動物源（宿
主）、たとえばネズミ、霊長類、たとえばヒト、ウサギ
、ウシ、羊、ウマ、ブタ等から得られる。その抗体は、
抗原特異的抗体の高血清レベルを有する宿主からのリン
パ球と骨髄腫細胞との既知技法による融合により又は適
切な形質転換ベクターによりそのような宿主のリンパ球
を形質転換することにより不滅化された細胞から産生さ
れ得る。その細胞は選択培地中で培養され、そして所望
する抗原を結合する抗体を選択するためにスクリーンさ
れる。

融合パートナーは、好ましくは完全な免疫グロブリン分
子を分泌せず、そしてＨＡＴ培地に関して選択され、そ
して所望により高い融合効率を有するいずれか便利な不
滅化されたＢ一細胞であり得る。融合パートナーの例と
して、ＵＣ７２９−６Ｊ−４（ＳＫＯ−００７＞　＝　
ＧＭ１５００　６ＴＧ−Ａ１２　．　Ｐ３／ＮＳＩ／１
−Ａｇ４−１及びＳＰ２／０−Ａｇｌ４を挙げることが
できる。

融合は、フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）　　としてポリエ
チレングリコールを用い、多くのウエル中にＨＡＴ培地
中細胞をプレートし、そして次に生存細抱含有ウェルの
上清液を対象の抗体についてスクリーニングすることに
より文献に記載のようにして行なわれ得る。次に、陽性
の反応性のウエルが、限界希釈法又はモノクローン性を
生成するような他の技法によらないで拡張される。その
得られたハイブリドーマは、モノクローナルハイブリド
ーマから区別するために化合物ハイブリドーマとして言
及される。化合物ハイブリドーマにより産生される抗体
の混合物は、ミニクローナルとして言及され、そしてそ
れらが比較的少数のクローン（ｍｉＡｂｓとして略語化
する）に由来することを示唆する。

池方、リンパ球は、形質転襖ベクター、たとえばエプス
タインーパールウィルスにより又はウィルス形質転換及
び細胞融合技法の組合せにより不滅化され得る。

上記の種々の段階で抗体産生細胞を得るために使用され
る選択技法は、他の細胞から所望する特異性を有する抗
体産生細胞の分離を可能にするであろういずれかの技法
であり得る。種々の技法、たとえば固体表面に結合され
る抗原に対する抗体産生細胞の結合、螢光ラベルされた
抗体に結合する能力に基づく選別及び同様の技法は、従
来技術に見出される。固体表面に結合される抗原の使用
は、その技法の単純性のために好ましい態様を示す。対
象の抗原が、固体表面に結合され（種々の技法が存在し
、このいくつかは後で引用される特許及び他の文献に説
胡される）、そして試験されるべき細胞の懸濁液が前記
表面と接触される。非結合細胞をゆっくりと洗浄するこ
とにより除き、この後、結合細胞を別々に除く。精密な
技法は、使用される表面のタイプに従って異なるであろ
う。

たとえば、ビーズ又は類似する物質がクロマトグラフィ
一方法に使用され得、又は連続した固体表面、たとえば
容器の壁が吸引又はデカントにより生じる流体除去に伴
って使用され得る。

選択されたミニクローンは拡張され、すなわち科学及び
特許文献に記載される標準のウエル技法に従って、抗体
産生に使用するために多数の細胞に増殖される。

本発明のミニクローナル抗体は、特に試薬の源として、
及び試薬として使用される生成物への前駆体として種々
の方法で使用され得る。

ミニクローナル抗体は、生体内及び生体外診断並びに治
療に使用され得る。多くの適用のためには、その抗体は
、抗体に所望する特性を付与する、たとえば検出可能な
シグナルを付与する、細胞毒性を付与する、局在化され
た電磁線を付与する、又は同様のものを付与する化合物
によりラベルされるであろう。

検出可能なシグナルを付与する広範囲の種類のラベルが
知られている。ラベルの例として、放射性同位体、たと
えば３８　．　１２５１　．　１３１＋　，　１４Ｃ　
　．螢光体、タとえばフルオレセイン、フィコビリタン
パク質、希土石キレート、ローダミン：酵素基質及びイ
ンヒビター；酵素、たとえばホースラディシュペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチ
ルコリンステラーゼ粒子、たとえばデキストラン、アガ
ロース、金属粒子、炭素磁気粒子、ボリスチレン粒子；
又は同様のものを挙げることができる。タンパク質への
ラベルの接合のための方法は、文献中に記載されている
；たとえばアメリカ特許第３，　８１７．　８３７号；
第４，　１３４，　７９２号；及び第４，　２２０，　
７２２号を参照のこと。

使用されるラベル化は、従来の技法に従い、そして抗体
分子当たりのラベルの数はラベルの性質、所望するシグ
ナルの感度、ラベル化の目的及び同様のことに依存して
変化するであろう。多くのアッセイ法が、本発明に適用
できる広範囲の種類の分析物の検出のために抗体と共に
使用するために開発されて来た。たとえばアメリカ特許
第３，　７９１，　９３２号；第３，　８１７，　８３
７号；第４，　１３４，　７９２号；第４，　１７４，
　３８４号；第４，　２７５，　１４９号；及び第４　
２９９．　９１６号（これらは引用により本明細書中に
組込まれる）を参照のこと。

ミニクローナル抗体は、リポソーム膜に組込まれ又はそ
のような膜に組込まれるように脂質により変性され得る
。単独での又はラベルされた抗体は、新生物、たとえば
頚部癌に関連する抗原の存在を測定するために生体外診
断に、又は生理学的に許容できるキャリャー、たとえば
リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中において宿主の静脈中への
導入により生体内診断のために使用され得、又は同じ態
様で治療目的のために導入され得る。

アッセイへの使用の他に、ミニクローナル抗体は、生体
内治療への使用のための特異的結合剤（典型的には放射
性又は放射線不透過性ラベルにより又は標的細胞の破壊
のために向けられる細胞毒性ラベルにより）としての使
用を含み、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗
体が一般的に使用されているいづれか他の技法のために
使用され得る。

単独での又はラベルされた抗体は、ヒト又は動物、特に
啼乳類宿王の新生物、たとえば頚部癌、前立腺癌、結腸
癌、肺癌、乳癌又は黒色腫を治療するためにもまた使用
され得る。たとえば、アメリカ特許第４，　３３１．　
６４７号；第４，　３４８，　３７６号；第４，　３６
１，　５４４号；第４，　４６８，　４５７号；第４，
　４４４，　７４４号第４．　４６０．　５５９号；及
び第４，　４６０，　５６１号を参照のこと。これらの
特許は、放射性ラベルされた抗体を用いての腫瘍の診断
及び治療のための多くの技法を記載する。池の使用とし
て、特に、ウィルス性疾病、特に多型性ウィルス、たと
えばインフルエンザウィルス又は旧Ｖ−ＩＩＩ（このウ
ィルスは後天性免疫不全症候群；ＡＩＤＳの原因である
と思われている）により引き起こされる疾病の診断及び
治療を含む。

本発明の抗体は容易に生理食塩水に溶解することができ
、そして従って、塩溶液又は点滴として静脈内又は筋肉
内注射され得る。さらに、本発明の抗体は、軟膏又は座
剤の形でも使用され得る。

使用される抗体の量及び結合親和性（又は結合活性）は
、特別な用途に依存して変化するであろう。診断及び治
療目的のためへの抗体の使用は、文献中に詳しく説明さ
れている。

完全な抗体が使用される必要はない：多くの適用のた絞
には、損なわれていない可変部を有するフラグメントで
十分である。たとえばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’
）２フラグメント又はＦｖ　フラグメントて十分である
。さらに、損われていない抗体の可変部を有するキメラ
抗体が産生され得る。

本発明の抗体は、多くの特定の定性及び定量免疫化学方
法、たとえば免疫電気泳動、免疫拡散、免疫沈殿、補体
結合、赤血球凝集、ラジオイムノアッセイ、酵素結合の
免疫吸着アッセイ及び同様の方法に使用され得る。これ
らのアッセイは、種々の抗原の存在及び／又は量の決定
のために過去数年間にわたって開発されて来た。つい最
近開発された抗原一抗体反応の研究のための技法として
、イムノラジオメトリックアッセイ及び他のタイプのイ
ムノメトリックアッセイを挙げることができる。

１つの有益なイムノメトリンクアッセイは、抗原が固体
表面上に固定される抗体と反応せしめられる２部位又は
゛′サンドインチ″イムノメトリノクアノセイである。

抗原に対する第２抗体がラベルされ、そして第１抗体を
通して固体支持体に結合される抗原と反応せしめられる
。

この技法は、元来、従来の生体内技法で産生されるポリ
クローナル抗体を用いて開発された。最近、モノクロー
ナル抗体が、サンドイッチアソセイに適用されて来た。

しかしながら、前記モノクローナル抗体の欠点がそのよ
うなアンセイに見られる。

サンドイッチアンセイにミニクローナル抗１本を適用す
ることにより、ポリクローナル及びモノクローナルシス
テムの両者の欠点の多くが回避され得る。

本発明のミニクローナル抗体；よ、既知方法、たとえば
ポリエチレンクリコール又は硫酸アンモニウムの飽和溶
液により、続いて所望により透升又はアフィニティーク
口マトグラフイーにより一部又は完全に精製され得る。

本発明は、記載されるようにして選択された本発明に記
載の化合物クローン（ミニクローン）及びそれにより産
生されるミニクローナル抗体の両者を含んで成る。ミニ
クローナル抗体を包含する技法はまた、本発明の一部で
ある。本発明の１つの観点は、下記の種々の成分及び試
薬を含む試験キット又は生体外診断キットを含んで成る
：液体−又は固体貯蔵形でのｍｉＡｂｓ（ラベルされて
いるか又はラベルされていない）；陽性又は陰性標準と
して使用するた約の種々の抗原：緩衝液、たとえばリン
酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ，　ＨＥＰＥＳ及び同様の
もの；及びｍｉＡｂｓが使用される特定のアッセイを行
なうためにこれまで必要とされて来た他の添加物又は試
薬。このキット成分は、場合によっては安定剤、たとえ
ばウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、デキスト
ロース、アジ化ナトリウム又は同様のもの、及びイムノ
アッセイキットに典型的に見出される他の試薬を含むこ
とができる。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載した
が、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。

例　　１ ミニクローナル抗一インフルエンザウィルス（抗−ｆβ
Ｕ）抗体を、ＭＲＬ／ｊ２ｐｒマウスからの牌臓細胞と
ＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫細胞系とを前記のようにして融合せ
しめることにより得ることができる［：Ｔａｇｇａｒｔ
　ａｎｄ　Ｓａｍｌｏｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８
３）　２１９：１２２８〜１２３０　；　Ｗｅｉｓｂａ
ｒｔ，など，　，　Ｊ，　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８４
）　１３２　：２９０９〜２９１：’Ｅ。手短に言えば
、牌臓細胞（２．４Ｘ１０８）を、抗−ｆβＵ抗体の高
血清レベルを有するＭＲＬ／βｐｒマウス（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ
，　Ｍａｉｎｅ）から得る。牌臓細胞を、抗原被覆のペ
トリ皿に結合せしめ、そして非付着性細胞を排除する。

抗原結合細胞をそのプレートから回収し、そして５０％
ポリエチレングリコール１６００を用いて４．　８　Ｘ
ＩＯ７個の骨髄腫細胞と融合せしめる。

ソノ細胞を、０．２ｍｌ．のＲＰ！，＋１１６４０及び
ｌＯ％ウシ胎児血清を含む９６個のウェルプレート中に
１×１０６／雁で培養するっ培養上浦液を１０口後収穫
し、そして前に記載の方法（１！ＩｅｉｓｂａｒｔＳｉ
ｉ　ｅ．，　ＡｎｎａｌｓＩｎｔ，！．ｌｅｄｉｃｉｎ
ｅ（１９８６）　１０４：３１０〜３１３　〕のように
して酵素結合イムノ吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　によ
りインフルエンザウィルスに対スるＩｇＧ抗体について
アンセイする。スクリーニングが、ウイルスを結合する
ＩｇＧ抗体のみを選択するために行なわれる。広い結合
特異性を、いくつかのウイルス株に対して選択すること
により確保する。所望する特異性の抗体を産生ずる複数
のウエルを組合すことにより、その組合された集団の複
数のクローン性質が確保される。次に、その組合された
細胞集団を、抗原被覆のペトリ皿に結合せしめ、そして
すべての非結合細胞を排除する。次に抗原結合細胞を集
め、そして所望する抗体を産土するミニクローンに拡張
する。ミニクローナル抗体を、比較しうる応答を付与す
る希釈度（０．５〜１０ｇ／Ｊ）でＥＬＩＳＡによりア
ツセイする。選択されたｍｉＡｂｓを産生ずるミニクロ
ーン細胞（約１０７）を、プリスタンにより感作された
Ｂａｉ／ｃマウスの腹腔内に注射し、そしてｍｉＡｂｓ
を、プロテインーＡセファロースに結合せしめ、そして
リン酸緩衝液中０．５ＭのＮａｉｌ！　（ｐＨ７．２）
　、続いて０．１ＭのＴｒｙｓグリシンＨＣβ　（ｐＨ
　４．　０　）により洗浄することによって非免疫グロ
ブリンタンパク質を除去すること１こより腹水から精製
する。たとえばｍｉ八ｂを、０．１ＭのＴｒｉｓ−グリ
シンＨｉ　　（ｐＨ２．８）によりプロテインーＡから
溶離することができる。

例　　２ 癌患者からのリンパ節を、ＲＰ！，！＋１６４０培地中
にナゲット鉗子により掻き裂き、そして単離されたリン
パ球を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２ｍＭのし
−グルタミンを有するＲＰＭＩ１６４０中において３７
℃及び５％ＣＯ２で一晩培養する。培養容器の底に、抗
原一反応性リンパ球を結合するために使用される癌細胞
（抗原）の単層が存在する。一晩のインキュベーション
の後、非結合リンパ球を排除し、そして抗原結合性リン
パ球を集める。リンパ球を計数し、そしてヒ｝　ＩＪン
パ芽球Ｂ細胞系［ＩＣ７２９−６（Ｈａｎｄｌｅｙ　ａ
ｎｄ　Ｒｏｙｓｔｏｎ，　１９８２，　”｝Ｉｙｂｒ＋
ｄｏｍａｓ＋ｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓ＋ｓ　
ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，　”Ｍｉｔｃｈｅｌａｎ
ｄ　Ｏｅｔｔｇｅｎ版、１２５〜１３２ページ、Ｒａｖ
ｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）　により２：１の比で混合し
、次にＧｅｆｔｅｒなど．，Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９７７）　３　：　３２１〜
３３６による技法の変法によりポリエチレングリコール
１５００により融合せしめる。融合された細胞を、ｌＯ
％ＦＣＳ及びＬ−グルタミンを有するＲＰＭＩ１６４０
により補足されたヒポキサンチンーアメトプテリンーチ
ミジン（ＨＡＴ，Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，　　Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ　（１９６４）１４５：７０９〜７１０）を含
むＣｏｓｔａｒ　９５−ウェルミクロタイタープレート
に１０５個の細胞／ウェルでプレートする。１０〜２０
日以内に、ハイブリドーマ増殖のために陽性のウェルを
、ヒト抗体産生についてアッセイし（抗−ヒト抗体を用
いて）、そしてヒト細胞パネルに対するそれらの反応性
を酵素イムノアンセイ　（ＥＩＡ）により測定する。所
望する抗体を産生ずるハイブリドーマを一緒にプールし
、そして次に抗原被覆のペトリ皿上での抗原結合性につ
いて選択する。非結合細胞を排除し、そして結合された
細胞をミニクローンとして収集し、そして限界希釈又は
モノクローナル段階を通らないでさらに研究のために拡
張する。

酵素イムノアソセイ ヒトｍｉＡｂｓ及び細胞に対するそれらの反応性を、（
１９８２）５４：２９１〜２９６〕による変法により検
出する。

手短に言えば、アフィニティー精製されたヤギ抗ヒトＩ
ｇ又は４Ｘ１０６個の標的細ｌ包／雁懸濁液のいずれか
５０ｍを、免疫濾過マニホールドの三重ウェルに固定す
る。〔インキュベーションチ丁ンハー及び濾過マニホー
ルド（ＶＰ　Ｎｏ．１０７）の両者として作用する特別
に作られたミクロタイタープレートは、Ｖ　ａｎｄ　Ｐ
　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ　
から入手できる〕。それぞれのウェルの底は、０．　６
　ｍｍの穴を含み、この上に直径６ＩＩＩＩＩ１のガラ
ス繊維フィルターが配置される。表面張力が、真空が適
用されるまで、１００４以下の流体体積の穴を通しての
流出を妨げる。真空が適用される場合、流体はフィルタ
ーを通して及びフィルター上に閉じ込釣られた粒状物質
を残す排出穴から排出される。リン酸緩衝溶液中０，３
％ゼラチンにより３度洗浄した後、ハイブリドーマ上清
液５０ｄを室温で３０分間インキユベートする。次に、
フィルターを洗浄し、そしてホスラディシュベルオキシ
ダーセ接合のヤギ抗一ヒ｝Ｉｇ５０Δと共にさらに３０
分間インキニベートする。フィルターを再び洗浄し、そ
してクエン酸緩衝液中オルトーフェニレンジアミンの４
００＝−ｇ　／ｄの溶液１５０４と共にインキユベート
する。次に、それぞれのウェルから１００Ｉを、２．　
５　ＭＬｙ）Ｈ２ＳＯｓ　５０，ｖを含む新しいプレー
トに移し、そしてＤｙｎａｔｅｋ　（Ａｌｅｘａｎｄｒ
　ｉａ，　ＶＡ）　！．ＩＲ５８０　　ミクロＥＬＩＳ
Ａ読取り機上で４９２ｎｍで読取る。

ハイブリドーマ培養流体を５０％硫酸アンモニウムによ
り沈殿せしめ、そして粗Ｉｇ画分を集める。沈殿物を生
理食塩水中に溶解し、そして１ｇＧを有するＳｔａｐｈ
．ａｎｒｅｕｓプロテイン八一結合セファロース及びｌ
ｇＭを有するセファロース〔羊抗（ヒ｝ＩｇＭ）抗体〕
を用いてアフィニティーク口マトグラフィーにより精製
する。典型的には、少なくとも２ｍｇのミニクローナル
抗体が、１βのミニクローナル培養流体から得られる。

例　　３ ｈＣＧ抗原に対するミニクローナル抗体を、周期的な間
隔でＢａβｂ／ｃマウスを感作することによって調製す
る。牌［攬細胞（牌細胞）を、最っとも高い力価の抗−
ｈＣＧ抗体を血清中に有するマウスから調製する。融合
の前、牌完細胞を、抗原被覆のべ｝　ＩＪ皿への結合性
について選択し、そして非結合牌ｌｉ鍜細胞を排除する
。特異的抗原結合性を示ず細抱を集め、そして上記のＫ
ｏｈｌｅｒ　ａｎｄ！．ｌｉｌｓｔｅｉｎの方法に従っ
てマウス骨髄腫細胞（ＮＳ１）と融合せしめる。融合の
前、骨髄腫細抱を、クルコース（Ｇ＋ｂｃｏ　：３２０
１９６０ＡＪ又は同等物）、３ｍＭのピルビン酸ナトリ
ウム、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭの
非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ巳３２０−１１４０又は同
等物）　、３ｍＭのヒポキサンチン、０．３ｍＭのチミ
ジン及び１０％の熱不活性化されたウ／胎児血清（ＦＢ
Ｓ　；　Ｇ＋ｂｃｏ　＃２００　６１４０又は同等吻）
を有するダルベソコの変性最少必須培地（Ｄ！．ｆＥＭ
）かろ成る培養培地中において生体外で対数相で増殖せ
しめる。ゲンタマインンを抗生物質として使用する。細
胞を、Ｍｉ織培養皿又はフラスコ中において５％ｃｏ２
雲囲気下で３７℃で増殖せしめる。細目包は、０．　５
　ＸＩＯ５ｆ固の細目包／　ｍｌ．　〜５．　Ｏ　Ｘ　
１０５イ固の細抱／ｍｌの間の密度で維持される場合に
最っとも急速に増殖する。細胞を、１０％ジメチルスル
ホヰ７・ド（　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ　）、２０％の熱不活性
化されたウシ胎児血清及び上記添加物を有する７０％の
Ｄ；，１巳｛を含む溶液約１ｄ中に１０×１０６個の細
胞を懸濁することによって液体窒素で凍結保存する。融
合は、抗体の生体外産生についてスクリーンされるハイ
ブリッド骨髄腫細胞（ハイブリドーマ）の収集体を生成
する。

ｈＣＧへの特異的結合についてのスクリーニングハイブ
リドーマ細胞の初期収集体を、多くの抗体産生ハイブリ
ドーマ細胞を含むであろう、複数細胞の一連の小サンプ
ルを得るために分ける（モノクローナル状態を通過しな
いで）。個々のサンプルからの上清液（約１００ｔＩＩ
／サンプル）を、ｈＣＧ標準液を含む一連の適切にラベ
ルされた管に添加し、続いて１２５Ｉによりラベルされ
たポリクローナル抗一ｈＣＧ約１００４を添加する。た
とえば、ウサギ抗−ｈＣＧは、市販されている。それら
の管を３７℃で約３０分間インキユベートする。ｍｉＡ
ｂ−ｈＣＧ−ＰＡＢ複合体を、０．１Ｍのリン酸緩衝溶
液中、４％ポリエチレングリコールを含むヤギマウス抗
血清２−の添加により沈殿せしめる。

次にその沈殿されたｍｉＡｂ−ｈＣＧ−ＰＡＢ複合体を
、１５００×ｇで１０分間、遠心分離することにより分
離する。上清液をデカントし、そして固体ペレットを含
む反応管を、ガンマンンチレーション計数計により数え
る。

この初期スクリーニング方法は、ｈＣＧに対して特異的
な抗体が存在するかいづれかを決定する。

所望する抗体を含むこれらのウェルからの細胞をプール
し、そして抗原被覆のべトリ皿への結合により抗原選択
にゆだねる。特異的抗原結合を示すこれらの細胞のみを
収穫し、そしてさらに研究するために拡張する。

ミニクローナル抗体を、ｈＣＧに対する１以上のモノク
ローナル抗体の結合を阻止するそれらの能力によりｈＣ
Ｇ分子への多重特異性について試験することができる。

この情報は、典型的には、疑わしいミニクローン上浦液
が、初めにｈＣＧとの結合を可能にされ、続いてｈＣＧ
に結合することが知られているラベルされたモノクロー
ナル抗体の添加を伴う阻止アソセイを行なうことにより
得られる。特定の抗体がモノクローナル抗体と同じ（又
は十分に近くの）エピトープと反応するその疑わしいミ
ニクローナル抗体中に存在する場合、ｈＣＧに結合でき
るモノクローナル抗体の量は、疑わしいミニクローナル
抗体のアリコートの存在下で結合する量よりも少ないで
あろう。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願は、
本発明が関与する当業者の熟練のレベルを示す。これら
のすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書
に組込まれる。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載した
が、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多型性又は複合性決定抗原を包含する診断又は治療
   に使用するために抗体産生ハイブリドーマ又は形質転換
   されたリンパ球細胞系を調製するための方法であって： 前記抗原により感作されたＢ−リンパ球から抗体産生細
   胞の収集体を創造し； 前記リンパ球の収集体から前記抗原を特異的に結合する
   リンパ球の集団を分離し； 前記抗原を特異的に結合するリンパ球の集団を細胞融合
   又は形質転換ベクターにより、不滅化された抗体分泌細
   胞に形質転換し； 前記不滅化された細胞を複合クローン集団に分離し； 前記複合クローン集団から、前記抗原と反応性の抗体を
   産生する少なくとも１種のミニクローナル集団を同定し
   ；そして モノクローナル段階を通過しないで前記ミニクローナル
   集団を増殖することを含んで成る方法。 ２、１種以上のミニクローナル集団が同定され、そして
   通常の集団に組合される請求項１記載の方法。 ３、前記通常の集団を、抗原被覆された固体表面に結合
   し、そして対象の抗原に特異的に結合できる細胞を選択
   することによって、精製されたミニクローンに選択する
   請求項２記載の方法。 ４、前記抗原が多型性ウィルスである請求項１記載の方
   法。 ５、前記ウィルスがインフルエンザウィルス又はＨＩＶ
   である請求項４記載の方法。 ６、前記選択が、少なくとも２種類の多型性形の前記ウ
   ィルスと特異的に結合する、前記ミニクローンからの前
   記抗体の能力を測定することを含んで成る請求項４記載
   の方法。 ７、前記抗原が複合性決定抗原である請求項１記載の方
   法。 ８、前記選択が、前記抗原上の種々の決定基に対して特
   異的な少なくとも２種のモノクローナル抗体に基づくそ
   の結合を阻止する、前記ミニクローンからの抗体の能力
   を測定することを含んで成る請求項６記載の方法。 ９、サンプル中の多型性又は複合性決定抗原の存在又は
   量を、前記抗原と免疫学的物質との免疫学的反応により
   検出する方法であって； 前記免疫学的物質としてミニクローナル抗体調製物（こ
   こで該調製物は、モノクローナル段階を通過していない
   複数のクローン細胞により分泌される種々の特異性を有
   する複数の抗体を含有する）を使用することを含んで成
   る方法。 １０、前記免疫学的反応がサンドイッチアッセイである
   請求項９記載の方法。 １１、ミニクローナル抗体調製物であって、モノクロー
   ナル段階を通過していない複数のクローン細胞により分
   泌される種々の特異性を有する精製された複数の抗体を
   含んで成る調製物。