JP6033894B2 - Mytilus属に属するイガイ幼生に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明にかかるモノクローナル抗体は、Mytilus属に属するイガイ幼生に反応し、Perna属に属するイガイ幼生には反応しないことを特徴とする。ここで、イガイは二枚貝類のイガイ目イガイ科に属する貝の総称であって、イガイ科Mytilus属には、イガイ(Mytilus coruscus)、ムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)等が属し、イガイ科Perna属には、ミドリイガイ(Perna viridis)、モエギイガイ(Perna canaliculatus)等が属している。なお、モノクローナル抗体が幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、whole-mountであっても、組織切片であっても、粗抽出液(超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物)であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理(固定、溶解、抽出等)も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。
本発明のモノクローナル抗体は、Mytilus属に属するイガイ幼生に反応し、Perna属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(以下、「本発明にかかるハイブリドーマ」と称する。)から得ることができる。
本発明にかかるハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、Perna属に属するイガイ幼生には反応性を示さないが、Mytilus属に属するイガイ幼生に対して特異的に反応性を示す。従って、イガイ科に属する生物間において、Mytilus属に属するイガイ幼生の属特異的な検出に有用であると考えられる。
本発明のモノクローナル抗体を得るために、以下の飼育方法により得られたムラサキイガイ付着期幼生(ペディベリジャー幼生)を抗原として用いた。
ムラサキイガイ親貝を水槽内で維持し、親貝の放卵・放精によって受精した卵を回収した。受精卵をろ過海水にて洗浄後、ろ過海水を満たしたビーカー等の容器に収容し、エアレーションを行なった。ろ過海水には抗生物質(終濃度ペニシリン3mg/L ストレプトマイシン 6.6mg/L)を添加し、餌として植物プランクトン(ハプト藻 Isochrysis galbana)を与えた。成長初期は飼育容器内の海水を毎日交換して給餌し、その後、2〜3日に1回の頻度で海水の交換を行った。約3週〜約1ヶ月後、顕微鏡観察によって、眼点及び足が形成されている個体を選別し、付着期幼生(ペディベリジャー幼生)の収集を行ない、以下のように抗原として用いた。
(2)(1)で得られたムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液(100μg/ml)50μlを、96穴イワキELISAプレートの各ウェルに加え、4℃で抗原をウェル底面に吸着させた。
(3)(2)で吸着処理した各ウェルをTBS(0.5 M NaCl及び20 mM Tris-HCl(pH7.5))200μlで洗浄した。
(4)各ウェルを1% BSAを含むTBS 100μlで1時間ブロッキングした。
(5)各ウェルをTTBS(0.05% Tween20を含むTBS)200μlで3回洗浄した。
(6)ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清(1次抗体)50μlを各ウェルに加え、1時間反応させた。
(7)各ウェルをTTBS 200μlで4回洗浄した。
(8)各ウェルに2次抗体(アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)ヤギ抗体;ZYMED laboratory)溶液(TBSで1000倍に希釈した溶液)50μlを加えて1時間反応させた。
(9)各ウェルをTTBS 200μlで5回洗浄した。
(10)各ウェルに基質(アルカリフォスファターゼ基質キット;BIO-RAD)溶液 100μlを加え、1時間振盪することにより発色させた。
(11)マイクロプレートリーダー(BIO-RAD Model550;405nm)を用いて、各ウェルの溶液の吸光度を測定した。
次に、実施例1により得られた1つのハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、ムラサキイガイ付着期幼生(ペディベリジャー幼生)に対して特異的に反応するか否かを調べるため、ムラサキイガイ幼生(付着期幼生、D型幼生)、ムラサキイガイ以外の二枚貝類(ミドリイガイ、アサリ、バカガイ、マガキ等)の付着期幼生(ペディベリジャー幼生)、ムラサキイガイ以外の二枚貝類(ミドリイガイ等)のD型幼生、甲殻類プランクトン(コペポーダ類、アルテミア(Artemia salina)ノープリウス幼生)、イワフジツボ(Chthamalus challengeri Hoek)キプリス幼生、アカフジツボキプリス幼生の粗抽出液(タンパク質の濃度;100μg/ml)との反応性を、実施例1に記載のELISA法と同様に確認した。なお、各粗抽出液は、各幼生又はプランクトンを50mM Tris-HCl(PH7.5)に加えてホモジナイズ・超音波(数秒×5回)処理し、5000rpm×20分間の遠心を行うことにより調製した。
次に、実施例1により得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がムラサキイガイ付着期幼生をwhole-mountで認識するかどうかを調べるために、ハイブリドーマN4-3-4bのモノクローナル抗体を用いて、ムラサキイガイ(付着期幼生、D型幼生)及びミドリイガイ(付着期幼生、D型幼生)に対する免疫染色を以下のように行った。また、以下において、特に記載がない過程については室温にて処理(反応を含む)を行った。
(2)各ウェルをPBS 200μlで洗浄した後、PBST(0.05% Tween20を含むPBS)200μlにてさらに洗浄した。
(3)各ウェルに1% BSAを含むPBST200μlを注入し、4℃で8時間ブロッキングした。
(4)各ウェルにN4-3-4bのモノクローナル抗体(1次抗体;1% BSAを含むPBSTで8倍に希釈した溶液)200μlを加え、4℃で一晩反応させた。なお、コントロールには、一次抗体としてマウス抗アカフジツボ付着期幼生抗体(特開2006-246820に記載のハイブリドーマKF1-6a4(1)6P-3(受託番号FERM P-20279)の培養上清)を用いた。
(5)各ウェルをPBST 200μlで4回洗浄した。
(6)各ウェルに2次抗体(アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)ヤギ抗体;1% BSAを含むPBSTで400倍に希釈した溶液)200μlを加えて4℃で8時間反応させた。
(8)各ウェルに基質(アルカリフォスファターゼ基質キット;BIO-RAD)溶液 200μlを加えて発色させた。
次に、ハイブリドーマN4-3-4bから産生されたモノクローナル抗体が、ムラサキイガイ付着期幼生又はムラサキイガイD型幼生のどの抗原に特異的に反応するのかを確認するため、ムラサキイガイ付着期幼生及びムラサキイガイD型幼生の各粗抽出液に対し、ハイブリドーマN4-3-4bから産生されたモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。また、ムラサキイガイ付着期幼生又はムラサキイガイD型幼生に類似した他の幼生に発現している抗原には、反応性を示さないことを確認するため、ミドリイガイD型幼生及びアカフジツボ付着期幼生の粗抽出液についてもウエスタンブロッティングを行った。
(2)PVDF膜を電気泳動ゲルと同様の大きさに切り、100%メタノールに数秒、次に10mMCAPS緩衝液を浸透させて親水化処理を行った。
(3)セミドライ式ブロッティング装置に10mMCAPS緩衝液を浸透させたろ紙、メンブレン及びSDS電気泳動後のゲルをセットし、2mA/cm2で2時間通電した。
(4)ブロッティング済みのPVDF膜をTBSで10分間洗浄した。
(5)PVDF膜を3%スキムミルク入りのTBSで室温にて1時間ブロッキングした。
(6)TBSで洗浄後、ハイブリドーマN4-3-4bを培養することによって得られた培養上清(一次抗体)を1%スキムミルク入りのTBSで10倍希釈し、室温で1時間又は4℃で一晩反応させた。
(7)蒸留水で洗浄後、TTBS中に10分間、2回置いた。
(8)PVDF膜を二次抗体(アルカリフォスファターゼ標識坑マウスIgG ヤギ抗体:BioRAD)溶液(1%スキムミルク入りのTBSで3000倍希釈)と1時間反応させた。
(9)蒸留水で洗浄後、TTBS中に10分間、2回置いた。
(10)蒸留水で洗浄後、BCIP/NBT アルカリフォスファターゼ基質溶液(SIGMA)にて染色を行った。
Claims (4)
- Mytilus属に属するイガイ幼生とPerna属に属するイガイ幼生を含む試料において、Mytilus属に属するイガイ幼生だけを検出する検出方法であって、
試料に、Mytilus属に属するイガイ幼生に反応し、Perna属に属するイガイ幼生には反応しないモノクローナル抗体又はその抗体結合部位を含むフラグメントを添加することを特徴とする検出方法。 - Mytilus属に属するイガイ幼生がムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)幼生であり、Perna属に属するイガイ幼生がミドリイガイ(Perna viridis)幼生であることを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
- 前記モノクローナル抗体又はその抗体結合部位を含むフラグメントはムラサキイガイ幼生の面盤に反応することを特徴とする請求項2に記載の検出方法。
- 前記モノクローナル抗体は受託番号FERM P-21414で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
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