JP6005705B2

JP6005705B2 - 非特異的反応阻害剤、それを用いた免疫学的測定法

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Publication number: JP6005705B2
Application number: JP2014194707A
Authority: JP
Inventors: 村田　誠; 誠村田
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: JP2016065795A

Description

本発明は、非特異的反応阻害剤及びそれを用いた免疫学的測定法に関するものである。

免疫学的測定方法としては、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィー法等が挙げられる。

このような免疫学的測定法において、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異的な反応により偽陽性や偽陰性を引き起こすものが存在し、測定結果に大きな影響を与えている。これら免疫学的測定法における非特異反応における原因として、異好性抗体やリウマチ因子などが知られている。異好性抗体とは他種属抗体に結合する血清中の抗体と定義され、代表的なものにヒト抗マウス抗体（ＨｕｍａｎＡｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙ；ＨＡＭＡ）がある。リウマチ因子はＩｇＧのＦｃ領域を認識するＩｇＭクラスの抗体であり、リウマチの患者だけでなく自己免疫疾患の患者、さらには健常人の血液中にも認められる。

これらは免疫測定法において、測定に使用する抗体に非特異に反応することにより測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められ、測定に使用する抗体とＨＡＭＡとの非特異反応を防止できなければ、不正確な測定結果により、診断ミス等の重大な問題を生じる可能性がある。したがって免疫学的測定法において常に注意すべきこととして、偽陽性、偽陰性の原因の１つである検体に共存するリウマチ因子やＨＡＭＡなどに起因する非特異的反応の影響を阻止又は緩和させることが肝要である。

これまでにこの非特異反応を抑制するために種々の方法が提供されている。抗体分子のＦｃ部分を酵素反応で取り除いたＦ（ａｂ’）_２分子を用いる免疫測定法が提案されている（特許文献１）。また、動物血清中から分離したＩｇＧクラスの抗体やＩｇＧクラスのマウスモノクローナル抗体又はマウス血清を免疫反応用緩衝液に共存させる方法が知られている（特許文献２）。さらに、ＩｇＧだけでなく、抗リウマチ因子抗体、ＩｇＭクラスの抗体を共存させることも報告されている（特許文献３、４、５）。さらにまた、ＩｇＧなどの代わりにα−グロブリンを添加して非特異反応を抑制する方法が開示されている（特許文献６）。

特開昭５４−１１９２９２特開２００６−３８８２３特開２０１１−２７７５１特開平９−６８５３１特開平７−１２８１８特開平９−４９８４０

しかしながら、上記の方法はいずれも比較的効果を有するものの、必ずしも十分とは言えず、それ以外の方法の開発が切望されていた。

そこで本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）が、異好性抗体の影響を阻止又は緩和さるための異好性阻止試薬として有名なＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ社製）より有効であることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下のとおりである。

（１）反応液中に抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を共存させることを特徴とする免疫学的測定法。
（２）有効成分として抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を含有する非特異的反応阻害剤。

本発明は、反応液中に抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を共存させることを特徴としており、これにより、従来法または異好性阻止試薬ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ社製）と比較し、以下の効果を奏することから、産業上きわめて有益である。
（１）ＨＢＲで抑制できなかった異好性抗体による非特異反応を抑制できるものである。
（２）ＨＢＲよりも少量の添加で異好性抗体による非特異反応を抑制できるものである。

本願発明は、上述したように、有効成分として抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を含有する非特異的反応阻害剤、および当該反応阻害剤を用いた免疫学的測定法に関するものである。

「抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）」とは、ヒト由来のＩｇＭ型リウマチ因子を抗原として公知の方法で作成されたＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗体を意味する。

ヒト由来のＩｇＭ型リウマチ因子は、すでに市販されており、当該市販品を利用することができる。また、遺伝子組換え手法を用いて調製した組換品であっても利用可能である。

このような抗原を用いたマウスモノクローナル抗体の調製は、公知の方法で行うことができる。すなわち、抗原を投与する動物としてはマウスを使用し、完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジュバンド、ミョウバンアジュバンド、水酸化アルミニウムアジュバンド、百日咳菌アジュバンドなどの各種アジュバンドと上述の抗原とのエマルジョンを調製し、これをマウスの静脈内、腹腔内、皮下または皮内に投与すればよい。投与量は、０．００１〜１ｍｇ／匹程度が好適である。初回投与後、１〜４週間おきに１〜５回程度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、マウス体内でヒトＩｇＭ型リウマチ因子に対する抗体産生を誘導する。

次に、抗体産生を誘導した動物から脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスに由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−グアニンホスフオリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。

このようなミエローマ細胞株の具体例としては、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ−９）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９７）（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８１，１−７（１９７８））、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９））、Ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）（ＥｕｒｏｐｉａｎＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８））などのマウスミエローマ細胞株を例示することができる。

細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエローマ細胞を選定する。細胞融合では、イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で１０^６〜１０^８細胞／ｍｌのミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：４〜１：１０に混合し、３７℃で１〜１０分間細胞同士を接触させることにより効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進させるため、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニールアルコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を使用することができる。また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもできる。

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえば、細胞懸濁液を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に１０^３〜１０^６細胞／ウェル程度まき、各ウェルに選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン耐性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場合は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目ぐらいまでに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）では長期間生育できないので、培養１０〜１４日目から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。

ヒトＩｇＭ型リウマチ因子を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などによって行うことができる。たとえば、ヒトＩｇＭ型リウマチ因子を吸着させた９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加してヒトＩｇＭ型リウマチ因子と反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるいはビオチン標識抗免疫グロブリン抗体を反応させたのちアビジンＤ−酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ウェルに酵素基質を加えて発色させる。ヒトＩｇＭ型リウマチ因子を固定化したウェルのみで発色する培養上清を選別することにより、ヒトＩｇＭ型リウマチ因子と特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを検索することができる。

ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などにより行うことができる。

このようにして取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭ１−１６４０培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地中で通常の方法で培養し、その培養上清液から抗体を取得することができる。腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動物に、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、たとえばマウスの場合にはハイブリドーマを約１０^６細胞／匹腹腔内投与する。ハイブリドーマは１０〜１８日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ−セファロースなどを用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより精製することができる。

得られたモノクローナル抗体のクラスは、公知の方法で決定し、ＩｇＧ型のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのみを選別し、得られたＩｇＧ型のモノクローナル抗体を本発明の阻害剤の有効成分として使用する。なお、有効成分の抗体は、未処理の抗体であって良く、また（Ｆａｂ’）_２、Ｆａｂなどの抗体処理物（抗体断片）であってもかまわない。

次に、本願発明の非特異的反応阻害剤を利用した免疫学的測定は、反応液中に抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を共存させることを特徴としており、それ以外の項目に関しては、抗体を利用する測定法であれば、測定原理、条件等は制限されない。たとえば、反応様式による分類として、競合反応法と非競合反応法（イムノメトリックアッセイ）が知られており、本発明においてはいずれの方法も採用できる。検出方法による分類として、抗原抗体反応の結果を直接検出する非標識法（ネフェロメトリーなど）と、なんらかのマーカーを使用して検出する標識法が知られているが、本発明ではいずれの方法によってもよい。ＢＦ分離を行う必要のあるヘテロジニアス法と必要のないホモジニアス法が知られており、本発明にはいずれの方法を適用してもよい。反応相による分類として、全反応が液相で行われる液相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が知られているが、本発明においてはいずれの方法も採用できる。

これら、公知の一般法の中から、本発明の測定法の目的に適合する方法を適宜選択すればよい。なお、一般的方法の詳細についてはたとえば以下の文献に詳細に記載されている。

・入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
・石川英治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
・臨床病理臨時増刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
・「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
・「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏｌ．７０」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））
・「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏｌ．７３」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））
・「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏｌ．７４」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））
・「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏｌ．８４」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））
・「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏｌ．９２」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））

反応系に共存させる非特異的反応阻害剤の有効成分である抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）の濃度としては、０．１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２００μｇ／ｍＬから適宜選定することが可能である。

なお、免疫学的測定時、反応液中に抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を共存させずに、免疫学的測定に先立ち、反応に供するサンプルを本発明の非特異的反応阻害剤で前処理する方法であっても、本発明の測定法では利用可能である。

以下、実施例、試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）の調製
精製ヒトリウマチ因子−ＩｇＭ型を、フロインド完全アジュバンドと共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに２〜３週間おきに３回腹腔内に投与した。３回免疫後、１０μｇをマウスに静脈投与し、最終免疫を行った。最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２）とをケラーとミルシュタインの方法に従って細胞融合した。すなわち、脾臓細胞と骨髄腫を１０：１で混合後、遠心分離して得たペレットに５０％ポリエチレングリコール含有ＲＰＭＩ１６４０溶液１ｍｌを徐々に加えて細胞を融合した。さらにこれにＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＳｐ２として３×１０^４個／１００μｌとなるように懸濁させ、９６ウェルマイクロタイタープレート１０枚に各ウェル１００μｌずつ分注した。

１日後、ＨＡＴ培地を１００μｌ添加し、その３〜４日おきに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した。融合後７日目に培養上清をサンプリングし、上記ＥＬＩＳＡ法のマウス血清の代わりに培養上清を用いてスクリーニングを行った。抗ヒトリウマチ因子−ＩｇＭ型マウスモノクローナルＩｇＧ抗体に対する抗体陽性ウェルを検索し、限界希釈法によりクローニングを行い、抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を産生するハイブリドーマ２３株（代表的なものとして「９Ｄ３」と「３Ａ３」を例示できる）を樹立した。

次に、上記ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体を常法により精製し、これを用いてリウマチ検体とＨＡＭＡ検体の各試料における非特異反応の有無を以下の２つの試験により確認した。

（２）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）測定試薬を用いたＥＩＡ法における検証
検体希釈液に本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を２５μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、コントロールとして市販の異好性阻止試薬ＨＢＲを同様に２５μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、試験に供した。

すなわち、酵素標識抗体液５０μＬを抗体固相プレートの所定のウェルに分注し、続けて本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）（９Ｄ３および３Ａ３）、または市販のＨＢＲを添加した希釈液で希釈した検体５０μＬを抗体固相プレートの各ウェルに分注した後、２時間静置後洗浄し、ＴＭＢＺで発色を行い、４５０ｎｍの吸光度の測定を行った。また、標準液の吸光度から検量線を作成し、検体の吸光度から濃度を算出した。

（血清中ＯＣＴ測定における非特異反応抑制剤の効果）
その結果、下記表１に示すように、非特異反応の抑制効果は検体によって異なるが、本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を用いた場合、市販のＨＢＲと比較して、リウマチ因子保有検体やＨＡＭＡ保有検体による非特異反応を有意に抑制できることが明らかになった。

（３）インスリン測定用ラテックス試薬を用いた凝集法における検証
ラテックスインスリンキット「ヤマサ」を使用し、本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）（９Ｄ３および３Ａ３）または市販のＨＢＲとの性能を比較した。
すなわち、キットの第一試薬に本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）または市販のＨＢＲを１００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加したものを使用した。

まず、第一試薬と検体を混合後、５分後に抗ヒトインスリン抗体を感作したラテックス粒子を含有するラテックス液１００μＬを混合物に加え、３７℃で反応させ、０．５〜２分後にかけて全自動分析装置日立ＴＢＡ−１２０ＦＲを用いて波長６６０ｎｍでの吸光度を測定し、各測定点の間の吸光度変化量を求めた。インスリンの濃度を定量するため、インスリン既知濃度の標準物質を測定して得られた検量線をもとして検体中のインスリン濃度を算出した。

（血清中インスリン測定における非特異反応抑制剤の効果）
その結果、下記表２に示すように、非特異反応の抑制効果は検体によって異なるが、本発明の抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を用いた場合、市販のＨＢＲと比較し、リウマチ因子保有検体やＨＡＭＡ保有検体による非特異反応を有意に抑制できることが明らかになった。

本願発明により、免疫測定法において非特異反応を抑制できるため、リウマチ因子や異好性抗体を含む試料についても該非特異因子により生じる非特異反応を抑制して、測定対象を正確に測定することができ、測定精度が向上し、より信頼性の高い臨床検査が可能となる。

Claims

反応液中に、ヒト由来のＩｇＭ型リウマチ因子を抗原として作成された抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を共存させることを特徴とする免疫学的測定法。
有効成分として、ヒト由来のＩｇＭ型リウマチ因子を抗原として作成された抗ヒトリウマチ（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を含有する非特異的反応阻害剤。