KR101510376B1

KR101510376B1 - 새우 알레르겐, 항새우 알레르겐 항체 및 그의 이용

Info

Publication number: KR101510376B1
Application number: KR20080013809A
Authority: KR
Inventors: 히로시 미야자와; 마사히로 사카구치; 다카시 후지무라; 히데하루 시라이
Original assignee: 아이티이에이 가부시키가이샤
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2008-02-15
Publication date: 2015-04-06
Also published as: CN101280010B; KR20080090967A; EP1977755A1; HK1125117A1; JP4444306B2; TW200840820A; JP2008255054A; EP1977755B1; US20080248588A1; CN101280010A

Abstract

본 발명은 신규 새우 알레르겐(shrimp allergen)을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명의 새우 알레르겐은 새우 콜라겐(shrimp collagen) 또는 그의 폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)으로 된다. 본 발명에 의하면, 신규 새우 알레르겐을 제공하고, 이것을 사용하여 항새우 알레르겐 항체(anti-shrimp allergen antibody), 새우 알레르겐 혼입검사방법, 새우 알레르겐 혼입검사용 시약, 새우 알레르겐 감수성 측정방법, 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약 등을 제공할 수 있다.

Description

새우 알레르겐, 항새우 알레르겐 항체 및 그의 이용{Shrimp allergen, anti-shrimp allergen antibody, and use thereof}

본 발명은 새우 알레르겐 및 항새우 알레르겐 항체에 관한 것이며, 또한 새우 알레르겐 혼입검사방법, 새우 알레르겐 혼입검사용 시약, 새우 알레르겐 감수성 측정방법, 및 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약에 관한 것이다.

일본에 있어서의 식물 알레르기(food allergy)의 주된 원인식물은 계란, 우유, 콩, 새우·게나 어류 등이다. 연령에 따라서 원인식물의 빈도는 상이하며, 성인에서는 새우·게 등의 갑각류에 의한 알레르기가 가장 고빈도로 확인된다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조.).

이 새우에 의한 알레르기는 즉시형으로, 섭식(또는 접촉) 직후부터 30분 이내에 구강점막 증상(구순의 마비, 부종 등), 피부증상(두드러기 등), 소화기 증상(구역질, 구토, 설사 등)이나 호흡기 증상(천식, 숨이 참 등)이 출현한다. 때로는 심각한 전신성 아나필락시스 쇼크(Anaphylactic shock)에 빠지는 경우도 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조.).

종래, 새우에 의한 알레르기의 원인물질로서는, 새우 트로포미오신(TMS; tropomyosin)이나 새우 아르기닌 키나아제(AK; arginine kinase)가 동정(同定)되어 있었다(예를 들면, 비특허문헌 3 및 4 참조.).

한편, 최근 생선 알레르기(fish allergy) 환자에 있어서 생선 콜라겐(fish collagen)이 알레르겐으로 되는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 5 및 6 참조.).

[비특허문헌 1] Yoneyama K, Ono A. Study of food allergy among university students in Japan. Allergology International 2002; 51: 205-208.

[비특허문헌 2] 나카무라 스스무, 이이쿠라 요지: 최신 식물 알레르기. 나가이 서점 2004; 241-244.

[비특허문헌 3] Daul CB, Slattery M, Reese G, et al: Identification of the major brown shrimp(Penaeus aztecus) allergen as the muscle protein tropomyosin. Int Arch Allergy Immunol 1994; 105: 49-55.

[비특허문헌 4] Yu CJ, Lin YF, Chiang BL, Chow LP. Proteomics and immunological analysis of a novel shrimp allergen, Pen m 2. J Immunol. 2003; 170: 445-453.

[비특허문헌 5] Hamada Y, Nagasima Y, Shiomi K, et al. Reactivity of IgE in fish-allergic patients to fish muscle collagen. Allergology International 2003; 52: 139-147.

[비특허문헌 6] Sakaguchi M, Toda M, Ebihara T, et al. IgE antibody to fish gelatin(type I collagen) in patients with fish allergy. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: 579-584.

새우 알레르기(shrimp allergy) 환자의 다수는 새우 트로포미오신(TMS; tropomyosin)과 새우 아르기닌 키나아제(AK; arginine kinase)의 양쪽 또는 어느 한쪽의 IgE 항체를 보유한다. 그러나, 이들 알레르겐에 대한 항체가 음성인 환자도 있기 때문에, 다른 미동정 알레르겐(unidentified allergen)도 또한 발증에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다.

따라서 본 발명의 목적은 신규 새우 알레르겐을 제공하고, 이를 사용하여 항새우 알레르겐 항체, 새우 알레르겐 혼입검사방법, 새우 알레르겐 혼입검사용 시약, 새우 알레르겐 감수성 측정방법, 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약 등을 제공하는 것에 있다.

본 발명자 등은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구한 결과, 새우 꼬리살(근육)에 포함되는 콜라겐이 알레르겐인 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 새우 콜라겐(shrimp collagen) 또는 그의 폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)으로 되는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐(shrimp allergen).

(2) 상기 새우 콜라겐은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis measurement)에 의한 분자량이 110~140 킬로 달톤인 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐.

(3) 상기 새우 콜라겐은 보리새우(Penaeus japonicus) 또는 스팟새우(Pandalus platyceros) 유래인 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐.

(4) 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체(anti-shrimp allergen antibody).

(5) 항혈청, IgG 분획, 다중클론 항체(polyclonal antibody), 또는 단일클론 항체(monoclonal antibody)인 상기 (4) 기재의 항새우 알레르겐 항체.

(6) 시료 중의 새우 알레르겐의 혼입을 검사하는 방법으로서, 시료로부터 추출물을 조제하고, 상기 추출물 중의 새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편의 존재 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 혼입검사방법.

(7) 상기 시료는 음식품 또는 그의 원재료인 상기 (6) 기재의 새우 알레르겐 혼입검사방법.

(8) 상기 새우 콜라겐은 보리새우 또는 스팟새우 유래인 상기 (6) 기재의 새우 알레르겐 혼입검사방법.

(9) 상기 추출물 중의 새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편의 존재 유무를 검출하는 수단이, 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 사용한 면역학적 검출수단인 상기 (6) 기재의 새우 알레르겐 혼입검사방법.

(10) 시료 중의 새우 알레르겐의 혼입을 검사하기 위해 사용되는 검사용 시약으로서, 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.

(11) 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 함유하는 용액을 포함하는 상기 (10) 기재의 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.

(12) 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 담지한 담체를 포함하는 상기 (10) 기재의 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.

(13) 피험자의 생체시료 또는 그 조제물에 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 작용시키고, 상기 생체시료 또는 그 조제물에 포함되는 IgE 항체 중, 상기 새우 알레르겐에 결합하는 IgE 항체의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 감수성 측정방법.

(14) 피험자의 새우 알레르겐에 대한 감수성을 측정하기 위해 사용되는 측정용 시약으로서, 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.

(15) 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 함유하는 용액을 포함하는 상기 (14) 기재의 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.

(16) 상기 (1) 기재의 새우 알레르겐을 담지한 담체를 포함하는 상기 (14) 기재의 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.

(17) 추가로, 표지 항IgE 항체를 포함하는 상기 (14) 기재의 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.

본 발명에 의하면, 신규 새우 알레르겐을 제공하고, 이것을 사용하여 항새우 알레르겐 항체, 새우 알레르겐 혼입검사방법, 새우 알레르겐 혼입검사용 시약, 새 우 알레르겐 감수성 측정방법, 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약 등을 제공할 수 있다.

본 발명은 새우 꼬리살(근육)에 포함되는 콜라겐이 알레르겐인 것을 새롭게 발견한 것에 의한 발명이다. 즉, 본 발명의 새우 알레르겐은 새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편으로 된다.

본 발명의 새우 알레르겐에 있어서 사용되는 새우 콜라겐은, 예를 들면 에비하라, 이리에의 방법(에비하라 데쯔야, 이리에 신키치: 어류 및 무척추 동물 콜라겐 세포학 매트릭스 연구법(I) 콜라겐 기술연수회간행 1998; 52-57.)과 같은 공지의 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 즉, 새우의 꼬리살(근육) 등을 원료로 하여 균일화, 세정액에 의한 세정, 에탄올에 의한 탈지, 펩신(pepsin)에 의한 소화·추출, NaCl에 의한 염석, 초산용액 가용화 후의 투석의 각 처리를 거치는 것 등에 의해서 얻을 수 있다.

콜라겐은 다양한 생물이 보유하고, 그 구조나 성질은 유사하다. 기본적으로는 분자량 약 10만의 폴리펩티드 사슬 3가닥으로 구성되고, 미변성 콜라겐(un-denatured collagen)에서는 이들이 나선구조(helix structure)를 취하고 있다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석에 의해 겔에 전개하면, 폴리펩티드 사슬 1가닥의 1량체(α 사슬), 2가닥의 2량체(β 사슬), 3가닥의 3량체(γ 사슬)로 나뉜다. 단, 원료조직으로부터의 추출성이나 얻어지는 분자종(1량체(α 사슬), 2량체(β 사슬), 3량체(γ 사슬) 별)은 동물의 종류 또는 사용하는 조직에 따라서 크게 상이하다.

본 발명에 있어서 사용되는 새우 콜라겐에 대해서는 새우 근육조직으로부터 추출시의 펩신 소화(pepsin digestion)를 2회 정도 반복함으로써, 콜라겐 정제분획을 용이하게 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 콜라겐 정제분획에는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석-쿠마시(Coomassie) 염색분석에 있어서 대략 싱글 밴드(approximately single band)를 나타낼 정도로 콜라겐의 1량체(α 사슬)가 정제되어 있다.

본 발명의 새우 알레르겐에 있어서 사용되는 새우 콜라겐은 상기 방법 이외의 방법으로도 적절히 얻을 수 있다. 또한, 새우 콜라겐은 공지의 기술을 이용하여 적절히 이를 농축, 정제할 수 있다.

원료 새우의 종류에 특별히 제한은 없지만, 식용 새우인 보리새우 또는 스팟새우 등을 바람직하게 예시할 수 있다.

본 발명의 새우 알레르겐에 있어서는, 예를 들면 알레르겐성(allergenic activity), 항체생산능, 항체결합능 등의 특성에 있어서, 새우 콜라겐의 면역학적 특성을 보유하는 것이면, 그의 폴리펩티드 단편을 사용하는 것도 가능하다. 즉, 예를 들면 항원-항체 반응의 특이성을 결정하는 국소구조인 에피토프(epitope)는 일반적으로 그 아미노산 길이는 10~수십 아미노산 정도이다. 따라서, 새우 콜라겐에도 그와 같은 면역학적 특성을 보유하는 부분 폴리펩티드 단편이 존재할 것으로 생각된다.

또한, 본 발명에 있어서 「면역학적」이란, 해당 분야에서 일반적으로 사용 되는 용어와 동일한 정의로 사용되고, 인간(human)에 대한 면역성을 이용하는 것 뿐 아니라, 예를 들면 토끼(rabbit), 염소(goat), 양(sheep), 원숭이(monkey), 소(bovine), 닭(chicken), 기니피그(guinea pig), 랫트(rat), 마우스(mouse) 등, 다른 동물에 대한 면역성을 이용하는 것도 포함된다.

본 발명의 새우 알레르겐에 있어서는 그 면역학적 특성을 보유하는 범위라면, 가역적 또는 불가역적으로 타물질과 결합시킨 상태로 사용할 수 있다. 예를 들면, 수지, 유리, 플라스틱, 금속, 색소분자, 방사성 물질, 형광물질, 생체고분자, 유기재료분자 등에 결합시킨 상태로 사용할 수 있다. 또한 결합시키는 것의 성상(性狀)에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 겔(gel)상, 나노입자(nano-particle)상, 콜로이드(colloid)상, 비즈(beads)상, 다공질상, 플레이트(plate)상 등이어도 된다.

본 발명의 새우 알레르겐은 이하와 같이 이용할 수 있다.

예를 들면, 시료로부터 추출물을 조제하고, 본 발명의 새우 알레르겐(새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편)을 물질적 지표로 하고, 상기 추출물 중의 새우 알레르겐(새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편)의 존재 유무를 검출한다. 상기 시료로서는 음식품 또는 그의 원재료 등을 들 수 있다.

이것에 의하면, 음식품 중에 새우 알레르겐의 혼입이 있는지 여부를 제조업자 또는 그 관리자가 간편하게 검사할 수 있고, 이를 제품의 패키지(package) 등에 표시함으로써 구입자에게 알릴 수 있다. 그리고, 새우 알레르기 발증 이력을 갖거나, 발증의 우려가 있는 소비자가 그 음식품을 섭취하는 것을 방지할 수 있다.

또한, 콜라겐은 용화(溶化)되어 젤라틴(gelatin)이 되어도 항원성이 유지되는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 새우 알레르겐(새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편)을 물질적 지표로 하는 경우에도, 가열처리된 음식품 중의 새우 알레르겐으로서의 항원성은 유지될 것으로 생각되어, 후술하는 면역학적 검출수단으로 간편하게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 새우 알레르겐은 또한 이하와 같이 이용할 수 있다.

예를 들면, 피험자의 생체시료 또는 그 조제물에 본 발명의 새우 알레르겐을 작용시키고, 상기 생체시료 또는 그 조제물에 포함되는 IgE 항체 중, 상기 새우 알레르겐에 결합하는 IgE 항체의 양을 측정한다. 이것에 의해서, 피험자의 새우 콜라겐에 대한 감수성을 측정하고, 또는 새우 콜라겐에 의한 알레르기 증상의 병태를 측정할 수 있다.

피험자의 생체시료 또는 그 조제물로서는 혈액, 혈청, 혈장 등을 들 수 있다.

상기 새우 알레르겐에 결합하는 IgE 항체의 양을 측정하는 수단으로서는, 예를 들면, 먼저 본 발명의 새우 알레르겐을 마이크로 플레이트(micro-plate)나 비즈(beads)에 고상화해 두고, 상기 생체시료 또는 그 조제물에 포함되는 IgE 항체 중 그 고상에 본 발명의 새우 알레르겐을 매개로 하여 결합하는 것을, 결합하지 않고 용액 중에 머무는 것으로부터 세정조작이나 원심조작에 의해 분리하고, 이를 IgE 항체에 대한 항체로 측정하는 방법으로 행할 수 있다. IgE 항체에 대한 항체로서는 항인간 IgE-β-갈락토시다아제(IgE-β-galactosidase) 표지항체 등이 시판되 어 있다.

상기의 측정방법을 간편하고 신속하게 할 수 있도록 하기 위해서는, 본 발명의 새우 알레르겐을 포함하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약이 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 새우 알레르겐 외에 필요로 되는 임의의 시약을 추가로 포함하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약으로서도 제공될 수 있다. 그 밖에 필요로 되는 임의의 시약으로서는, 예를 들면 상기 항인간 IgE-β-갈락토시다아제 표지항체 등의 표지 항 IgE 항체를 들 수 있다.

한편, 본 발명의 항새우 알레르겐 항체는 본 발명의 새우 알레르겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체로서, 구체적으로는 항혈청, IgG 분획, 다중클론 항체 또는 단일클론 항체 등의 항새우 알레르겐 항체이다. 그 조제방법으로서는 해당 분야에서 주지의 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 새우 알레르겐을 면역동물에 투여하고, 해당 동물로부터의 항혈청을 채취한다. 면역동물로서는 토끼, 염소, 양, 원숭이, 소, 닭, 기니피그, 랫트, 마우스 등을 들 수 있다.

본 발명의 항새우 알레르겐 항체에 있어서는 그 면역학적 특성을 보유하는 범위라면, 가역적 또는 불가역적으로 타물질과 결합시킨 상태로 사용할 수 있다. 예를 들면, 수지, 유리, 플라스틱, 금속, 색소분자, 방사성 물질, 형광물질, 생체고분자, 유기재료분자 등에 결합시킨 상태로 사용할 수 있다. 또한 결합시키는 것의 성상에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 겔상, 나노입자상, 콜로이드상, 비즈상, 다공질상, 플레이트상 등이어도 된다.

본 발명의 항새우 알레르겐 항체는 이하와 같이 이용할 수 있다.

예를 들면, 전술한 시료 중의 새우 알레르겐의 존재 유무를 검출하는 방법에 있어서, 새우 콜라겐 또는 그의 폴리펩티드 단편의 존재 유무를 검출하는 수단으로서, 본 발명의 항새우 알레르겐 항체를 사용한 면역학적 검출수단을 사용할 수 있다.

면역학적 검출수단은 ELISA법이나 면역크로마토그래피법(Immunochromatography) 등을 비롯하여 각종 방법이 널리 보급되어 있어, 해당 분야의 당업자라면, 공지의 기술을 적절히 이용하는 것에 곤란은 없다.

상기의 검사방법을 간편하고 신속하게 할 수 있도록 하기 위해서는, 본 발명의 항새우 알레르겐 항체를 포함하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약이 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 항새우 알레르겐 항체 외에 필요로 되는 임의의 시약을 추가로 포함하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약으로서도 제공될 수 있다. 추가로, 그밖에 필요로 되는 임의의 시약으로서는, 예를 들면 항새우 알레르겐 항체를 인식하는 항 IgG-Fc 프래그먼트 항체(anti IgG-Fc fragment antibody) 등, 항 IgG(anti IgG) 2차 항체(secondary antibody)를 들 수 있다.

[실시예]

이하 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<제조예 1> 보리새우 콜라겐(shrimp collagen from Penaeus japonicus)의 정제

보리새우의 꼬리살로부터 에비하라, 이리에의 방법(에비하라 데쯔야, 이리에 신키치: 어류 및 무척추 동물 콜라겐 세포학 매트릭스 연구법(I) 콜라겐 기술연수 회간행 1998; 52-57.)에 따라 이하와 같이 하여 콜라겐을 정제하였다.

새우 꼬리살을 빙냉한 세정액(0.1 μM, N-ethylmaleimide, 10 μM PMSF, 1 mM EDTA, 25 mM Na₂HPO₄; 용시조제) 중에 넣고, 유리 호모지나이저로 균질화하였다. 이 용액을 10000 rpm(15000×g), 10분간, 4℃에서 원심하고(이하의 원심조작도 특별히 기재가 없는 경우는 이 원심조건에 따른다.), 침전에 세정액을 첨가하여 3~10시간 교반하였다. 다시 원심하고, 침전에 세정액을 첨가하여 교반, 이 세정공정을 5~7회 반복하였다. 상청의 단백질 농도가 10 ㎍/㎖ 이하가 된 것을 확인하고, 침전에 약 10배량의 냉에탄올을 첨가하여 약 3시간 교반, 상청이 투명해질 때까지 수회 반복하였다. 이 탈지 침전에 약 10배량의 1 ㎎/㎖ 펩신-0.5 M 초산(추출액)을 첨가하고, 하룻밤 교반하였다. 이를 원심하여 그 상청을 회수하였다. 또한, 원심 후의 침전에는 다시 추출액을 첨가하여 동일하게 추출을 행하였다. 원심 후의 상청을 합치고, 여기에 최종농도 2 M이 되도록 NaCl을 첨가하여, 하룻밤 교반하였다. 이를 원심하고, 그 침전에 약 10배량의 0.05 M 초산을 첨가하여 용해시킨 후, 다시 원심하고, 그 상청을 투석막(PIERCE사제, Rockford, IL)에 넣어 0.005 M Tris-HCl, pH 7.5에 대해 하룻밤 투석하고, 추가로 투석 외액의 pH가 7.5로 안정될 때까지 반복하여 투석을 행하였다. 투석 후, 원심하고, 그 침전에 약 10배량의 0.05 M 초산을 첨가하여 용해시키고, 다시 원심하였다. 이 상청을 회수, 0.005 M 초산에 대해 하룻밤 투석한 후, 20분간 원심하여 그 상청(보리새우 콜라겐 정제물)을 얻었다.

얻어진 상청을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석 처리하고, 쿠마시 염 색을 하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

콜라겐은 다양한 생물이 보유하고, 그 구조나 성질은 유사하다. 기본적으로는 분자량 약 10만의 폴리펩티드 사슬 3가닥으로 구성되고, 미변성 콜라겐에서는 그들이 나선구조를 취하고 있다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석에 의해 겔에 전개하면, 폴리펩티드 사슬 1가닥의 1량체(α 사슬), 2가닥의 2량체(β 사슬), 3가닥의 3량체(γ 사슬)로 나뉜다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 분자량 마커와의 대비로부터, 얻어진 상청으로부터는 약 120 킬로달톤(kDa)의 밴드가 주요 밴드로서 확인되고, 이것이 콜라겐의 1량체(α 사슬)라고 생각되었다. 또한, 콜라겐의 2량체(β 사슬), 3량체(γ 사슬)에 상당하는 밴드는 조금 확인될 뿐이었다. 그 밖에 42 kDa 부근에 매우 조금 밴드가 확인되었다.

<시험예 1> 새우 알레르겐 협잡(夾雜)물질의 확인

새우 알레르겐 환자의 다수는 새우 트로포미오신과 새우 아르기닌 키나아제의 양쪽 또는 어느 한쪽에 대한 특이적 IgE 항체를 보유한다.

따라서, 항새우 트로포미오신 항체(마우스 유래) 및 항새우 아르기닌 키나아제 항체(마우스 유래)를 사용하여, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물 중에, 이들이 협잡물질로서 혼입되어 있지 않은지 여부를 이하와 같이 하여 조사하였다. 또한, 이들의 항체는 다음과 같이 제작하였다. 즉, 대하(oriental shrimp)(보리새우 속(genus Penaeus))의 꼬리살을 자비(煮沸)하고, 그 추출액을 황산암모늄 염석한 후, 음이온 교환 칼럼 및 히드록시아파타이트 칼럼(hydroxyapatite column)을 사용 하여 새우 트로포미오신을 단리하였다. 이 정제 트로포미오신을 알럼(애쥬번트)과 함께 마우스에 면역하고, 통상의 방법에 따라 항새우 트로포미오신 항체(마우스 항혈청)를 얻었다. 또한, 보리새우 꼬리살의 호모제네이트를 제작하고, 황산암모늄 염석 후, 니켈킬레이트 칼럼을 사용하여 아르기닌 키나아제를 단리하였다. 이 정제 아르기닌 키나아제를 알럼(애쥬번트)과 함께 마우스에 면역하고, 통상의 방법에 따라 항새우 아르기닌 키나아제 항체(마우스 항혈청)를 얻었다.

제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물을 0.05 M 탄산-중탄산 완충액, pH 9.6에서 10 ㎍/㎖로 조제하여, 96웰 바닥이 평평한 마이크로 플레이트의 1웰 중에 100 ㎕(약 1 ㎍)씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치(靜置)하여 고상화하였다. PBST로 3회 세정한 후, 상기 새우 주요 알레르겐 항체(마우스 항혈청)(항 TMS, 항 AK, 각 25000배)를 실온에서 60분간 반응시켰다. 세정 후, 알칼리포스파타아제(Alp) 표지 항마우스 IgG 항체(2000배)를 실온에서 60분간 반응시켰다. 세정 후, 1 ㎎/㎖ p-니트로페닐포스페이트(p-nitro phenyl phosphate)를 실온에서 15분간 반응시켰다. 0.2 M EDTA를 첨가하고 반응을 정지하여, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 각각의 항체에 대한 양성 대조로서, 새우 트로포미오신과 새우 아르기닌 키나아제를 96웰 바닥이 평평한 마이크로 플레이트의 1웰 중에 각각 약 0.1 ㎍ 포함되도록 고상화하고, 동일하게 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

표 1에 나타내는 바와 같이, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물은, 항새우 트로포미오신 항체(마우스 항혈청) 및 항새우 아르기닌 키나아제 항체(마우스 항혈청)에 대해서는 전혀 반응성을 가지지 않고, 2종의 항체의 새우 콜라겐으로의 반응량(흡광도)은 각각 blank로 동일하였다.

이상의 결과 및 전술한 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석의 결과로부터, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물에는, 새우 트로포미오신이나 새우 아르기닌 키나아제의 혼입은 없어, 새우 콜라겐의 알레르겐성을 평가하기 위해 충분히 정제되어 있다고 판단되었다.

<시험예 2> 보리새우 콜라겐의 동정

제조예 1에서 얻어진 단백질이 콜라겐인 것을 확인하기 위해, 미변성 콜라겐의 나선구조에 특이적으로 결합하는 색소인 시리우스-레드(Sirius-red)에 의한 염색을 하였다. 구체적으로는, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물에 대해서, 콜라겐 동정 키트인 「Sircol Collagen Assay 키트」(상품명, 영국 Biodye science사제, Northern Ireland)를 사용하여 시리우스-레드에 의한 염색 정도를 측정하였다. 또한, 가열처리(변성)한 것에 대해서도 동일하게 측정하였다. 도 2에는 그 결과를 나타낸다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 비가열(미변성) 시료는 색소 시리우스-레드로 염색되었지만, 가열처리(변성) 시료에서는 염색성이 크게 저하되었다. 이 결과는 소 콜라겐(bovine collagen)의 결과와 동일하였다.

콜라겐의 아미노산 조성은 매우 특징적으로 글리신이 많고, 소수성 아미노산이 적으며, 티로신이 거의 포함되어 있지 않기 때문에 280 ㎚의 흡수가 거의 확인되지 않는다. 따라서, 도 3에는 제조예 1에서 얻어진 단백질(보리새우 콜라겐)의 자외선 흡수특성에 대해서, 소 콜라겐 및 BSA(소 혈청 알부민)의 자외선 흡수특성과 비교하였다. 구체적으로는, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물과 소 콜라겐 및 BSA를 각각 1 ㎎/㎖의 농도로 정제수로 조정하고, 240-300 ㎚의 파장에서의 자외선 흡수특성을 비교하였다.

도 3에 나타내는 바와 같이, BSA는 280 ㎚에 명료한 흡수 피크를 확인한 것에 대해, 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물, 또는 소 콜라겐에서는 280 ㎚에 흡수 피크(absorbance peak)를 확인하지 못했다.

이상으로부터, 제조예 1에서 얻어진 단백질이 콜라겐인 것이 확인되었다.

<제조예 2> 스팟새우 콜라겐(shrimp collagen from Pandalus platyceros)의 정제

스팟새우의 꼬리살로부터 제조예 1과 동일하게 하여 콜라겐을 정제하였다. 그 결과, 보리새우 콜라겐과 동일한 특성을 갖는, 분자량 약 120 킬로달톤(kDa)의 스팟새우 콜라겐을 정제할 수 있었다.

<시험예 3> 새우 콜라겐의 알레르겐성

새우 알레르기 환자(새우 CAP RAST 양성 23예)의 혈청 중에서, 새우 콜라겐에 대한 IgE 항체의 발현량이 증가하고 있는지 여부를 조사할 목적으로, 이하와 같이 하여 간접 ELISA법에 의한 측정을 행하였다. 또한, 상기 새우 알레르기 환자는 새우의 섭식으로 구순부종이나 두드러기, 또한 접촉 피부염(조리중) 등의 알레르기를 발증한 경험이 있으며, 그 혈청은 시판의 알레르겐 IgE 항체검사 키트(CAP-RAST)로의 판정에서 양성이다.

제조예 1 또는 제조예 22에서 얻어진 새우 콜라겐을 0.05 M 탄산-중탄산 완충액, pH 9.6에서 10 ㎍/㎖로 조제하고, 96웰 바닥이 평평한 마이크로 플레이트의 1웰 중에 약 1 ㎍ 포함되도록 고상화하였다. PBST(PBS, 0.05% Tween 20)로 3회 세정한 후, 새우 알레르기 환자의 혈청을 1% BSA-PBST로 5배 희석하여 분주(分注)하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. PBST로 3회 세정한 후, 항인간 IgE-β-갈락토시다아제 표지항체(「CAP RAST FEIA 키트」(상품명), Phadia사제)를 1% BSA-PBST로 15배 희석하여 분주하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBST로 3회 세정한 후, 0.3 mM 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드(4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside)를 첨가하고, 37℃의 항온조 중에서 90분간 반응시켰다. 마지막으로, 0.1 M Glycine-NaOH, pH 10.2를 첨가하고 반응을 정지시켰다. 형광단위(FU)는 마이크로 플레이트 리더 「Fluoroskan II」(상품명, 미국 Titertek사제)를 사용하여 측정하고, 100 형광단위(FU) 이상을 항체 양성으로 하였다.

그 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타내는 바와 같이, 항원으로서 보리새우 콜라겐을 사용한 경우에는 새우 알레르기 환자 23예 중 8예(35%)가 항체 양성이었다. 또한, 항원으로서 스팟새우 콜라겐을 사용한 경우에는, 새우 알레르기 환자 23예 중 5예(22%)가 항체 양성이었다.

이상으로부터, 일부 새우 알레르기 환자(새우 CAP RAST 양성 23예)의 혈청에서, 새우 콜라겐에 대한 IgE 항체의 발현량이 증가하고 있는 것이 명확해졌다. 따라서, 새우 콜라겐이 새우 알레르기 증상의 원인물질의 하나인 것이 시사되었다.

<시험예 4> 다른 동물 유래의 콜라겐과의 교차 반응성

콜라겐은 다양한 생물이 보유하고, 그 구조나 성질은 유사하다. 또한, 사카구치(Sakaguchi) 등은 생선 알레르기 환자의 생선 젤라틴 IgE 항체 양성률은 약 30%였다고 보고하고 있다(상기 비특허문헌 6 참조.).

따라서, 시험예 3에서 나타내어진 새우 콜라겐의 알레르겐성이, 새우 알레르기 환자의 혈청 중에 존재하는 다른 동물 유래의 콜라겐에 기인하는 IgE 항체와의 반응에 의한 것은 아닌 것을 확인하기 위해, 새우 콜라겐의 교차 반응성에 대해서 조사하였다. 구체적으로는 고등어(Mackerel)와 소(bovine)의 콜라겐을 사용한 억제법 ELISA에 의해, 새우 알레르기 환자의 혈청 중에 존재하는 콜라겐 IgE 항체(collagen IgE antibody)의 특이성에 대해서 검토하였다.

먼저, 제조예 1에서 얻어진 보리새우 콜라겐을 0.05 M 탄산-중탄산 완충액, pH 9.6에서 10 ㎍/㎖로 조제하고, 96웰 바닥이 평평한 마이크로 플레이트의 1웰 중에 약 1 ㎍ 포함되도록 고상화하였다. 별도의 시험관에 제조예 1에서 얻어진 보리새우 콜라겐, 고등어 및 소의 콜라겐 각각에 대해서, 20 ㎍/㎖부터 4 ㎍/㎖, 0.8 ㎍/㎖로 단계적으로 희석한 용액을 준비하고, 5배로 희석한 콜라겐 IgE(collagen IgE) 양성 풀혈청(positive pool serum)(시험예 3에서의 양성자 3예의 혈청을 혼합한 것)을 등량 첨가하여 혼합, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 콜라겐 고상화 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 시험관에 제작한 콜라겐과 혈청의 혼합액을 100 ㎕씩 분주하여 실온에서 3시간 반응시켰다. 이후에는 시험예 3과 동일하게 하여 측정을 행하였다. 억제율은 다음 식으로 구하였다.

·억제율(%)=(억제제 미첨가 웰의 FU-억제제 첨가 웰의 FU)÷억제제 미첨가 웰의 FU×100

그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 억제제에 새우 콜라겐을 사용한 경우에는 고상화 보리새우 콜라겐과 혈청의 반응이 농도 의존적으로 억제되었다. 이것에 대해 고등어나 소의 콜라겐을 억제제에 사용한 경우에는 전혀 억제되지 않았다.

이상으로부터, 새우 콜라겐은 다른 종의 콜라겐(collagen originated from other species)과의 교차 반응성이 낮은 알레르겐인 것이 명확해졌다. 또한, 시험예 3에서 나타내어진 새우 콜라겐의 알레르겐성이 새우 알레르기 환자의 혈청 중에 존재하는 다른 동물 유래의 콜라겐에 기인하는 IgE 항체와의 반응에 의한 것은 아니고, 새우 콜라겐 특이적인 IgE 항체의 발현량의 증가에 따른 것이라고 생각되었다.

<실시예 1> 새우 콜라겐 특이적 IgE 항체 보유자의 검출

일반 성인 175예에 있어서의 새우와 고등어의 콜라겐에 대한 IgE 항체 보유상황을 조사하였다. 구체적으로는, 각 피험자로부터 혈청을 채취하고, 시험예 3과 동일하게 하여 양성자를 검출하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타내는 바와 같이, IgE 항체 양성자는 보리새우에서 3예(1.7%), 고등어에서 4예(2.3%)였다. 새우와 고등어의 항체값 사이에는 상관이 인정되지 않고, 양자에 IgE 항체를 보유한 것은 1예 뿐이었다. 또한, 새우 콜라겐 IgE 항체를 보유한 3예는 모두 새우나 게의 섭식에 의해 두드러기나 구순부종 등의 경험을 가지고 있었다.

이상과 같이, 새우 알레르기 발증자와 새우 콜라겐 IgE 항체 보유자의 상관이 인정되기 때문에, 알레르겐으로서의 새우 콜라겐이나, 이것을 사용하여 제작할 수 있는 항새우 알레르겐 항체 등을, 새우 알레르기의 측정 등에 응용할 수 있는 것이 명확해졌다.

도 1은 제조예 1의 보리새우 콜라겐 정제물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석 처리하여 쿠마시 염색한 사진이다.

도 2는 미변성 콜라겐 나선구조에 특이적으로 결합하는 색소인 시리우스-레드에 의한 염색을 한 결과를 나타내는 도표이다.

도 3은 제조예 1에서 얻어진 보리새우 콜라겐의 자외선 흡수특성을 소 콜라겐 및 BSA(소 혈청 알부민)의 자외선 흡수특성과 비교한 결과를 나타내는 도표이다.

도 4는 새우, 고등어 및 소의 콜라겐을 억제제에 사용한 억제법 ELISA의 결과를 나타내는 도표이다.

Claims

시료 중의 새우 알레르겐의 혼입을 검사하는 방법으로서, 시료로부터 추출물을 조제하고, 상기 추출물 중의 새우 콜라겐의 존재 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 혼입검사방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 음식품 또는 그의 원재료인 새우 알레르겐 혼입검사방법.
제1항에 있어서, 상기 새우 콜라겐은 보리새우 또는 스팟새우 유래인 새우 알레르겐 혼입검사방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물 중의 새우 콜라겐의 존재 유무를 검출하는 수단이, 새우 콜라겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 사용한 면역학적 검출수단인 새우 알레르겐 혼입검사방법.
시료 중의 새우 알레르겐의 혼입을 검사하기 위해 사용되는 검사용 시약으로서, 새우 콜라겐을 인식하는 항새우 알레르겐 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.
제5항에 있어서, 상기 항새우 알레르겐 항체를 함유하는 용액을 포함하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.
제5항에 있어서, 상기 항새우 알레르겐 항체를 담지한 담체를 포함하는 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 새우 콜라겐은 보리새우 또는 스팟새우 유래인 새우 알레르겐 혼입검사용 시약.
피험자의 새우 알레르겐에 대한 감수성을 측정하기 위해 사용되는 측정용 시약으로서, 새우 콜라겐으로 이루어진 새우 알레르겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.
제9항에 있어서, 상기 새우 알레르겐을 함유하는 용액을 포함하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.
제9항에 있어서, 상기 새우 알레르겐을 담지한 담체를 포함하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.
제9항에 있어서, 상기 새우 콜라겐은 보리새우 또는 스팟새우 유래인 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 표지 항IgE 항체를 포함하는 새우 알레르겐 감수성 측정용 시약.
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