CN108427001A

CN108427001A - 改进的诊断花生过敏的测定法

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Publication number: CN108427001A
Application number: CN201711468054.0A
Authority: CN
Inventors: W·苏尔; S·罗威尔; B·布瑞克斯; A·韦曼
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CA2992044A1; WO2018149927A1; JP2018132525A; US20180231567A1; BR102017026619A2; AU2017279647A1; EP3364193A1; LT3364193T; ES2788389T3; HRP20200585T1; HK1263291A1; US10871493B2; PL3364193T3; CN113777325A; AU2017279647B2; EP3364193B1; KR102228185B1; CN108427001B; KR20180094487A; SI3364193T1

Abstract

本发明涉及诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具；包括在来自受试者的样品中检测针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的存在或不存在的步骤的方法以及包含Ara h 7同种型7.0201或其变体的药物组合物。

Description

改进的诊断花生过敏的测定法

在食物过敏中，与花生(Arachis hypogea)有关的过敏受到最多的研究关注，因为它们比较常见，通常是永久性的，并且通常是严重的。美国的食物过敏反应死亡率登记暗示花生在63例死亡的59％中是触发因素，并且表明青少年和年轻成人的风险最高，另外的风险因素是过敏反应过程中肾上腺素注射的延迟和哮喘。花生是一种无处不在的食物，并且受影响的患者(往往对小剂量有反应)为了避免摄入会面临着无数的障碍，并遭受对生活质量产生的负面影响。

主要在以下两种情况下怀疑花生过敏：当患者表现出严重的过敏反应时或在监测其他食物或空气过敏原的过敏条件的情况下。当通过阳性皮肤点刺测试(SPT)或花生特异性IgE测定(其相对于临床疾病的诊断可靠性目前不足)发现花生致敏时，则将患者送至提供基于双盲安慰剂对照的食物挑战(DBPCFC)的诊断的专业中心。这个程序是食物过敏诊断的金标准，但是它的应用需要住院治疗并且是昂贵的。此外，即使在训练有素的医生的控制下，使用花生的DBPCFC可能会导致严重或甚至威胁生命的反应。

因此，对于基于来自怀疑患有花生过敏的受试者的样品中的特异性抗体的检测来诊断花生过敏的改进的测定法存在极大的兴趣。

现有技术中描述的测定依赖于使用天然或重组过敏原检测主要花生过敏原如Arah 1、Ara h 2、Ara h 3和Ara h 6(Flinterman,A.E.,van Hoffen,E.,den Hartog,JagerC.F.,Koppelman,S.,Pasmans,S.G.,Hoekstra,M.O.,Bruijnzeel-Koomen,C.A.,Knulst,A.C.,Knol,E.F.(2007):Children with peanut allergy recognize predominantlyArah 2and Ara h 6,which remains stable over time,Clin Exp Allergy2007；37；1221-1228；de Leon,M.P.,Drew,A.C.,Glaspole,I.N.,Suphioglu,C.,O’Hehir,R.E.,Rolland,J.M.(2007):IgE cross-reactivity between the major peanut allergen Arah 2and tree nut allergens,Mol Immunol 2007；44:463-471)。

Ara h 2和Ara h 6是蓝豆蛋白(conglutin)类型的2S贮藏蛋白，并且属于醇溶蛋白超家族。该家族的成员的特征在于存在位于形成三个或四个分子内二硫键的约100个氨基酸残基的序列内的六个或八个半胱氨酸残基的保守模式。它们对热处理和蛋白质水解是稳定的。

Ara h 2是花生的一种主要过敏原，并且以具有不同分子量(MW)的两种同种型存在，这是由于具有1,414Da的MW的12个氨基酸的插入引起的。在其一级蛋白序列中，Ara h 6与Ara h 2的同一性为53％，并且与Ara h 2相比，Ara h 6具有10个而不是8个半胱氨酸，但没有N-糖基化位点。像Ara h 2一样，Ara h 6对消化具有抵抗力，并且对加热是稳定的，特别是在烘烤过程中。已阐明了Ara h 6的三级结构，并鉴定了至少四个α螺旋结构和二硫键的位置参数。在生理条件下的消化实验中，Ara h 2和Ara h 6即使在还原条件下也能形成稳定的片段。这支持以下观点：Ara h 2和Ara h 6之间的交叉反应性由IgE反应性构象表位介导(Schmidt,H.,Krause,S.,Gelhaus,C.,Petersen,A.,Janssen,O.,and Becker,W.M.(2010):Detection and structural characterization of natural Ara h 7,the thirdpeanut allergen of the 2S albumin family,J Proteome Res 2010；9:3701–709.)。

Ara h 7是另一种花生过敏原，其同种型Ara h 7.0101最初由噬菌体展示系统鉴定并克隆，但最初在花生提取物中未发现天然对应物，这是其对过敏的影响在现有技术中被描述为低的原因之一。

Schmidt等人(2008,Detection and Structural Characterization of NaturalAra h 7,the Third Peanut Allgergen of the 2S Albumin Family)发现存在另一种同种型(Ara h 7.0201)。Ara h 7.0是在UNIPROT数据库中公布的除7.0101之外的另一种同种型)。然而，Schmidt等人没有提及诊断应用；他们所做的是纯粹的蛋白质组学研究。

更重要的是，Schmidt等人使用的六个患者血清中只有五个(通过Ara h 7.0101反应性进行了预选择)显示与Ara h 7.0201的阳性IgE结合，表明Ara h 7.0201实际上反应性较低并且因此甚至具有比Ara h7.0101更低的诊断价值。因此，据发明人所知，Ara h7.0201直到本发明才被用于常规诊断。

此外，一些研究已经使用纯化的花生蛋白(Ara h 1-3、Ara h 6)评估了一系列免疫学参数，发现临床严重程度与Ara h 2和6在低浓度下的识别和Ara h 1和3在较高浓度下的识别相关，表明Ara h 2的明显增加的效力(Peeters,K.A.,Koppelman,S.J.,vanHoffen,E.,van der Tas,C.W.,den Hartog,Jager C.F.,Penninks,A.H.,Hefle,S.L.,Bruijnzeel-Koomen,C.A.,Knol,E.F.,and Knulst,A.C.(2007):Does skin prick testreactivity to purified allergens correlate with clinical severity of peanutallergy？Clin Exp Allergy.2007Jan；37(1):108-15.)。

对花生过敏原Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6和Ara h 7的IgE抗体反应性也在使用重组过敏原的花生过敏患者中进行了研究。Codreanu等人评价了蛋白在2个大组的花生过敏患者中诊断花生过敏的表现。使用利用ImmunoCAP测试的UniCAP平台进行特异性IgE的测量。他们报道Ara h 2是花生过敏患者最敏感的过敏原，其中77-100％的病例存在可检测的IgE抗体，其次是Ara h 6(38-80％的病例)。相比之下，他们的数据表明没有患者对Ara h 7是单敏感的(Codreanu,F.,Collignon,O.,Roitel,O.,Thouvenot,B.,Sauvage,C.,Vilain,A.C.,Cousin,M.O.,Decoster,A.,Renaudin,JM.,Astier,C.,Monnez,JM.,Vallois,P.,Morisset,M.,Moneret-Vautrin,D.A.,Brulliard,M.,Ogier,V.,Castelain,M.C.,Kanny,G.,Bihain,B.E.,and Jacquenet,S.(2011):A novel immunoassay usingrecombinant allergens simplifies peanut allergy diagnosis,Int Arch AllergyImmunol,2011；154(3):216-26.)。没有患者对Ara h 7单敏感的发现是不使用任何Ara h 7同种型进行常规诊断的另一个原因，因为认为它不增加鉴别花生过敏患者的诊断测试的灵敏度。

目前，许多对花生过敏的患者根据常规测试的结果不能诊断为过敏。丝毫不是鉴于与花生过敏有关的症状的严重程度，对于灵敏度最高的诊断的需求不断增加。

本发明的一个问题是克服与基于针对花生过敏原的抗体的检测的现有技术诊断测定相关的任何缺点。

本发明的另一个问题是提供允许在使用常规测定系统会无法诊断或误诊的患者中诊断过敏的新抗原、新测定法、新试剂和新方法。

本发明的另一个问题是提供用于检测患有坚果过敏、优选花生过敏的患者中的IgE抗体的改进的抗原。

本发明的另一个问题是提供用于诊断坚果过敏，优选花生过敏的替代方法和替代试剂。

本发明的另一个问题是提供方法和试剂，其在用于诊断坚果过敏，优选花生过敏的已知方法和试剂组合使用时，增加整体诊断可靠性，特别是灵敏度。

本发明的另一个问题是提供方法和试剂，其在资源投入(特别是时间和所使用的抗原的数量)最小的情况下，允许以最大的整体诊断可靠性特别是灵敏度诊断坚果过敏，优选花生过敏。

本发明的问题通过所附独立和从属权利要求的主题来解决。

在第一方面，本发明的问题通过诊断上有用的载体来解决，所述载体包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具。

在第一方面的另优选的实施方案中，载体进一步包含用于特异性捕获以下抗体的工具：针对选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9的一种或多种其他抗原的抗体，最优选针对Ara h 2的抗体和/或针对Ara h 6的抗体。

在第一方面的另优选的实施方案中，诊断上有用的载体选自珠子、测试条，微量滴定板，微阵列，衍生自纤维素的固体聚合物，印迹，优选选自蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹，玻璃表面，生物芯片和膜，并且最优选是微量滴定板或线印迹。

第二方面，通过包含诊断上有用的载体的试剂盒解决了本发明的问题，所述诊断上有用的载体包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对抗原Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6的抗体的工具，优选还包含用于特异性捕获针对一种或多种其他抗原，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9的一种或多种其他抗原的抗体，最优选针对Ara h 2的抗体和/或针对Ara h 6的抗体的工具，任选还包含用于特异性检测捕获的抗体的工具。

在第二方面的另优选的实施方案中，诊断上有用的载体进一步包含用于特异性捕获针对选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Arah 9、Ara h 8和Ara h 5的一种或多种其它抗原的抗体的工具，其中用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ IDNO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种其他抗原的抗体的工具在分开的载体上。

在第二方面的优选实施方案中，诊断上有用的载体进一步包含用于特异性捕获针对选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5的一种或多种其它抗原的抗体的工具，其中用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种其他抗原的抗体的工具在一个载体上，优选与一个载体共价连接。

第三方面，本发明的问题通过优选用于诊断或帮助诊断坚果过敏，更优选花生过敏的方法来解决，该方法包括以下步骤：在来自受试者的样品中检测针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的存在的步骤。

在第三方面的优选实施方案中，所述方法进一步包括在来自受试者的样品中检测针对一种或多种其他抗原的抗体的存在，所述抗原优选地选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3和Ara h 9，最优选Ara h 2和/或Ara h 6。

在第三方面的另优选的实施方案中，同时检测针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的存在以及针对一种或多种其他抗原，优选Ara h 2和/或Ara h6的抗体的存在。

在第三方面的另优选的实施方案中，在空间上分离的结合反应中检测针对Ara h7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的存在以及针对一种或多种其他抗原，优选Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的存在。

在第三方面的另一个优选实施方案中，在一锅反应中检测针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的存在以及针对一种或多种其他抗原，优选Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的存在。

在第三方面的另一个优选实施方案中，所述方法包括使根据本发明的诊断上有用的载体与来自受试者的样品接触的步骤。

在任何方面的另一个优选实施方案中，所述受试者患有或怀疑患有过敏，优选对坚果、更优选花生的过敏。

在任何方面的另一个优选实施方案中，针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ IDNO6的抗体是针对Ara h 7同种型7.0201，更优选针对选自SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8具有单特异性的抗体。

第四方面，通过药物组合物解决了本发明的问题，所述药物组合物包含SEQ ID NO8、更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201、或其变体，和优选包含选自Arah 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5及其变体，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3和Ara h 9及其变体，最优选Ara h 2和/或Ara h 6的一种或多种其他抗原。

在第五方面，通过包含含有SEQ ID NO 8、更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201、或其变体的多肽解决了本发明的问题。

在优选的实施方案中，根据本发明的多肽是固定化的、纯化的或融合蛋白，优选是纯化的，更优选是固定化和纯化的，更优选是纯化和重组并固定化的。

在第六方面，通过根据本发明的多肽、载体或试剂盒用于诊断花生过敏的用途来解决所述问题，其中优选灵敏度增加。

在第七方面，通过根据本发明的多肽用于制备用于诊断花生过敏的试剂盒的用途来解决所述问题，其中优选诊断的灵敏度增加。

优选地，包含SEQ ID NO 8、更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201、或其变体的多肽是包含所述多肽和Ara h 2和/或Ara h 6或其变体的组合物。

在第八方面，该问题通过抗体来解决，所述抗体是与Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选SEQ ID NO8特异性结合的抗体，优选是IgE类抗体，其优选是分离的抗体。可以使用抗原作为亲和配体，使用标准方案从患者样品的通过亲和层析来分离抗体。

在第九方面，通过根据本发明的抗体用于诊断花生过敏或制备用于诊断花生过敏的试剂盒的用途来解决所述问题。

本发明围绕着针对Ara h 7同种型7.0201，更特别地其惊人免疫反应性的C-末端，特别是包含SEQ ID NO 8的表位的抗体的检测，其作为在来自怀疑患有坚果过敏的患者的样品上实施的诊断方法的一部分，更令人惊讶地，一些过敏患者具有的抗体仅对包含SEQID NO8的Ara h 7同种型7.0201具有单特异性，并且不与其他Ara h 7同种型，更具体地7.0101和Ara h 7.0结合，更不用说与Ara h 2或Ara hh 6结合。

这与以前发表的研究形成鲜明对比，例如Codreanu等人的研究表明，针对任何Arah 7同种型的抗体的检测相较于来自Ara h 2和/或Ara h 6的检测的数据具有有限的诊断价值，或者特别是具有超出该数据的诊断价值。特别地，这些研究表明没有患者具有对任何Ara h7同种型具有单特异性的抗体。

本发明涉及诊断上有用的载体，其优选地是固相载体，用于使用于特异性捕获抗体的工具(该工具与所述载体结合)与来自受试者、优选哺乳动物受试者、更优选人受试者的体液样品接触。在优选的实施方案中，固相载体是诊断设备，更优选选自珠子、试纸条，微量滴定板，印迹，玻璃表面，生物芯片和膜，更优选选自印迹，测试条和膜。在一个最优选的实施方案中，诊断上有用的载体是微量滴定板或线性印迹(Raoult,D.,and Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and other antibodies.Itsapplication to the serotyping of gram-negative bacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)。在优选的实施方案中，本文使用的术语“线印迹”是指已经用一种或多种用于捕获抗体的工具，优选各自的多肽涂布的测试条，更优选基于膜的测试条。如果使用两种或更多种工具，则它们优选在载体上空间上分开。优选地，带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选40、50、60、70或80％。测试条可以包含一个或多个对照带，用于确认其已在适当的条件下(特别是在存在人血清、抗体缀合物或两者的情况下)与样品接触足够久。大量的线印迹可从市场上买到，例如购自EUROIMMUN,Lübeck,Germany。

用于实施本发明的来自受试者的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。通常，样品是包含整个受试者的免疫球蛋白的代表性组的体液。然而，一旦提供，样品就可以进行进一步处理，其可以包括分馏、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，优选IgE，其可以影响各种类别的免疫球蛋白的相对分布。样品可以选自全血，血清，脑脊髓液和唾液，并且优选是血清。在最优选的实施方案中，样品包含IgE类抗体。在更优选的实施方案中，样品包含来自类别IgA、IgG和IgE，优选IgG和IgE，更优选IgG1、IgG4和IgE的受试者抗体的代表性组，其中最优选抗体数量与不同抗原的比率与从受试者获得的样品中的比率相比基本上没有改变。

诊断上有用的载体包括用于特异性捕获针针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQID NO8的抗体的工具，任选地与一种或多种另外的抗原如Ara h 2和/或Ara h 6组合。在优选实施方案，如本文所用，术语“Ara h 7同种型7.0201”，“Ara h 2”，“Ara h 6”，“Ara h1”，“Arah 3”，“Ara h 5”，“Ara h 8”和“Ara h 9”是指分别由数据库编码B4XID4(Ara h 7同种型7.0201，不含信号肽的表达序列：SEQ ID NO2)和Q6PSU2(Ara h 2，不含信号肽的表达序列：SEQ ID NO4)、Q647G9(Ara h 6，不含信号肽的表达序列：SEQ ID NO5)、P43238(Arah1)、O82580(Ara h 3)、Q9SQI9(Ara h 5)、B0YIU5或Q6VT83(Ara h 8的两种同种型)和B6CG41或B6CEX8(Ara h 9的两种同种型)及其变体代表的多肽。优选地，如本文所使用的术语“Ara h 7”是指全部三种Ara h 7同种型，术语“Ara h 7.0101”是指具有序列SEQ ID NO1的同种型，并且术语“Ara h 7.0”是指具有序列SEQ ID NO3的同种型。本申请通篇引用的任何数据库代码是指在本申请的优先权日通过在线NCBI数据库可获得的多肽序列。优选在样品中检测到结合根据本发明的Ara h 7.0201，但不结合任何其他Ara h 7同种型、更具体地Ara h 7.0101和Ara h 7.0的抗体，并且用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具被配置用于此目的，并且优选是包含选自SEQ ID NO8或其变体，优选选自SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO6、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，更优选SEQ ID NO6，最优选Ara h 7同种型7.0201或其变体的多肽。

优选地，针对Ara h 7同种型7.0201的抗体是针对SEQ ID NO6，更优选选自SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选SEQ ID NO8的抗体。更优选地，它不结合三种Ara h 7同种型所共有的任何表位。

在优选的实施方案中，如本文所用，术语“用于特异性捕获针对(抗原)X的抗体和针对(抗原)Y的抗体的工具”是指特异性捕获针对(抗原)X的抗体但非针对(抗原)Y的抗体的工具与特异性地捕获针对(抗原)Y的抗体但非针对(抗原)X的抗体的工具的总和。

例如，X可以是Ara h 2，Y可以是Ara h 6。在这种情况下，用于特异性捕获针对Arah 2和Ara h 6的抗体的工具将包括用于特异性捕获针针对Ara h 2的抗体的工具和此外用于特异性捕获针对Ara h 6的抗体的工具。例如，用Ara h 2和Ara h 6包被的线印迹(在空间上彼此分开)是用于特异性捕获针对Ara h 2和Ara h 6的抗体的工具。

根据本发明，载体包含一种或多种用于特异性捕获抗体的工具，优选一种或多种，更优选两种或更多种，更优选三种或更多种，更优选四种或更多种这样的工具，其各自能够特异性捕获不同的抗体。在最优选的实施方案中，载体包含用于特异性检测针对Ara h 2、Ara h 7同种型7.0201和Ara h 6的抗体的工具。所述工具优选固定在所述载体上。在优选的实施方案中，用于特异性捕获抗体的工具是包含待被捕获或检测的抗体结合的抗原或其变体(例如选自Ara h 2、Ara h 7同种型7.0201和Ara h 6，优选Ara h 7同种型7.0201或其变体)的多肽或由其组成。优选地，所述多肽在用于检测针对Ara h 7同种型7.0201的抗体时包含来自包含SEQ ID NO8的序列，更优选来自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，更优选SEQ ID NO6，最优选Ara h 7同种型7.0201，或其变体。所述多肽可以是线性肽或折叠多肽，后者优选是采用可通过CD光谱学测定的与Ara h 7同种型7.0201基本上相同的折叠的变体。在优选的实施方案中，所述肽或多肽包含待捕获或检测的抗体的至少7个，优选10个，更优选15个氨基酸的表位。所述抗原与其附接的不溶性载体一起可以在与样品接触时从反应混合物中直接分离，例如通过过滤，离心或滗析。所述抗原可以以可逆或不可逆方式固定。例如，如果分子通过离子相互作用(其可以通过加入高浓度的盐掩盖)与载体相互作用，或如果分子通过可切割的共价键结合，则固定是可逆的。相比之下，如果分子通过不能在水溶液中裂解的共价键与载体连接，则固定是不可逆的。可以间接固定多肽，例如通过固定对多肽具有亲和性的抗体或其他实体，然后加入多肽并形成多肽-抗体复合物。

在优选的实施方案中，载体选自珠子、试纸条、微量滴定板、微阵列、衍生自纤维素的固体聚合物、印迹(优选选自蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹)、玻璃表面、载玻片、生物芯片和膜，并且最优选是微量滴定板或线印迹。在另优选的实施方案中，载体选自珠子、试纸条，微量滴定板，微阵列，源自纤维素的固体聚合物，选自线印迹和斑点印迹的印迹，玻璃表面，载玻片和生物芯片，并且最优选是微量滴定板或线印迹。

如果诊断上有用的载体是珠子，则可以使用各自携带一种类型的用于特异性捕获抗体的工具的珠子的混合物。所述混合物包含至少一个携带用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201(优选针对选自包含SEQ ID NO6的组的序列，更优选来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选SEQ ID NO8或其变体)的抗体的工具的珠子。另外，珠子的混合物可以包含至少一种另外的珠子，每个珠子携带用于特异性地捕获针对来自包含Arah 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5及其变体的组的一种或多种，更优选针对来自包含Ara h 2、Ara h 6、Ara h1、Ara h 3、Ara h9及其变体的组的一种或多种，最优选针对Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的工具。

如果诊断上有用的载体是珠子，则除了用于特异性捕获针对Arah 7同种型7.0201，优选针对来自包含SEQ ID NO6的组的序列，更优选针对来自包含SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选针对SEQ ID NO8或针对其变体的抗体的工具之外，所述珠子可以备选地包含用于特异性捕获抗体的至少一种或多种另外的工具，该抗体可以是针对来自包含Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5及其变体的组的一种或多种，更优选针对来自包含Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Arah 3、Ara h 9及其变体的组的一种或多种，最优选针对Ara h 2和/或Ara h6的抗体。最优选地，这样的珠子包含用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201，优选针对来自包含SEQ IDNO6的组的序列，更优选针对来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具，用于特异性捕获针对Ara h 2的抗体的工具和用于特异性捕获针对Ara h 6的抗体的工具。

然而，本发明的教导不仅可以使用任选与一种或多种另外的抗原例如Ara h 2和/或Ara h 6组合的多肽例如Ara h 7同种型7.0201(其具有在本申请中例如通过功能、名称、序列或登录号明确或隐含提及的确切的序列)来进行，也可以使用这些多肽的变体。

在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“变体”可以指所提及的全长序列的至少一个片段，更特别地是指一个或多个氨基酸或核酸序列，其相对于全长序列在一个或两个末端被一个或多个氨基酸截短。这种片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少10、15、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。

在另优选的实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且涉及包含氨基酸序列的多肽或其片段，优选包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％相同的至少25个，更优选50个，更优选200个连续氨基酸的片段，其中除生物学活性(例如与感兴趣的抗体特异性结合的能力，或多肽的折叠或结构)所必需的氨基酸以外的氨基酸被缺失或被取代和/或一个或多个此类必需氨基酸以保守的方式被替换和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物学活性至少部分保留。本领域的现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,OxfordUniversity Press,2008,第3版。在优选的实施方案中，使用默认设置使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)。

在优选的实施方案中，变体还可以包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化，磷酸化，乙酰化，脱羧，瓜氨酸化，羟基化等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。此外，还可以通过与其他已知的多肽或其变体融合来产生变体。

多肽的变体具有生物学活性。在优选的实施方案中，这样的生物学活性是与相应抗体结合的能力。例如，Ara h 7同种型7.0201的变体具有与从对花生过敏的受试者获得的样品中的针对Ara h 7同种型7.0201的抗体，优选IgA、IgE或IgG类抗体，更优选IgE、IgG1或IgG4类抗体特异性结合的能力，因为它包含所述抗体结合的表位。优选地，其包含被来自过敏患者的样品中的抗体识别的表位，所述抗体与Ara h 7同种型7.0201结合，更优选结合包含SEQ ID NO8的表位，最优选结合SEQ ID NO8，并且更优选不结合同种型7.0101或7.0。在考虑到SEQ ID NO8的重要性的情况下，本领域技术人员能够从原始Ara h 7同种型7.0201序列开始设计具有生物活性的变体，引入修饰如点突变、截短等，并随后通过测试所述变体是否结合从对花生过敏的受试者获得的样品中的针对Ara h 7同种型7.0201的IgE抗体来确认所述变体仍具有生物学活性，优选使用实施例1中详细描述的ELISA。

如果使用多肽作为用于特异性捕获抗体(例如针对Ara h 7同种型7.0201的抗体)的工具，则当用于实施本发明的教导时，所述多肽可以以任何形式和以任何纯化程度从包含内源形式的所述多肽的组织、果实或细胞、更优选过表达所述多肽的细胞、这种细胞的粗制或富集的裂解物来提供为纯化的和/或分离的可以是基本上纯的多肽。在优选的实施方案中，多肽是天然多肽，其中如本文所用的术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选是指从组织或细胞、更优选从哺乳动物细胞或组织、任选从非重组组织或细胞中纯化的折叠多肽。如果使用天然多肽，则优选与其天然状态相比其是富集的。

根据本发明，多肽可以是重组蛋白质，其中如本文所用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用基因工程方法产生的多肽，例如通过将编码多肽的核酸融合至强启动子用于在细胞或组织中过表达或通过改造多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和编码的多肽(例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),MolecularCloning,CSH or in Brown T.A.(1986),Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中描述的)以及用于生产和纯化天然或重组多肽(例如由GE Healthcare Life Sciences出版的Handbook“Strategies for Protein Purification”，“Antibody Purification”和Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide to Protein Purification中的)的方法。在另优选的实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”是指与使用生物技术或合成方法生产时的状态相比，多肽已经富集，并且优选是纯的，即相应样品中至少60、70、80、90、95或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后考马斯蓝染色和肉眼检查判断的。用作捕获抗体的工具的载体上的任何多肽优选是纯的。

在优选的实施方案中，根据本发明提供了优选用于提供针对Arah 7同种型7.0201的抗体的方法，其包括以下步骤：a)提供包含针对Ara h 7同种型7.0201，优选针对来自包含SEQ ID NO6的组的序列，更优选针对来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的样品，b)使样品与用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201，优选针对来自包含SEQ ID NO6的组的序列，更优选针对来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选针对SEQ IDNO8的抗体的工具在与形成包含抗体和工具的复合物相容的条件下接触，和c)分离该复合物，任选随后从复合物中释放和/或检测抗体。

提供样品的本发明的受试者是产生抗体的生物体，更优选哺乳动物，最优选为人，所述抗体优选为IgA、IgE或IgG，更优选为IgE、IgG1或IgG4类或等同的过敏相关抗体。

在本发明的范围内的是诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获针对抗原诸如Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性捕获抗体”是指特异性结合感兴趣的抗体的能力以使其结合并从样品中移除，而其他抗体，优选同一类别的抗体，基本上不结合并且留在样品中。

根据本发明的诊断上有用的载体充当用于特异性捕获抗体优选诊断相关抗体的一种或多种工具的支架。所述载体适合于执行诊断方法。通过使用载体而不是游离的可溶性工具来特异性地捕获抗体，更直接地从样品中分离和分开包含工具和抗体的复合物并洗涤所述复合物，例如为了除去任何非特异性结合至工具、复合物或载体的分子。在优选的实施方案中，诊断上有用的载体是诊断装置，优选选自包含珠子、试纸条、微量滴定板、印迹和膜的组，并且优选是微量滴定板或线印迹。

根据本发明，提供了用于特异性检测捕获的抗体的工具，任选地作为试剂盒的一部分。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“特异性检测捕获的抗体”是指在捕获后检测特异性结合用于特异性捕获抗体的工具的抗体，优选Ara h 7同种型7.0201，而不是检测任何其他存在于样品中的抗体。在优选的实施方案中，如本文所用，术语“特异性结合”是指结合比以1x 10^-5M,更优选1x 10^-7M,更优选1x 10^-8M,更优选1x 10^-9M,更优选1x 10^-10M,更优选1x 10^-11M,更优选1x 10^-12M的解离常数为特征的结合反应更强，如通过使用Biacore设备的表面等离子体共振在25℃在pH 7的PBS缓冲液中测定的。

在优选的实施方案中，用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种另外的抗原的抗体的工具在分开的载体上。这意味着所述工具不附接至单个载体，而是一个或多个分离的和/或可在不损坏它们的情况下分离的载体。例如，可以将用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具附接至第一测试条，并且将用于特异性捕获针对Ara h 2的抗体的工具附接至与第一测试条分开的另一个测试条。

在另优选的实施方案中，用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种另外的抗原的抗体的工具在一个载体上，优选与一个载体共价连接。这意味着所述工具被附接至不能在不损坏载体的情况下拆卸以使得所述工具在分开的载体上的一个载体上。例如，所述装置可以全部涂布在一个测试条(特别是线印迹的形式)上。

本发明的教导提供了一种试剂盒，优选用于诊断过敏，更优选用于诊断花生过敏。这样的试剂盒是包含实施本发明方法所需的特定试剂，特别是根据本发明的诊断上有用的载体的容器，任选地其还包含实施本发明方法所需的一种或多种溶液，优选选自或全部选自样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和包含用于检测任何特异性捕获的抗体的工具(例如二抗)以及任选地用于检测后者的工具的缓冲液。此外，其可以包括详细说明如何使用试剂盒和本发明的诊断上有用的载体(例如线印迹，其中本发明的用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体固定在线印迹上)用于使本发明的多肽与来自受试者优选人受试者的体液样品接触的说明书。此外，试剂盒可以包含阳性对照，例如已知结合Ara h 7同种型7.0201的重组抗体，和阴性对照，例如对Arah 7同种型7.0201没有可检测的亲和力的蛋白如牛血清白蛋白。最后，这样的试剂盒可以包含含有Ara h 7同种型7.0201结合抗体的标准溶液以制备校准曲线。在优选的实施方案中，试剂盒包含装置，优选基于印迹的装置，例如涂布有用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体以及任选地针对一种或多种其他抗原如Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的工具的线印迹。

根据本发明，用于检测一种或多种捕获的抗体的工具是需要的，并且可以包括在试剂盒中。本领域技术人员知道可以使用的许多方法，其也在现有技术中描述，例如Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company，特别是在第14章中。在优选的实施方案中，使用与一种或多种捕获的抗体(其为相应的一抗)的恒定区结合的二抗，该二抗可以与直接检测的标记例如荧光、放射性或酶活性标记(后者可以催化化学发光反应或产生可用比色法或光谱法或其他分析方法检测的分子)结合。在更优选的实施方案中，二抗与选自荧光标记、放射标记和化学发光标记的标记结合。

或者，可以使用生物功能测定作为用于检测一种或多种捕获的抗体的工具，条件是抗体是IgE类抗体，该测定优选是基于IgE抗体嗜碱性粒细胞活化的测定。已经在现有技术中描述了这样的测定法，例如Hausmann,O.V.,Gentinetta,T.,Bridts,C.H.,and Ebo,E.G.(2009):The Basophil Activation Test in Immediate-Type Drug Allergy,Immunol.Allergy Clin.N.Am.29,555-566。

在优选的实施方案中，如本文所用，术语“诊断”是指旨在获得有用的信息的任何类型的程序，所述信息有助于评估患者是否在过去、在诊断时或将来患有或可能或比平均或比较受试者(后者优选具有相似的症状)更可能患有某种疾病或病症的，以了解疾病如何进展或将来可能如何进展或评估患者关于某种治疗(例如合适的药物例如用于过敏患者脱敏的药物的施用)的响应性。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，还包括预测和/或监测疾病或病症的进程。在更优选的实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”意味着受试者(来自其的样品根据本发明进行分析)对坚果(优选花生)是否过敏(如通过针对花生特异性过敏原(例如选自包含Ara h 2、Ara h 6和Ara h 7的组，优选Ara h 7)的抗体在其血液中的存在证明的)是未知的。

因此，术语“诊断”优选地并不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将是确定的并且足以基于单一检测更不用说参数来完成诊断，而是可以指对所谓的“差别诊断”的贡献，即基于一系列诊断参数考虑一系列可能病况的可能性的系统性诊断程序。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换句话说，该方法或药剂可涉及选择受试者的治疗方案。

本发明涉及一种方法，所述方法包括在来自受试者的样品中检测针对Ara h 7同种型7.0201，优选针对来自包含SEQ ID NO6的组的序列，更优选针对来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的存在或不存在。这样的方法可以包括以下步骤：a)提供来自受试者的样品，b)使样品与根据本发明的诊断上有用的载体在与形成包含诊断上有用的载体和抗体(更特别是用于特异性捕获抗体的工具和抗体)的复合物相容的条件下接触，c)分离任何所述复合物，例如通过除去样品，d)任选洗涤所述复合物，和e)检测所述复合物。该方法优选是体外方法。根据本发明的用于预后、诊断的复合物、方法或检测试剂盒的检测包括使用选自包含免疫扩散技术、通过IgE抗体的嗜碱性粒细胞活化、免疫电泳技术、光散射免疫测定、凝集技术、标记的免疫测定的组的方法，例如选自包括放射性标记的免疫测定法、酶免疫测定法如比色测定法、化学发光免疫测定法和免疫荧光技术的组的标记的免疫测定法。在优选的实施方案中，复合物利用选自包括免疫扩散技术、通过IgE抗体的嗜碱性粒细胞活化、免疫电泳技术，光散射免疫测定、凝集技术、选自包括放射性标记的免疫测定法、化学发光免疫测定法和免疫荧光技术的组的标记的免疫测定法的组的方法检测。本领域技术人员熟悉这些方法，其在现有技术中也有描述，例如Zane,H.D.(2001):Immunology–Theoretical&Practical Concepts inLaboratory Medicine,W.B.Saunders Company,in particular in Chapter 14。

在许多情况下，检测样品中抗体的存在或不存在(任选地意味着确定抗体的浓度是否超过优选如通过使用ELISA的测量设定(优选如实施例1所述的)的本方法的隐含检测极限中的某个阈值(通常由检测极限提示))足以用于诊断。如果可以检测到抗体，则这对于临床医生的诊断是有用的信息，并且表明患者患有疾病的可能性增加。在优选的实施方案中，可以确定血清中的抗体相较于可以在平均健康受试者中发现的水平的相对浓度。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“检测存在”意思是足以核实足以超出任何背景水平的信号是否被使用指示感兴趣的抗体存在或者存在比健康受试者中更多的感兴趣的抗体的复合检测方法检测到。在更优选的实施方案中，这可涉及确定浓度是否是在平均健康受试者中发现的感兴趣抗体的浓度的至少0.1，优选0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍。

在优选的实施方案中，同时(即在相同的时间)检测至少抗体如针对Ara h 7同种型7.0201的抗体和针对Ara h 2的抗体和/或针对Arah 6的抗体的存在或不存在。就有效的诊断程序而言这是方便的，因为在给定的时间段内获得最大的诊断信息。当然，先决条件是有足够的容量来运行所有的反应。

在优选的实施方案中，在空间上分开的反应中检测至少两种抗体(例如针对Ara h7同种型7.0201的抗体和针对Ara h 2的抗体和/或针对Ara h 6的抗体)的不存在或存在。这意味着这些反应在分开的容器中在不同的反应混合物中运行。

如果要检测多于一种抗体，则该方法可以在一锅反应中进行。优选地，如本文所使用的术语“一锅反应”是指为了检测抗体的存在或不存在而进行的两个或更多个，优选所有反应在一个反应容器中的相同反应混合物中进行，在反应之间没有物理屏障，与设想至少两个反应在分开的溶液和反应容器中进行的实验设置相反。

待检测的抗体可以是单特异性抗体。在优选的实施方案中，本文使用的术语“单特异性抗体”是指仅结合一种抗原的抗体，优选仅结合一种诊断相关抗原，更优选仅结合一种来自包含Ara h 7、Ara h 2和Ara h 6的组的诊断相关抗原。在更优选的实施方案中，待检测的单特异性抗体可以结合Ara h 7同种型7.0201，优选结合SEQ ID NO6，更优选结合来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选结合SEQ IDNO8，但不结合任何其它过敏原，例如同种型Ara h 70101、Ara h 7.0，或者例如Ara h 2和/或Ara h 6。如果患者仅具有单特异性抗体，则它们的过敏只能通过血清学的方式在使用特异性捕获和检测所述单特异性抗体的工具时检测。如果使用基于检测针对不同于7.0201的不包含SEQ ID NO8的Ara h 7同种型的抗体的工具的诊断测定法，则测定结果可能是假阴性的，因为对Ara h 7同种型7.0201更优选SEQ ID NO8具有单特异性的抗体不能被检测到。

本发明提供了用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的工具的用途，所述工具优选为包含Ara h 7同种型7.0201或其变体的多肽，其用于增加诊断上有用的载体的灵敏度，用于检测针对Ara h7的抗体优选针对Ara h 7的单特异性抗体，用于制备用于诊断花生过敏的试剂盒或用于诊断坚果过敏优选花生过敏的方法，任选地其与用于特异性捕获针对一种或多种另外的抗原如Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的工具组合。

本发明提供了特异性结合Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选结合来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选结合SEQID NO8的抗体的使用，该抗体优选是单特异性抗体。更优选地，抗体在患者样品中检测或从患者样品中分离，并且是IgA、IgE或IgG类抗体，更优选IgE、IgG1或IgG4类抗体，最优选IgE类抗体。

本发明提供了特异性结合Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选结合来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选结合SEQID NO8的抗体或其片段，该抗体优选是单特异性抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是多克隆抗体。该抗体可用于许多诊断应用，例如用于测量来自样品的抗体的亲合力。或者，抗体可以用于竞争性测定，例如竞争性ELISA。或者，抗体可用于将优选包含SEQ ID NO6，更优选来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列，最优选SEQID NO8的多肽固定化。或者，抗体可以用作阳性对照。本领域技术人员知道如何获得这样的抗体，例如使用重组方法。制造可能涉及纯化和/或分离抗体的步骤。

本发明提供了包含Ara h 7同种型7.0201、优选包含SEQ ID NO6的多肽、更优选来自包含SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的组的序列、最优选SEQ IDNO8或其变体(任选地与一种或多种另外的抗原例如Ara h 2和/或Ara h 6或其变体组合)的药物组合物，优选疫苗，所述组合物优选适合施用于受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人类。这种药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、滴眼、直肠、经鼻、口腔、阴道或通过植入的储库施用，其中本文使用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。药物组合物可以以合适的剂型提供，例如胶囊，片剂和含水悬浮液和溶液，优选无菌形式。其可以用于治疗疾病优选过敏的方法中，该方法包括将有效量的本发明多肽施用至受试者。可以使用Ara h 7的低过敏原性变体和任选一种或多种另外的抗原如Ara h 2和/或Ara h 6。本领域技术人员熟悉用于产生已知过敏原的低过敏原性变体的方法。

本发明提供了包含Ara h 7同种型7.0201，更优选包含SEQ ID NO6的多肽，更优选来自包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的组的序列，最优选SEQID NO 8的疫苗。

本发明提供了治疗、预防或改善过敏，优选坚果过敏，更优选花生过敏，但将本发明的药物组合物施用至受试者的方法。

本发明提供了优选与Ara h 2和/或Ara h 6或其变体组合的Ara h7同种型7.0201、更优选包含SEQ ID NO8的多肽、更优选来自包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9和SEQ ID NO 10的组的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201或其变体用于制备用于诊断花生过敏的试剂盒的用途，其中提供了具有增加的灵敏度的诊断测定。这样的制备可涉及将优选与Ara h 2和/或Ara h6或其变体组合的Ara h 7同种型7.0201、更优选包含SEQ ID NO6的多肽、更优选来自包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9和SEQ ID NO 10的组的序列、最优选SEQ ID NO8固定在诊断上有用的载体上的步骤的方法。

本发明提供了优选与Ara h 2和/或Ara h 6或其变体组合的Ara h7同种型7.0201、更优选包含SEQ ID NO8的多肽、更优选来自包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9和SEQ ID NO 10的组的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201或其变体用于制备药物优选疫苗的用途，所述药物优选用于预防、改善或治疗过敏病况，特别是坚果过敏，更特别是花生过敏。

附图说明

图1显示如实施例1所述通过ELISA检测的IgE与花生致敏患者的Ara h 7同种型的结合。

图2显示如实施例2所述通过线印迹检测的IgE与花生致敏患者的Ara h 7同种型以及Ara h 2和Ara h 6的结合。

图3显示了实施例3中描述的抑制实验。对固定化的过敏原致敏的患者中的五种花生成分观察到最大抑制。水平线表示中值。灰色的、空心的标记指示使用与固定化的过敏原相同的过敏原的抑制。

图4显示了针对Ara h 7.0201C-末端的线性肽的血清IgE的表位作图的结果。针对微阵列上的每个肽呈现归一化的信噪比(z-分数)。阳性结合需要至少6个随后的肽产生高于3的z-分数。

序列：

本发明包括一系列新的多肽，更具体地

SEQ ID NO1(Ara h 7.0101的不含信号序列的表达序列)

TRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHMRRRVEQEQEQEQDEYPYSRRGSRGRQPGESDENQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFWVPAGQEPVASDGEGAQELAPELRVQVTKPLRPL

SEQ ID NO2(Ara h 7.0201的不含信号序列的表达序列)

TRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEKEQEQEQDEYPYIQRGSRGQRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO3(Ara h 7.0的不含信号序列的表达序列)

TRWDPDRGSRGLRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEQEQEQEQDEYPYSQRGSRGRRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQNGEGAQELAPELRVQVTKPLRP

SEQ ID NO4(Ara h 2.0201的不含信号序列的表达序列)

RQQWELQGDRRCQSQLERANLRPCEQHLMQKIQRDEDSYGRDPYSPSQDPYSPSQDPDRRDPYSPSPYDRRGAGSSQHQERCCNELNEFENNQRCMCEALQQIMENQSDRLQGRQQEQQFKRELRNLPQQCGLRAPQRCDLEVESGGRDRY

SEQ ID NO5(Ara h 6.0101的不含信号序列的表达序列)

MRRERGRQGDSSSCERQVDRVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYDIRSTRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCDRLQDRQMVQQFKRELMNLPQQCNFRAPQRCDLDVSGGRCSEQ ID NO6(Ara h 7同种型7.0201的C端)

HQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO7(Ara h 7同种型7.0201的C端)

NCGFRSPSRC

SEQ ID NO8(来自Ara h 7同种型7.0201的C端的反应性表位)

GFRSPS

SEQ ID NO9(Ara h 7同种型7.0201的C端)

CGFRSPSRCD

SEQ ID NO10(Ara h 7同种型7.0201的C端)

QNCGFRSPSRCDL

SEQ ID NO11(Ara h 7同种型7.0101，如实施例1中所表达的)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHMRRRVEQEQEQEQDEYPYSRRGSRGRQPGESDENQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFWVPAGQEPVASDGEGAQELAPELRVQVTKPLRPL

SEQ ID NO12(Ara h 7同种型7.0201，如实施例1中所表达的)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGSRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEKEQEQEQDEYPYIQRGSRGQRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQMERELRNLPQNCGFRSPSRCDLSSRTPY

SEQ ID NO13(Ara h 7同种型7.0，如实施例1中所表达的)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMTRWDPDRGSRGLRWDAPSRGDDQCQRQLQRANLRPCEEHIRQRVEQEQEQEQDEYPYSQRGSRGRRPGESDEDQEQRCCNELNRFQNNQRCMCQALQQILQNQSFRFQQDRSQLHQNGEGAQELAPELRVQVTKPLRP

SEQ ID NO14(Ara h 2同种型2.0201，如实施例1中所表达的)

MSHHHHHHIEGRTMRQQWELQGDRRCQSQLERANLRPCEQHLMQKIQRDEDSYGRDPYSPSQDPYSPSQDPDRRDPYSPSPYDRRGAGSSQHQERCCNELNEFENNQRCMCEALQQIMENQSDRLQGRQQEQQFKRELRNLPQQCGLRAPQRCDLEVESGGRDRYSEQ ID NO15(Ara h 6同种型6.0101，如实施例1中所表达的)

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMRRERGRQGDSSSCERQVDRVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYDIRSTRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCDRLQDRQMVQQFKRELMNLPQQCNFRAPQRCDLDVSGGRC

SEQ ID NO16:如实施例3中所用的Ara h 1.01.01

MSHHHHHHIEGRTMKSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDDLKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDDRRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRKIRPEGREGEQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQFQNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNLDEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSYLQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNFGKLFEVKPDKKNPQLQDLDMMLTCVEIKEGALMLPHFNSKAMVIVVVNKGTGNLELVAVRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNREVRRYTARLKEGDVFIMPAAHPVAINASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKLIKNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN

SEQ ID NO17:如实施例3中所用的Ara h 3.01.01

MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMRQQPEENACQFQRLNAQRPDNRIESEGGYIETWNPNNQEFECAGVALSRLVLRRNALRRPFYSNAPQEIFIQQGRGYFGLIFPGCPRHYEEPHTQGRRSQSQRPPRRLQGEDQSQQQRDSHQKVHRFDEGDLIAVPTGVAFWLYNDHDTDVVAVSLTDTNNNDNQLDQFPRRFNLAGNTEQEFLRYQQQSRQSRRRSLPYSPYSPQSQPRQEEREFSPRGQHSRRERAGQEEENEGGNIFSGFTPEFLEQAFQVDDRQIVQNLRGETESEEEGAIVTVRGGLRILSPDRKRRADEEEEYDEDEYEYDEEDRRRGRGSRGRGNGIEETICTASAKKNIGRNRSPDIYNPQAGSLKTANDLNLLILRWLGPSAEYGNLYRNALFVAHYNTNAHSIIYRLRGRAHVQVVDSNGNRVYDEELQEGHVLVVPQNFAVAGKSQSENFEYVAFKTDSRPSIANLAGENSVIDNLPEEVVANSYGLQREQARQLKNNNPFKFFVPPSQQSPRAVA

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，本发明的其它特征、实施方式、方面和优点可以从这些实施例中得出。

实施例

实施例1：通过ELISA检测来自花生致敏患者的血清中的针对Ara h 7同种型的IgE抗体

1.1.重组蛋白

重组过敏原的异源表达和纯化

Ara h 7.0101(SEQ ID NO11)、Ara h 7.0201(SEQ ID NO 12)、Ara h 7.0(SEQ IDNO 13)、Ara h 6(SEQ ID NO 15)和Ara h 2(SEQ ID NO 14)在大肠杆菌中被表达和纯化为His6融合蛋白，其具有如Sitaru C, C,Probst C,Komorowski L,I,Schmidt E,Schlumberger W,Rose C, W,Zillikens D.Enzyme-linkedimmunosorbent assay using multimers of the 16th non-collagenous domain of theBP180antigen for sensitive and specific detection of pemphigoidautoantibodies.Exp Dermatol.2007Sep；16(9):770-7中所述的相应SEQ ID NO所示序列。通过固定金属离子色谱法在变性条件下进行纯化。

1.2.通过ELISA检测IgE结合

通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析三种Ara h 7同种型的IgE结合能力，所述酶联免疫吸附测定法(ELISA)用对花生提取物显示IgE阳性的33名患者的血清孵育(图1)。此外，无花生过敏的遗传性过敏症患者的10份血清和23名健康献血者被孵育作为阴性对照(全部反应阴性，数据未显示)。

如Sitaru等人所述，将微量滴定板用重组花生过敏原(pH7.5的PBS中9μg/ml)在4℃包被2小时。将血清在封闭缓冲液(PBS-0.1％牛血清白蛋白)中以1/10(v/v)稀释，每孔100μl一式两份地施加到板上，使其在4℃反应过夜。

使用抗人IgE过氧化物酶缀合物检测结合的抗体，并用四甲基联苯胺(Total IgEELISA EV 3840-9601E,Euroimmun,Lubeck,Germany)染色。使用自动化分光光度计(Spectra Mini,Tecan,Germany)以620nm为参考在450nm下读取光密度(OD)。

结果

在66个人血清中测量了针对Ara h 7同种型7.0101、Ara h 7同种型7.0201和Arah 7.0的IgE反应性。23名献血者和没有针对花生提取物的IgE的遗传性过敏症患者的10份血清均无反应阳性。在23个花生提取物阳性血清中，11个显示与Ara h 7.0201的阳性结果，而仅6个和10个显示与Ara 7.0101和Ara h 7的阳性结果。

在阳性反应血清中，Ara h 7.0201的平均OD为1.0。Ara h 7.0101和Ara h 7.0的平均OD相当低(均为0.4)。

这些结果表明，一方面，Ara h 7.0201与患者IgE反应更强，另一方面，通过使用Ara h 7.0201作为靶抗原检测IgE抗体，相较于另外两种同种型可以正确诊断更多的患者(图1)。事实上，如果检测到针对Ara h 7.0201的抗体，一些患者只能被鉴定和诊断为过敏。

实施例2：通过线印迹检测IgE抗体

通过免疫印迹分析研究了2S白蛋白Ara h 2、Ara h 6和三种Arah 7同种型的IgE结合能力。将来自34名花生致敏受试者的血清样品(图2)与线印迹-免疫印迹一起孵育，并使用EUROLINEScan软件评估强度。此外，无花生过敏的遗传性过敏症受试者的20份血清和17个健康献血者被孵育作为阴性对照(全部阴性，数据未显示)。

对于线印迹免疫印迹，使用标准方法将重组过敏原涂布在基于尼龙的膜上。之后将膜封闭，干燥并固定在箔上。将该箔切成条，其与血清一起孵育。

根据EUROIMMUN免疫印迹说明书(例如在DPA-Dx花粉1，DP 3210-1601-1E中的)执行血清样品的手动孵育。所有孵育和洗涤步骤均在室温(+18℃至+25℃)的摇摆振荡器上完成。从EUROIMMUN提供的试剂盒(DPA-Dx花粉1，DP 3210-1601-1E)中取出试剂。将免疫印迹条与工作强度通用缓冲液(WSUB)预孵育5分钟。移除所有液体后，在第一步中用100μl以1.0ml WSUB稀释的每种血清样品孵育条过夜(12至24小时)。在第二步中，将条与1.0ml酶缀合物(碱性磷酸酶缀合的抗人IgE)孵育60分钟。在第一步和第二步之后，分别吸出液体，用1.0ml WSUB将条洗涤3×5分钟。在第三步中，将条与1.0ml生色团/底物溶液一起孵育10分钟。之后再次吸出液体，通过用去离子水或蒸馏水洗涤每个条3×1分钟来停止酶反应。最后将测试条置于评估方案上，风干并用EUROLINEScan软件进行评估。

结果

总共有71个样品用免疫印迹分析。在没有针对花生提取物的特异性IgE(sIgE)的遗传性过敏症受试者的20份血清和17个健康献血者中均没有检测到针对Ara h 2、Ara h 6和所有三种Ara h 7同种型的sIgE。在来自具有针对花生提取物的sIgE的受试者的34个样品中，分别地17个样品与Ara h 2和Ara h 6反应阳性，15个样品与Ara h7.0201反应阳性，14个样品与Ara h 7.0101反应阳性，和11个样品与Ara h 7.0反应阳性。

在阳性反应血清中，来自Ara h 2、Ara h 6和Ara h 7.0201的免疫印迹强度的平均值分别为84、59和74，来自Ara h 7.0101和Ara h7的平均强度相当低(20和28)(图2)。

结果显示具有针对花生提取物的sIgE的受试者具有比Ara h7.0101和Ara h 7.0的平均IgE水平更高的Ara h 7.0201的平均IgE水平。此外，花生提取物IgE阳性受试者具有非常相似的Ara h 2和Ara h 7.0201IgE的平均水平，表明Ara h 7.0201IgE与Ara h 2一样是花生过敏的另一个主要过敏原组分。

实施例3：使用线印迹和ELISA的基于更大患者队列的研究

患者选择

为了评估不同花生贮藏蛋白的诊断价值，选择了基于历史和/或致敏疑似花生过敏的成年人(其已在2003年至2014年9月在University Medical Center Utrecht进行了使用花生的诊断性开放或双盲安慰剂对照的食物挑战(DBPCFC))(n＝127)。在食物挑战日期前后一年常规采集血液后的残余血清对于95个受试者是可用的。从这个队列中，根据ImmunoCAP ISAC致敏数据的可用性，选择40个花生过敏患者和40个耐受患者(分别使用积极和消极挑战)。按照如前所述的国际共识方案进行DBPCFC(Taylor SL,Hefle SL,Bindslev-Jensen C,Atkins FM,Andre C,Bruijnzeel-Koomen C等人A consensusprotocol for the determination of the threshold doses for allergenic foods:How much is too much？Clin Exp Allergy 2004；34:689–95.doi:10.1111/j.1365-2222.2004.1886.x.)。所有积极的挑战是DBPCFC。消极的挑战还包括两个开放的花生挑战。对于抑制实验，从10个对花生提取物敏感和使用积极DBPCFC的过敏成年人(随机选自从之前由Peeters KABM,Koppelman SJ,van Hoffen E,van der Tas CWH,den Hartog JagerCF,Penninks AH,et al.Does skin prick test reactivity to purified allergenscorrelate with clinical severity of peanut allergy？Clin Exp Allergy 2007；37:108–15.doi:10.1111/j.1365-2222.2006.02628.x表征的队列)收集血清。

线印迹

使用如实施例2中所述的线印迹评估对重组花生贮藏蛋白Ara h1.0101、2.0201、3.0101、6.0101和Ara h 7同种型7.0201的致敏(表1)。简言之，将测试条与稀释缓冲液1:11稀释的100μl患者血清在室温下在轨道振荡器上过夜。洗涤后，与酶标记的抗人IgE抗体孵育，然后与底物硝基蓝四唑鎓/5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸孵育，使用软件“EUROLineScan”评估反应。条带的强度被报告为强度水平和类别，对应于酶-过敏-吸附剂测试分类(类别0-6)(Williams PB,Barnes JH,Szeinbach SL,Sullivan TJ.Analytic precision andaccuracy of commercial immunoassays for specific IgE:Establishing astandard.J Allergy Clin Immunol 2000；105:1221–30.doi:10.1067/mai.2000.105219)。1或更高的类别(相当于3或更高的强度水平)被认为是阳性的。

重组过敏原的异源表达和纯化

在没有信号序列的情况下在大肠杆菌中表达Ara h 7.0101(SEQ ID NO 11)、Arah 7.0201(SEQ ID NO 12)、Ara h 7(SEQ ID NO 13)、Ara h 6(SEQ ID NO 15)和Ara h 2(SEQ ID NO 14)为具有N-末端His(6x)的融合蛋白，其由Sitaru等人(2007)描述的相应的SEQ ID NO表示。通过固定金属离子色谱法在变性条件下进行纯化。对于抑制实验，针对TBS(20mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl，3％蔗糖，1.2mM谷胱甘肽(非还原性)，3.8mM谷胱甘肽(还原性))透析重组蛋白。

ELISA和抑制实验

如Sitaru等人所述，将微量滴定板用固定的重组花生过敏原(pH7.5的PBS中9μg/ml)在4℃包被2小时。

对于剂量依赖性交叉抑制实验，将实施例1中描述的封闭缓冲液中的最佳稀释血清(参见表3)与最终浓度为0.1、1和10μg/ml的竞争性过敏原在室温在摇动下预孵育30分钟，随后施加至板。将抑制值给出为与仅添加封闭缓冲液的对照相比的OD减少百分比。

数据分析和统计

使用Spearman相关分析sIgE测试结果之间的相关性。使用卡方检验评估耐受性和过敏性患者之间阳性测试的差异。确定接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)以评估测试鉴别食物挑战所建立的过敏和耐受的能力。使用SPSS Statistics 21(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)执行分析。

结果

对花生贮藏蛋白致敏的评价

表2中列出了用于诊断评估的80个花生挑战患者的患者特征。中位年龄为25岁(范围：16-77)，36％为男性。对所有花生贮藏蛋白的致敏在花生过敏组中显著更频繁出现。在花生过敏组中，73％对五种贮藏蛋白中的至少一种敏感，相比之下在花生耐受组中为15％。花生2S白蛋白Ara h 2在花生过敏患者中最为常见(65％)，紧随其后的是另外两个2S白蛋白Ara h 6和7(均为60％)。

对于Ara h 6发现了最高的区分值(AUC 0.85)，其次是Ara h 7和2(AUC 0.83和0.81)。EUROLINE强度值显示与花生贮藏蛋白的ISAC ISU结果的强至非常强的相关性(r_s值Ara h 1：0.73，Ara h2：0.87，Ara h 3：0.80，Ara h 6：0.84，所有p<0.001)。Ara h 7强度值与EUROLINE上Ara h 2和6的强度值强相关(r_s＝0.81，两者p<0.001)。表2列出了致敏结果以及EUROLINE和ImmunoCAP ISAC上对组分的区分能力。

对花生贮藏蛋白的共致敏是最常见的。在所有对花生贮藏蛋白Ara h 1、2、3、6或7敏感的患者中，几乎一半对所有五种致敏(46％；线上储存库中的图E1)，随后是仅对Ara h2、6和7的共致敏(14％)。当特别注意对2S白蛋白Ara h 2、6或7致敏的患者时，大多数患者对所有三者共致敏(n＝24，68％；图1)。对于Ara h 2(n＝6)、Ara h 6(n＝2)和Ara h 7(n＝2)观察到单致敏作用，分别在6个的4个，在2个的1中和在2个的1中为阳性。

使用Ara h 2、6和7同种型的ELISA抑制

对于抑制研究的10个患者，平均年龄为25岁，其中四名男性。所有受试者中均检测到对花生提取物的致敏，ImmunoCAP滴度范围为1.7至>100kU/L。首先，通过ELISA在10份血清中评估针对三种Ara h 7同种型以及Ara h 2和6的IgE反应性。四份血清显示对所有五个组分的反应性。此外，两份血清与Ara h 7.0201、Ara h 2和6反应，一份血清只与Ara h 2和6反应。其余三名患者的OD值对于抑制实验而言太低。确定每种血清的最佳稀释度(数据未显示)。交叉抑制实验表明，在不同的2S白蛋白之间获得的最大抑制量上，每份患者血清存在可变性(图3)。在一些患者中，未观察到抑制，而其他患者表现出使用不同的固定化过敏原和抑制剂的部分或几乎完全抑制。对于Ara h 7.0101和7同种型，其他两种同种型能够达到强抑制，类似于用相同的过敏原进行抑制。对于Ara h 7.0201，使用另外两个表位的抑制导致非常有限的抑制。

不同的2S白蛋白之间抑制的变异性更加明显(图4)。例如，对于固定化的Ara h7.0201，使用Ara h 6的抑制导致8至86％抑制(中值22％)，且使用Ara h 2的抑制导致4至71％的抑制(中值16％)。另一方面，与Ara h 6和Ara h 2的结合被Ara h 7同种型抑制，但Ara h 2对针对的Ara h 6的sIgE的抑制为12％至70％(中值43％)，反过来为高至77％(中值24％)。总之，Ara h 2和6在一些患者中能够抑制与Ara h 7.0201的结合，但在其他患者中不能抑制。虽然Arah 2和6能够不同程度地抑制彼此的结合，但是Ara h 7同种型很难抑制与Ara h 2和6的结合。

讨论

在我们的80个花生挑战的患者队列中，我们证明了Ara h 7.0201具有与主要过敏原Ara h 2和6非常相似的区分能力，这可以通过它们频繁的共致敏以及它们的结果之间的强相关性来解释。总体而言，我们发现Ara h 6在ImmunoCAP ISAC和EUROLINE系统上具有最好的区分能力，比Ara h 2稍高。

除了常见的共致敏外，我们还观察到对Ara h 2、6或7.0201的单致敏。虽然对Arah 2的单敏致最常见(n＝6)，但重要的是认识到对Ara h 6和7.0201的单致敏的存在，其在仅测试对Ara h 2的致敏时会被忽略掉。这是表明在两个受试者中对Ara h 7.0201的单致敏的第一项研究。

以前的研究已经研究了对Ara h 7的致敏，但只研究了Ara h 701.01同种型。在首次克隆Ara h 7.0101之后，Kleber-Janke等人在具有确定的花生过敏史的40个花生过敏受试者的17个(43％)中检测到对rAra h 7.0101的致敏，相比之下，对于Ara h 2为85％。Codreanu及其同事研究了几种重组花生在免疫测定中的作用，并且显示与rArah 2和6相比，rAra h 7.0101的灵敏度较差。

在我们的研究中的抑制实验显示Ara h 7.0201是Ara h 7的最相关的同种型。在具有针对Ara h 7.0101和7.0的sIgE的患者的血清中，其他同种型的强抑制表明存在于所有三个Ara h 7同种型上的表位的识别。另一方面，在对Ara h 7.0201致敏的受试者中，其他同种型的抑制的缺乏表明对独特表位的共致敏，而不存在于其他两种同种型中。在6个对任何Ara h 7同种型致敏的血清中，有4个对所有三种Ara h7同种型共致敏。似乎有矛盾的是，与Ara h 7.0201的结合不能被其他同种型所抑制，而另一方面，Ara h 7.0201能够抑制与其他同种型的结合。一种解释是在单个患者中识别Ara h 7.0201的多个表位(独特的和交叉反应性的)，其中针对存在于一种Ara h 7同种型上的独特表位的大量sIgE导致缺乏该表位的其他同种型的低抑制。另一个影响因素可能是固相上的固定的涂层过敏原与溶解的、折叠的过敏原之间IgE的表位的可接近性的差异。

2S白蛋白的交叉抑制显示针对Ara h 2和6的IgE不能被Ara h 7同种型抑制，但在某种程度上彼此抑制。这可以通过不是Ara h 7同种型的一部分的Ara h 2和6上的共有表位来解释。

总之，这项研究已经证明Ara h 7同种型7.0201是第三个临床相关的花生2S白蛋白，具有在群体水平上与Ara h 2和6相当的对花生过敏的区分能力。虽然对花生贮藏蛋白和更特别是2S白蛋白的共致敏是最常见的，但对Ara h 2、6或7的单致敏在个体患者中发生，导致当测试单个2S白蛋白时导致误诊的风险。

实施例4：使用肽微阵列检测针对特定的Ara h 7表位的IgE抗体

肽微阵列孵育和可视化

商购获得获得包含覆盖Ara h 7.0201(SEQ ID NO6)的C端的具有重叠序列(偏移量：1，每个肽以一式两份打印)的Ara h 7.0201(SEQ ID NO2)的15聚体肽的肽微阵列(PEPperPRINT)。对于孵育实验，微阵列用工作强度通用缓冲液(WSUB，参见实施例2)在定轨摇床上室温封闭1小时。所有进一步描述的孵育也在WSUB中进行。3个花生阳性和2个花生阴性患者的血清以1:4稀释，并在4℃孵育过夜。为了检测结合的IgE抗体，将生物素化的抗IgEIT-28(Squarix)以1:5000稀释并在阵列上在室温下孵育1小时。洗涤后，将阵列在室温下与以1:5000稀释的荧光Neutravidin 800(Thermo Fisher)孵育1小时。用Licor Odyssey成像仪以800nm的波长(强度：8.5)扫描肽微阵列载玻片。图像焦点被设置为0.8mm，并且选择最大图像分辨率(21μm)以保证最大灵敏度。

评估

扫描之后，将TIFF图像和肽图文件加载到Pepslide Analyzer软件(SICASYS)，以定量对应于每个单肽的信号。将原始数据导出为

CSV文件，并计算阵列上每个单个Ara h 7肽(S_Ara)和空斑点(S_Blank)的信噪比的log2。为了更稳健和规范化的评估，根据下式计算每个单肽的z-分数(Zi)：

基于这些计算，将阳性结合表位定义为包含3.0或更高的z-分数(p＝0.003)的至少6个随后的肽的检测。使用Microsoft Excel进行数据可视化(图4)。

结果

虽然两个阴性血清没有检测到表位，但使用血清3，可以检测到包含序列GFRSPS(氨基酸129-134)(根据SEQ ID NO2的氨基酸残基编号)的先前未知的Ara h 7.0201表位。尽管低于z-分数截断点，但该表位对于血清1也是可检测的。由于该序列对于Ara h 7.0201是独特的，所以可以得出结论，相较于其他两种同种型，该表位与对于Ara h 7.0201的反应性增强相关。

表

表1：EUROLINE条带上存在的花生贮藏蛋白质。改编自Becker和Jappe[5]和VanErp等人[7]。

表2：在队列中的40个花生耐受性和40个花生过敏性患者的患者特征和致敏数据

IQR：四分位间距。AUC：曲线下的面积。CI：置信区间

*使用制备商推荐的截断值进行阳性测试。耐受性和过敏性受试者之间阳性测试数量的差异值(卡方检验)。

表3：实施例3中描述的剂量依赖性抑制实验的血清的个体稀释

序列表

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG

<120> 改进的诊断花生过敏的测定法

<130> 17PP016

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO1 (Ara h 7.0101的不含信号序列的表达序列)

<400> 1

Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser Arg Trp Asp Ala

1 5 10 15

Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn

20 25 30

Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Met Arg Arg Arg Val Glu Gln Glu Gln

35 40 45

Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Arg Arg Gly Ser Arg Gly

50 55 60

Arg Gln Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asn Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn

65 70 75 80

Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu

85 90 95

Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Trp Val Pro Ala Gly Gln Glu

100 105 110

Pro Val Ala Ser Asp Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala Pro Glu Leu

115 120 125

Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu

130 135

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO2 (Ara h 7.0201的不含信号序列的表达序列)

<400> 2

Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser Arg Trp Asp Ala

1 5 10 15

Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn

20 25 30

Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val Glu Lys Glu Gln

35 40 45

Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ile Gln Arg Gly Ser Arg Gly

50 55 60

Gln Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn

65 70 75 80

Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu

85 90 95

Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln Gln Asp Arg Ser

100 105 110

Gln Leu His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Asn Cys

115 120 125

Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser Arg Thr Pro Tyr

130 135 140

<210> 3

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO3 (Ara h 7.0的不含信号序列的表达序列)

<400> 3

Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Leu Arg Trp Asp Ala

1 5 10 15

Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu Gln Arg Ala Asn

20 25 30

Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val Glu Gln Glu Gln

35 40 45

Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Gln Arg Gly Ser Arg Gly

50 55 60

Arg Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln Arg Cys Cys Asn

65 70 75 80

Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Gln Ala Leu

85 90 95

Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln Gln Asp Arg Ser

100 105 110

Gln Leu His Gln Asn Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala Pro Glu Leu

115 120 125

Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro

130 135

<210> 4

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO4 (Ara h 2.0201的不含信号序列的表达序列)

<400> 4

Arg Gln Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln Lys Ile

20 25 30

Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg Arg Asp Pro Tyr Ser

50 55 60

Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln Glu

65 70 75 80

Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met

85 90 95

Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln

100 105 110

Gly Arg Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro

115 120 125

Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Glu Val Glu

130 135 140

Ser Gly Gly Arg Asp Arg Tyr

145 150

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO5 (Ara h 6.0101的不含信号序列的表达序列)

<400> 5

Met Arg Arg Glu Arg Gly Arg Gln Gly Asp Ser Ser Ser Cys Glu Arg

1 5 10 15

Gln Val Asp Arg Val Asn Leu Lys Pro Cys Glu Gln His Ile Met Gln

20 25 30

Arg Ile Met Gly Glu Gln Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Ile Arg Ser

35 40 45

Thr Arg Ser Ser Asp Gln Gln Gln Arg Cys Cys Asp Glu Leu Asn Glu

50 55 60

Met Glu Asn Thr Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met

65 70 75 80

Glu Asn Gln Cys Asp Arg Leu Gln Asp Arg Gln Met Val Gln Gln Phe

85 90 95

Lys Arg Glu Leu Met Asn Leu Pro Gln Gln Cys Asn Phe Arg Ala Pro

100 105 110

Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Ser Gly Gly Arg Cys

115 120

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO6 (Ara h 7同种型7.0201的C端)

<400> 6

His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Asn Cys Gly Phe

1 5 10 15

Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser Arg Thr Pro Tyr

20 25 30

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO7 (Ara h 7同种型7.0201的C端)

<400> 7

Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys

1 5 10

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO8 (来自Ara h 7同种型7.0201的C端的反应性表位)

<400> 8

Gly Phe Arg Ser Pro Ser

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO9 (Ara h 7同种型7.0201的C端)

<400> 9

Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO10 (Ara h 7同种型7.0201的C端)

<400> 10

Gln Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO11 (Ara h 7同种型7.0101，如实施例1中所表达的)

<400> 11

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser

20 25 30

Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu

35 40 45

Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Met Arg Arg Arg Val

50 55 60

Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Arg Arg

65 70 75 80

Gly Ser Arg Gly Arg Gln Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asn Gln Glu Gln

85 90 95

Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met

100 105 110

Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Trp Val Pro

115 120 125

Ala Gly Gln Glu Pro Val Ala Ser Asp Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu

130 135 140

Ala Pro Glu Leu Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu

145 150 155

<210> 12

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO12 (Ara h 7同种型7.0201，如实施例1中所表达的)

<400> 12

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Ser

20 25 30

Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu

35 40 45

Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val

50 55 60

Glu Lys Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ile Gln Arg

65 70 75 80

Gly Ser Arg Gly Gln Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln

85 90 95

Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met

100 105 110

Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln

115 120 125

Gln Asp Arg Ser Gln Leu His Gln Met Glu Arg Glu Leu Arg Asn Leu

130 135 140

Pro Gln Asn Cys Gly Phe Arg Ser Pro Ser Arg Cys Asp Leu Ser Ser

145 150 155 160

Arg Thr Pro Tyr

<210> 13

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO13 (Ara h 7同种型7.0，如实施例1中所表达的)

<400> 13

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Thr Arg Trp Asp Pro Asp Arg Gly Ser Arg Gly Leu

20 25 30

Arg Trp Asp Ala Pro Ser Arg Gly Asp Asp Gln Cys Gln Arg Gln Leu

35 40 45

Gln Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Glu His Ile Arg Gln Arg Val

50 55 60

Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Asp Glu Tyr Pro Tyr Ser Gln Arg

65 70 75 80

Gly Ser Arg Gly Arg Arg Pro Gly Glu Ser Asp Glu Asp Gln Glu Gln

85 90 95

Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Arg Phe Gln Asn Asn Gln Arg Cys Met

100 105 110

Cys Gln Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ser Phe Arg Phe Gln

115 120 125

Gln Asp Arg Ser Gln Leu His Gln Asn Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu

130 135 140

Ala Pro Glu Leu Arg Val Gln Val Thr Lys Pro Leu Arg Pro

145 150 155

<210> 14

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO14 (Ara h 2同种型2.0201，如实施例1中所表达的)

<400> 14

Met Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg Thr Met Arg Gln

1 5 10 15

Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu Glu Arg

20 25 30

Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln Lys Ile Gln Arg

35 40 45

Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro

50 55 60

Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser

65 70 75 80

Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln Glu Arg Cys

85 90 95

Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Glu

100 105 110

Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln Gly Arg

115 120 125

Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln

130 135 140

Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Glu Val Glu Ser Gly

145 150 155 160

Gly Arg Asp Arg Tyr

165

<210> 15

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO15 (Ara h 6同种型6.0101，如实施例1中所表达的)

<400> 15

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Arg Arg Glu Arg Gly Arg Gln Gly Asp Ser Ser Ser

20 25 30

Cys Glu Arg Gln Val Asp Arg Val Asn Leu Lys Pro Cys Glu Gln His

35 40 45

Ile Met Gln Arg Ile Met Gly Glu Gln Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp

50 55 60

Ile Arg Ser Thr Arg Ser Ser Asp Gln Gln Gln Arg Cys Cys Asp Glu

65 70 75 80

Leu Asn Glu Met Glu Asn Thr Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln

85 90 95

Gln Ile Met Glu Asn Gln Cys Asp Arg Leu Gln Asp Arg Gln Met Val

100 105 110

Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Met Asn Leu Pro Gln Gln Cys Asn Phe

115 120 125

Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Ser Gly Gly Arg Cys

130 135 140

<210> 16

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO16: 如实施例3中所用的Ara h 1.01.01

<400> 16

Met Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg Thr Met Lys Ser

1 5 10 15

Ser Pro Tyr Gln Lys Lys Thr Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu

20 25 30

Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu

35 40 45

Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro

50 55 60

Arg Gly His Thr Gly Thr Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg

65 70 75 80

Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro

85 90 95

Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg

100 105 110

Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro

115 120 125

Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu

130 135 140

Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val Arg Glu Glu Thr Ser Arg

145 150 155 160

Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg Arg Phe Ser Thr Arg Tyr Gly

165 170 175

Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Val Leu Gln Arg Phe Asp Gln Arg Ser

180 185 190

Arg Gln Phe Gln Asn Leu Gln Asn His Arg Ile Val Gln Ile Glu Ala

195 200 205

Lys Pro Asn Thr Leu Val Leu Pro Lys His Ala Asp Ala Asp Asn Ile

210 215 220

Leu Val Ile Gln Gln Gly Gln Ala Thr Val Thr Val Ala Asn Gly Asn

225 230 235 240

Asn Arg Lys Ser Phe Asn Leu Asp Glu Gly His Ala Leu Arg Ile Pro

245 250 255

Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg His Asp Asn Gln Asn Leu

260 265 270

Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln Phe Glu

275 280 285

Asp Phe Phe Pro Ala Ser Ser Arg Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Gln Gly

290 295 300

Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala Phe Asn Ala Glu Phe Asn Glu

305 310 315 320

Ile Arg Arg Val Leu Leu Glu Glu Asn Ala Gly Gly Glu Gln Glu Glu

325 330 335

Arg Gly Gln Arg Arg Trp Ser Thr Arg Ser Ser Glu Asn Asn Glu Gly

340 345 350

Val Ile Val Lys Val Ser Lys Glu His Val Glu Glu Leu Thr Lys His

355 360 365

Ala Lys Ser Val Ser Lys Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gly Asp Ile Thr

370 375 380

Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe

385 390 395 400

Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn Pro Gln Leu Gln

405 410 415

Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys Val Glu Ile Lys Glu Gly Ala Leu

420 425 430

Met Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Met Val Ile Val Val Val Asn

435 440 445

Lys Gly Thr Gly Asn Leu Glu Leu Val Ala Val Arg Lys Glu Gln Gln

450 455 460

Gln Arg Gly Arg Arg Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu

465 470 475 480

Gly Ser Asn Arg Glu Val Arg Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly

485 490 495

Asp Val Phe Ile Met Pro Ala Ala His Pro Val Ala Ile Asn Ala Ser

500 505 510

Ser Glu Leu His Leu Leu Gly Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn His

515 520 525

Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu

530 535 540

Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu

545 550 555 560

Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro

565 570 575

Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys Glu Ser Pro Glu

580 585 590

Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu Leu

595 600 605

Ser Ile Leu Lys Ala Phe Asn

610 615

<210> 17

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO17: 如实施例3中所用的Ara h 3.01.01

<400> 17

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Arg Gln Gln Pro Glu Glu Asn Ala Cys Gln Phe Gln

20 25 30

Arg Leu Asn Ala Gln Arg Pro Asp Asn Arg Ile Glu Ser Glu Gly Gly

35 40 45

Tyr Ile Glu Thr Trp Asn Pro Asn Asn Gln Glu Phe Glu Cys Ala Gly

50 55 60

Val Ala Leu Ser Arg Leu Val Leu Arg Arg Asn Ala Leu Arg Arg Pro

65 70 75 80

Phe Tyr Ser Asn Ala Pro Gln Glu Ile Phe Ile Gln Gln Gly Arg Gly

85 90 95

Tyr Phe Gly Leu Ile Phe Pro Gly Cys Pro Arg His Tyr Glu Glu Pro

100 105 110

His Thr Gln Gly Arg Arg Ser Gln Ser Gln Arg Pro Pro Arg Arg Leu

115 120 125

Gln Gly Glu Asp Gln Ser Gln Gln Gln Arg Asp Ser His Gln Lys Val

130 135 140

His Arg Phe Asp Glu Gly Asp Leu Ile Ala Val Pro Thr Gly Val Ala

145 150 155 160

Phe Trp Leu Tyr Asn Asp His Asp Thr Asp Val Val Ala Val Ser Leu

165 170 175

Thr Asp Thr Asn Asn Asn Asp Asn Gln Leu Asp Gln Phe Pro Arg Arg

180 185 190

Phe Asn Leu Ala Gly Asn Thr Glu Gln Glu Phe Leu Arg Tyr Gln Gln

195 200 205

Gln Ser Arg Gln Ser Arg Arg Arg Ser Leu Pro Tyr Ser Pro Tyr Ser

210 215 220

Pro Gln Ser Gln Pro Arg Gln Glu Glu Arg Glu Phe Ser Pro Arg Gly

225 230 235 240

Gln His Ser Arg Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu Glu Glu Asn Glu Gly

245 250 255

Gly Asn Ile Phe Ser Gly Phe Thr Pro Glu Phe Leu Glu Gln Ala Phe

260 265 270

Gln Val Asp Asp Arg Gln Ile Val Gln Asn Leu Arg Gly Glu Thr Glu

275 280 285

Ser Glu Glu Glu Gly Ala Ile Val Thr Val Arg Gly Gly Leu Arg Ile

290 295 300

Leu Ser Pro Asp Arg Lys Arg Arg Ala Asp Glu Glu Glu Glu Tyr Asp

305 310 315 320

Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Asp Glu Glu Asp Arg Arg Arg Gly Arg Gly

325 330 335

Ser Arg Gly Arg Gly Asn Gly Ile Glu Glu Thr Ile Cys Thr Ala Ser

340 345 350

Ala Lys Lys Asn Ile Gly Arg Asn Arg Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro

355 360 365

Gln Ala Gly Ser Leu Lys Thr Ala Asn Asp Leu Asn Leu Leu Ile Leu

370 375 380

Arg Trp Leu Gly Pro Ser Ala Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Arg Asn Ala

385 390 395 400

Leu Phe Val Ala His Tyr Asn Thr Asn Ala His Ser Ile Ile Tyr Arg

405 410 415

Leu Arg Gly Arg Ala His Val Gln Val Val Asp Ser Asn Gly Asn Arg

420 425 430

Val Tyr Asp Glu Glu Leu Gln Glu Gly His Val Leu Val Val Pro Gln

435 440 445

Asn Phe Ala Val Ala Gly Lys Ser Gln Ser Glu Asn Phe Glu Tyr Val

450 455 460

Ala Phe Lys Thr Asp Ser Arg Pro Ser Ile Ala Asn Leu Ala Gly Glu

465 470 475 480

Asn Ser Val Ile Asp Asn Leu Pro Glu Glu Val Val Ala Asn Ser Tyr

485 490 495

Gly Leu Gln Arg Glu Gln Ala Arg Gln Leu Lys Asn Asn Asn Pro Phe

500 505 510

Lys Phe Phe Val Pro Pro Ser Gln Gln Ser Pro Arg Ala Val Ala

515 520 525

Claims

1.一种诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对Ara h7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具，

其中所述载体优选选自珠子、测试条，微量滴定板，微阵列，衍生自纤维素的固体聚合物，印迹，优选选自蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹的印迹，玻璃表面，载玻片，生物芯片和膜，并且最优选是微量滴定板或线印迹。

2.根据权利要求1所述的诊断上有用的载体，其中所述载体进一步包含用于特异性捕获以下抗体的工具：针对选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Arah 5，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9的一种或多种其他抗原的抗体，更优选针对Ara h 2的抗体和/或针对Ara h 6的抗体，最优选针对Ara h 2的抗体。

3.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的诊断上有用的载体，和任选用于特异性检测捕获的抗体的工具。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，

其中所述诊断上有用的载体包含用于特异性捕获针对选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5的一种或多种其它抗原的抗体的工具，

其中用于特异性捕获针对同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种其他抗原的抗体的工具在分开的载体上，或者

其中用于特异性捕获针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的工具和用于特异性捕获针对一种或多种其他抗原的抗体的工具在一个载体上，优选与一个载体共价连接。

5.一种方法，所述方法包括在来自受试者的样品中检测针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选针对选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选针对SEQ ID NO8的抗体的存在的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在来自受试者的样品中检测针对一种或多种其他抗原的抗体的存在，所述抗原优选地选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h 9、Ara h 8和Ara h 5，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3和Ara h 9，最优选Ara h 2和/或Ara h 6。

7.根据权利要求5至6中任一项所述的方法，其中同时检测针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的存在或不存在以及针对一种或多种其他抗原，优选针对Ara h 2和/或Ara h 6的抗体的存在。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在空间上分离的结合反应中检测针对Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO 8的抗体的存在或不存在以及针对一种或多种其他抗原的抗体的存在。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中在一锅反应中检测针对Ara h 7同种型7.0201的抗体的存在以及针对一种或多种其他抗原的抗体的存在。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的载体、试剂盒或方法，其中针对同种型7.0201的抗体是对Ara h 7，优选同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选选自SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选SEQ ID NO8具有单特异性的抗体。

11.一种药物组合物，其包含含有SEQ ID NO 8、更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201、或其变体的多肽，和优选包含选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3、Ara h9、Ara h 8和Ara h 5及其变体，更优选选自Ara h 2、Ara h 6、Ara h 1、Ara h 3和Ara h 9及其变体，最优选Ara h 2和/或Ara h 6的一种或多种其他抗原。

12.一种多肽，其包含SEQ ID NO 8，更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列，更优选SEQ ID NO6，最优选Ara h 7同种型7.0201，或其变体，其中所述多肽是重组的、固定化的、纯化的或融合蛋白，优选是纯化和重组并固定化的。

13.根据权利要求12所述的多肽、根据权利要求1至2中任一项所述的载体或根据权利要求3至4中任一项所述的试剂盒用于诊断花生过敏的用途，其中优选所述诊断的灵敏度增加。

14.根据权利要求12所述的多肽用于制备用于诊断花生过敏的试剂盒的用途，其中优选诊断的灵敏度增加。

15.根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求12所述的多肽或根据权利要求13至14中任一项所述的用途，其中包含SEQ ID NO 8、更优选选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列、更优选SEQ ID NO6、最优选Ara h 7同种型7.0201、或其变体的多肽是包含所述多肽和Ara h 2和/或Ara h 6或其变体的组合物。

16.一种抗体，优选IgE、IgG1和IgG4类抗体，其特异性结合Ara h 7同种型7.0201，优选SEQ ID NO6，更优选选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列，最优选SEQ ID NO8，所述抗体优选是分离的抗体。

17.根据权利要求16所述的抗体用于诊断花生过敏或用于制备用于诊断花生过敏的试剂盒的用途。