JPH05215749A - ヒトインタ−ロイキン−８の免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の目的は低濃度のヒトインターロイキン
−８を検出することにあり、また血液などの体液成分中
でも体液成分が測定系に与える影響が極めて少ない測定
系を提供することにある。 【構成】抗ヒトインターロイキン８ポリクローナル抗体
および抗ヒトインターロイキン−８モノクローナル抗体
を組み合わせて用い、最低検出感度１０ｐｇ／ｍｌ以下
である高感度免疫学的ヒトインタ−ロイキン−８測定
法、クローンＥＬ１３９および測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインタ−ロイキン
−８（以下ＩＬ−８と略す）を測定するための方法、さ
らに詳しくは、ＩＬ−８に対するポリクロ−ナル抗体お
よびモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定方法、ク
ローンＥＬ１３９および測定を行なうためのキットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）は、
単球由来好中球走化性因子（ＭＣＮＣＦ）、好中球活性
化ペプチド−１（ＮＡＰ−１）、好中球活性化因子（Ｎ
ＡＦ）など、種々の名前で研究されてきた分子量約８０
００のポリペプチドであり、炎症局所への白血球（とく
に好中球）の遊走およびその活性化など、炎症反応の初
期メディエ−タ−として重要な役割を担うサイトカイン
である（松島；MedicalImmunology, 18, p9 (1989) な
ど）その一次構造は、connective tissue activating
peptide III(ＣＴＡＰ-III）、β-thromboglobulin（β
−ＴＧ）、platelet factor 4 （ＰＦ４）、γ-interfe
ron inducible protein （ＩＰ−１０）、growth relat
ed oncogene （ＧＲＯ）などと類似性があり、一群のＩ
Ｌ−８ファミリ−タンパク質を形成している。また、単
球遊走活性化因子（ＭＣＡＦ）をはじめとする他の一群
の蛋白質とも若干のホモロジ−を有することが知られて
いる。ＩＬ−８に関する研究は、１９８８年にその遺伝
子が単離され、一次構造が決定されて以来、ＮＭＲ、Ｘ
線結晶解析による３次構造の決定、レセプタ−遺伝子の
単離など急速に進んでおり、また慢性関節リウマチ、乾
癬、敗血症、メサンギウム増殖性腎炎などいくつかの疾
患との関連性も注目されはじめている。

【０００３】現在、ＩＬ−８の測定には、ヒト好中球に
対する遊走活性または好中球からのリソゾ−ム酵素の放
出を測定するバイオアッセイ法が用いられているが（Yo
shimura,T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, p92
33 (1987) ，Schroder,J.M.et al., J.Immunol., 139,
p3474 (1987) ）、感度が高くないこと、測定操作が煩
雑であること、また他の生理活性物質の影響を受けやす
いことなどいくつかの問題点から、臨床検体に広く適用
されるには至っていない。また、ポリクロ−ナル抗体お
よびモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定法も報告
されているが（Sticherling,M. et al., J.Immunol., 1
43, p1628 (1989), Sylvester,I. et al., Am.Rev.Resp
ir.Dis., 141, p683 (1990), Ceska,M. et al., Cytoki
ne, 1, p136 (1989), DeForge, L.E. et al., Immunol.
Invest., 20, p89 (1991) ）、測定感度は必ずしも十分
ではなく、通常の血液中に見出される１０ｐｇ／ｍｌ以
下といった低濃度のＩＬ−８を精度良く測定できる系は
知られていなかった。また、血液など各種体液成分が測
定系に与える影響についての十分な検討もなされていな
かった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のように各種疾患との関連性が報告されているＩＬ−８
を、体液中で高感度かつ精度良く定量するため、低濃度
のＩＬ−８を検出可能な免疫学的測定法を提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記本発明の課題を解決
するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、
本発明は、抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナル
抗体と抗ヒトインタ−ロイキン−８ポリクローナル抗体
とを組み合わせて用い、ヒトインタ−ロイキン−８の最
低検出感度が１０ｐｇ／ｍｌ以下であることを特徴とす
る高感度免疫学的測定法である。

【０００６】本発明に用いる抗体は、哺乳動物をＩＬ−
８で免疫して得られる抗血清から精製されるポリクロ−
ナル抗体およびＩＬ−８で免疫された哺乳動物から取り
出した抗体産生細胞をミエロ−マ細胞と融合し、得られ
たハイブリド−マから産生されるモノクロ−ナル抗体の
いずれもが使用できる。このようにして得られる各種の
抗体のなかから、抗原に対する親和性の高いものを選択
することにより、１０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは３ｐ
ｇ／ｍｌといった低濃度のＩＬ−８を測定することがで
きる高感度な免疫学的測定方法の確立に成功し、本発明
を完成した。以下に、本発明の具体的な方法を説明す
る。

【０００７】（ａ）ポリクロ−ナル抗体の作製 ＩＬ−８に対するポリクロ−ナル抗体は、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジなど種々の生物に抗原ＩＬ−８を感作して得
られる抗血清を材料とし、塩析、イオン交換クロマトグ
ラフィ−、アフィニティ−クロマトグラフィ−など種々
の手段で精製することにより得ることができる。なお、
親和性の高い抗体を得るためには、抗原固定化カラムに
よるアフィニティ−クロマトグラフィ−を用いて抗原と
結合する抗体のみを選択的に精製することが望ましい。
また、免疫に用いる抗原は、ヒト由来の細胞から産生さ
れる天然型ＩＬ−８および組換えＤＮＡ技術によって作
製された遺伝子組換え型ＩＬ−８のいずれもが使用され
得る。

【０００８】（ｂ）モノクロ−ナル抗体 ＩＬ−８に対するモノクロ−ナル抗体は、常法に従って
作製することができる。すなわち、マウスなど適当な動
物をＩＬ−８で免疫したのち、脾細胞をミエロ−マ細胞
と融合し、得られたハイブリド−マの中からＩＬ−８と
特異的に結合する抗体を産生するクロ−ンをＥＬＩＳＡ
などの手法を用いて選択する。高感度な測定系を確立す
るためには、この段階でできるだけ抗原との親和性の高
い抗体を選ぶことが重要である。次に、得られたハイブ
リド−マを培養し、その培養上清またはハイブリド−マ
を適当な動物に接腫して得られる腹水を材料として、モ
ノクロ−ナル抗体を精製することができる。

【０００９】（ｃ）免疫学的測定法 免疫学的測定法としては、サンドイッチ法、競合法など
種々の測定原理を用いることができる。また、標識物質
としては、酵素、ビオチンなどのハプテン、ラジオアイ
ソト−プなどが用いられるが、高感度かつ測定の簡便な
系とするためには、酵素標識抗体を用いたサンドイッチ
法が望ましい。固相担体への抗体の固定および抗体の酵
素標識は、常法に従って行なうことができる。固定化さ
れた抗体に検体中のＩＬ−８を結合させ、さらに酵素標
識抗体を反応させることにより、固相上に３者のサンド
イッチ複合体を形成させる。最後に酵素基質を加え固相
上の酵素活性を測定することにより、検体中のＩＬ−８
濃度を定量することができる。

【００１０】抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナ
ル抗体と抗ヒトインタ−ロイキン−８ポリクローナル抗
体とを組み合わせることによりキットが構成されるが、
必要に応じ、９６穴マイクロプレートなど適当な担体に
固相化した抗体、標識抗体および標準となる既知濃度の
ＩＬ−８などを組み合わせてキットを構成する。

【００１１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。

【００１２】１．ポリクロ−ナル抗体の作製 ウサギ（ニュ−ジ−ランドホワイト、雌）２羽に対し
て、３５０μｇのヒト線維芽細胞由来天然型ＩＬ−８を
２−３週間の間隔で３回皮下投与した。初回免疫時はフ
ロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と、２回目および
３回目はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）と混
合後投与した。最終免疫の１０日後に全採血を行ない、
抗血清を分離した。

【００１３】抗血清からの抗体精製は、ＩＬ−８固定化
カラムを用いたアフィニティ−精製の手法により行な
い、抗血清３０ｍｌより精製抗体７．５ｍｇを得た。

【００１４】２．モノクロ−ナル抗体の作製 免疫は、８週令の雌ｂａｌｂ／ｃマウス１０匹を用い、
腹腔内投与で３−４回行なった。初回免疫は、１０−２
０μｇのＩＬ−８を、１×１０¹⁰個の百日咳死菌添加硫
酸アルミニウムカリウムアジュバントと混合して投与
し、２回目は硫酸アルミニウムカリウムアジュバントと
混合、３回目以降はＰＢＳ溶液で、それぞれ１０μｇの
ＩＬ−８を追加免疫した。最終免疫の３−４日後にマウ
スより脾臓を摘出し、脾細胞を単離した。これを、対数
増殖期のマウスミエロ−マ細胞Ｐ３Ｕ１（P3-X63-Ag8U
1）と１０：１の細胞数比で混合し、５０％ポリエチレ
ングリコ−ル（ＰＥＧ）１５００を用いて細胞融合を行
なった。融合後の細胞は、１５％牛胎児血清、２ｎｇ／
ｍｌヒトＩＬ−６およびＨＡＴを含むＲＰＭＩ１６４０
培地に浮遊し、５×１０⁵ 個／２００μｌ／ウェルの細
胞密度で９６穴マイクロプレ−トに分注し、７％ＣＯ₂
存在下、３７℃で培養を行なった。

【００１５】抗体産生細胞のスクリ−ニングは、固相化
ＩＬ−８に対する抗体の結合を検出する下記のＥＬＩＳ
Ａ法により行なった。９６穴マイクロプレ−トの各ウェ
ルに０．５μｇ／ｍｌのＩＬ−８ＰＢＳ溶液を分注し、
４℃で１晩固相化を行なった。０．５％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液でブロッキングを行なった
後、ハイブリド−マのＨＡＴ培地培養上清（細胞融合後
７−１０日目）１００μｌを室温で１時間反応させ、さ
らにビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、ストレプトアビ
ジン−ＨＲＰをそれぞれ室温で３０分、１５分順次反応
させた。なお、各反応の間は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳ溶液にてウェルを３回洗浄し、未反応の
試薬を除いた。最後に酵素基質（０．００６％過酸化水
素および０．２ｍｇ／ｍｌ３、３´、５、５´−テトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５）を加えて発色反応を行
ない、その着色から陽性ウェルの判定を行なった。

【００１６】陽性ウェルは、ＨＴ培地１００μｌを加え
てさらに一晩培養を行ない、翌日培養上清を３倍段階希
釈して再度ＥＬＩＳＡを行なった。低濃度抗体（高希釈
倍率）まで発色が認められたウェルを選択することによ
り、比較的親和性の高い抗体を産生するクロ−ンを選
び、限界希釈法でクロ−ニングを行なった。上記スクリ
−ニング、クロ−ニングの操作を２回繰り返して、単一
クロ−ンとして１８個ののハイブリド−マを確立した。

【００１７】３．モノクロ−ナル抗体の解析 抗体の解析は、各ハイブリド−マの無血清培地培養上清
を用いて行なった。まず、抗体のサブクラスの決定は、
ＥＬＩＳＡ法を用いたタイピングキットを用いて行なっ
た。また、ウェスタンブロッティングは、以下に示すTo
wbinらの方法に従って行なった。約７５μｇ／ｍｌのＩ
Ｌ−８を含むサンプル１００μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（２０％ゲル）で分離後、メンブレンにブロッティング
し、２μｇ／ｍｌの各モノクロ−ナル抗体、ビオチン化
ヤギ抗マウスＩｇＧまたはビオチン化ヤギ抗マウスＩｇ
Ｍ、ストレプトアビジン−ＨＲＰを順次反応させた。Ｈ
ＲＰ活性の検出は、発色キット（コニカ社製 イムノス
テインＨＲＰ）を用いて行なった。

【００１８】各抗体の抗原ＩＬ−８に対する親和性の評
価は、下記の４通りのＥＬＩＳＡ法を用いて行なった。

【００１９】評価では、マイクロプレ−トに固相化し
た抗原ＩＬ−８（０．５μｇ／ｍｌ、４℃、１晩）に対
して、段階希釈した各モノクロ−ナル抗体を２５℃３０
分間反応させ、さらにビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧま
たはビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ、ストレプトアビジ
ン−ＨＲＰ、酵素基質を順次反応させて、各ウェルの発
色から結合した抗体量を測定した。最大結合量の１／２
を与える抗体濃度（ＢＣ５０）を算出し、親和性の指標
とした。評価では、ＩＬ−８を直接プレ−トに固相化
するかわりにウサギポリクロ−ナル抗ＩＬ−８抗体を固
相化し、これに過剰量（１０ｎｇ／ウェル）のＩＬ−８
を反応させた後、この抗原に対する親和性を評価と同
様の方法で求めた。評価では、プレ−トにウサギ抗Ｉ
Ｌ−８ポリクロ−ナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を固相化
し、これに対して段階希釈した抗原ＩＬ−８を加えて２
５℃１時間反応を行なった。その後各モノクロ−ナル抗
体（２μｇ／ｍｌ）、ビオチン化ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、酵素基質を順次反応
させ、吸光度を測定した。抗体の親和性は、１ｎｇ／ｍ
ｌのＩＬ−８を測定したときの吸光度とバックグラウン
ド（ＩＬ−８無添加の吸光度）の差を求め、これをΔＯ
Ｄとして表示した。評価では、評価とは逆に各モノ
クロ−ナル抗体（２μｇ／ｍｌ）を固相化し、これに対
して段階希釈したＩＬ−８を２５℃１時間反応させた。
ビオチン標識したウサギ抗ＩＬ−８ポリクロ−ナル抗
体、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、酵素基質を順次反応
させ吸光度を測定し、評価と同様に１ｎｇ／ｍｌのＩ
Ｌ−８とバックグラウンドの吸光度差ΔＯＤを求めた。

【００２０】最後に、抗体のエピト−プの解析は、合成
ペプチドを用いた以下の方法で行なった。ＩＬ−８（７
２アミノ酸型）の全アミノ酸配列をカバ−し、それぞれ
６−７残基のオ−バ−ラップを持つ１５アミノ酸残基の
ペプチド８種類（ＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫ、Ｃ
ＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫ、ＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲ
ＶＩＥＳＧ、ＬＲＶＩＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥＩ、ＨＣＡ
ＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲ、ＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤ
ＰＫＥ、ＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥ、ＶＱＲＶＶ
ＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ）を合成した。それぞれを１−
１．６μｇ／ｍｌの濃度で９６穴プレ−トに分注し、室
温で２時間結合反応を行なった。ブロッキング後、各モ
ノクロ−ナル抗体を２−０．０１６μｇ／ｍｌの濃度範
囲で段階希釈した抗体溶液を添加して室温で１時間イン
キュベ−トし、さらにビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧま
たはビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ、ストレプトアビジ
ン−ＨＲＰ、酵素基質を順次反応させた。各ペプチドを
固相化したウェルの発色をペプチドを固相化していない
コントロ−ルウェルと比較することにより、各ペプチド
に対する抗体の反応性を調べた。

【００２１】得られた１８クロ−ンのモノクロ−ナル抗
体についての解析結果を表１にまとめる。抗体のクラス
は、ＩｇＧ１、κが１４クロ−ンと最も多く、ＩｇＧ
１，λが２クロ−ン、ＩｇＧ２ａ，κおよびＩｇＭ、κ
が１クロ−ンであった。１８クロ−ンのうち、１３クロ
−ンはウエスタンブロット法でもＩＬ−８と強く反応
し、これらクロ−ンはいずれも７２アミノ酸型ＩＬ−８
および７７アミノ酸型ＩＬ−８と思われる近接する２本
のバンドをともに染色した。また、合成ペプチドにたい
する反応性を調べた結果、ＥＫ５０、ＥＫ５６、ＥＫ６
０の各クロ−ンがそれぞれＣｙｓ９−Ｌｙｓ２３、Ｌｅ
ｕ４９−Ｇｌｕ６３、Ｖａｌ５８−Ｓｅｒ７２の各領域
の配列を持つペプチドＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩ
Ｋ、ＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥ、ＶＱＲＶＶＥＫ
ＦＬＫＲＡＥＮＳ、と反応性を示し、エピト−プを同定
することができた。しかし、残りの１５クロ−ンは、８
種のペプチドのいずれとも反応性を示さなかった。抗体
の抗原親和性について４通りの方法で調べた結果を合わ
せて表１に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】評価方法により成績の異なる場合もあった
が、実際のサンドイッチＥＬＩＳＡ系に近い評価法であ
る、の結果を重視して、有望なクロ−ンとしてＥＣ
８１、ＥＫ３５、ＥＬ１３９、ＥＭ１２、ＥＭ３０の５
クロ−ンを選択し、さらに詳細な検討を行なった。

【００２４】なお、ＥＬ１３９を産生するハイブリドー
マは微工研菌寄第１２７１０号として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。

【００２５】４．抗体組み合わせの選択 上で選択した５クロ−ンのモノクロ−ナル抗体とウサギ
ポリクロ−ナル抗体を含めた６種の抗体について、それ
ぞれを固相化第１抗体およびビオチン化第２抗体として
用いる３６通りのサンドイッチ系を組み、比較検討を行
なった。サンプルとしては、抗原ＩＬ−８を緩衝液
（０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ）またはヒトプ−ル血清で希釈したものを用
いた。結果の例として、緩衝液サンプルで特に良好な性
能（高感度）を与えた２つの組み合わせの結果を図１
Ａ、Ｂに示す。この２つの組み合わせ例でもみられるよ
うに、ほとんどの組み合わせにおいて血清で希釈した検
体は緩衝液で希釈した検体よりも発色が低くなり血清成
分により反応が阻害されることが示唆された。阻害要因
についての検討を行なった結果、ＥＣ８１／ビオチン化
ＥＬ１３９の系についてはその阻害物質をセファクリル
Ｓ−２００ゲル濾過カラムおよびＥＣ８１抗体固定化カ
ラムで精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した結果よ
り、血中に存在しＩＬ−８とホモロジ−を有するタンパ
ク、Connective tissue activating peptide-III（ＣＴ
ＡＰ−III ）が ＥＣ８１抗体と交差反応するためと判
明した。ＥＭ３０／ＥＬ１３９については、これとは異
なるより熱不安定な因子が原因と考えられたが、物質を
特定することはできなかった。

【００２６】調べた抗体組み合わせの中で、比較的血清
の影響を受けず、また感度的にも良い結果を与えたポリ
クロ−ナル抗体／ビオチン化ＥＬ１３９（図１Ｃ）の系
に絞ってさらに検討を行なった。その結果、第１反応時
に検体（５０μｌ）を１００μｌの０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０、０．２５％ＢＳＡおよび０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で３倍希釈し、また、第２抗
体ＥＬ１３９をＦab'化後直接ＨＲＰ標識することによ
り、血清成分の影響を受けず、かつ簡便な測定系を確立
することができた。最終的に決定した測定プロトコ−ル
を図２に示す。以下ポリクローナル抗体／ビオチン化Ｅ
Ｌ１３９系のさらに詳細な検討を示す。

【００２７】５．酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）系の確立
およびその基本性能評価 ９６穴マイクロプレ−トの各ウェルに０．５μｇ／ｍｌ
のウサギ抗ＩＬ−８ポリクロ−ナル抗体ＰＢＳ溶液１０
０μｌを入れ、４℃で一晩固相化を行なった。０．５％
ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブロッキング後、各ウェルを洗浄
液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄
し、反応緩衝液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０および５μｌ／ｍｌ正常マウス血清および正常
ウサギ血清を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．
０）１００μｌおよび検体５０μｌを入れ２５℃で１時
間反応を行なった。各ウェルを洗浄後、０．５μｇ／ｍ
ｌのＨＲＰ標識ＥＬ１３９Ｆ(ab')2抗体液１００μｌを
入れ２５℃で３０分間反応を行ない、さらに各ウェルを
洗浄後基質液（０．００６％過酸化水素および０．２ｍ
ｇ／ｍｌ３、３´、５、５´−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ５．５）１００μｌを分注して２５℃で３０分間
発色反応を行なった。なお、反応中は常時マイクロプレ
−ト振盪器を用いてプレ−トの振盪を行なった。最後に
１００μｌの１Ｎ硫酸を入れて反応を停止し、４５０ｎ
ｍ（対照波長５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。

【００２８】この方法に従って測定を行ない、得られた
標準曲線および最低検出感度の算出結果を図３に示す。
標準曲線は、０−３００ｐｇ／ｍｌの範囲で良好な直線
性を示し、また、バックグラウンドレベル（０ｐｇ／ｍ
ｌでの発色）も０．０３０と低く良好な結果であった。
０ｐｇ／ｍｌの吸光度の平均＋２ＳＤより算出した最低
検出感度は、２．４ｐｇ／ｍｌ（０．１２ｐｇ／ウェ
ル）となった。次に、測定値のアッセイ内変動（同時再
現性）について検討を行なった。健常者プ−ル血漿にＩ
Ｌ−８を添加して調製した３種の管理検体（Ｌ、Ｍ、
Ｈ）をそれぞれ１６回測定し、その変動係数（ＣＶ）を
算出した。

【００２９】

【表２】 表２に示すように、ＣＶ値の平均は５．２％、最大でも
５．８％となり、測定間のばらつきは少なかった。

【００３０】６．各種検体からの添加回収率 各種検体からの添加回収実験の結果を表３に示す。

【表３】

【００３１】健常者血清、血漿、尿、および培地（ＲＰ
ＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ）からの平均回収率はそれ
ぞれ９１．５％、９２．３％、１０５．０％、および１
０８．０％となり、本測定系はこれら成分の影響を受け
ないことが示された。なお、血清検体および尿検体で見
られた陽性例について、偽陽性の可能性を調べるために
抗体による吸収実験を行なった結果も合わせて示した
が、サンプルを抗ＩＬ−８ポリクロ−ナル抗体とあらか
じめインキュベ−トすることにより測定値は顕著に低下
し、コントロ−ルとして同濃度のウサギＩｇＧとインキ
ュベ−トした場合には測定値は変らないことより、これ
ら陽性検体は実際にＩＬ−８を含むことが確認された。

【００３２】７．他のサイトカインとの交差反応 本ＥＬＩＳＡ系の他のサイトカインとの交差反応性につ
いて検討した結果を表４に示す。

【表４】

【００３３】ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ（いずれ
もヒト由来）の各物質を１ｎｇ／ｍｌで含む緩衝液をサ
ンプルとして測定を行なったが、測定値はいずれも検出
感度以下であり、交差反応性は全く認められなかった。
また、一次構造上ＩＬ−８とホモロジ−のあることが知
られている５種類のタンパク、β−thromboglobulin
（β−ＴＧ）、connectivetissue activating peptide
III（ＣＴＡＰ-III）、platelet factor 4 （ＰＦ−
４）、γ-interferon inducible protein （ＩＰ−１
０）、growth related oncogene （ＧＲＯ）それぞれを
４５−１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む緩衝液での測定結
果もいずれもほぼ検出感度以下であり、またこれら溶液
に添加したＩＬ−８の回収率も８９−１０５％と問題が
見られなかったことから、このＥＬＩＳＡ系は、これら
類似タンパクの影響も受けないことが確認された。

【００３４】８．血清検体と血漿検体の比較 表３の結果およびその他いくつかの予備検討結果より、
血清検体は健常者でも陽性例がかなり見られ、また、検
体群（採血時期、場所の違い）により全体的に高値にな
る場合と低値になる場合があることから、血清検体では
採血時の条件により測定値が変動する可能性が疑われ
た。そこで、同一検体より血清、血漿検体を調製し、測
定値を比較したところ、表５に示すように血清検体は血
漿検体よりも明らかに高値を示した。

【００３５】

【表５】

【００３６】表３の実験と同様に抗体による吸収試験を
行った結果、抗ＩＬ−８抗体の添加により特異的に測定
値が低下し偽陽性ではないことより、血清分離時に血球
細胞より産生されるＩＬ−８の存在が示唆された。一
方、添加回収率については、血清、血漿検体とも８９−
１０７％と問題はなかった。

【００３７】９．臨床検体の測定 ＥＬＩＳＡ系の実際の臨床検体への適用例として、敗血
症患者血漿１６例を測定し、健常者と比較した結果を図
４に示す。敗血症患者検体の測定値平均は１５７．６ｐ
ｇ／ｍｌとなり、個人差は大きいものの、健常者（平均
０．８ｐｇ／ｍｌ）と比べて明らかに高濃度のＩＬ−８
を含むことが示された。

【００３８】

【発明の効果】本発明により、生体中に微量存在するＩ
Ｌ−８を高感度かつ簡便に定量することが可能となっ
た。この方法は、各種疾患とＩＬ−８との関連性を解明
するための有効な手段となる。また、特定の疾患との関
連性が明らかとなれば、その診断のために有効に活用さ
れ得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種抗体組み合わせによる緩衝液中および血清
中のＩＬ−８の測定結果を示す。

【図２】ＥＬＩＳＡ系の測定プロトコ−ルを示す。

【図３】標準曲線および最低検出感度の算出結果を示
す。

【図４】健常者血漿および敗血症患者血漿中のＩＬ−８
測定値の分布を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナ
   ル抗体と抗ヒトインタ−ロイキン−８ポリクローナル抗
   体とを組み合わせて用い、ヒトインタ−ロイキン−８の
   最低検出感度が１０ｐｇ／ｍｌ以下であることを特徴と
   する高感度なヒトインタ−ロイキン−８の免疫学的測定
   法。
2. 【請求項２】請求項１において、抗ヒトインタ−ロイキ
   ン−８ポリクロ−ナル抗体を固相化抗体として、抗ヒト
   インタ−ロイキン−８モノクロ−ナル抗体を酵素標識抗
   体として用いることを特徴とするヒトインタ−ロイキン
   −８の酵素免疫測定法。
3. 【請求項３】抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナ
   ル抗体がクローンＥＬ１３９である請求項１または２記
   載の免疫学的測定法。
4. 【請求項４】抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナ
   ル抗体クローンＥＬ１３９。
5. 【請求項５】抗ヒトインタ−ロイキン−８モノクローナ
   ル抗体と抗ヒトインタ−ロイキン−８ポリクローナル抗
   体とを組み合わせて用いることを特徴とする最低検出感
   度が１０ｐｇ／ｍｌ以下の高感度免疫学的ヒトインター
   ロイキン−８測定キット。