CN112114150A

CN112114150A - 用于诊断海鲜过敏的方法及产品

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Publication number: CN112114150A
Application number: CN202010563753.9A
Authority: CN
Inventors: W·苏尔; M·柯林格; A·韦曼; S·罗韦尔; H·希斯曼; M·P·坎普德威拉
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS; Hospital Clinic de Barcelona
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2020-12-22
Also published as: JP2021006811A; US20210333274A9; KR20200146018A; CA3083859A1; EP3754337A1; US20200400665A1; US11598772B2

Abstract

本发明涉及诊断上有用的载体，其包括用于特异性捕获来自受试者的样品中针对多肽的抗体的工具，该多肽选自鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体；一种方法，其包括在来自受试者的样品中检测是否存在针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的抗体，以及根据本发明的多肽或载体或者与针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的来自患者的样品的IgE抗体特异性结合的多肽用于制备诊断试剂盒(优选用于过敏诊断)的用途。

Description

用于诊断海鲜过敏的方法及产品

技术领域

本发明涉及诊断上有用的载体，其包括用于特异性捕获来自受试者的样品中针对多肽的抗体的工具，所述多肽选自鱿鱼MLC1或鱿鱼 MLC2或其变体；一种方法，其包括检测来自受试者的样品中是否存在针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的抗体的步骤；以及根据本发明的多肽或载体或者与针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的来自患者的样品中的IgE抗体特异性结合的多肽用于制备诊断试剂盒(优选用于过敏诊断)的用途。

背景技术

对海鲜的过敏反应的范围从轻微到全身性反应，包括严重的过敏反应。除了食用可识别的海鲜产品时的过敏反应外，在各种食品中过敏原可能是不可识别的成分，其中过敏原的性质和过敏反应的危险就被隐藏了。

尽管海鲜过敏的发病率很高，但很少有可供选择的治疗方法，并且忌口往往是唯一可能的选择。当然，这需要关于患者对其有反应的一种或多种抗原的性质的精确信息。

一系列测试是商业上可获得的，特别是关于最普遍的海鲜成分，特别是甲壳动物(包括虾、对虾、蟹、龙虾和小龙虾)。例如，肌肉蛋白质原肌球蛋白在各种虾种中都被识别为主要的交叉反应性过敏原。

这些海鲜过敏的诊断测试涉及来自患者的对来自过敏源的蛋白质具有特异性的IgE抗体的检测。但是，阳性IgE测试(即IgE致敏)并不总是与临床表现相关。换句话说，如果检测到针对一种过敏原的IgE，这种观察结果不足以提供结论性诊断。

相反，这是表明所测试的过敏源比其他过敏源更有可能相关的第一迹象。在临床实践中，医生对过敏原的诊断通常基于对相关过敏源的阳性IgE致敏和对该过敏原的过敏反应的可信临床史。此外，通过在患者皮肤上局部应用特定提取物所进行的补充试验(如皮肤点刺试验(SPT)) 的结果可被考虑用于最终诊断。

然而，有相当多的患者无法确诊，因为他们对迄今都未知的过敏原有反应。

成功识别针对特定过敏原的过敏后，就可以进行治疗。虽然抗组胺药可用于改善治疗，但能够通过基于受控过敏原施用的特异性免疫疗法进行长期和根治性治疗。尽管确切的机制还不完全清楚，但这种免疫系统的特异性激活缓解了随后暴露于相同过敏原环境时的症状。对各种植物和动物过敏原的成功治疗已被证明。

Yadzir等人对来自白鱿鱼的提取物进行了蛋白质组分析，包括2D SDS PAGE，随后进行质谱和生物信息学分析(Yadzir,Z.H.M.,Misnan, R.和Murad,S.(2012)Identification of tropomyosin as major allergen of white squid(Loligo edulis)by two-dimensional immunoblotting and mass spectrometry,Southeast Asian JTrop Med Public Health,43(1),185)。尽管识别了超过50种不同的蛋白质，但唯一一致的反应蛋白点被归于原肌球蛋白。

Tong,S.W.等人公开了作为过敏原的来自不同种的肌球蛋白轻链，但没有公开来自鱿鱼的(Tong,S.W.,Yuen,A.W.T.,Wai,C.Y.Y., Leung,N.Y.H.,Chu,K.H.,Leung,P.S.C.(2018)Diagnosis of fish and shellfish allergies,J.Asthma and Allergy,11,247-260)。

US2015/0153358公开了各种虾过敏原，包括虾肌球蛋白轻链。鱿鱼肌球蛋白轻链未被公开过。

Miayazawa等人公开了鱿鱼过敏原的纯化(Miyazawa,M.T., Fukamachi,F.,Inakagi,Q.,Reese,G.,Daul,C.B.,Lehrer,S.C.Inouye, S和Sakaguchi,M.(1996)J.Allergy Clin.Immunol.98,948-953)。识别了鱿鱼原肌球蛋白，以及还发现了分子量在70kDa和90kDa之间的过敏性蛋白质，但在免疫印迹中未发现约18kDa(鱿鱼肌球蛋白轻链的分子量)的反应性条带，也未公开鱿鱼肌球蛋白轻链，更不用说作为抗原。

因此，对提供诊断、治疗和预防海鲜过敏反应的试剂和方法仍有持续需求。

发明内容

本发明的基本问题是提供新的测试和相关试剂用于诊断或辅助诊断海鲜过敏，优选软体动物过敏，更优选鱿鱼过敏。

本发明的另一基本问题是提供新的测试和相关试剂用于鉴别诊断或辅助鉴别诊断海鲜过敏，从而能够将鱿鱼过敏与其他海鲜过敏(特别是虾过敏)区分开来。

本发明的基本问题由所附独立和从属权利要求的主题来解决。

在第1方面中，通过诊断上有用的载体来解决该问题，其包括用于特异性捕获来自患者的样品中针对多肽的抗体的工具，所述多肽选自鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体。

在一个优选实施方案中，所述载体选自珠粒、测试条、微量滴定板、微阵列、印迹(优选蛋白质印迹(western blot)、线性印迹(line blot) 和斑点印迹(dot blot))、玻璃表面、聚合物(例如纤维素衍生物)、载玻片、生物芯片和膜，并且最优选微量滴定板或线性印迹。

在一个优选实施方案中，所述载体还包括捕获针对鱿鱼TM的抗体的工具。

在第2方面中，通过包括根据权利要求1至3中任一项的诊断上有用的载体的试剂盒来解决所述问题，其中所述试剂盒优选另外包括选自校准物(优选一组校准物)、洗涤缓冲液和用于检测IgE或IgG(优选 IgG4抗体)的工具(优选标记二抗)的一种或多种，优选包括全部。

在第3方面中，通过一种方法来解决所述问题，该方法包括检测来自受试者的样品中是否存在针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的抗体的步骤。

在一个优选实施方案中，所述方法还包括检测样品中是否存在针对鱿鱼TM的抗体。

在第4方面中，通过包含鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体的药物组合物来解决所述问题，优选还包含佐剂。

在第5方面中，通过包含鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体的多肽来解决所述问题，其中所述多肽是分离的或固定化的。

在一个优选实施方案中，多肽与特异性结合至所述多肽的抗体(优选IgE或IgG，优选IgG4类抗体)复合。

在一个优选实施方案中，多肽是在真核细胞中表达的。

在第6方面中，通过根据本发明所述的多肽、载体或试剂盒用于过敏诊断的用途来解决所述问题。

在第7方面中，通过根据本发明所述的多肽或载体或者特异性结合至患者样品中针对鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的IgE或IgG(优选IgG4) 抗体的多肽用于制备诊断试剂盒(优选用于过敏诊断)的用途来解决所述问题。

在一个优选实施方案中，过敏是贝类过敏，优选鱿鱼过敏。

在一个优选实施方案中，诊断是贝类过敏的鉴别诊断，其中优选区分虾和鱿鱼过敏。

在另一个优选实施方案中，诊断是过敏的鉴别诊断，其中优选区分昆虫和贝类过敏，其中所述昆虫可以更优选地选自家蟋蟀和面粉虫。

在第8方面中，通过一种方法来解决所述问题，该方法包括使包含多肽的医疗或诊断装置与溶液接触的步骤，所述溶液优选以已知浓度包含针对该多肽的抗体，优选针对该多肽的IgE或IgG(优选IgG4)抗体，其中该多肽选自鱿鱼MLC1和鱿鱼MLC2或其变体。

在第9方面中，通过特异性结合至鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2的抗体 (优选IgE或IgG，优选IgG4类抗体)来解决所述问题，该抗体优选是分离的。在一个优选实施方案中，抗体是单克隆抗体。

本发明基于发明人令人惊讶的发现，鱿鱼肌球蛋白轻链1(MLC1) 和肌球蛋白轻链2(MLC2)多肽是过敏原，并且能够在来自罹患鱿鱼过敏的患者的样品中检测到针对鱿鱼MLC1和鱿鱼MLC2的抗体。此外，将这种抗体的检测与针对选自鱿鱼原肌球蛋白、虾MLC和虾原肌球蛋白(TM)的一种或多种抗原的抗体的检测相结合，增加了诊断的有用性。而且，能够将鱿鱼过敏与其他海鲜过敏(特别是虾过敏)区分开来。

在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“鱿鱼MLC1”是指 SEQ ID NO:8或其变体或者Uniprot登录号P05945，优选SEQ ID NO: 8或其变体。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“鱿鱼 MLC2”是指SEQ ID NO:10或其变体。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“鱿鱼TM”是指SEQ ID NO:6或其变体。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“虾MLC”是指SEQ ID NO:7或其变体。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“虾TM”是指SEQ ID NO:4或登录号Q3Y8M6，优选SEQ ID NO:4或其变体。在本申请全文中所提到的任何数据库代码是指在本申请的申请日或其最早优先权日通过相应的数据库(例如Uniprot)在线获得的多肽序列。

本发明涉及诊断上有用的载体，其优选固体载体，用于使来自受试者(优选哺乳动物受试者，更优选人受试者)的体液样品与结合于所述载体的特异性捕获抗体的工具一起接触。

根据本发明，载体包括特异性捕获抗体的一种或多种工具，优选一种或多种、更优选两种或更多种、更优选三种或更多种这样的工具，每种工具都能够特异性捕获不同抗体。在一个最优选的实施方案中，载体包括特异性检测针对选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM的一种或多种抗原的抗体的工具。所述工具优选固定在所述载体上。在一个优选实施方案中，用于特异性捕获抗体的工具是包含待捕获或待检测抗体与之结合的抗原或其变体(例如选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM 或其变体)或者由其组成的多肽。多肽可以是线性肽或折叠多肽，后者优选采用与天然蛋白质基本相同的折叠的变体，这可以通过圆二色谱确定。在一个优选实施方案中，肽或多肽包含至少7个、优选10个、更优选15个氨基酸的针对待捕获或待检测抗体的表位。所述抗原及其附着的不溶性载体可以用直接的方式从反应混合物中分离出来，其中所述抗原与样品接触，例如通过过滤、离心或倾析。

根据本发明的任何固定可以是以可逆或不可逆的方式。例如，如果待固定化的多肽是通过离子相互作用与载体相互作用(可通过添加高浓度盐来掩蔽)，或者如果多肽是通过可断裂共价键结合的，则固定化是可逆的。相反，如果这样的多肽是通过水溶液中不能被裂解的共价键连接到载体上的，则固定化是不可逆的。可以间接固定多肽，例如通过固定化抗体或与该多肽有亲和力的其他实体，然后添加该多肽并形成多肽 -抗体复合物。可以使用特异性捕获待检测抗体的标记二抗或标记工具来检测所捕获的抗体。固定化方法描述于Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugatino and Cross-Linking,1991,CRC Press和Rosenberg, I.M.,Protein Analysis and Purification,第二版,Springer,2005中。

在一个优选实施方案中，诊断上有用的载体是印迹，优选线性印迹 (Raoult,D.,和Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and otherantibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65； WO2013041540)。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“线性印迹”是指包被有一种或多种特异性捕获抗体的工具(优选每种都是多肽)的测试条，更优选基于膜的测试条。如果使用两种或更多种工具，则它们优选地在载体上空间分开。优选地，条带的宽度至少为测试条宽度的30％，更优选为40％、50％、60％、70％或80％。线性印迹可以包括一个或多个对照条带，用于确认其已在合适条件下与样品接触足够长时间，特别是在分别存在人血清或有二抗的条件下。现有技术中描述了各种印迹，例如van Oss,J.C.,和Regenmortel,M.H.V., Immunochemistry,1994,Marcell Dekker，特别是第35章。

在一个优选实施方案中，载体可以是侧流免疫测定装置。侧流装置可以包括膜，该膜包括样品垫，垫上放置样品液，下游位置上的颗粒缀合物包括待检测抗体与之结合的抗原和可检测标记(例如胶体金)，具有将与待检测抗体结合的颗粒缀合物固定化的工具的测试线以及对照线。侧流免疫测定描述于Wong,R.,Tse,H.Lateral Flow Immunoassay,Springer,2009中。

在一个优选实施方案中，载体是纤维素衍生物，其上固定了包括 MLC1和/或MLC2或其变体的多肽。现有技术中描述了这样的衍生物，例如在Adeleke,O.A.Premiumethylcellulose polymer based architectures at work in drug delivery,Int.J.Pharm.X,doi 10.1016/j.ijpx.2019.100023中。

在一个优选实施方案中，根据本发明的二抗可以是与来自Ig(免疫球蛋白)类的所有抗体都结合的抗体。优选地，二抗与一种或多种不同的人抗体类别结合，优选与IgE和/或IgG和/或IgM抗体结合，优选与 IgG和/或IgE结合，优选与IgE结合。二抗通常识别所述类别的恒定结构域。各种各样的二抗都可商购获得。在一个优选实施方案中，与 IgM、IgG和IgE类抗体结合的二抗可以是包含与IgM类抗体结合的二抗、与IgG类抗体结合的二抗和与IgE类抗体结合的二抗的混合物。在一个优选实施方案中，与IgE和IgG类抗体结合的二抗可以是包含与 IgE类抗体结合的二抗和与IgG类抗体结合的二抗的混合物。二抗优选被标记。合适的二抗可商购获得，例如来自EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG(产品EI2606-9601-2或2260-9601中的“缀合物”) 或来自Rockland Immunochemicals Inc.(Dylight 609-145-006)。

在一个优选实施方案中，诊断上有用的载体更优选线性印迹，其包括允许识别由于IgE或类似抗体与糖蛋白表位(例如N-聚糖上的α-1,3- 岩藻糖)结合而导致的假阳性结果的CCD对照(Altmann,F.(2016) Coping with cross-reactive carbohydratedeterminants in allergy diagnosis,Allergo J Int 25(4),98-105)。这可以是包含糖蛋白表位的线性印迹中的额外线，如果是阴性的话，则表明在其他条带中没有假阴性反应。大量的线性印迹可商购获得，例如来自EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck,Germany。在一个优选实施方案中，根据本发明的方法包括检测是否存在与交叉反应性碳水化合物表位结合从而导致假阳性结果的抗体的步骤。其他测试条包括试纸条 (dipsticks)。现有技术中描述了各种测试条和基于印迹的载体，例如 Khare,R.,Guide toClinical and Diagnostic Virology,Wiley 2019，特别是第14章以及Fischbach,F.T.,Barnett,M.,A Manual of Laboratory and Diagnostics Tests,第8版,2009，特别是第3章。

在另一个优选实施方案中，诊断上有用的载体是珠粒。用于众多应用的各种珠粒都可商购获得，珠粒主要是基于碳水化合物(例如琼脂糖凝胶或琼脂糖)或者塑料。它们含有活性的或可活化的化学基团(例如羧基或酯基)，其能够用来固定特异性捕获抗体的工具。优选地，珠粒是具有平均直径为0.1μm到10μm、0.5μm到8μm、0.75μm到7μm 或者1μm到6μm的珠粒。能够直接地或通过亲和配体(例如分别为生物素或谷胱甘肽和链霉亲和素与GST)用特异性捕获抗体的工具来包被珠粒。例如，可以用生物素或谷胱甘肽包被珠粒，并且抗原可以分别与链霉亲和素或谷胱甘肽-S-转移酶或其变体融合。优选地，以具有10％到 90％、优选20％到80％、优选30％到70％、更优选40％到60％(w/w) 珠粒含量的水性混悬剂形式提供珠粒。在一个优选实施方案中，用第一可检测标记物(例如荧光染料)包被珠粒。

如果使用了其上包被不同过敏原的一种以上类型的珠粒，则每种类型可以具有不同类型的可检测标记物以使珠粒的类型可区分，例如用于在流式细胞术中识别珠粒和过敏原的类型。如果使用荧光标记检测到针对过敏原的抗体的存在，则选择第一可检测标记(如果也是荧光标记的话)以便能够区分两者，例如使用分开的激光(例如绿色和红色激光)。

在特别优选的实施方案中，珠粒是能够借助于磁铁而易于集中在表面上的顺磁珠。为此目的，商用顺磁珠通常含有顺磁性矿物，例如氧化铁。多种合适的顺磁珠都可商购获得。可以用可检测标记对珠粒进行标记。将抗原或抗体包被在珠粒上并将它们用于诊断测定的技术是现有技术中已知的并描述于教科书中，例如描述于现有技术中，例如Kontermann,R.E.,Dübel，S.,Antibody Engineering,第二版,Springer 2010和Wild,D.The Immunoassay Handbook,第3版,2005,Elsevier。

在另一个优选实施方案中，载体是可以用于ELISA的微量滴定板，优选包括至少8个孔。至少一个孔包被有用于直接或间接地特异性捕获抗体的工具。提供至少3个(优选4个、更优选5个)校准物，其包含针对抗原(优选确定浓度的选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM或其变体的一种或多种抗原)的抗体，并可以用来建立用于半定量分析的校准曲线。在进行本发明的方法时，可以将校准物与样品一起平行处理和显影。可以提供包含可检测标记(例如酶活性、化学发光或荧光标记) 的二抗，例如具有辣根过氧化物酶活性或碱性磷酸酶活性的标记或者能够化学发光的酶。用于进行ELISA分析和试剂制备(包括包被的微量滴定板)的实验方案是现有技术中众所周知的并描述于例如Crowther,J.R., The ELISAGuidebook,2001,Humana Press中，特别是第3章。

在另一个优选实施方案中，载体是微阵列。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“微阵列”是指具有各种(优选至少20、优选30、40、 50、80或100种)空间上分开的过敏原的芯片。它们可以包括额外的软体动物过敏原，例如在Tong,S.W.,Yuen,A.W.T.,Wai,C.Y.Y.,Leung, N.Y.H.,Chu,K.H.,Leung,P.S.C.(2018)Diagnosis of fish andshellfish allergies,J.Asthma and Allergy,11,247-260；US2015/0153358和Miyazawa,M.T.,Fukamachi,F.,Inakagi,Q.,Reese,G.,Daul,C.B., Lehrer,S.C.Inouye,Sand Sakaguchi,M.(1996)J.Allergy Clin. Immunol.98,948-953中所公开的过敏原。微阵列是现有技术中已知的并描述于Schena,M.,Protein Microarrays,2005,Jones andBartlett中。

用于实施本发明的来自受试者的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。典型地，样品是一种体液，其包含受试者全部免疫球蛋白的代表性集合。但是，一旦提供样品，就可以进行进一步处理，处理可包括分级、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任意免疫球蛋白类别(优选IgE 或IgG，优选IgG4)，这可以影响不同类别免疫球蛋白的相对分布。样品可以选自全血、血清、血浆、脑脊液和唾液，以及优选血清。在最优选的实施方案中，样品包含IgE类抗体。在更优选的实施方案中，样品包含来自IgA、IgG和IgE类(优选IgG和IgE，更优选IgG1、IgG4和 IgE)的受试者抗体的代表性集合，其中最优选的是抗体与不同抗原的比例与获自受试者样品的比例相比基本无变化，特别是IgE类抗体。样品可以来自能够在暴露于抗原时产生抗体的动物或人，优选哺乳动物、更优选灵长类、最优选人受试者。受试者可以是实验动物，优选选自小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、山羊、灵长类或马，以及更优选啮齿动物。可以使用这些方法和试剂来测试实验动物是否已被成功免疫，例如为了开发候选疫苗或药物的目的或者用于抗血清生产。

本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确(例如通过功能、名称、序列号或登录号)或隐含提及的确切序列的多肽来进行，而且可以使用这些多肽的变体来进行。

在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“变体”可以是指所述全长序列的至少一种片段，更具体地说是相对于全长序列在一个或两个末端截短一个或多个氨基酸后的一种或多种氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原序列或其变体的至少6、7、8、9、10、15、25、 50、75、100、110、120或130个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是 25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或250个或更多氨基酸。

在另一个优选实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一种片段，而且还涉及包含氨基酸序列的多肽或其片段，优选包含至少25个、更优选 50个、更优选100个连续氨基酸的片段，它们与所述参考氨基酸序列或其片段是至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的，其中除生物学活性(例如与目标抗体特异性结合的能力)或者多肽的折叠或结构所必需的氨基酸以外的氨基酸都被缺失和/或置换了，和/或以保守方式取代一个或多个这样的必需氨基酸，和/或添加或缺失使多肽的生物学活性至少部分保留的氨基酸。现有技术包括可以使用的对齐两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introductionto bioinformatics,Oxford University Press,2008,第3版。在优选实施方案中，使用应用了默认设置的ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields, G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H., Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D., Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version2.0. Bioinformatics,23,2947-2948)。

在一个优选实施方案中，变体还可以包括化学修饰，例如标记(例如同位素标记或可检测标记)或者共价修饰(例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、羟基化等)。本领域技术人员熟悉多肽的修饰方法。此外，变体还可以通过与其他已知多肽或其变体融合的方式形成，例如与人工接头(优选地不是源自疟原虫多肽)、亲和标签、其他抗原等。

根据本发明，医疗或诊断装置(例如诊断上有用的载体)的制备可以通过在细胞(例如真核细胞或原核细胞)中表达包含亲和标签的重组变体(任选带有可以包括蛋白酶切割位点的人工接头)，使表达的变体与特异性结合至亲和标签的被固定在固相上的配体接触，洗涤固相以将来自细胞的非特异性结合材料除去，并优选通过添加过量的非固定化配体将所表达的变体从固相上洗脱。然后可以将变体固定在装置上。任选地，在固定化之前可以通过将变体与蛋白酶(优选识别蛋白酶切割位点的蛋白酶)接触来除去亲和标签。亲和标签可以选自包括18A、ACP、 Aldehyd、Avi、BCCP、钙调蛋白、几丁质结合蛋白、E标签、ELK16、FLAG、flash、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、GST、GFP、HA、Isope、麦芽糖结合蛋白、myc、nus、NE、ProtA、ProtC、Tho1d4、S-Tag、SnoopTag、 SpyTag、SofTag、链霉亲和素、Strep-tag II、T7表位标签、TAP、TC、硫氧还蛋白、Ty、V5、VSV和Xpress标签的标签组。可用的蛋白酶包括但不限于TEV、凝血酶、Faktor-Xa或肠肽酶。

在一个优选实施方案中，真核细胞是昆虫或哺乳动物细胞，更优选哺乳动物细胞，最优选人细胞。永生化人工细胞系(例如CHO或 HEK293)可用于生产任何蛋白质。

多肽的变体具有生物学活性。在一个优选实施方案中，这种生物活性是与相应抗体结合的能力。在一个优选实施方案中，其包含能够与优选来自罹患海鲜过敏(更优选鱿鱼过敏)的患者的样品的相应抗体结合的表位，其中更优选该表位包含来自抗原的至少5、6、7或8个氨基酸残基的序列，该抗原优选选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM。更具体地，鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM的变体能够特异性结合或特异性捕获与来自罹患海鲜过敏(更优选鱿鱼过敏)的患者的样品的抗体结合的抗体。

在一个优选实施方案中，诊断上有用的载体包括一种或多种用于特异性捕获针对多肽的抗体的另外的工具，所述多肽更优选是选自下列的多肽：甲壳动物MLC、甲壳动物肌质钙结合蛋白、甲壳动物TM、甲壳动物肌钙蛋白C、甲壳动物精氨酸激酶、磷酸丙糖异构酶，优选选自Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 4、Der f 6、Der f 7、Der f 8、Der f 10、Derf 11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、 Der f 17、Der f 18、Der f 20、Der f21、Der f 22、Der f 23、Der f 24、Der f 25、Der f 26、Der f 27、Der f 28、Der f 29、Der f 30、Der f 31、Der f 32、Der f 33、Der f 34、Der f 35、Der f 36、 Der f 37、Derf 38、Der f 39、Der m 1、Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 6、Der p 7、Der p8、Der p 10、Der p 11、 Der p 13、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 20、Der p 21、Der p 23、Der p 24、Der p 25、Der p 36、Der p 37、Der p 38、 Der p 39、Eur m 1、Eur m2、Eur m 3、Eur m 4、Eur m 14的屋尘螨过敏原，优选选自Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Blag 4、Bla g 5、 Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Bla g 9、Bla g 11、Per a 1、Per a 2、Per a3、Per a 5、Per a 6、Per a 7、Per a 9、Per a 10、Per a 11、Per a 12、 Per a 13的蟑螂过敏原，其中甲壳动物蛋白优选虾蛋白，最优选选自 Pen m 1(原肌球蛋白)、Pen m 2(精氨酸激酶)、Pen m 3(肌球蛋白轻链)、Pen m 4(肌质钙结合蛋白)、Cra c 6(肌钙蛋白c)和Crac 8 (磷酸丙糖异构酶)。

包括虾过敏原表位的综合信息可以在Pascal,M.,Grishina,G., Yang,A.C.,Sanchez-Garcia,S.,Lin,J.,Towle,D.,Ibanez,M.D., Sastre,J.,Sampson,H.A.和Ayuso,R.(2015)Molecular Diagnosis of Shrimp Allergy:Efficiency of Several Allergensto Predict Clinical Reactivity,J.Allergy Clin.Immunol.Pract.,521-529e10中找到，其通过引用并入本文。

Zhang等人已经研究了MLC过敏原的表位(Zhang,Y.X.,Chen, H.L.,Maleki,S.J.,Cao,M.J.,Zhang,L.J.,Su,W.J.,和Liu,G.M. (2015)Purification,Charaterization andAnalysis of the Allergenic Properties of Myosin Light Chain in Procambarusclarkii(2015)J.Agr. Food Chem.,63,6271-6282)。如果需要序列X的变体，本领域技术人员能够通过从序列X开始，引入修饰(例如点突变、截短等)来设计具有生物学活性的变体，以及随后通过测试所述变体是否与来自这种样品的抗体结合来确认该变体仍具有生物学活性。

本领域技术人员可以考虑来自鱿鱼MLC1抗原的表位可以包括 GGTKKMGE(SEQ IDNO:18)、SSKDTGTA(SEQ ID NO:19)和 DREGQ(SEQ ID NO:20)及其变体。

序列

GGTKKMGEKAYKLEEILPIYEEMSSKDTGTAADEFMEAFKTFDR EGQ(SEQ ID NO:21)及其变体也是高度抗原性的。

本领域技术人员可以考虑来自鱿鱼MLC2抗原的表位包括 ALRNAFSMFD(SEQ IDNO:30)，更优选NAFSMF(SEQ ID NO:31), FIPEDYLKDL(SEQ ID NO:42)，更优选IPEDYLKDL(SEQ ID NO:43) 和FSKEEIKNVWKD(SEQ ID NO:51)。

虾MLC过敏原的表位已在Pascal等人,2015中进行了描述。本领域技术人员可以考虑来自鱿鱼TM的表位,其包括 DESERGRKVLENRSQGDEER(SEQ ID NO:26)、IDLLEKQLEEAKWIAEDADR(SEQ ID NO:27)、 KFDEAARKLAITEVDLERAEARLE(SEQ ID NO:28)、KEVDRLEDELLAEKERYKTISDELDQTFAELAGY(SEQ ID NO:29) 及其变体。

因此，根据本发明的变体包括包含这些表位的多肽和肽。在优选实施方案中，由SEQ ID NO:10所代表的MLC2的变体包括肽或多肽，其包含选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:51的一个或多个，优选包含全部，并优选包含选自SEQ ID NO:43和SEQ IDNO:31的一个或两个。在更优选的实施方案中，变体包含来自SEQ ID NO:10的至少5、6、7、8、9、10、12或15个氨基酸段的氨基酸序列，其中所述氨基酸段包含选自SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:42和 SEQ ID NO:51的一个或多个，优选包含全部，并优选包含选自SEQ ID NO:43和SEQID NO:31的一个或两个。在设计MLC2的变体时，实施例2中所描述的结果将有助于指导本领域技术人员。

在一个优选实施方案中，优选可以使用如实施例中所描述的包含该变体作为特异性捕获抗体的工具的线性印迹测定来测试该变体是否具有这种活性。该变体还可包含N末端和/或C末端肽或多肽融合体，只要它们对抗原序列部分不具有特异性结合活性和/或不与其他序列部分结合而掩蔽抗原序列使得其结合特性显著改变和/或不再能够与抗体结合。

可以从以内源性形式包含所述多肽的组织、液体或细胞中以任何形式和以任何纯化程度提供多肽，更优选过表达多肽的细胞、这些细胞的粗制或富集的裂解物直到纯化和/或分离的多肽(其可能基本上是纯的)。在一个优选实施方案中，多肽是天然多肽，其中如本文所使用的术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选从细胞(更优选原核细胞或真核细胞，优选哺乳动物细胞)中纯化的折叠多肽。可以使用多肽的糖基化形式。

根据本发明，多肽可以是重组蛋白，其中如本文所使用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用基因工程方法生产的多肽，例如通过将编码多肽的核酸与强启动子融合以在细胞或组织中过表达，或通过改造多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH或描述于Brown T.A.(1986),Gene Cloning–anintroduction,Chapman&Hall)以及用于生产和纯化天然或重组多肽的方法(例如GEHealthcare Life Sciences出版的手册“Strategies for Protein Purification”,“Antibody Purification”，以及在 Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide toProtein Purification 中)。在另一个优选实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”是指该多肽与其使用生物技术或合成方法生产时的状态相比已经被富集，并且优选是纯的，即在相应液体中至少60％、70％、80％、 90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳然后进行考马斯蓝染色和目视检查所判断出的。优选地，用作捕获抗体的工具的载体上的任何多肽都是纯的。

本发明的教导提供了试剂盒，优选用于诊断海鲜过敏。这种试剂盒是包含实施本发明方法所需的特定试剂的容器，特别是根据本发明所述的诊断上有用的载体，任选除了实施本发明方法所需的一种或多种溶液或试剂以外，优选选自或全部选自样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液以及包含用于检测任何特异性捕获的抗体(例如二抗，其可包含可检测标记以及任选用于检测后者的工具)的工具或试剂的缓冲液。此外，它可包含详细说明如何使用试剂盒的说明。它可以包含诊断上有用的载体，用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品接触，例如线性印迹。此外，试剂盒可以包含阳性对照，例如已知与包括鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM及其变体的组中的一种或多种结合的重组或多克隆抗体，以及阴性对照，例如对鱿鱼MLC1 或MLC2或TM没有可检测的亲和力的蛋白质(例如牛血清白蛋白)。阳性对照可以是来自患者的稀释样品，其包含针对鱿鱼MLC1、MLC2 和/或TM的抗体，优选IgE或IgG(例如IgG4)。最后，这种试剂盒可包括一种或多种标准溶液，也称为校准物，其包括一种或多种包括与鱿鱼MLC1结合的抗体、与鱿鱼MLC2结合的抗体和与鱿鱼TM 结合的抗体以及与包含选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM或其变体的抗原的多肽结合的抗体，其包括在试剂盒中，例如固定在诊断上有用的载体上，用于制备校准曲线，其中优选已知每种标准溶液中抗体的绝对或相对浓度。标准溶液中的浓度可以不同，以便覆盖校准曲线的浓度范围。例如，两种标准溶液中抗体的相对浓度可以为1：2、1：5、1：10、1：20、1：50或1：100或更高。在更优选的实施方案中，抗体具有恒定区或其变体或二抗结合亲和力与待检测抗体类似，和/或用于检测的任何二抗与所述抗体和待检测抗体结合。抗体可以是单克隆抗体，优选包含人IgE或IgG(优选IgG4)的杂合体，更优选与二抗结合的IgE恒定区或其变体，所述二抗与人IgE或IgG(优选 IgG4，更优选IgE类抗体)结合。试剂盒可以包含根据本发明的多肽或者包含选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM或其变体的抗原的纯化多肽，该多肽可任选包含可检测标记。试剂盒还可包括洗涤溶液。试剂盒可包括合适的水密容器，其用于在其他液体(例如反应缓冲液) 存在的情况下使诊断上有用的载体与样品接触。例如，可以在温育盘中或与温育盘组合提供线性印迹，或者可以提供微量滴定板。在现有技术中描述了合适的容器，例如EP3025780或EP3025779。试剂盒可包含用于实施根据本发明的方法的试剂，例如根据第8方面的方法。校准物及其使用描述于David Wild的The Immunoassay Handbook，第3版，Elsevier 2005中，特别是第9章。

根据本发明，可以提供或使用用于检测所捕获的抗体的工具或试剂或多肽来检测针对一种或多种选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼 TM的捕获抗体。该工具或试剂或多肽可以是结合至目标类型抗体的恒定区的二抗或其片段或变体。例如，如果要检测捕获到的人IgE或 IgG(例如IgG4)类抗体，则可以使用分别特异性结合至人IgE或IgG (例如IgG4)类抗体的恒定区的抗体。抗体(优选与这些类型的恒定区特异性结合的单克隆抗体，并可用于捕获溶液中该类型的所有抗体，无论它们的可变区所决定的结合特异性如何)可商购获得，例如来自描述于Berlina,A.N.,Taranova,N.A.,Zherdev,A.V.,Sankov,M.N., Andreev,I.V.,Martynov,A.I和Dzantiev,B.B.(2013) Quantum-Dot-Based ImmunochromatographicAssay for Total IgE in Human Serum.PLoS ONE 8(10):e77485. doi:10.1371/journal.pone.0077485中的来源。工具或试剂可被直接或间接标记。

在一个优选实施方案中，工具或试剂或抗体的任何结合或检测或捕获，优选待检测的抗体与抗原(例如MLC1或MLC2，优选MLC2) 的结合，都意味着其特异性结合，这优选意味着结合反应(例如在工具和所捕获的抗体之间)比特征在于解离常数为1x 10^-5M、更优选1x 10^-7M、更优选1x 10^-8M、更优选1x 10^-9M、更优选1x 10^-10M、更优选1x 10^-11M、更优选1x10^-12M的结合反应更强，如通过使用 Biacore设备在25℃下于pH 7的PBS缓冲液中进行的表面等离子体共振所确定的。

根据本发明的方法或产品可以用于诊断过敏，优选海鲜过敏，更优选鱿鱼过敏。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得有助于评估患者是否罹患或比普通受试者或对比受试者 (后者优选具有类似症状)可能或更有可能在过去、诊断时或将来罹患过敏的信息的任何类型的方法，以发现过敏如何发展或在将来可能发展、或者评估患者对治疗的反应性或测量化合物在治疗罹患过敏的受试者中的功效。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且包括预测和/或监测疾病或病症的过程。如果在来自受试者的样品中检测到通过针对根据本发明的多肽的抗体的检测所显示的针对至少一种选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM的抗原的抗体，则该受试者可能或更可能罹患过敏。

因此，术语“诊断”优选并不意味着根据本发明的诊断方法或产品将是确定的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断，但是可以指对所谓的“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑一系列可能条件的可能性的系统诊断过程)的贡献。在一个优选实施方案中，术语“诊断”是指该方法或产品或用途可以用于帮助过敏的诊断或者识别有罹患过敏的风险的受试者。术语“诊断”还可以指用于选择患者最有希望的治疗方案的方法或药剂。过敏可以是海鲜过敏，其中如本文所使用的术语“海鲜”优选是指甲壳动物和软体动物，优选软体动物，优选鱿鱼。根据本发明，可以将对甲壳动物(优选虾)的过敏与对软体动物(优选鱿鱼)的过敏区分开。

本发明涉及一种方法，其包括以下步骤：在液体(例如来自受试者的样品)中检测抗体是否存在，该抗体选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM的抗体。这样的方法可以包括以下步骤：a)提供液体，b)在与包含诊断上有用的载体和抗体(更具体地说是多肽和抗体)的复合物形成相容的条件下，使液体与选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM的多肽接触，c)任选分离任何所述复合物，例如通过除去液体，d)任选洗涤所述复合物，和e)任选在与相应的一种或多种选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM的抗原接触后检测所述复合物，其可以在竞争性测定形式的情况下进行标记。该方法优选体外方法。

用于根据本发明的预后、诊断、方法或试剂盒的抗体或复合物的检测包括使用选自免疫扩散技术、免疫电泳技术、光散射免疫测定、凝集技术、标记免疫测定(例如选自放射性标记的免疫测定、酶免疫测定(例如比色测定)、化学发光免疫测定和免疫荧光技术的那些)的方法。本领域技术人员熟悉这些方法，也在现有技术中进行了描述，例如在Zane,H.D.(2001):Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，特别是在第14章。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语抗体的“存在”是指使用这样的方法(优选选自酶免疫测定，更优选比色测定或化学发光免疫测定，最优选如实施例中所描述的基于线性印迹和使用碱性磷酸酶活性检测的比色测定的方法)可检测到抗体。

在许多情况下，检测优选是指检测抗体是否存在，任选是指确定抗体的浓度是否超过足以用于诊断的某一阈值，优选通过使用在液体中的ELISA测量所设定的。如果能够检测到一种或多种抗体，优选选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM的抗体，这将是有助于临床医生诊断的信息，并表明患者罹患过敏的可能性增加。在一个优选实施方案中，与可在普通健康受试者中所发现的水平相比，可以确定血清中抗体的相对浓度。同样，如果一种或多种针对鱿鱼抗原(优选鱿鱼MLC1、MLC2和/或TM)的抗体的相对浓度高于一种或多种针对虾过敏原(优选虾MLC1、MLC2和/或 TM)的抗体相对浓度，这可能表明患者更容易罹患鱿鱼过敏而不是虾过敏。在一个优选实施方案中，如本文所使用的术语“检测...存在”是指使用指示目标抗体存在或者比健康受试者存在更多目标抗体的合适复合物检测方法足以检查是否可以检测到足以超过任何背景水平的信号。

在一个优选实施方案中，同时(即在同一时间)检测是否存在选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM 的抗体的两种或更多种抗体。

在一个优选实施方案中，在空间上分开的反应中检测是否存在选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM 的抗体的两种或更多种抗体，更优选在分开的容器中的不同反应混合物中检测。

在一个优选实施方案中，检测到选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM的抗体的两种或更多种抗体。在更优选的实施方案中，这是指不仅检测是否存在这些抗体中的至少一种，而且检测这些抗体中的哪一种存在。换句话说，能够区分这些抗体中的哪一种存在于样品中。

在一个优选实施方案中，本发明提供了试剂或工具或多肽用于检测一种或多种抗体的用途，所述抗体选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM的抗体，或与这样的一种或多种抗体结合的试剂或编码鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或鱿鱼TM或其变体的核酸、或在严格条件下与所述核酸特异性杂交的核酸、或包含所述核酸的载体或细胞用于制备过敏诊断的试剂盒的用途。在一个优选实施方案中，提供了包含所述载体的细胞并在允许核酸表达的条件下培养，然后分离表达产物，其可以是鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或鱿鱼TM或其变体，随后使用表达产物作为在根据本发明的方法或产品中用于特异性捕获抗体的工具。

在另一个优选实施方案中，方法可以用于确认抗体检测测定的可靠性，并且可以涉及在溶液中检测针对鱿鱼过敏原的抗体，该抗体选自针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM 的抗体，所述溶液不是来自患者的样品，但已知包含(优选以已知浓度包含)针对鱿鱼过敏原的抗体。备选地，该溶液可以是不包含抗体的阴性对照以检查背景。这种方法可以与诊断方法同时运行、在诊断方法之后或之前运行。

在一个优选实施方案中，本发明提供了用于分析来自患者的样品以检测一种或多种指示过敏可能性增加的抗体的设备，其中抗体优选选自包括针对鱿鱼MLC1的抗体、针对鱿鱼MLC2的抗体和针对鱿鱼TM抗体的组，更优选所有抗体选自所述组，所述设备包括：

a.载体，其包含当样品与载体接触时用于从样品中捕获至少一种抗体的工具，

b.当可检测工具与载体接触时，能够结合至通过载体所捕获的抗体的可检测工具，特别地，可检测工具是能够结合至在载体上捕获的抗体的经标记的二抗，

c.任选地，优选通过洗涤从载体和可检测工具中除去任何样品的工具；

d.检测装置，其用于检测可检测工具的存在并将结果转换成电信号，以及

e.任选地，用于从检测装置接收电子信号并通过与在背景中检测到的信号水平或从健康受试者样品所获得的输入参考值进行比较，确定该信号的水平是否指示鱿鱼过敏的可能性增加，特别是鱿鱼过敏比虾过敏的可能性更高。

本发明提供了药物组合物(优选疫苗)，其包含一种或多种选自鱿鱼MLC1、鱿鱼MLC2和鱿鱼TM或其变体的抗原，任选地与一种或多种其他海鲜抗原组合，该组合物优选适于向受试者施用，优选哺乳动物受试者，更优选向人施用。这种药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、通过滴眼液、经直肠、经鼻、含服、阴道或通过植入的储库施用，其中如本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。药物组合物可以以合适剂型提供，例如胶囊、片剂、水性混悬剂和溶液，优选以无菌形式提供。它可用于治疗疾病、优选治疗过敏的方法中，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。可使用抗原的低过敏性变体。本领域技术人员熟悉用于产生已知过敏原的低过敏性变体的方法。药物组合物可以是例如基于PBS的灭菌液体溶液，其可用于注射。现有技术中描述了这种药物组合物和变体的产生，例如在Curin等人(2018) Next-Generation ofAllergen-Specific Immunotherapies:Molecular Approaches,Curr.Allergy andAsthma Rep.18,39(2018). https://doi.org/10.1007/s11882-018-0790-x或者在Valenta和Coffman的 Vaccines against Allergies，Springer 2011中。

根据本发明，可以提供与包括鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体的多肽特异性结合的抗体，该抗体优选是分离的。这种抗体不仅可以用作阳性对照物或校准物，而且可以用于各种测定形式，例如用于抗体测试的竞争性测定或者夹心法测定，其中检测到了包括待检测抗体、包含鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体的多肽以及与包含鱿鱼MLC1或鱿鱼 MLC2的多肽特异性结合的抗体的复合物。更优选地，所提供的抗体是针对选自以下组的序列的抗体：ALRNAFSMFD(SEQ ID NO:30)、更优选NAFSMF(SEQ ID NO:31)、FIPEDYLKDL(SEQ ID NO:42)、更优选IPEDYLKDL(SEQ ID NO:43)和FSKEEIKNVWKD(SEQ ID NO:51)。更优选地，抗体是针对来自MLC2的表位的抗体，所述表位包括选自以下组的序列：ALRNAFSMFD(SEQ ID NO:30)、更优选 NAFSMF(SEQ ID NO:31)、FIPEDYLKDL(SEQ ID NO:42)、更优选IPEDYLKDL(SEQ ID NO:43)和FSKEEIKNVWKD(SEQ ID NO: 51)。备选地，抗体可以是与MLC2上的结合位点结合的抗体，而不与包括选自以下组的序列的表位或选自以下组的序列结合：ALRNAFSMFD (SEQ IDNO:30)、更优选NAFSMF(SEQ ID NO:31)、FIPEDYLKDL (SEQ ID NO:42)、更优选IPEDYLKDL(SEQ ID NO:43)和FSKEEIKNVWKD(SEQ ID NO:51)，例如用于固定包括MLC2或其变体的多肽以进行竞争性测定。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是选自包括小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、山羊、灵长类或马的组的动物的抗体。这些测定和其他测定描述于David Wild的The Immunoassay Handbook,第3版,Elsevier2005 中，特别是第1章和第2章。

根据本发明，选自鱿鱼MLC1或鱿鱼MLC2或其变体的多肽可用于制备鱿鱼LC1或鱿鱼MLC2或其变体的多克隆抗体。根据本发明，多肽可被注射到能够产生抗体的动物中，优选哺乳动物和鸟类，然后通过常规实验方案回收抗血清。根据本发明的试剂和方法可用于确定抗体(优选IgE或IgG，优选IgG4类抗体)产生的有效性或者免疫接种的有效性或者向患者施用的药物或疫苗或候选药物或疫苗的功效。例如，如果在施用候选药物后所产生的抗体水平降低，则表明该药物是有效的。单克隆抗体和多克隆抗体的生产的这些测定和其他测定描述于David Wild的 The Immunoassay Handbook,第3版,Elsevier 2005中，特别是第8章。

在一个优选实施方案中，根据本发明的产品(例如载体、装置、多肽、抗体、校准物等)可组合使用或在包含稳定剂(例如牛血清白蛋白) 或防腐剂(例如叠氮化物)的组合物中使用。

附图说明

图1描绘了基于示例条的具有各种虾和鱿鱼蛋白质的EUROLINE 测试的布局。

图2显示了如本实施例中所述的经温育的肽芯片的示例。该芯片包括八个小组，绿色规则小组代表对照肽。IgE反应显示为绿色，IgG4反应显示为红色。

图3显示了如实施例2中所讨论的针对基于SEQ ID NO:10的肽的四名过敏和两名耐受患者血清中的抗体反应性检测。Y轴显示C分数，以及X轴显示分开的肽。黑线显示临界值，绿色柱代表IGE反应性，红色柱代表IgG4反应性。

图4显示了针对基于SEQ ID NO:10的重叠肽的IgE和IgG4血清反应的热图。

序列：

本发明包括一系列新的核酸和多肽序列，更具体为：

SEQ ID NO:1:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Tod p MLC1的核酸序列

ATGAGCCATCATCATCATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTT TCAGGGTCCATCCATGTCTCAACTGACCAAAGACGAAATTGAG GAAGTCCGTGAAGTGTTTGACCTCTTCGACTTTTGGGATGGTC GTGATGGTGATGTTGACGCTGCGAAAGTTGGCGATCTGTTACG CTGTTTAGGGATGAATCCAACCGAAGCTCAGGTACACCAACATGGAGGCACGAAGAAAATGGGCGAGAAAGCGTATAAACTGGAA GAGATTCTGCCGATTTATGAGGAAATGAGCTCCAAAGATACTG GCACAGCAGCGGACGAATTCATGGAAGCCTTCAAAACGTTTGA TCGTGAAGGTCAGGGTTTGATCAGTTCAGCCGAAATTCGGAAT GTGCTGAAAATGCTTGGCGAACGCATTACCGAGGATCAGTGCA ACGATATCTTCACCTTTTGCGACATTCGCGAAGATATCGATGG GAACATCAAATACGAGGATCTGATGAAGAAGGTGATGGCAGGACCTTTTCCGGACAAATCGGATTAA

SEQ ID NO:2:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Tod p MLC2的核酸序列

ATGAGCCATCATCATCATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTT TCAGGGTCCATCCATGGCGGAAGAAGCTCCTCGTCGCGTGAAA CTGTCACAACGCCAGATGCAGGAGCTGAAAGAAGCGTTTACCA TGATTGATCAGGACCGTGATGGGTTCATTGGCATGGAAGATCT GAAAGACATGTTCAGCTCTTTAGGACGGGTACCACCCGATGACGAACTGAATGCCATGCTGAAAGAATGCCCGGGTCAACTCAATT TCACGGCTTTTCTGACCTTGTTTGGGGAGAAAGTGAGTGGTAC TGACCCGGAAGATGCACTTCGCAATGCCTTTTCGATGTTCGAC GAAGATGGTCAGGGCTTTATCCCGGAAGATTATCTGAAAGACT TGCTGGAAAATATGGGCGATAACTTTTCCAAAGAGGAGATTAA GAACGTCTGGAAAGATGCACCGTTAAAGAACAAACAGTTCAAC TACAACAAGATGGTTGACATCAAAGGCAAAGCGGAGGATGAA GATTAA

SEQ ID NO:3:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Pen a 1.0101(红虾(Penaeus aztecus)原肌球蛋白)的多肽序列

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMDAIKKKMQAMKLEKDNAMDRAD TLEQQNKEANNRAEKSEEEVHNLQKRMQQLENDLDQVQESLLK ANIQLVEKDKALSNAEGEVAALNRRIQLLEEDLERSEERLNTATT KLAEASQAADESERMRKVLENRSLSDEERMDALENQLKEARFLA EEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAETGESKIVELEEELRV VGNNLKSLEVSEEKANQREEAYKEQIKTLTNKLKAAEARAEFAE RSVQKLQKEVDRLEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGY

SEQ ID NO:4:编码Pen a 1.0101(红虾原肌球蛋白)的多肽序列；登录号Q3Y8M6

MDAIKKKMQAMKLEKDNAMDRADTLEQQNKEANNRAEKSEEE VHNLQKRMQQLENDLDQVQESLLKANIQLVEKDKALSNAEGEVA ALNRRIQLLEEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKVLE NRSLSDEERMDALENQLKEARFLAEEADRKYDEVARKLAMVEAD LERAEERAETGESKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKANQREEA YKEQIKTLTNKLKAAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEK EKYKSITDELDQTFSELSGY

SEQ ID NO:5:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Sep l 1.0101(莱氏拟乌贼(Sepioteuthis lessoniana)原肌球蛋白)的多肽序列 MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMDAIKKKMLAMKMEKEVATDKAE QTEQSLRDLEDAKNKIEEDLSTLQKKYANLENDFDNANEQLTAAN TNLEASEKRVAECESEIQGLNRRIQLLEEDLERSEERFSSAQSKLE DASKAADESERGRKVLENRSQGDEERIDLLEKQLEEAKWIAEDAD RKFDEAARKLAITEVDLERAEARLEAAEAKIVELEEELKVVGNNM KSLEISEQEASQREDSYEETIRDLTHRLKEAENRAAEAERTVSKLQ KEVDRLEDELLAEKERYKTISDELDQTFAELAGY

SEQ ID NO:6:编码Sep l 1.0101(莱氏拟乌贼原肌球蛋白)的多肽序列 MDAIKKKMLAMKMEKEVATDKAEQTEQSLRDLEDAKNKIEEDL STLQKKYANLENDFDNANEQLTAANTNLEASEKRVAECESEIQGL NRRIQLLEEDLERSEERFSSAQSKLEDASKAADESERGRKVLENRS QGDEERIDLLEKQLEEAKWIAEDADRKFDEAARKLAITEVDLERA EARLEAAEAKIVELEEELKVVGNNMKSLEISEQEASQREDSYEETI RDLTHRLKEAENRAAEAERTVSKLQKEVDRLEDELLAEKERYKT ISDELDQTFAELAGY

SEQ ID NO:7:编码Lit v 3.0101(凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 肌球蛋白轻链2)的多肽序列[带His标签的版本为SEQ ID NO:17] MSRKSGSRSSSKRSKKSGGGSNVFDMFTQRQVAEFKEGFQLMDR DKDGVIGKTDLRGTFDEIGRIATDQELDEMLADAPAPINFTMLLN MFAERQTGESDDDDVVAKAFLAFADEEGNIDCDTFRHALMTWG DKFSSQEADDALDQMDIDDGGKIDVQGVIQMLTAGGGDDAAAEEA

SEQ ID NO:8:编码太平洋褶鱿鱼(Todarodes pacificus)Tod p MLC1 (肌球蛋白轻链1)的多肽序列；源自登录号P05945

SQLTKDEIEEVREVFDLFDFWDGRDGDVDAAKVGDLLRCLGMNP TEAQVHQHGGTKKMGEKAYKLEEILPIYEEMSSKDTGTAADEFM EAFKTFDREGQGLISSAEIRNVLKMLGERITEDQCNDIFTFCDIREDIDGNIKYEDLMKKVMAGPFPDKSD

SEQ ID NO:9:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Tod p MLC1(太平洋褶鱿鱼肌球蛋白轻链1)的多肽序列

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMSQLTKDEIEEVREVFDLFDFWDGR DGDVDAAKVGDLLRCLGMNPTEAQVHQHGGTKKMGEKAYKLE EILPIYEEMSSKDTGTAADEFMEAFKTFDREGQGLISSAEIRNVLK MLGERITEDQCNDIFTFCDIREDIDGNIKYEDLMKKVMAGPFPDK SD

SEQ ID NO:10:编码Tod p MLC2(太平洋褶鱿鱼肌球蛋白轻链2)的多肽序列

AEEAPRRVKLSQRQMQELKEAFTMIDQDRDGFIGMEDLKDMFSS LGRVPPDDELNAMLKECPGQLNFTAFLTLFGEKVSGTDPEDALR NAFSMFDEDGQGFIPEDYLKDLLENMGDNFSKEEIKNVWKDAPLKNKQFNYNKMVDIKGKAEDED

SEQ ID NO:11:编码如实施例中所使用的带有N-末端His标签的Tod p MLC2(太平洋褶鱿鱼肌球蛋白轻链2)的多肽序列

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMAEEAPRRVKLSQRQMQELKEAFT MIDQDRDGFIGMEDLKDMFSSLGRVPPDDELNAMLKECPGQLNF TAFLTLFGEKVSGTDPEDALRNAFSMFDEDGQGFIPEDYLKDLLE NMGDNFSKEEIKNVWKDAPLKNKQFNYNKMVDIKGKAEDED SEQ ID NO:12:包含编码Lit v 3.0101(肌球蛋白轻链2)的序列的载体 pET24d-Lit v3.0101-(PSc)-His的核酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTCTCGCAAAAGTG GCTCACGTTCCAGCTCCAAACGCAGCAAGAAATCGGGTGGTG GCTCGAATGTCTTTGACATGTTCACGCAACGCCAAGTTGCGGA GTTCAAAGAAGGGTTTCAGCTGATGGATCGCGACAAAGATGG GGTGATTGGCAAAACCGATCTGCGTGGTACCTTTGACGAGATT GGCCGCATTGCGACCGATCAGGAACTGGATGAGATGCTTGCA GATGCCCCAGCACCGATCAATTTCACGATGCTCCTGAACATGT TTGCGGAACGTCAGACTGGCGAATCTGACGACGATGACGTGG TTGCCAAAGCGTTCTTAGCCTTTGCCGATGAAGAGGGAAACAT CGATTGCGATACCTTTCGGCATGCTCTGATGACTTGGGGCGAC AAGTTCAGCAGTCAAGAAGCGGATGATGCCTTGGATCAGATGGACATTGATGACGGCGGGAAAATCGACGTACAGGGTGTGATTCA GATGCTGACAGCTGGTGGAGGTGATGATGCAGCAGCGGAAGA AGCTCTCGAGGTCCTGTTCCAAGGACCCCACCACCATCACCAT CACTGATCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGC TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCT GAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCT TGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGC GAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGT GTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCC CTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCAC GTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCT TTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAA AACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTG ATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTA TCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCG GCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACG CGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACT TTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAA AACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAG GATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAA GGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCT GGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACC TATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAAT CACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTT ATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGC TCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCG TGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAA GGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAAC ACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATT CTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGT GAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATG GTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTC AGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGA TTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATA CCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTA GAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTG TATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAA AATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCC GTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGC GCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGC GGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCG AAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCC TTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGT AGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTG GCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACT CAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAA CGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCT ACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGC CACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG CGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGG GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCAC CTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGC GGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTT CCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTT TCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGT GCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCA GTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGC CCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTC CGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAA CGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGA AGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGT TGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCG GGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCC TCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGA TGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGA ACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCG GTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAA TGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTA GCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCA GGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAA CCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGC AGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATT CTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTC AACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATG CCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGG GACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGA ATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAA AGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCT GTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGC GACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGG GTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAA TGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAT CGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCA GGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATT GCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTC CACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTG GTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGT ATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTC GGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCA ACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCA TGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCG TTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGC CAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGG CCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGAT GCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAAT ACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGT CATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGC GAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTT CGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGG CGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCA GGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTT TGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAA ACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAA GAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTT TCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCA TGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGG ATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAG CCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCC ACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATG AGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCG GCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATG CCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA

SEQ ID NO:13:包含编码Pen a 1.0101的序列的载体 pET24d-N-(PSc)-Pen_a1.0101的核酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCCATCATCATC ATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCATCCAT GGATGCCATCAAGAAGAAGATGCAGGCCATGAAACTGGAGAA AGACAACGCCATGGATCGTGCGGATACACTGGAACAGCAGAA CAAAGAAGCGAATAATCGTGCGGAAAAGTCTGAAGAAGAAGT GCATAATCTGCAGAAACGCATGCAACAGTTGGAAAACGATCTG GATCAAGTGCAGGAAAGTCTCCTGAAAGCGAACATTCAGCTGG TAGAGAAAGACAAAGCGCTTTCGAATGCAGAAGGCGAAGTTG CCGCCTTGAATCGTCGCATTCAACTGTTGGAAGAAGATCTGGA ACGCTCAGAAGAGCGGTTAAATACCGCCACCACCAAATTAGCT GAAGCAAGCCAAGCAGCCGACGAATCTGAACGTATGCGCAAA GTGCTGGAGAATCGCTCACTCTCGGATGAAGAACGCATGGAC GCGTTAGAGAACCAGCTGAAAGAGGCTCGTTTTCTCGCGGAG GAAGCTGACCGGAAATACGATGAAGTGGCGCGCAAACTGGCC ATGGTTGAGGCCGACCTTGAGCGCGCTGAAGAACGCGCAGAG ACTGGTGAGAGCAAAATCGTAGAACTGGAAGAGGAGTTACGT GTCGTTGGCAATAACCTGAAATCCCTGGAAGTTTCCGAGGAGA AAGCTAACCAGCGCGAAGAAGCGTATAAAGAACAGATCAAGA CTCTGACGAACAAACTGAAAGCGGCAGAGGCACGTGCGGAAT TTGCAGAACGTAGCGTGCAAAAGCTGCAGAAAGAAGTCGATC GCTTGGAAGATGAACTGGTCAACGAGAAAGAAAAGTACAAATC GATTACCGATGAACTCGACCAAACGTTCAGCGAACTTAGTGGG TATTAATCGAGTAAGTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGA TCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCT GCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTA AACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATC CGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC GCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTT GCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCT TTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCG GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTC GACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTC CACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACA CTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTT GCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAA AAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTC AGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT TTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTA ATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTT ATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTT TCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGAT GGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACA TCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAAT GGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCC AGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACC GTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGA TCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACC GGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGA ATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGG ATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAA AATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTT TAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTT TGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATA CAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGA GCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAA TCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATA ACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGT TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC GTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCT TTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCAC CGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCA AATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCA AGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCT GTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACC GGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAG CGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTAT GAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGT ATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGG AGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGG GTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCG TCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCC TTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCG CCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGA GCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGAT GCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGC ATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATA GTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCA TGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCT GACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGT GACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCA TCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCG TGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGT CCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCT GATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAA TGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTAC TGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAA CAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACT CAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTC CACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACA TAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCA GACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCG GTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAG CCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGG GGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGT TTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGC AAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTG CCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCAT AAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGA GCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCC CGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCA ACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAG CAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGT TTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGG TATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAG CCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTG ATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTC AGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGT CGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAG ATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGA ACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAAT GCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGG AGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAG AAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATG GCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGA CGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTC GACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCC AGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACG GCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCA ACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAAT GTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTT TCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGG TCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGT TACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGG CGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGG TGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCG CCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTC CCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAG CGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGT GATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCC GGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGAT CTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA

SEQ ID NO:14:包含编码Sep l1.0101的序列的载体 pET24d-N-(PSc)-Sepl1.0101的核酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCCATCATCATC ATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCATCCAT GGATGCCATCAAGAAGAAAATGCTGGCTATGAAAATGGAGAAA GAGGTTGCAACCGACAAAGCGGAGCAAACCGAACAGTCACTG CGTGATCTGGAAGATGCGAAGAACAAAATCGAAGAAGATCTGA GCACATTGCAGAAGAAATATGCCAACCTCGAAAACGATTTCGA CAATGCGAATGAACAGCTGACTGCAGCGAACACGAACTTAGAA GCGTCCGAGAAACGTGTCGCAGAATGCGAATCGGAGATTCAA GGCCTTAATCGGCGCATTCAGCTGCTTGAAGAGGACTTAGAGC GTAGTGAAGAACGCTTTTCTAGCGCTCAGAGCAAACTGGAAGA TGCCTCGAAAGCCGCTGATGAATCCGAACGTGGTCGCAAAGTGCTGGAGAATCGCAGTCAAGGGGACGAAGAACGCATTGATCTG CTCGAGAAACAGTTGGAAGAAGCGAAATGGATTGCCGAAGAT GCGGATCGCAAATTCGACGAAGCTGCGCGTAAACTGGCCATTA CCGAAGTCGATCTCGAACGTGCGGAAGCACGTTTGGAAGCAG CTGAGGCGAAAATCGTGGAACTGGAGGAGGAACTGAAAGTAG TTGGCAACAACATGAAATCGCTGGAAATCTCAGAGCAGGAAGC TTCTCAACGTGAGGACAGCTATGAGGAAACCATTCGCGATCTTACTCATCGCCTGAAAGAGGCCGAAAATCGGGCAGCAGAAGCC GAACGCACAGTGTCCAAACTGCAGAAAGAGGTTGATCGCTTAG AGGACGAACTGCTGGCCGAAAAGGAACGCTACAAGACCATCA GTGACGAATTGGATCAGACGTTTGCGGAATTAGCGGGTTATTA ATGATCGAGTAAGTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATC CGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCC GGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCG CGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG CCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGG GGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGA CCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCA TCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCA CGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACT CAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGC CGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAA ATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAG GTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTT ATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAAT TCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATT CATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCT GTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGG CAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATC AATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAA GTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATG GCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCA GCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCG TTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGAT CGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCG GCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAA TCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGA TCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAA ATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTT AGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTT GCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATAC AATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAAT CGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAA CACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTT CATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCG TCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTT TTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACC GCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACT CTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAA ATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTG TTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCG GGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGT CGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGC GAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTA TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGG TTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGT CAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCT TTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC TTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGA GCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGAT GCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGC ATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATA GTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCT GACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGT GACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCA TCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCG TGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGT CCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCT GATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAA TGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTAC TGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAA CAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACT CAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTC CACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACA TAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCA GACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCG GTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAG CCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGG GGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGT TTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGC AAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTG CCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCAT AAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGA GCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCC CGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCA ACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAG CAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGT TTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGG TATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAG CCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTG ATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTC AGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGT CGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAG ATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGA ACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAAT GCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGG AGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAG AAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATG GCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGA CGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTC GACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCC AGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACG GCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCA ACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAAT GTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTT TCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGG TCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGT TACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGG CGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGG TGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCG CCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTC CCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAG CGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGT GATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCC GGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGAT CTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA

SEQ ID NO:15:包含编码Tod p MLC1(轻链1)的序列的载体 pET24d-N-(PSc)-Todp MLC1的核酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCCATCATCATC ATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCATCCAT GTCTCAACTGACCAAAGACGAAATTGAGGAAGTCCGTGAAGTG TTTGACCTCTTCGACTTTTGGGATGGTCGTGATGGTGATGTTGACGCTGCGAAAGTTGGCGATCTGTTACGCTGTTTAGGGATGAA TCCAACCGAAGCTCAGGTACACCAACATGGAGGCACGAAGAA AATGGGCGAGAAAGCGTATAAACTGGAAGAGATTCTGCCGATT TATGAGGAAATGAGCTCCAAAGATACTGGCACAGCAGCGGAC GAATTCATGGAAGCCTTCAAAACGTTTGATCGTGAAGGTCAGG GTTTGATCAGTTCAGCCGAAATTCGGAATGTGCTGAAAATGCT TGGCGAACGCATTACCGAGGATCAGTGCAACGATATCTTCACCTTTTGCGACATTCGCGAAGATATCGATGGGAACATCAAATACG AGGATCTGATGAAGAAGGTGATGGCAGGACCTTTTCCGGACAA ATCGGATTAATGATCGAGTAAGTCGAGCACCACCACCACCACC ACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTT GGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGG GCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAA CTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGC ATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGC TACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTC CCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTC TAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACG GCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGT AGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGT TGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGG AACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAG GGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGAT TTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTA CAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCC TATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACT GCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAA AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCC ATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCG TCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAA GGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGG TGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAA CAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAAC CAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAAT ACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAAT GCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTC ACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTAC GGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAG CCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACG CTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCT TCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATT ATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTG GAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATAT GGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAG TTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTC CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTT GAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAG CTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGC AGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCA CCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTG CTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGT GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGC GCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAG CTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGT GAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG GACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGC ACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTC CTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTG ATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAA CGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCT CACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGA ACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAG CGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTT CACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT GCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGA CTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGA CGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTT CACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCT CATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTC ATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTC TGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCT GTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCAT GGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGT GAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGA AAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATG TAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGAT CCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGA CTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTC AGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTC GCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGC CAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGC ACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCG CCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCG AGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATC ATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCC AGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAA GACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCA CCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGG TCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATT GCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGT GCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCG GTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTG AGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGA GAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCG AAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAG CTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCAC CAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCA GCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGAT GCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATG GCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGAT TGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCG CCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTG GTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCG TCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAG AGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTC CACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATC AGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTT TACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCAC GCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACA ATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACG CCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGC GGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACG CGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACAT CGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTC TCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCC ATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACT CCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGA GCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGC CCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGC CGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTT CCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCAC CTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGA GGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA

SEQ ID NO:16:包含编码Tod p MLC2(轻链2)的序列的源自pET24d 的载体pET24d-N-(PSc)-Tod p MLC2的核酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCCATCATCATC ATCATCATCATCATTTGGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCATCCAT GGCGGAAGAAGCTCCTCGTCGCGTGAAACTGTCACAACGCCA GATGCAGGAGCTGAAAGAAGCGTTTACCATGATTGATCAGGAC CGTGATGGGTTCATTGGCATGGAAGATCTGAAAGACATGTTCA GCTCTTTAGGACGGGTACCACCCGATGACGAACTGAATGCCAT GCTGAAAGAATGCCCGGGTCAACTCAATTTCACGGCTTTTCTG ACCTTGTTTGGGGAGAAAGTGAGTGGTACTGACCCGGAAGAT GCACTTCGCAATGCCTTTTCGATGTTCGACGAAGATGGTCAGG GCTTTATCCCGGAAGATTATCTGAAAGACTTGCTGGAAAATAT GGGCGATAACTTTTCCAAAGAGGAGATTAAGAACGTCTGGAAAGATGCACCGTTAAAGAACAAACAGTTCAACTACAACAAGATGG TTGACATCAAAGGCAAAGCGGAGGATGAAGATTAATGATCGAG TAAGTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTA ACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTG AGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTT GAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCG AATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCT AGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGT TCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTT AGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAA CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGAT AGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAA TAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATC TCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCG AATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTT TCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAA ATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGG ATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAG GAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTG GTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCT ATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAAT CACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTT ATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGC TCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCG TGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAA GGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAAC ACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATT CTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGT GAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATG GTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTC AGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGA TTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATA CCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTA GAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAA AATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCC GTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGC GCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGC GGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCG AAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCC TTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGT AGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTG GCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACT CAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAA CGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCT ACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGC CACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG CGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGG GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCAC CTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGC GGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTT CCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGT TATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTT TCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGT GCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCA GTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGC CCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTC CGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAA CGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGA AGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGT TGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCG GGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCC TCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGA TGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCG GTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAA TGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTA GCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCA GGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAA CCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGC AGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATT CTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTC AACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATG CCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGG GACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGA ATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAA AGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCT GTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGC GACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGG GTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAA TGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAT CGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCA GGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATT GCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTC CACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTG GTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGT ATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTC GGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCA ACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCA TGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCG TTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGC CAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGG CCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGAT GCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAAT ACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCC GGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGT CATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGC GAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTT CGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGG CGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCA GGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTT TGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAG CTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAA GAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTT TCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCA TGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGG ATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAG CCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGG AATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATG AGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCG GCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATG CCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATC CCGCGAAATTAATACGACTCACTATA

SEQ ID NO:17:编码如实施例中所使用的带有C-末端His标签的Lit v 3.0101(凡纳滨对虾肌球蛋白轻链2)的多肽序列

MSRKSGSRSSSKRSKKSGGGSNVFDMFTQRQVAEFKEGFQLMDR DKDGVIGKTDLRGTFDEIGRIATDQELDEMLADAPAPINFTMLLN MFAERQTGESDDDDVVAKAFLAFADEEGNIDCDTFRHALMTWG DKFSSQEADDALDQMDIDDGGKIDVQGVIQMLTAGGGDDAAAEE ALEVLFQGPHHHHHH

SEQ ID NO:18:Tod MLC1的表位序列

GGTKKMGE

SEQ ID NO:19:Tod MLC1的表位序列

SSKDTGTA

SEQ ID NO:20:Tod MLC1的表位序列

DREGQ

SEQ ID NO:21:Tod MLC1的表位序列

GGTKKMGEKAYKLEEILPIYEEMSSKDTGTAADEFMEAFKTFDR EGQ

SEQ ID NO:22:Tod MLC2的表位序列

QGPSMA

SEQ ID NO:23:Tod MLC2的表位序列

KVSGTDPE

SEQ ID NO:24:Tod MLC2的表位序列

DREGQ

SEQ ID NO:25:Tod MLC2的表位序列

QELKEAFTMIDQDRDGFIGMEDLKDMFSSLGRVPPDDELNAMLK ECPGQLNFT

SEQ ID NO:26:Tod TM的表位序列

DESERGRKVLENRSQGDEER

SEQ ID NO:27:Tod TM的表位序列

IDLLEKQLEEAKWIAEDADR

SEQ ID NO:28:Tod TM的表位序列

KFDEAARKLAITEVDLERAEARLE

SEQ ID NO:29:Tod TM的表位序列

KEVDRLEDELLAEKERYKTISDELDQTFAELAGY

SEQ ID NO:30:MLC2的表位序列1

ALRNAFSMFD

SEQ ID NO:31:MLC2的更短表位序列1

NAFSMF

SEQ ID NO:32:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽1

GTDPEDALRNAFSMF

SEQ ID NO:33:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽2

TDPEDALRNAFSMFD

SEQ ID NO:34:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽3

DPEDALRNAFSMFDE

SEQ ID NO:35:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽4

PEDALRNAFSMFDED

SEQ ID NO:36:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽5

EDALRNAFSMFDEDG

SEQ ID NO:37:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽6

DALRNAFSMFDEDGQ

SEQ ID NO:38:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽7

ALRNAFSMFDEDGQG

SEQ ID NO:39:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽8

LRNAFSMFDEDGQGF

SEQ ID NO:40:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽9

RNAFSMFDEDGQGFI

SEQ ID NO:41:用于识别MLC2表位序列1的微阵列肽20

NAFSMFDEDGQGFIP

SEQ ID NO:42:MLC2的表位序列2

FIPEDYLKDL

SEQ ID NO:43:MLC2的更短表位序列2

IPEDYLKDL

SEQ ID NO:44:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽1

EDGQGFIPEDYLKDL

SEQ ID NO:45:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽2

DGQGFIPEDYLKDLL

SEQ ID NO:46:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽3

GQGFIPEDYLKDLLE

SEQ ID NO:47:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽4

QGFIPEDYLKDLLEN

SEQ ID NO:48:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽5

GFIPEDYLKDLLENM

SEQ ID NO:49:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽6

FIPEDYLKDLLENMG

SEQ ID NO:50:用于识别MLC2表位序列2的微阵列肽7

IPEDYLKDLLENMGD

SEQ ID NO:51:MLC2的表位序列3

FSKEEIKNVWKD

SEQ ID NO:52:用于识别MLC2表位序列3的微阵列肽1

GDNFSKEEIKNVWKD

SEQ ID NO:53:用于识别MLC2表位序列3的微阵列肽1

DNFSKEEIKNVWKDA

SEQ ID NO:54:用于识别MLC2表位序列3的微阵列肽2

NFSKEEIKNVWKDAP

SEQ ID NO:55:用于识别MLC2表位序列3的微阵列肽3

FSKEEIKNVWKDAPL

SEQ ID NO:56:微阵列肽NO 8:

GSGSGSGAEEAPRRV

SEQ ID NO:57:微阵列肽NO 9:

SGSGSGAEEAPRRVK

SEQ ID NO:58:微阵列肽NO 10:

GSGSGAEEAPRRVKL

SEQ ID NO:59:微阵列肽NO 11:

SGSGAEEAPRRVKLS

SEQ ID NO:60:微阵列肽NO 12:

GSGAEEAPRRVKLSQ

SEQ ID NO:61:微阵列肽NO 13:

SGAEEAPRRVKLSQR

SEQ ID NO:62:微阵列肽NO 14:

GAEEAPRRVKLSQRQ

SEQ ID NO:63:微阵列肽NO 15:

AEEAPRRVKLSQRQM

SEQ ID NO:64:微阵列肽NO 16:

EEAPRRVKLSQRQMQ

SEQ ID NO:65:微阵列肽NO 17:

EAPRRVKLSQRQMQE

SEQ ID NO:66:微阵列肽NO 18:

APRRVKLSQRQMQEL

SEQ ID NO:67:微阵列肽NO 19:

PRRVKLSQRQMQELK

SEQ ID NO:68:微阵列肽NO 20:

RRVKLSQRQMQELKE

SEQ ID NO:69:微阵列肽NO 21:

RVKLSQRQMQELKEA

SEQ ID NO:70:微阵列肽NO 22:

VKLSQRQMQELKEAF

SEQ ID NO:71:微阵列肽NO 23:

KLSQRQMQELKEAFT

SEQ ID NO:72:微阵列肽NO 24:

LSQRQMQELKEAFTM

SEQ ID NO:73:微阵列肽NO 25:

SQRQMQELKEAFTMI

SEQ ID NO:74:微阵列肽NO 26:

QRQMQELKEAFTMID

SEQ ID NO:75:微阵列肽NO 27:

RQMQELKEAFTMIDQ

SEQ ID NO:76:微阵列肽NO 28:

QMQELKEAFTMIDQD

SEQ ID NO:77:微阵列肽NO 29:

MQELKEAFTMIDQDR

SEQ ID NO:78:微阵列肽NO 30:

QELKEAFTMIDQDRD

SEQ ID NO:79:微阵列肽NO 31:

ELKEAFTMIDQDRDG

SEQ ID NO:80:微阵列肽NO 32:

LKEAFTMIDQDRDGF

SEQ ID NO:81:微阵列肽NO 33:

KEAFTMIDQDRDGFI

SEQ ID NO:82:微阵列肽NO 34:

EAFTMIDQDRDGFIG

SEQ ID NO:83:微阵列肽NO 35:

AFTMIDQDRDGFIGM

SEQ ID NO:84:微阵列肽NO 36:

FTMIDQDRDGFIGME

SEQ ID NO:85:微阵列肽NO 37:

TMIDQDRDGFIGMED

SEQ ID NO:86:微阵列肽NO 38:

MIDQDRDGFIGMEDL

SEQ ID NO:87:微阵列肽NO 39:

IDQDRDGFIGMEDLK

SEQ ID NO:88:微阵列肽NO 40:

DQDRDGFIGMEDLKD

SEQ ID NO:89:微阵列肽NO 41:

QDRDGFIGMEDLKDM

SEQ ID NO:90:微阵列肽NO 42:

DRDGFIGMEDLKDMF

SEQ ID NO:91:微阵列肽NO 43:

RDGFIGMEDLKDMFS

SEQ ID NO:92:微阵列肽NO 44:

DGFIGMEDLKDMFSS

SEQ ID NO:93:微阵列肽NO 45:

GFIGMEDLKDMFSSL

SEQ ID NO:94:微阵列肽NO 46:

FIGMEDLKDMFSSLG

SEQ ID NO:95:微阵列肽NO 47:

IGMEDLKDMFSSLGR

SEQ ID NO:96:微阵列肽NO 48:

GMEDLKDMFSSLGRV

SEQ ID NO:97:微阵列肽NO 49:

MEDLKDMFSSLGRVP

SEQ ID NO:98:微阵列肽NO 50:

EDLKDMFSSLGRVPP

SEQ ID NO:99:微阵列肽NO 51:

DLKDMFSSLGRVPPD

SEQ ID NO:100:微阵列肽NO 52:

LKDMFSSLGRVPPDD

SEQ ID NO:101:微阵列肽NO 53:

KDMFSSLGRVPPDDE

SEQ ID NO:102:微阵列肽NO 54:

DMFSSLGRVPPDDEL

SEQ ID NO:103:微阵列肽NO 55:

MFSSLGRVPPDDELN

SEQ ID NO:104:微阵列肽NO 56:

FSSLGRVPPDDELNA

SEQ ID NO:105:微阵列肽NO 57:

SSLGRVPPDDELNAM

SEQ ID NO:106:微阵列肽NO 58:

SLGRVPPDDELNAML

SEQ ID NO:107:微阵列肽NO 59:

LGRVPPDDELNAMLK

SEQ ID NO:108:微阵列肽NO 60:

GRVPPDDELNAMLKE

SEQ ID NO:109:微阵列肽NO 61:

RVPPDDELNAMLKEC

SEQ ID NO:110:微阵列肽NO 62:

VPPDDELNAMLKECP

SEQ ID NO:111:微阵列肽NO 63:

PPDDELNAMLKECPG

SEQ ID NO:112:微阵列肽NO 64:

PDDELNAMLKECPGQ

SEQ ID NO:113:微阵列肽NO 65:

DDELNAMLKECPGQL

SEQ ID NO:114:微阵列肽NO 66:

DELNAMLKECPGQLN

SEQ ID NO:115:微阵列肽NO 67:

ELNAMLKECPGQLNF

SEQ ID NO:116:微阵列肽NO 68:

LNAMLKECPGQLNFT

SEQ ID NO:117:微阵列肽NO 69:

NAMLKECPGQLNFTA

SEQ ID NO:118:微阵列肽NO 70:

AMLKECPGQLNFTAF

SEQ ID NO:119:微阵列肽NO 71:

MLKECPGQLNFTAFL

SEQ ID NO:120:微阵列肽NO 72:

LKECPGQLNFTAFLT

SEQ ID NO:121:微阵列肽NO 73:

KECPGQLNFTAFLTL

SEQ ID NO:122:微阵列肽NO 74:

ECPGQLNFTAFLTLF

SEQ ID NO:123:微阵列肽NO 75:

CPGQLNFTAFLTLFG

SEQ ID NO:124:微阵列肽NO 76:

PGQLNFTAFLTLFGE

SEQ ID NO:125:微阵列肽NO 77:

GQLNFTAFLTLFGEK

SEQ ID NO:126:微阵列肽NO 78:

QLNFTAFLTLFGEKV

SEQ ID NO:127:微阵列肽NO 79:

LNFTAFLTLFGEKVS

SEQ ID NO:128:微阵列肽NO 80:

NFTAFLTLFGEKVSG

SEQ ID NO:129:微阵列肽NO 81:

FTAFLTLFGEKVSGT

SEQ ID NO:130:微阵列肽NO 82:

TAFLTLFGEKVSGTD

SEQ ID NO:131:微阵列肽NO 83:

AFLTLFGEKVSGTDP

SEQ ID NO:132:微阵列肽NO 84:

FLTLFGEKVSGTDPE

SEQ ID NO:133:微阵列肽NO 85:

LTLFGEKVSGTDPED

SEQ ID NO:134:微阵列肽NO 86:

TLFGEKVSGTDPEDA

SEQ ID NO:135:微阵列肽NO 87:

LFGEKVSGTDPEDAL

SEQ ID NO:136:微阵列肽NO 88:

FGEKVSGTDPEDALR

SEQ ID NO:137:微阵列肽NO 89:

GEKVSGTDPEDALRN

SEQ ID NO:138:微阵列肽NO 90:

EKVSGTDPEDALRNA

SEQ ID NO:139:微阵列肽NO 91:

KVSGTDPEDALRNAF

SEQ ID NO:140:微阵列肽NO 92:

VSGTDPEDALRNAFS

SEQ ID NO:141:微阵列肽NO 93:

SGTDPEDALRNAFSM

SEQ ID NO:142:微阵列肽NO 94:

GTDPEDALRNAFSMF

SEQ ID NO:143:微阵列肽NO 95:

TDPEDALRNAFSMFD

SEQ ID NO:144:微阵列肽NO 96:

DPEDALRNAFSMFDE

SEQ ID NO:145:微阵列肽NO 97:

PEDALRNAFSMFDED

SEQ ID NO:146:微阵列肽NO 98:

EDALRNAFSMFDEDG

SEQ ID NO:147:微阵列肽NO 99:

DALRNAFSMFDEDGQ

SEQ ID NO:148:微阵列肽NO 100:

ALRNAFSMFDEDGQG

SEQ ID NO:149:微阵列肽NO 101:

LRNAFSMFDEDGQGF

SEQ ID NO:150:微阵列肽NO 102:

RNAFSMFDEDGQGFI

SEQ ID NO:151:微阵列肽NO 103:

NAFSMFDEDGQGFIP

SEQ ID NO:152:微阵列肽NO 104:

AFSMFDEDGQGFIPE

SEQ ID NO:153:微阵列肽NO 105:

FSMFDEDGQGFIPED

SEQ ID NO:154:微阵列肽NO 106:

SMFDEDGQGFIPEDY

SEQ ID NO:155:微阵列肽NO 107:

MFDEDGQGFIPEDYL

SEQ ID NO:156:微阵列肽NO 108:

FDEDGQGFIPEDYLK

SEQ ID NO:157:微阵列肽NO 109:

DEDGQGFIPEDYLKD

SEQ ID NO:158:微阵列肽NO 110:

EDGQGFIPEDYLKDL

SEQ ID NO:159:微阵列肽NO 111:

DGQGFIPEDYLKDLL

SEQ ID NO:160:微阵列肽NO 112:

GQGFIPEDYLKDLLE

SEQ ID NO:161:微阵列肽NO 113:

QGFIPEDYLKDLLEN

SEQ ID NO:162:微阵列肽NO 114:

GFIPEDYLKDLLENM

SEQ ID NO:163:微阵列肽NO 115:

FIPEDYLKDLLENMG

SEQ ID NO:164:微阵列肽NO 116:

IPEDYLKDLLENMGD

SEQ ID NO:165:微阵列肽NO 117:

PEDYLKDLLENMGDN

SEQ ID NO:166:微阵列肽NO 118:

EDYLKDLLENMGDNF

SEQ ID NO:167:微阵列肽NO 119:

DYLKDLLENMGDNFS

SEQ ID NO:168:微阵列肽NO 120:

YLKDLLENMGDNFSK

SEQ ID NO:169:微阵列肽NO 121:

LKDLLENMGDNFSKE

SEQ ID NO:170:微阵列肽NO 122:

KDLLENMGDNFSKEE

SEQ ID NO:171:微阵列肽NO 123:

DLLENMGDNFSKEEI

SEQ ID NO:172:微阵列肽NO 124:

LLENMGDNFSKEEIK

SEQ ID NO:173:微阵列肽NO 125:

LENMGDNFSKEEIKN

SEQ ID NO:174:微阵列肽NO 126:

ENMGDNFSKEEIKNV

SEQ ID NO:175:微阵列肽NO 127:

NMGDNFSKEEIKNVW

SEQ ID NO:176:微阵列肽NO 128:

MGDNFSKEEIKNVWK

SEQ ID NO:177:微阵列肽NO 129:

GDNFSKEEIKNVWKD

SEQ ID NO:178:微阵列肽NO 130:

DNFSKEEIKNVWKDA

SEQ ID NO:179:微阵列肽NO 131:

NFSKEEIKNVWKDAP

SEQ ID NO:180:微阵列肽NO 132:

FSKEEIKNVWKDAPL

SEQ ID NO:181:微阵列肽NO 133:

SKEEIKNVWKDAPLK

SEQ ID NO:182:微阵列肽NO 134:

KEEIKNVWKDAPLKN

SEQ ID NO:183:微阵列肽NO 135:

EEIKNVWKDAPLKNK

SEQ ID NO:184:微阵列肽NO 136:

EIKNVWKDAPLKNKQ

SEQ ID NO:185:微阵列肽NO 137:

IKNVWKDAPLKNKQF

SEQ ID NO:186:微阵列肽NO 138:

KNVWKDAPLKNKQFN

SEQ ID NO:187:微阵列肽NO 139:

NVWKDAPLKNKQFNY

SEQ ID NO:188:微阵列肽NO 140:

VWKDAPLKNKQFNYN

SEQ ID NO:189:微阵列肽NO 141:

WKDAPLKNKQFNYNK

SEQ ID NO:190:微阵列肽NO 142:

KDAPLKNKQFNYNKM

SEQ ID NO:191:微阵列肽NO 143:

DAPLKNKQFNYNKMV

SEQ ID NO:192:微阵列肽NO 144:

APLKNKQFNYNKMVD

SEQ ID NO:193:微阵列肽NO 145:

PLKNKQFNYNKMVDI

SEQ ID NO:194:微阵列肽NO 146:

LKNKQFNYNKMVDIK

SEQ ID NO:195:微阵列肽NO 147:

KNKQFNYNKMVDIKG

SEQ ID NO:196:微阵列肽NO 148:

NKQFNYNKMVDIKGK

SEQ ID NO:197:微阵列肽NO 149:

KQFNYNKMVDIKGKA

SEQ ID NO:198:微阵列肽NO 150:

QFNYNKMVDIKGKAE

SEQ ID NO:199:微阵列肽NO 151:

FNYNKMVDIKGKAED

SEQ ID NO:200:微阵列肽NO 152:

NYNKMVDIKGKAEDE

SEQ ID NO:201:微阵列肽NO 153:

YNKMVDIKGKAEDED

SEQ ID NO:202:微阵列肽NO 154:

NKMVDIKGKAEDEDG

SEQ ID NO:203:微阵列肽NO 155:

KMVDIKGKAEDEDGS

SEQ ID NO:204:微阵列肽NO 156:

MVDIKGKAEDEDGSG

SEQ ID NO:205:微阵列肽NO 157:

VDIKGKAEDEDGSGS

SEQ ID NO:206:微阵列肽NO 158:

DIKGKAEDEDGSGSG

SEQ ID NO:207:微阵列肽NO 159:

IKGKAEDEDGSGSGS

SEQ ID NO:208:微阵列肽NO 160:

KGKAEDEDGSGSGSG

本发明通过以下非限制性实施例进一步说明，从中可以获得本发明的其他特征、实施方案、方面和优点。

实施例1：评估Tod p MLC1和Tod p MLC2的诊断可靠性

Tod p MLC1和Tod p MLC2的克隆、重组表达和纯化

通过基因合成(Eurofins Genomics GmbH)生成融合到接头和His 标签序列的如上面所示的蛋白质的编码DNA序列，通过聚合酶链反应扩增并使用pBAD/

ThioFusion^TM表达试剂盒(Invitrogen)亚克隆至重组载体pEt24d中。使用所得到的SEQ IDNO:12(包含编码虾 MLC的插入物，Lit v 3.0101)、SEQ ID NO:13(包含编码虾TM的插入物，Pen a 1.0101)、SEQ ID NO:14(包含编码鱿鱼TM的插入物， Sep l1.0101)、SEQ ID NO:15(包含编码鱿鱼MLC1的插入物)和SEQ ID NO:16(包含编码鱿鱼MLC2的插入物)。按照制造商的描述将融合蛋白在大肠杆菌中表达，并通过镍基质上的亲和层析(IMAC)分离。多参数线性印迹(EUROLINE)的制备

通过使用精密点胶机(从Zeta公司商购获得)将所分离的单个融合蛋白SEQ IDNO:3(带His标签的虾TM Pen a 1.0101)、SEQ ID NO:5 (Sep I 1.0101，带His标签的鱿鱼TM)、SEQ ID NO:17(Lit v 3.0101，带His标签的虾MLC2)、SEQ ID NO:9(带His标签的鱿鱼MLC1)和SEQ ID NO:11(带His标签的鱿鱼MLC2)包被到硝化纤维素膜(从Whatman商购获得)上产生EUROLINE线性印迹。按照制造商的说明书中的建议进行封闭和洗涤后，将含有单个蛋白质的膜对齐并切成3mm的条带，从而产生多参数测试。最终布局如图1所示。

使用EUROLINE线性测定评估样品

按照制造商(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck,Germany)的说明书(产品编号：DP 3110-1601E)中的建议，温育EUROLINE条带。详细而言，在洗涤缓冲液中将条带与1ml的1/11 (v/v)稀释的患者样品(25名鱿鱼过敏和42名鱿鱼耐受的患者)在室温下温育16h。弃去患者样品后，每个条带用1ml的洗涤缓冲液将条带洗3次，每次5min，并且随后与1ml的缀合有AP的抗人IgE抗体温育1h。之后，用洗涤缓冲液再次洗涤5次，然后用BCIP/NBT底物温育10min。

使用扫描仪和

程序(EUROIMMUN AG,Lübeck, Germany)进行结果评估。通过使用WHO标准(75/502)的IgE校准曲线，能够实现半定量分析。

统计分析

根据患者的食物激发结果来计算测定表现统计，定义如下：TP：真阳性测试结果的百分比；TN：真阴性测试结果的百分比；FP：假阳性测试结果的百分比；FN：假阴性测试结果的百分比。

结果

将含有各种虾蛋白和鱿鱼蛋白的EUROLINE多参数条带与来自25 名鱿鱼过敏和42名鱿鱼耐受儿童的样品一起温育，以识别是否可能基于对单一过敏原成分的致敏预测鱿鱼过敏。

测定表现统计如表1所示。鱿鱼TM和虾TM均显示高的灵敏性和中等的特异性，产生分别为57％和59％的PPV。由于TM被广泛接受为具有高交叉反应性的节肢动物泛过敏原，因此这一结果并不令人惊讶，并且证实了所进行的测定的合理性。

与此相反，鱿鱼MLC2与虾MLC2相比显示出更高的灵敏性(44％对16％)，具有相似的特异性(86％对95％)，产生PPV(65％对67％) 和NPV(72％对66％)值。总的来说，鱿鱼MLC2显示了测试中所使用的所有蛋白质的最高功效。

尽管MLC1的灵敏性(8％)有限，但其特异性(100％)突出。

总之，所呈现的结果清楚地表明，与目前可用的所有鱿鱼过敏测试系统相比，所要求保护的鱿鱼MLC2为预测鱿鱼过敏提供了诊断益处。

表1：单个蛋白质的测定表现统计。TM：原肌球蛋白；MLC：肌球蛋白轻链；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。

实施例2：Tod pMLC2_V2的比较表位作图

根据Ehlers等人的描述(Ehlers,A.M.,Klinge,M.,Suer,W., Weimann,Y.,Knulst,A.C.,Besa,F.,Le,T.M.,Otten,H.G.(2019)Ara h 7isoforms share many linearepitopes:Are 3D epitopes crucial to elucidate divergent abilities？,Clin ExpAllergy 49(11),1512-1519)，制备并温育包含SEQ ID NO:10代表的十五个氨基酸序列的重叠肽的肽微阵列芯片，选择偏离量为一，测量按一式三份进行。所使用的肽包含SEQ IDNO:56至SEQ ID NO:208。每种肽含有15个氨基酸，偏离量为1。测量按一式三份进行。

患者队列包括十一份来自对鱿鱼过敏的患者的血清和八份来自致敏但耐受患者的样品以及两份来自健康供体的血清。

按照Ehlers等人的描述评估结果，除以下例外：临界值增加到3以增加结果的显著性。如果识别出四个后续肽段，相当于所描述的抗his 标签单克隆抗体3D5的至少四个氨基酸的表位长度，则认为表位已被验证(Lindner,P.,Bauer,K.,Krebber,A.,Nieba,L.,Kremmer,E.,Krebber, C.,Honegger,A.,Klinger,B.,Mocikat,R.,Plückthun,A.(1997)Specific detection of his-tagged proteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phage fusions,Biotechniques 22(1),140-9)。

图4显示了针对基于SEQ ID NO:10的重叠肽的IgE和IgG4血清反应性的热图。

第一栏描述了患者血清的命名。左栏代表所使用的肽。具有至少为三分设定分值的反应被认为是阳性的。如果识别出至少三个后续肽，则认为表位是有效的。绿色信号显示与相应肽的IGG反应性。红色信号显示IGG4反应性。颜色越强，信号就越高。

结果

可显示来自过敏患者的血清和来自耐受患者的血清之间反应性的明显区别。

尽管九份来自耐受患者的血清中有两份与SEQ ID NO:10的n-末端区域代表的肽反应，但可证明过敏患者特异的反应性包含以下序列的肽：ALRNAFSMFD(SEQ ID NO:30)、NAFSMF(SEQ ID NO:31)、 FIPEDYLKDL(SEQ ID NO:42)、IPEDYLKDL(SEQ ID NO:43) 和FSKEEIKNVWKD(SEQ ID NO:51)。

总的来说，能够得出结论，包含序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO:51的表位和包含它们的肽或蛋白质被来自过敏患者的抗体特异性识别。这些表位不被耐受患者的抗体所识别，并且可用来设计与它们结合的抗原或者与它们结合或不与它们结合的抗体作为免疫测定的试剂。