JP2018132525A - ピーナッツアレルギーの診断のための改善されたアッセイ - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明の根底にある課題は、ピーナッツアレルゲンに対する抗体の検出に基づく診断アッセイの技術水準と関連する何らかの欠点を克服することである。
【解決手段】本発明は、被験体に由来するサンプル中でＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む診断上有用なキャリア；被験体に由来するサンプル中でＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在を検出する工程を包含する方法、およびＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１またはその改変体を含む薬学的組成物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、被験体に由来するサンプル中でＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む診断上有用なキャリア；被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在を検出する工程を包含する方法、およびＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む薬学的組成物に関する。
食品アレルギーの中で、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇｅａ）に関するアレルギーは、比較的一般的であり、典型的に永続的であり、そしてしばしば重篤であることから、最も研究の注目を集めている。米国において食品アナフィラキシーによる死亡記録は、６３名の死亡者のうちの５９％における誘因としてピーナッツを意味しており、青年および若年成人が最も大きなリスクにあることを示し、さらなるリスクファクターは、喘息およびアナフィラキシーの間のエピネフリンの注射が遅れてしまうことである。ピーナッツは、どこにでもある食品であり、罹患した患者は、しばしば少用量にも反応し、摂取を回避し、クオリティー・オブ・ライフに対して負の影響を経験する数多くのハードルに直面する。
ピーナッツアレルギーは、主に２つの状況において疑われる：患者が重篤なアレルギー反応を示す場合または他の食品もしくは空気アレルゲンに対するアレルギー状態をモニターしている状況において。ピーナッツ感作が陽性の皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）、またはピーナッツ特異的ＩｇＥアッセイによって発見される場合、臨床上の疾患に対するその診断の信頼性は、現在は不十分であり、患者は、二重盲検プラセボ対照食品チャレンジ（ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｆｏｏｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）（ＤＢＰＣＦＣ）に基づく診断を提供する特別な施設に委ねられる。この手順は、食品アレルギー診断の常套手段であるが、その適用は入院を要し、コストがかかる。さらに、訓練を積んだ医師のコントロール下にあっても、ピーナッツでのＤＢＰＣＦＣは、重篤なまたは生命を脅かす反応を引き起こし得る。
従って、ピーナッツアレルギーに罹患していると疑われる被験体に由来するサンプル中の特異的抗体の検出に基づいて、ピーナッツアレルギーの診断のための改善されたアッセイは、大きな関心事である。
技術水準で記載されるアッセイは、天然のまたは組換えのアレルゲンを使用する主要なピーナッツアレルゲン（例えば、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ６）の検出に依拠する（Ｆｌｉｎｔｅｒｍａｎ， Ａ． Ｅ．， ｖａｎ Ｈｏｆｆｅｎ， Ｅ．， ｄｅｎ Ｈａｒｔｏｇ， Ｊａｇｅｒ Ｃ． Ｆ．， Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ， Ｓ．， Ｐａｓｍａｎｓ， Ｓ． Ｇ．， Ｈｏｅｋｓｔｒａ， Ｍ． Ｏ．， Ｂｒｕｉｊｎｚｅｅｌ−Ｋｏｏｍｅｎ， Ｃ． Ａ．， Ｋｎｕｌｓｔ， Ａ． Ｃ．， Ｋｎｏｌ， Ｅ． Ｆ． （２００７）： Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ａｒａ ｈ ２ ａｎｄ Ａｒａ ｈ ６， ｗｈｉｃｈ ｒｅｍａｉｎｓ ｓｔａｂｌｅ ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２００７；３７； １２２１−１２２８； ｄｅ Ｌｅｏｎ， Ｍ． Ｐ．， Ｄｒｅｗ， Ａ． Ｃ．， Ｇｌａｓｐｏｌｅ， Ｉ． Ｎ．， Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ， Ｃ．， Ｏ’Ｈｅｈｉｒ， Ｒ． Ｅ．， Ｒｏｌｌａｎｄ， Ｊ． Ｍ． （２００７）： ＩｇＥ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ａｒａ ｈ ２ ａｎｄ ｔｒｅｅ ｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； ４４： ４６３−４７１）。
Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６は、コングルチンタイプの２Ｓ貯蔵タンパク質であり、プロラミンスーパーファミリーに属する。このファミリーのメンバーは、３個または４個の分子内ジスルフィド結合を形成する約１００アミノ酸残基の配列内に位置する６個または８個のシステイン残基の保存されたパターンの存在によって特徴付けられる。それらは、熱処理およびタンパク質分解に安定である。
Ａｒａ ｈ ２は、ピーナッツの主要アレルゲンであり、ＭＷ １，４１４Ｄａを有する１２アミノ酸の挿入に起因して、異なる分子量（ＭＷ）を有する２種のアイソフォームで存在する。その一次タンパク質配列において、Ａｒａ ｈ ６は、Ａｒａ ｈ ２と５３％の同一性を示し、Ａｒａ ｈ ２と比較すると、８個のシステインの代わりに１０個のシステインを有するが、Ｎ−グリコシル化部位はない。Ａｒａ ｈ ２と同様に、Ａｒａ ｈ ６は、消化に対して抵抗性、かつ加熱に対して、特に、焼成プロセスにおいて安定である。Ａｒａ ｈ ６の三次構造は解明されており、少なくとも４個のα−らせん構造およびジスルフィド結合の位置パラメーターが同定された。生理学的条件下での消化実験において、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６は、還元条件下ですら安定なフラグメントを形成する。このことは、Ａｒａ ｈ ２とＡｒａ ｈ ６との間での交差反応性が、ＩｇＥ反応性立体構造エピトープによって媒介されるという考えを裏付ける（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｈ．， Ｋｒａｕｓｅ， Ｓ．， Ｇｅｌｈａｕｓ， Ｃ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ａ．， Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｏ．， ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ， Ｗ． Ｍ． （２０１０）： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ Ａｒａ ｈ ７， ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ ｆａｍｉｌｙ， Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１０； ９： ３７０１- ７０９．）。
Ａｒａ ｈ ７は、別のピーナッツアレルゲンである。そしてそのアイソタイプＡｒａ ｈ ７．０１０１は、ファージディスプレーシステムによって初めて同定され、クローニングされたが、当初、天然の対応物はピーナッツ抽出物中で見出されなかった。それは、アレルギーに対するその影響が、技術水準では低いと記載されている理由のうちの１つである。
Ｓｃｈｍｉｄｔら（２００８， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｒａ ｈ ７， ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｐｅａｎｕｔ Ａｌｌｇｅｒｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ２Ｓ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｆａｍｉｌｙ）は、別のアイソタイプが存在する（Ａｒａ ｈ ７．０２０１）ことを見出した。Ａｒａ ｈ ７．０は、７．０１０１に加えて、データベースＵＮＩＰＲＯＴにおいて公開された別のアイソタイプである。しかし、Ｓｃｈｍｉｄｔらは、診断適用に言及していない；プロテオミクス研究があるのみである。
さらに、Ｓｃｈｍｉｄｔらが使用した６名の患者の血清のうちの５つのみ（これらは、Ａｒａ ｈ ７．０１０１反応性によって予め選択された）が、Ａｒａ ｈ ７．０２０１と陽性のＩｇＥ結合を示した。このことは、Ａｒａ ｈ ７．０２０１が実際には反応性が低く（！）、従って、Ａｒａ ｈ ７．０１０１より診断価値がさらに低いことを示唆する。従って、Ａｒａ ｈ ７．０２０１は、発明者が知る限りにおいて現在まで慣用的な診断には使用されていない。
さらに、いくつかの研究から、精製ピーナッツタンパク質（Ａｒａ ｈ １〜３， Ａｒａ ｈ ６）を使用して免疫学的パラメーターの範囲が評価され、臨床上の重篤度と、低濃度でのＡｒａ ｈ ２および６の認識、ならびにより高濃度でのＡｒａ ｈ １および３の認識とには相関関係が見出された。これは、Ａｒａ ｈ ２の見かけ上の増大した有効性を示す（Ｐｅｅｔｅｒｓ， Ｋ． Ａ．， Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ， Ｓ． Ｊ．， ｖａｎ Ｈｏｆｆｅｎ， Ｅ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｔａｓ， Ｃ． Ｗ．， ｄｅｎ Ｈａｒｔｏｇ， Ｊａｇｅｒ Ｃ． Ｆ．， Ｐｅｎｎｉｎｋｓ， Ａ． Ｈ．， Ｈｅｆｌｅ， Ｓ． Ｌ．， Ｂｒｕｉｊｎｚｅｅｌ−Ｋｏｏｍｅｎ， Ｃ． Ａ．， Ｋｎｏｌ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｋｎｕｌｓｔ， Ａ． Ｃ． （２００７）： Ｄｏｅｓ ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ？ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ． ２００７ Ｊａｎ； ３７（１）：１０８−１５．）。
ピーナッツアレルゲンＡｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ６およびＡｒａ ｈ ７に対するＩｇＥ抗体反応性は、組換えアレルゲンを使用して、ピーナッツアレルギー患者においても調査された。Ｃｏｄｒｅａｎｕらは、ピーナッツアレルギー患者の２つの大きなコホートにおいて、ピーナッツアレルギーの診断におけるタンパク質の能力を評価した。特異的ＩｇＥの測定を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ試験に伴うＵｎｉＣＡＰプラットフォームを使用して行った。彼らは、Ａｒａ ｈ ２はピーナッツアレルギー患者が最も頻繁に感作されるアレルゲンであり、検出可能なＩｇＥ抗体が症例のうちの７７〜１００％に存在し、Ａｒａ ｈ ６がこれに続く（３８〜８０％の症例）ことを報告した。対照的に、彼らのデータは、Ａｒａ ｈ ７に対して単一感受性（ｍｏｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）の患者は存在しないことを示唆する（Ｃｏｄｒｅａｎｕ， Ｆ．， Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ， Ｏ．， Ｒｏｉｔｅｌ， Ｏ．， Ｔｈｏｕｖｅｎｏｔ， Ｂ．， Ｓａｕｖａｇｅ， Ｃ．， Ｖｉｌａｉｎ， Ａ． Ｃ．， Ｃｏｕｓｉｎ， Ｍ． Ｏ．， Ｄｅｃｏｓｔｅｒ， Ａ．， Ｒｅｎａｕｄｉｎ， ＪＭ．， Ａｓｔｉｅｒ， Ｃ．， Ｍｏｎｎｅｚ， ＪＭ．， Ｖａｌｌｏｉｓ， Ｐ．， Ｍｏｒｉｓｓｅｔ， Ｍ．， Ｍｏｎｅｒｅｔ−Ｖａｕｔｒｉｎ， Ｄ． Ａ．， Ｂｒｕｌｌｉａｒｄ， Ｍ．， Ｏｇｉｅｒ， Ｖ．， Ｃａｓｔｅｌａｉｎ， Ｍ． Ｃ．， Ｋａｎｎｙ， Ｇ．， Ｂｉｈａｉｎ， Ｂ． Ｅ．， ａｎｄ Ｊａｃｑｕｅｎｅｔ， Ｓ． （２０１１）： Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１１；１５４（３）：２１６−２６．）。Ａｒａ ｈ ７に対して単一感受性の患者は存在しないという知見は、慣用的な診断にＡｒａ ｈ ７のいかなるアイソタイプをも使用しない別の理由であった。なぜならそれはピーナッツアレルギー患者を同定するための診断試験の感度を増大させないと考えられたからである。
現在では、ピーナッツに対してアレルギー性の多くの患者は、従来の試験の結果に基づいてアレルギー性と診断することはできない。ピーナッツアレルギーと関連する症状の重篤度に少なくとも鑑みても、最大限の感度の程度を有する診断の需要は継続して増大しつつある。
Ｆｌｉｎｔｅｒｍａｎ， Ａ． Ｅ．， ｖａｎ Ｈｏｆｆｅｎ， Ｅ．， ｄｅｎ Ｈａｒｔｏｇ， Ｊａｇｅｒ Ｃ． Ｆ．， Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ， Ｓ．， Ｐａｓｍａｎｓ， Ｓ． Ｇ．， Ｈｏｅｋｓｔｒａ， Ｍ． Ｏ．， Ｂｒｕｉｊｎｚｅｅｌ−Ｋｏｏｍｅｎ， Ｃ． Ａ．， Ｋｎｕｌｓｔ， Ａ． Ｃ．， Ｋｎｏｌ， Ｅ． Ｆ． （２００７）： Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ａｒａ ｈ ２ ａｎｄ Ａｒａ ｈ ６， ｗｈｉｃｈ ｒｅｍａｉｎｓ ｓｔａｂｌｅ ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２００７；３７； １２２１−１２２８ ｄｅ Ｌｅｏｎ， Ｍ． Ｐ．， Ｄｒｅｗ， Ａ． Ｃ．， Ｇｌａｓｐｏｌｅ， Ｉ． Ｎ．， Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ， Ｃ．， Ｏ’Ｈｅｈｉｒ， Ｒ． Ｅ．， Ｒｏｌｌａｎｄ， Ｊ． Ｍ． （２００７）： ＩｇＥ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ａｒａ ｈ ２ ａｎｄ ｔｒｅｅ ｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７； ４４： ４６３−４７１） Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｈ．， Ｋｒａｕｓｅ， Ｓ．， Ｇｅｌｈａｕｓ， Ｃ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ａ．， Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｏ．， ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ， Ｗ． Ｍ． （２０１０）： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ Ａｒａ ｈ ７， ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ ｆａｍｉｌｙ， Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１０； ９： ３７０１- ７０９． Ｐｅｅｔｅｒｓ， Ｋ． Ａ．， Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ， Ｓ． Ｊ．， ｖａｎ Ｈｏｆｆｅｎ， Ｅ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｔａｓ， Ｃ． Ｗ．， ｄｅｎ Ｈａｒｔｏｇ， Ｊａｇｅｒ Ｃ． Ｆ．， Ｐｅｎｎｉｎｋｓ， Ａ． Ｈ．， Ｈｅｆｌｅ， Ｓ． Ｌ．， Ｂｒｕｉｊｎｚｅｅｌ−Ｋｏｏｍｅｎ， Ｃ． Ａ．， Ｋｎｏｌ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｋｎｕｌｓｔ， Ａ． Ｃ． （２００７）： Ｄｏｅｓ ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ？ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ． ２００７ Ｊａｎ； ３７（１）：１０８−１５． Ｃｏｄｒｅａｎｕ， Ｆ．， Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ， Ｏ．， Ｒｏｉｔｅｌ， Ｏ．， Ｔｈｏｕｖｅｎｏｔ， Ｂ．， Ｓａｕｖａｇｅ， Ｃ．， Ｖｉｌａｉｎ， Ａ． Ｃ．， Ｃｏｕｓｉｎ， Ｍ． Ｏ．， Ｄｅｃｏｓｔｅｒ， Ａ．， Ｒｅｎａｕｄｉｎ， ＪＭ．， Ａｓｔｉｅｒ， Ｃ．， Ｍｏｎｎｅｚ， ＪＭ．， Ｖａｌｌｏｉｓ， Ｐ．， Ｍｏｒｉｓｓｅｔ， Ｍ．， Ｍｏｎｅｒｅｔ−Ｖａｕｔｒｉｎ， Ｄ． Ａ．， Ｂｒｕｌｌｉａｒｄ， Ｍ．， Ｏｇｉｅｒ， Ｖ．， Ｃａｓｔｅｌａｉｎ， Ｍ． Ｃ．， Ｋａｎｎｙ， Ｇ．， Ｂｉｈａｉｎ， Ｂ． Ｅ．， ａｎｄ Ｊａｃｑｕｅｎｅｔ， Ｓ． （２０１１）： Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１１；１５４（３）：２１６−２６．
本発明の根底にある課題は、ピーナッツアレルゲンに対する抗体の検出に基づく診断アッセイの技術水準と関連する何らかの欠点を克服することである。
本発明の根底にある別の課題は、従来のアッセイシステムを使用して診断されないまたは誤って診断されていたと思われる患者におけるアレルギー診断を可能にする、新たな抗原、新たなアッセイ、新たな試薬および新たな方法を提供することである。
本発明の根底にある別の課題は、ナッツアレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーに罹患している患者におけるＩｇＥ抗体の検出のために、改善された抗原を提供することである。
本発明の根底にある別の課題は、ナッツアレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーを診断するための代替法および代替試薬を提供することである。
本発明の根底にある別の課題は、ナッツアレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーの診断のための公知の方法および試薬と組み合わせて使用される場合に、全体的な診断の信頼性、特に、感度を増大させる方法および試薬を提供することである。
本発明の根底にある別の課題は、資源、特に、時間および使用される抗原の数の投資を最小限にして、全体的な診断の信頼性、特に感度を最大限にして、ナッツアレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーの診断を可能にする方法および試薬を提供することである。
本発明の根底にある課題は、添付の独立請求項および従属請求項の主題によって解決される。
第１の局面において、本発明の根底にある課題は、被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む診断上有用なキャリアによって解決される。
第１の局面の別の好ましい実施形態において、上記キャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含む。
第１の局面の別の好ましい実施形態において、上記診断上有用なキャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群からのブロット、ガラス表面、バイオチップならびに膜を含む群より選択され、最も好ましくはマイクロタイタープレートまたはラインブロットである。
第２の局面において、本発明の根底にある課題は、被験体に由来するサンプル中で、抗原Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む、好ましくは１もしくはこれより多くのさらなる抗原、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５の群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を、必要に応じて捕捉された抗体を特異的に検出するための手段もさらに含む、診断上有用なキャリアを含むキットによって解決される。
第２の局面の別の好ましい実施形態において、上記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含み、ここでＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための上記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための上記手段は、別個のキャリア上に存在する。
第２の局面の好ましい実施形態において、上記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含み、ここでＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための上記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための上記手段は、１個のキャリア上に、好ましくは１個のキャリアに共有結合して存在する。
第３の局面において、本発明の根底にある課題は、好ましくは、ナッツアレルギー、より好ましくはピーナッツアレルギーを診断するかまたはその診断を補助するための方法によって解決され、上記方法は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程を包含する。
第３の局面の好ましい実施形態において、上記方法は、好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群から、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ９を含む群から選択される、１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程をさらに包含する。
第３の局面の別の好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在は、同時に検出される。
第３の局面の別の好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ６および／またはＡｒａ ｈ ２に対する抗体の存在は、空間的に別個の結合反応において検出される。
第３の局面の別の好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ６および／またはＡｒａ ｈ ２に対する抗体の存在は、１ポット反応において検出される。
第３の局面の別の好ましい実施形態において、上記方法は、本発明に従う診断上有用なキャリアと上記被験体に由来するサンプルとを接触させる工程を包含する。
任意の局面の別の好ましい実施形態において、上記被験体は、アレルギー、好ましくはナッツに対するアレルギー、より好ましくはピーナッツに対するアレルギーに罹患しているかまたは罹患していると疑われている。
任意の局面の別の好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する抗体は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対して、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対して、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である。
第４の局面において、本発明の根底にある課題は、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体、ならびに好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５、およびこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６を含む薬学的組成物によって解決される。
第５の局面において、本発明の根底にある課題は、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくは Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、またはこれらの改変体を含むポリペプチドによって解決される。
好ましい実施形態において、本発明に従うポリペプチドは、固定化され、精製され、そして／または融合タンパク質であり、好ましくは精製され、より好ましくは固定化され、精製されており、より好ましくは精製され、組換えであり、固定化されている。
第６の局面において、上記課題は、ピーナッツアレルギーの診断のための本発明に従うポリペプチド、キャリアまたはキットの使用によって解決され、ここで好ましくはその感度は、増大される。
第７の局面において、上記課題は、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための本発明に従うポリペプチドの使用によって解決され、ここで好ましくは上記診断の感度は、増大されている。
好ましくは、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドは、上記ポリペプチドならびにＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはその改変体を含む組成物である。
第８の局面において、上記課題は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対して、最も好ましくは配列番号８に対して特異的に結合する抗体、好ましくはＩｇＥクラスの抗体によって解決され、それは、好ましくは単離された抗体である。上記抗体は、アフィニティーリガンドとして上記抗原を使用して、患者サンプルから標準プロトコルを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって単離され得る。
第９の局面において、上記課題は、ピーナッツアレルギーの診断のための、またはピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、本発明に従う抗体の使用によって解決される。
本発明は、ナッツに対するアレルギーを有すると疑われる患者に由来するサンプルに対して実施される診断法の一部として、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より具体的にはその驚くべき免疫反応性のＣ末端、特に、配列番号８を含むエピトープに対する抗体の検出に集中している。より驚くべきことには、いくらかのアレルギー患者は、配列番号８を含むＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対して単一特異的であるのみであり、他のＡｒａ ｈ ７アイソタイプ、より具体的には７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７．０に、ましてやＡｒａ ｈ ２またはＡｒａｈ ｈ ６に結合しない抗体を有する。
これは、以前に発表された研究、例えば、Ｃｏｄｒｅａｎｕらによる研究（これは、任意の（！）Ａｒａ ｈ ７アイソタイプに対する抗体の検出が、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６の検出から生じるデータと比較して、または特にそのデータを超えて、限られた診断価値を有することを示唆する）とは著しく対照的である。特に、これらの研究は、任意のＡｒａ ｈ ７アイソタイプに対してモノ特異的な抗体を有する患者が存在しないことを示唆する。
本発明は、診断上有用なキャリアであって、これは、抗体を特異的に捕捉するための手段（この手段は、キャリアと会合している）と、被験体（好ましくは哺乳動物被験体、より好ましくはヒト被験体）に由来する体液サンプルとを接触させるために、好ましくは固体キャリアであるものに関する。好ましい実施形態において、上記固体キャリアは、診断デバイス、より好ましくはビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、ブロット、ガラス表面、バイオチップおよび膜を含む群から、より好ましくはブロット、試験ストリップおよび膜を含む群から選択される。最も好ましい実施形態において、上記診断上有用なキャリアは、マイクロタイタープレートまたはラインブロットである（Ｒａｏｕｌｔ， Ｄ．， ａｎｄ Ｄａｓｃｈ， Ｇ． Ａ． （１９８９）， Ｔｈｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ： ａｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２５ （１−２）， ５７−６５； ＷＯ２０１３０４１５４０）。好ましい実施形態において、用語「ラインブロット」とは、本明細書で使用される場合、試験ストリップ、より好ましくは膜ベースの、抗体を捕捉するための１もしくはこれより多くの手段、好ましくは各々ポリペプチドで被覆されているものをいう。２もしくはこれより多くの手段が使用される場合、それらは、上記キャリア上で好ましくは空間的に分離している。好ましくはそのバンドの幅は、上記試験ストリップの幅の少なくとも３０％、より好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％または８０％である。上記試験ストリップは、十分に長くかつ適切な条件下で、特に、ヒト血清、抗体結合体、またはその両方の存在下でサンプルと接触されていることを確認するために、１もしくはこれより多くのコントロールバンドを含み得る。多くのラインブロットは、例えば、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ（Ｌuｂｅｃｋ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
本発明を実施するために使用される被験体に由来するサンプルは、抗体（免疫グロブリンともいわれる）を含む。代表的には、上記サンプルは、上記被験体の免疫グロブリン全体の代表的セットを含む体液である。しかし、上記サンプルは、一旦提供されると、種々のクラスの免疫グロブリンの相対的分布に影響を及ぼし得る上記被験体の免疫グロブリン全体または任意の免疫グロブリンクラス、好ましくはＩｇＥの分画、遠心分離、富化または単離を含み得るさらなる処理に供され得る。上記サンプルは、全血、血清、脳脊髄液および唾液を含む群から選択され得、好ましくは血清である。最も好ましい実施形態において、上記サンプルは、ＩｇＥクラス抗体を含む。より好ましい実施形態において、上記サンプルは、クラスＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＥ、好ましくはＩｇＧおよびＩｇＥ、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびＩｇＥからの上記被験体の抗体の代表的セットを含み、ここで最も好ましくは種々の抗原に対する抗体の数の比は、上記被験体から得られる場合のサンプル中の比と比較して、実質的には不変である。
上記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を、必要に応じて１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６）と組み合わせて含む。好ましい実施形態において、用語「Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１」、「Ａｒａ ｈ ２」、「Ａｒａ ｈ ６」、「Ａｒａ ｈ １」、「Ａｒａ ｈ ３」、「Ａｒａ ｈ ５」、「Ａｒａ ｈ ８」および「Ａｒａ ｈ ９」とは、本明細書で使用される場合、それぞれ、データベースコードＢ４ＸＩＤ４（Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、シグナルペプチドなしの発現された配列：配列番号２）、ならびにＱ６ＰＳＵ２（Ａｒａ ｈ ２、シグナルペプチドなしの発現された配列：配列番号４）、Ｑ６４７Ｇ９（Ａｒａ ｈ ６、シグナルペプチドなしの発現された配列：配列番号５）、Ｐ４３２３８（Ａｒａ ｈ １）、Ｏ８２５８０（Ａｒａ ｈ ３）、Ｑ９ＳＱＩ９（Ａｒａ ｈ ５）、Ｂ０ＹＩＵ５またはＱ６ＶＴ８３（Ａｒａ ｈ ８の２種のアイソタイプ）、およびＢ６ＣＧ４１またはＢ６ＣＥＸ８（Ａｒａ ｈ ９の２種のアイソタイプ）およびこれらの改変体によって表されるポリペプチドをいう。好ましくは用語「Ａｒａ ｈ ７」とは、本明細書で使用される場合、３種のＡｒａ ｈ ７アイソタイプの全体をいい、用語「Ａｒａ ｈ ７．０１０１」とは、配列番号１の配列を有するアイソタイプをいい、用語「Ａｒａ ｈ ７．０」とは、配列番号３の配列を有するアイソタイプをいう。この出願全体を通じて言及される任意のデータベースコードは、この出願の優先日においてオンライン時にＮＣＢＩデータベースを介して入手可能であったポリペプチド配列に言及する。好ましくは、抗体がサンプル中で検出され、この抗体は、本発明に従うＡｒａ ｈ ７．０２０１に結合するが、他のＡｒａ ｈ ７アイソタイプのいずれにも、より具体的には、Ａｒａ ｈ ７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７．０には結合しない。そしてＡｒａ ｈ ７ ｉｓｏｔｙｐ ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、この目的のために構成され、好ましくは、配列番号８もしくはその改変体を含む群から選択される配列、好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号６、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドである。
好ましくは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体は、配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体である。より好ましくは、その抗体は、上記３種のＡｒａ ｈ ７アイソタイプによって共有されるいかなるエピトープにも結合しない。
好ましい実施形態において、用語「［抗原］Ｘに対する抗体および［抗原］Ｙに対する抗体を特異的に捕捉するための手段」とは、本明細書で使用される場合、［抗原］Ｘに対する抗体を特異的に捕捉するが、［抗原］Ｙに対する抗体を特異的に捕捉しない手段、および［抗原］Ｙに対する抗体を特異的に捕捉するが、［抗原］Ｘに対する抗体を特異的に捕捉しない手段の和をいう。
例えば、Ｘは、Ａｒａ ｈ ２であり得、Ｙは、Ａｒａ ｈ ６であり得る。この場合、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、Ａｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段、そしてさらに、Ａｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む。例えば、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６で、互いから空間的に分離してコーティングされたラインブロットは、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段である。
本発明によれば、上記キャリアは、抗体を特異的に捕捉するための１もしくはこれより多くの手段、好ましくは１もしくはこれより多くの、より好ましくは２もしくはこれより多くの、より好ましくは３もしくはこれより多くの、より好ましくは４もしくはこれより多くのこのような手段を含み、それらの各々は、異なる抗体を特異的に捕捉し得る。最も好ましい実施形態において、上記キャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１およびＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に検出するための手段を含む。上記手段は、好ましくは上記キャリア上に固定化される。好ましい実施形態において、抗体を特異的に捕捉するための上記手段は、捕捉または検出されるべき上記抗体が結合する抗原、またはその改変体（例えば、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１およびＡｒａ ｈ ６を含む群からの、好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、またはその改変体）を含むかまたはこれらからなるポリペプチドである。好ましくは、上記ペプチドは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の検出に使用される場合、配列番号８を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、またはこれらの改変体を含む。上記ポリペプチドは、直鎖ペプチドまたは折りたたまれたポリペプチドであり得、上記折りたたまれたポリペプチド、好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１と実質的に同じ折りたたみを採用する改変体は、ＣＤ分光法によって決定され得る。好ましい実施形態において、上記ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは１５アミノ酸の、捕捉または検出されるべき抗体に対するエピトープを含む。上記抗原は、付着される不溶性のキャリアと一緒に、反応混合物から分離され得、ここでそれはサンプルと直接的な様式で、例えば、濾過、遠心分離またはデカントすることによって接触される。上記抗原は、可逆的なまたは不可逆的な様式で固定化され得る。例えば、固定化は、分子が、高濃度の塩の添加によってマスクされ得るイオン間相互作用を介してキャリアと相互作用する場合または分子が切断可能な共有結合を介して結合される場合には可逆的である。対照的に、上記固定化は、分子が、水性溶液中で切断され得ない共有結合を介して上記キャリアに繋がれる場合に不可逆的である。上記ポリペプチドは、間接的に、例えば、上記ポリペプチドに対して親和性を有する抗体または他の実体を固定化し、続いて、上記ポリペプチドを添加し、ポリペプチド−抗体複合体を形成することによっても固定化され得る。
好ましい実施形態において、上記キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群からのブロット、ガラス表面、スライド、バイオチップならびに膜を含む群から選択され、最も好ましくはマイクロタイタープレートまたはラインブロットである。別の好ましい実施形態において、上記キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、ラインブロットおよびドットブロットを含む群から選択されるブロット、ガラス表面、スライド、ならびにバイオチップを含む群から選択され、そして最も好ましくはマイクロタイタープレートまたはラインブロットである。
上記診断上有用なキャリアが、ビーズである場合、ビーズの混合物（各々は、抗体を特異的に捕捉するための１タイプの手段を有する）が使用され得る。上記混合物は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８、またはこれらの改変体に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を有する少なくとも１種のビーズを含む。さらに、ビーズの混合物は、少なくとも１種のさらなるビーズを含み得、各ビーズは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多く、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を有する。
上記診断上有用なキャリアがビーズである場合、上記ビーズは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８、またはこれらの改変体に対する抗体を特異的に捕捉するための手段に加えて、抗体を特異的に捕捉するための少なくとももう１つの手段（この抗体は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多く、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体であり得る）を代わりに含み得る。最も好ましくは、このようなビーズは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段、Ａｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段ならびにＡｒａ ｈ ６に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む。
しかし、本発明の教示は、ポリペプチド、例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１を、必要に応じて、この出願において例えば、機能、名称、配列もしくはアクセッション番号によって明示的に、または暗示的に言及される正確な配列を有する１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６）と組み合わせて使用して実行され得るのみならず、このようなポリペプチドの改変体を使用しても実行され得る。
好ましい実施形態において、用語「改変体」とは、本明細書で使用される場合、言及される全長配列の少なくとも１つのフラグメント、より具体的には全長配列に対して、１もしくはこれより多くのアミノ酸が一方もしくは両方の末端において短縮されている１もしくはこれより多くのアミノ酸または核酸配列に言及し得る。このようなフラグメントは、元の配列のうちの少なくとも１０個、１５個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個もしくは２００個の連続するアミノ酸を有するペプチドまたはこれらの改変体を含むかまたはコードする。上記改変体の全体の長さは、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個もしくはこれより多くのアミノ酸にあり得る。
別の好ましい実施形態において、用語「改変体」とは、少なくとも１個のフラグメントに関するのみならず、アミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはそのフラグメント、好ましくは言及される参照アミノ酸配列もしくははそのフラグメントと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、少なくとも２５個、より好ましくは５０個、より好ましくは２００個の連続するアミノ酸を含むフラグメントにも関し、ここで生物学的活性、例えば、目的の抗体に特異的に結合する能力、または上記ポリペプチドの折りたたみもしくは構造に必須のもの以外のアミノ酸は、欠失もしくは置換される、そして／または１個もしくはこれより多くのこのような必須のアミノ酸は、保存的様式において置換される、そして／またはアミノ酸は、上記ポリペプチドの生物学的活性が少なくとも部分的に保存されるように、付加もしくは欠失される。技術水準は、２種の所定の核酸配列もしくはアミノ酸配列を整列させ、同一性の程度を計算するために使用され得る種々の方法を包含する（例えば、Ａｒｔｈｕｒ Ｌｅｓｋ （２００８）， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００８， 第３版を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェア（Ｌａｒｋｉｎ， Ｍ． Ａ．， Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ， Ｇ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ． Ｐ．， Ｃｈｅｎｎａ， Ｒ．， ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ， Ｐ． Ａ．， ＭｃＷｉｌｌｉａｍ， Ｈ．， Ｖａｌｅｎｔｉｎ， Ｆ．， Ｗａｌｌａｃｅ， Ｉ． Ｍ．， Ｗｉｌｍ， Ａ．， Ｌｏｐｅｚ， Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｄ．， Ｇｉｂｓｏｎ， Ｔ． Ｊ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ． Ｇ． （２００７）： Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２３， ２９４７−２９４８）は、デフォルト設定を適用して使用される。
好ましい実施形態において、改変体は、さらに、化学的改変、例えば、同位体標識または共有結合改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、脱炭酸、シトルリン化、ヒドロキシル化など）を含み得る。当業者は、ポリペプチドの改変のための方法に精通している。さらに、改変体は、他の公知のポリペプチドまたはその改変体との融合する方法によっても生成され得る。
ポリペプチドの改変体は、生物学的活性を有する。好ましい実施形態において、このような生物学的活性は、それぞれの抗体に結合する能力である。例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１の改変体は、ピーナッツに対してアレルギー性の被験体から得られるサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＧクラスの抗体、より好ましくはＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４クラスの抗体に特異的に結合する能力を有する。なぜなら上記改変体は、上記抗体が結合するエピトープを含むからである。好ましくは、上記改変体は、アレルギー患者に由来するサンプル中の抗体によって認識されるエピトープを含み、その抗体は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に、より好ましくは配列番号８を含むエピトープに、最も好ましくは配列番号８に結合し、より好ましくは、アイソタイプ７．０１０１または７．０）に結合しない。当業者は、元のＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１配列から出発することによって、配列番号８の重要性を心に留めながら生物学的活性を有する改変体を設計し得、点変異、短縮などのような改変を導入し、その後、その改変体がなお生物学的活性を有することを、ピーナッツに対してアレルギー性の被験体から得られるサンプル中で、好ましくは実施例１に詳細に記載されるとおりのＥＬＩＳＡを使用して、上記改変体がＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対するＩｇＥ抗体に結合するか否かを試験することによって確認する。
ポリペプチドが、例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段として使用される場合、上記ポリペプチドは、本発明の教示を実行するために使用されるときに、上記ペプチドを内因性形態で含む組織、実または細胞、より好ましくは上記ポリペプチドを過剰発現する細胞、このような細胞の粗製または富化された溶解物から、精製および／または実質的に純粋であり得る単離されたポリペプチドまで、任意の形態でおよび任意の精製程度で提供され得る。好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、天然のポリペプチドであり、ここで用語「天然のポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、折りたたまれたポリペプチド、より好ましくは組織もしくは細胞から、より好ましくは哺乳動物の細胞もしくは組織から、必要に応じて非組換え組織もしくは細胞から精製された、折りたたまれたポリペプチドをいう。天然のポリペプチドが使用される場合、それは、好ましくは、その天然の状態と比較して富化されている。
本発明によれば、上記ポリペプチドは、組換えタンパク質であり得、ここで用語「組換え」とは、本明細書で使用される場合、生成プロセスの任意の段階で、例えば、上記ポリペプチドをコードする核酸を、細胞もしくは組織中で過剰発現させるための強力なプロモーターに融合することによって、または上記ポリペプチド自体の配列を操作することによって、遺伝子操作アプローチを使用して生成されるポリペプチドをいう。当業者は、核酸およびコードされるポリペプチドを操作するための方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＣＳＨまたはＢｒｏｗｎ Ｔ． Ａ． （１９８６）， Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ - ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌに記載される）および天然もしくは組換えポリペプチドを生成および精製するための方法（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ 「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、刊行ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｒ． Ｒ．， Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍ． Ｐ． （２００９）： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に精通している。別の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり、ここで用語「単離された」とは、ポリペプチドが、生物工学的または合成アプローチを使用して生成された際の状態と比較して富化されており、好ましくは純粋である、すなわち、それぞれのサンプル中の上記ポリペプチドのうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて、クーマシーブルー染色、および目視検査によって判断される場合、上記ポリペプチドからなることを意味する。好ましくは、抗体を捕捉するための手段として使用されるキャリア上の任意のポリペプチドは、純粋である。
好ましい実施形態において、好ましくは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を提供するための方法は、本発明に従って提供され、上記方法は、ａ）Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群の配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を含むサンプルを提供する工程、ｂ）上記サンプルと、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは 配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段とを、上記抗体および上記手段を含む複合体の形成と適合性の条件下で接触させる工程、ならびにｃ）この複合体を単離し、必要に応じて、続いて上記複合体から放出する、および／または上記抗体を検出する工程を包含する。
上記サンプルを提供する本発明に従う被験体は、抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＧ、より好ましくは、ＩｇＥ、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４クラスまたは等価なアレルギー関連抗体を生成する生物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
本発明の範囲内には、抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１）に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む診断上有用なキャリアがある。好ましい実施形態において、用語「抗体を特異的に捕捉する」とは、本明細書で使用される場合、抗体が結合されて上記サンプルから除去されるのに対して、他の抗体（好ましくは同じくラスの他の抗体）は、実質的に結合されず上記サンプル中に残るという趣旨で、上記目的の抗体に特異的に結合する能力をいう。
本発明に従う診断上有用なキャリアは、抗体、好ましくは診断上関連する抗体を特異的に捕捉するための１もしくはこれより多くの手段のための足場として働く。上記キャリアは、診断法を実施するために適している。抗体を特異的に捕捉するための遊離の、可溶性の手段よりむしろキャリアを使用することによって、上記手段および上記抗体を含む複合体を上記サンプルから単離および分離し、そして上記複合体を、例えば、上記手段、複合体もしくはキャリアに非特異的に結合する任意の分子を除去する目的で洗浄することは、より簡単である。好ましい実施形態において、上記診断上有用なキャリアは、好ましくはビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、ブロットおよび膜を含む群より選択される診断デバイスであり、好ましくはマイクロタイタープレートまたはラインブロットである。
本発明によれば、捕捉された抗体を特異的に検出するための手段は、必要に応じて、キットの一部として提供される。好ましい実施形態において、用語「捕捉された抗体を特異的に検出する」とは、本明細書で使用される場合、上記抗体を特異的に捕捉するための手段（好ましくは Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１）に特異的に結合する抗体が、捕捉後に、上記サンプル中に存在する任意の他の抗体よりむしろ検出されることを意味する。好ましい実施形態において、用語「特異的に結合する」とは、本明細書で使用される場合、２５℃においてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）中でＢｉａｃｏｒｅ装置を使用して表面プラズモン共鳴によって決定される場合に、結合が、１×１０−５Ｍ、より好ましくは１×１０−７Ｍ、より好ましくは１×１０−８Ｍ、より好ましくは１×１０−９Ｍ、より好ましくは１×１０−１０Ｍ、より好ましくは１×１０−１１Ｍ、より好ましくは１×１０−１２Ｍという解離定数によって特徴付けられる結合反応よりも強いことを意味する。
好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段および１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、別個のキャリア上に存在する。これは、上記手段が単一のキャリアに付着していないが、別個であること、および／または損傷をそれらに与えることなく分離可能である１もしくはこれより多くのキャリアを意味する。例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、第１の試験ストリップに付着され得、Ａｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、上記第１の試験ストリップとは別個である別の試験ストリップに付着される。
別の好ましい実施形態において、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段および１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段は、１個のキャリア上に、好ましくは１個のキャリアに共有結合されて存在する。これは、上記手段が別個のキャリア上に存在するように、上記手段が、上記キャリアに損傷を与えることなく、分解され得ることがない１個のキャリアに付着されることを意味する。例えば、上記手段は、１枚の試験ストリップ、特に、ラインブロットの形態上に全てコーティングされ得る。
本発明の教示は、好ましくはアレルギーを診断するためのキット、より好ましくはピーナッツアレルギーを診断するためのキットを提供する。このようなキットは、本発明の方法を実施するために必要とされる特異的試薬、特に、本発明に従う診断上有用なキャリアを、必要に応じて、本発明の方法を実施するために必要とされる１もしくはこれより多くの溶液（好ましくはサンプル希釈緩衝液、洗浄緩衝液および任意の特異的に捕捉された抗体を検出するための手段（例えば、二次抗体および必要に応じて二次抗体を検出するための手段）を含む緩衝液を含む群より選択されるかまたはこの群から全て選択される）に加えて含む容器である。さらに、上記キットは、キットの使用方法を詳述する説明書および本発明のポリペプチドと、被験体（好ましくはヒト被験体）に由来する体液サンプルとを接触させるための本発明の診断上有用なキャリア（例えば、ラインブロット）を含み得、ここでＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための本発明の手段は、ラインブロット上に固定化される。さらに、上記キットは、陽性コントロール（例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に結合することが公知の組換え抗体）、および陰性コントロール（例えば、ウシ血清アルブミンなどの、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対して検出可能な親和性を全く有しないタンパク質）を含み得る。最後に、このようなキットは、検量線を調製するためのＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１結合抗体を含む標準溶液を含み得る。好ましい実施形態において、上記キットは、デバイス、好ましくはブロットベースのデバイス（例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段でコーティングされたラインブロット）、および必要に応じて、１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６）に対する抗体を含む。
本発明によれば、１もしくはこれより多くの捕捉された抗体を検出するための手段は、必要とされ、キット中に含まれ得る。当業者は、使用され得る多くの方法を承知しており、それらはまた、技術水準、例えば、Ｚａｎｅ， Ｈ． Ｄ． （２００１）， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ - Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（特に第１４章）に記載される。好ましい実施形態において、上記１もしくはこれより多くの捕捉された抗体（これは、相当する一次抗体である）の定常領域に結合する二次抗体が使用され、その二次抗体は、検出が容易な標識（例えば、蛍光標識、放射性標識または酵素的に活性な標識）と会合され得、そのうちの酵素的に活性な標識は、比色法または分光光度法または別の分析法を使用して検出可能な化学発光反応または分子の生成を触媒し得る。より好ましい実施形態において、上記二次抗体は、蛍光標識、放射性標識および化学発光標識を含む群から選択される標識と会合している。
あるいは、生物学的機能アッセイは、上記１もしくはこれより多くの捕捉された抗体を、それがＩｇＥクラス抗体であるという条件下で検出するための手段、好ましくはＩｇＥ抗体による好塩基球活性化に基づくアッセイとして使用され得る。このようなアッセイは、技術水準、例えば、Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｏ． Ｖ．， Ｇｅｎｔｉｎｅｔｔａ， Ｔ．， Ｂｒｉｄｔｓ， Ｃ． Ｈ．， ａｎｄ Ｅｂｏ， Ｅ． Ｇ． （２００９）： Ｔｈｅ Ｂａｓｏｐｈｉｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ ｉｎ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｔｙｐｅ Ｄｒｕｇ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｎ． Ａｍ． ２９， ５５５−５６６において記載されている。
好ましい実施形態において、用語「診断」とは、本明細書で使用される場合、患者が、ある特定の疾患もしくは障害に罹患しているか、あるいはある特定の疾患もしくは障害に、過去に、診断の時点でもしくは将来的に平均もしくは比較被験体（後者は、好ましくは類似の症状を有する）より罹患する可能性が高いかまたは罹患する可能性がより高いかの評価の助けになる情報を得ることを、疾患がどの程度進行しつつあるのかまたは将来的に進行する可能性があるのかを見出すことを、あるいはある特定の処置、例えば、適切な薬物（例えば、アレルギー患者の脱感作のための薬物）の投与に関して、患者の応答性を評価することを目的とする何らかの種類の手順をいう。言い換えると、用語「診断」は、疾患もしくは障害を診断するのみならず、その予後を予測する（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｉｎｇ）および／または経過をモニターすることを包含する。より好ましい実施形態において、用語「診断」は、本明細書で使用される場合、被験体（そのサンプルが本発明に従って分析される）が、ナッツ、好ましくはピーナッツに対するアレルギー（血液中のピーナッツ特異的アレルゲン（例えば、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６およびＡｒａ ｈ ７を含む群より選択されるもの（好ましくは Ａｒａ ｈ ７））に対する抗体の存在によって証明されるように）を有するか否か未知であることを含意する。
従って、用語「診断」は、好ましくは、本発明に従う診断法また診断薬剤が単一の試験、ましてやパラメーターに基づいて診断を最終決定するために決定的かつ十分であることを含意しないが、「鑑別診断」といわれるもの、すなわち、診断パラメーターの範囲に基づいて、考えられる状態の範囲の可能性を考慮した体系的な診断手順に対する寄与に言及し得る。用語「診断」はまた、患者のために最も有望な処置レジメンを選択するために使用される方法または薬剤に言及し得る。言い換えると、上記方法または薬剤は、被験体のための処置レジメンを選択することに関し得る。
本発明は、被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６を含む群からの配列、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在または非存在を検出する工程を包含する方法に関する。このような方法は、ａ）被験体に由来するサンプルを提供する工程、ｂ）上記サンプルと本発明に従う診断上有用なキャリアとを、上記診断上有用なキャリアおよび上記抗体（より具体的には、上記抗体を特異的に捕捉するための手段および上記抗体）を含む複合体の形成と適合性の条件下で接触させる工程、ｃ）任意の上記複合体を、例えば、上記サンプルを除去することによって単離する工程、ｄ）上記複合体を必要に応じて洗浄する工程、ならびにｅ）上記複合体を検出する工程を包含し得る。上記方法は、好ましくはインビトロ方法である。本発明に従う予後、診断、方法または試験キットに関する上記複合体の検出は、免疫拡散技術、ＩｇＥ抗体による好塩基球活性化、免疫電気泳動技術、光散乱イムノアッセイ、凝集技術、標識イムノアッセイ（例えば、放射性標識イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、比色アッセイ）、化学発光イムノアッセイおよび免疫蛍光技術を含む群からのアッセイ）を含む群から選択される方法の使用を包含する。好ましい実施形態において、上記複合体は、免疫拡散技術、ＩｇＥ抗体による好塩基球活性化、免疫電気泳動技術、光散乱イムノアッセイ、凝集技術、放射性標識イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイおよび免疫蛍光技術を含む群からの標識イムノアッセイを含む群から選択される方法を使用して検出される。当業者は、これらの方法に精通しており、これらの方法はまた、技術水準、例えば、Ｚａｎｅ， Ｈ． Ｄ． （２００１）： Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ - Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（特に、第１４章）において記載される。
多くの場合において、抗体の非存在または存在を検出する工程（必要に応じて、上記抗体の濃度が、サンプル中で、この方法による暗黙の検出限界において、しばしば検出限界によって示唆されるある特定の閾値（好ましくはＥＬＩＳＡ（好ましくは実施例１に記載されるとおり）を使用して測定することによって設定されるとおり）を超えるか否かを決定することを意味する）は、診断に十分である。上記抗体が検出され得る場合、これは、臨床医の診断の助けになる情報であり、上記患者が疾患に罹患する可能性の増大を示す。好ましい実施形態において、血清中の上記抗体の相対的濃度は、平均的で健康な被験体において見出され得るレベルと比較して決定され得る。好ましい実施形態において、用語「存在を検出する」とは、本明細書で使用される場合、任意のバックグラウンドレベルを十分に超えるシグナルが、上記目的の抗体が存在するかまたは健康な被験体にあるより多くの目的の抗体が存在することを示す適切な複合体検出法を使用して、検出され得るか否かをチェックするために十分であることを意味する。より好ましい実施形態において、これは、濃度が、平均的で健康な被験体において見出される目的の抗体の濃度より少なくとも０．１倍、好ましくは０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍高いか否かを決定することを包含し得る。
好ましい実施形態において、少なくとも抗体（例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体、ならびにＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体）の非存在または存在は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、すなわち同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）検出される。これは、効率的な診断手順に関して便利である。なぜなら診断情報の最大限が所定の期間に得られるからである。当然のことながら、必要条件は、十分な能力が全ての反応を実行するために利用可能であることである。
好ましい実施形態において、少なくとも２種の抗体（例えば、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体、ならびにＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体）の非存在または存在は、空間的に別個の反応において検出される。これは、これらの反応が、別個の容器中での異なる反応混合物において実行されることを意味する。
１種より多くの抗体が検出されるべきである場合、上記方法は、１ポット反応において行われ得る。好ましくは、用語「１ポット反応」とは、本明細書で使用される場合、抗体の存在または非存在を検出する目的で行われる２種もしくはこれより多くの、好ましくは全ての反応が、少なくとも２種の反応が別個の溶液および反応容器の中で行われることを企図する実験設定とは対照的に、１個の反応容器の中で、反応間で物理的バリアなしに、同じ反応混合物中で行われることを意味する。
検出されるべき抗体は、単一特異的抗体であり得る。好ましい実施形態において、用語「単一特異的抗体」とは、本明細書で使用される場合、１種の抗原のみ、好ましくは１種の診断に関連する抗原のみ、より好ましくはＡｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６を含む群からの１種のみの診断に関連する抗原に結合する抗体をいう。より好ましい実施形態において、検出されるべき単一特異的抗体は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に、好ましくは配列番号６に、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に、最も好ましくは配列番号８に結合し得るが、いかなる他のアレルゲン（例えば、アイソタイプＡｒａ ｈ ７０１０１、Ａｒａ ｈ ７．０、または例えば、Ａｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６）には結合しない。患者が単一特異的抗体のみを有する場合、彼らのアレルギーは、上記単一特異的抗体を特異的に捕捉し検出するための手段が使用される場合には、血清学の方法によってしか検出することはできない。配列番号８を含まない、７．０２０１以外のＡｒａ ｈ ７アイソタイプに対する抗体を検出するための手段に基づく診断アッセイが使用される場合、そのアッセイの結果は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より好ましくは 配列番号８に対して単一特異的な抗体が検出され得ないことから偽陰性になり得る。
本発明は、診断上有用なキャリアの感度を増大させるため、Ａｒａ ｈ ７に対する抗体、好ましくはＡｒａ ｈ ７に対する単一特異的抗体を検出するため、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットを製造するため、またはナッツアレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーを診断するための方法のための手段であって、必要に応じて、１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６）に対する抗体を特異的に捕捉するための手段と組み合わせて、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１（これは、好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１またはその改変体を含むポリペプチドである）に対する抗体を特異的に捕捉するための手段の使用を提供する。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対して、好ましくは配列番号６に対して、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対して、最も好ましくは配列番号８に対して特異的に結合する抗体（この抗体は、好ましくは単一特異的抗体である）の使用を提供する。より好ましくは、上記抗体は、患者サンプル中で検出されるかまたは患者サンプルから単離され、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧクラスの抗体、より好ましくはＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４クラスの抗体、最も好ましくはＩｇＥクラスの抗体である。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対して、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対して、最も好ましくは配列番号８に対して特異的に結合する抗体（この抗体は、好ましくは単一特異的抗体である）またはそのフラグメントを提供する。上記抗体は、モノクローナル抗体であり得る。上記抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。この抗体は、多くの診断適用に、例えば、サンプル由来の抗体のアビディティーを測定するために有用である。あるいは、上記抗体は、競合アッセイ（例えば、競合的ＥＬＩＳＡ）のために使用され得る。あるいは、上記抗体は、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８を含むポリペプチドを固定化するために使用され得る。あるいは、上記抗体は、陽性コントロールとして使用され得る。当業者は、このような抗体を、例えば組換え法を使用して得る方法を承知している。その製造は、上記抗体を精製する工程および／または単離する工程を包含し得る。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８を含むポリペプチドまたはその改変体を、必要に応じて、１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはその改変体）と組み合わせて含む薬学的組成物、好ましくはワクチン（その組成物は、好ましくは、被験体、好ましくは哺乳動物被験体、より好ましくはヒトへの投与に適している）を提供する。このような薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。上記薬学的組成物は、例えば、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、点眼剤によって、直腸に、鼻に、口内に、膣に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与され得、ここで用語「非経口的に」とは、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内および頭蓋内の注射または注入の技術を含む。上記薬学的組成物は、適切な投与形態、例えば、カプセル剤、錠剤、ならびに水性の懸濁物および液剤で、好ましくは滅菌形態で提供され得る。それは、疾患、好ましくはアレルギーの処置の方法（この方法は、有効量の本発明のポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する）において使用され得る。Ａｒａ ｈ ７の低アレルギー性の改変体および必要に応じて１もしくはこれより多くのさらなる抗原（例えば、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６）が使用され得る。当業者は、公知のアレルゲンの低アレルギー性の改変体の生成のための方法に精通している。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８を含むポリペプチドを含むワクチンを提供する。
本発明は、アレルギー、好ましくはナッツアレルギー、より好ましくはピーナッツアレルギーを処置、予防または改善するが、被験体に本発明の薬学的組成物を投与するための方法を提供する。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より好ましくは配列番号８、より好ましくは配列番号７、配列番号６、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドの使用であって、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはこれらの改変体と組み合わせた、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための使用を提供し、ここで増大した感度を有する診断アッセイが提供される。このような製造は、診断上有用なキャリア上に、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８を含むポリペプチドを、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはこれらの改変体と組み合わせて固定化する工程を包含する方法に関し得る。
本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、より好ましくは配列番号８、より好ましくは配列番号７、配列番号６、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１またはその改変体を含むポリペプチドの使用であって、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはこれらの改変体と組み合わせた、医薬、好ましくはワクチンの製造のための使用を提供し、それは、好ましくはアレルギー状態、特にナッツアレルギー、より具体的にはピーナッツアレルギーを防止、改善または処置するためである。
本発明の実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは、配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む、診断上有用なキャリアであって、
ここで該キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群からのブロット、ガラス表面、スライド、バイオチップならびに膜を含む群より好ましくは選択され、そして最も好ましくは、マイクロタイタープレートまたはラインブロットである、
診断上有用なキャリア。
（項目２）
前記キャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体、より好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含む、前記項目に記載の診断上有用なキャリア。
（項目３）
前記項目のいずれかに記載の診断上有用なキャリア、ならびに必要に応じて、捕捉された抗体を特異的に検出するための手段も含む、キット。
（項目４）
前記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５の群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含み、
アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、別個のキャリア上に存在するか、または
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは 配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、１個のキャリア上に存在し、好ましくは１個のキャリアに共有結合して存在する、
前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目５）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程を包含する方法。
（項目６）
好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群から、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ９を含む群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程をさらに包含する、前記項目に記載の方法。
（項目７）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在は、同時に検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号８に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、空間的に離れた結合反応において検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在、および１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、１ポット反応において検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して、好ましくはアイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である、前記項目のいずれかに記載のキャリア、キットまたは方法。
（項目１１）
配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチド、ならびに好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６を含む、薬学的組成物。
（項目１２）
配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、組換えタンパク質、固定化された精製タンパク質または融合タンパク質であり、好ましくは精製され、かつ組換えられ、かつ固定化されているタンパク質である、ポリペプチド。
（項目１３）
ピーナッツアレルギーの診断のための、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド、キャリア、またはキットの使用であって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、使用。
（項目１４）
ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための前記項目のいずれかに記載のポリペプチドの使用であって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、使用。
（項目１５）
配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む前記ポリペプチドは、該ポリペプチドならびにＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはこれらの改変体を含む組成物である、前記項目のいずれかに記載の薬学的組成物、ポリペプチド、または使用。
（項目１６）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に、最も好ましくは配列番号８に特異的に結合する抗体、好ましくはＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４クラスの抗体であって、該抗体は、好ましくは単離されている、抗体。
（項目１７）
ピーナッツアレルギーの診断のための、またはピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、前記項目に記載の抗体の使用。
本発明の実施形態において、例えば、以下の項目も提供される。
（項目Ａ１）
被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは、配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む、診断上有用なキャリアであって、
ここで該キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群からのブロット、ガラス表面、スライド、バイオチップならびに膜を含む群より好ましくは選択され、そして最も好ましくは、マイクロタイタープレートまたはラインブロットである、
診断上有用なキャリア。
（項目Ａ２）
前記キャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体、より好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含む、前記項目に記載の診断上有用なキャリア。
（項目Ａ３）
前記項目のいずれかに記載の診断上有用なキャリア、ならびに必要に応じて、捕捉された抗体を特異的に検出するための手段も含む、キット。
（項目Ａ４）
前記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５の群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含み、
アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、別個のキャリア上に存在するか、または
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは 配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、１個のキャリア上に存在し、好ましくは１個のキャリアに共有結合して存在する、
前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ５）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在を、被験体から単離されたサンプル中で検出する工程を包含する方法。
（項目Ａ６）
好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群から、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ９を含む群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在を、被験体から単離されたサンプル中で検出する工程をさらに包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ７）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在は、同時に検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ８）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号８に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、空間的に離れた結合反応において検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ９）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在、および１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、１ポット反応において検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１０）
アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して、好ましくはアイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である、前記項目のいずれかに記載のキャリア、またはキット。
（項目Ａ１０）
アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して、好ましくはアイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１２）
配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチド、ならびに好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６を含む、薬学的組成物。
（項目Ａ１３）
配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、組換えタンパク質、固定化された精製タンパク質または融合タンパク質であり、好ましくは精製され、かつ組換えられ、かつ固定化されているタンパク質である、ポリペプチド。
（項目Ａ１４）
ピーナッツアレルギーの診断のための、前記項目のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物、前記項目のいずれかに記載のキャリア、または前記項目のいずれかに記載のキットであって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、組成物、キャリアまたはキット。
（項目Ａ１５）
ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための前記項目のいずれかに記載のポリペプチドの使用であって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、使用。
（項目Ａ１６）
前記項目のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットであって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、キット。
（項目Ａ１７）
前記ポリペプチドは、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む、前記項目のいずれかに記載の薬学的組成物、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド、または前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目Ａ１８）
前記ポリペプチドは、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む、前記項目のいずれかに記載の使用。
（項目Ａ１９）
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に、最も好ましくは配列番号８に特異的に結合する抗体、好ましくはＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４クラスの抗体であって、該抗体は、好ましくは単離されている、抗体。
（項目Ａ２０）
ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、前記項目のいずれかに記載の抗体の使用。
（項目Ａ２１）
ピーナッツアレルギーの診断のための、前記項目のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
（項目Ａ２２）
ピーナッツアレルギーの診断のための前記項目のいずれかに記載の抗体を含むキット。
摘要
本発明は、被験体に由来するサンプル中でＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む診断上有用なキャリア；被験体に由来するサンプル中でＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在を検出する工程を包含する方法、およびＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１またはその改変体を含む薬学的組成物に関する。
図１は、実施例１に記載されるとおりのＥＬＩＳＡの手段によって検出されるピーナッツ感作患者のＡｒａ ｈ ７アイソフォームへのＩｇＥ結合を示す。
図２は、実施例２に記載されるとおりのラインブロットの手段によって検出されるピーナッツ感作患者のＡｒａ ｈ ７アイソフォーム、ならびにＡｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６へのＩｇＥ結合を示す。
図３は、実施例３において記載される阻害実験を示す。固定化されたアレルゲンに対して感作された患者において５つのピーナッツ成分について観察された最大の阻害。水平の線はメジアン値を表す。灰色の開いたマーカーは、固定化されたものと同一のアレルゲンによる阻害を示す。
図４は、Ａｒａ ｈ ７．０２０１ Ｃ末端の直鎖ペプチドに対する血清ＩｇＥのエピトープマッピングの結果を示す。正規化したシグナル−対−ノイズ比（ｚ−スコア）を、マイクロアレイ上の全てのペプチドに関して示す。陽性結合は、３を上回るｚ−スコアを生じる少なくとも６個の続きのペプチドを要する。
一部の実施形態において、本発明は、被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む、診断上有用なキャリアを提供する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６に対するものである。
一部の実施形態において、抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列に対するものである。一部の実施形態において、抗体は配列番号８に対するものである。一部の実施形態において、キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、ブロット、ガラス表面、スライド、バイオチップならびに膜からなる群より選択される。一部の実施形態において、キャリアは、ウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットからなる群から選択されるブロットである。一部の実施形態において、キャリアは、マイクロタイタープレートまたはラインブロットである。
一部の実施形態において、診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５からなる群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含む。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、およびＡｒａ ｈ ９からなる群から選択される。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体は、Ａｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体である。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体は、Ａｒａ ｈ ２に対する抗体である。
一部の実施形態において、本発明は、上記実施形態のいずれかに記載される診断上有用なキャリアを含むキットも提供する。一部の実施形態において、キットは、捕捉された抗体を特異的に検出するための手段を含む。
上記実施形態のいずれかにおいて、診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５からなる群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含み得る。上記実施形態のいずれかにおいて、手段は、アイソタイプ７．０２０１に対する抗体を特異的に捕捉するためのものであり得る。上記実施形態のいずれかにおいて、手段は、配列番号６に対する抗体を特異的に捕捉するためのものであり得る。上記実施形態のいずれかにおいて、手段は、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列に対する抗体を特異的に捕捉するためのものであり得る。上記実施形態のいずれかにおいて、手段は、配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するためのものであり得る。上記実施形態のいずれかにおいて、抗体を特異的に捕捉するための手段は、別個のキャリア上に存在するか、または１個のキャリア上に存在し得る。上記実施形態のいずれかにおいて、抗体を特異的に捕捉するための手段は、１個のキャリアに共有結合して存在し得る。
一部の実施形態において、本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程を包含する方法も提供する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６に対するものである。一部の実施形態において、抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列に対するものである。一部の実施形態において、抗体は、配列番号８に対するものである。
上記実施形態のいずれかにおいて、方法は、１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在を、被験体に由来するサンプル中で検出する工程をさらに包含する。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５をからなる群から選択される。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ９からなる群から選択される。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６である。
上記実施形態のいずれかにおいて、アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して単一特異的な抗体であり得る。一部の実施形態において、Ａｒａ ｈ ７に対して単一特異的な抗体は、アイソタイプ７．０２０１に対するものである。一部の実施形態において、Ａｒａ ｈ ７に対して単一特異的な抗体は、配列番号６に対するものである。一部の実施形態において、Ａｒａ ｈ ７に対して単一特異的な抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列に対するものである。一部の実施形態において、Ａｒａ ｈ ７に対して単一特異的な抗体は、配列番号８に対するものである。
一部の実施形態において、本発明は配列番号８を含むポリペプチドを含む薬学的組成物も提供する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、薬学的組成物は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体からなる群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原をさらに含み得る。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体からなる群から選択される。一部の実施形態において、１もしくはこれより多くのさらなる抗原は、Ａｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６である。
一部の実施形態において、本発明は、配列番号８を含むポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドは、組換えタンパク質、固定化された精製タンパク質または融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、精製され、かつ組換えられ、かつ固定化されている。
一部の実施形態において、本発明は、ピーナッツアレルギーの診断のための、上記実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、キャリア、またはキットの使用も提供する。一部の実施形態において、診断の感度は増大される。
一部の実施形態において、本発明は、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、上記実施形態のいずれかに記載のポリペプチドの使用も提供する。一部の実施形態において、診断の感度は増大される。
上記実施形態のいずれかにおいて、配列番号８を含むポリペプチドは、該ポリペプチドならびにＡｒａ ｈ ２および／もしくはＡｒａ ｈ ６またはこれらの改変体を含む組成物であり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む。
一部の実施形態において、本発明は、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に特異的に結合する抗体も提供する。一部の実施形態において、抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４クラスの抗体である。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態において、抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択される配列に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態において、抗体は、配列番号８に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態において、抗体は単離されている。
一部の実施形態において、本発明は、ピーナッツアレルギーの診断のための、またはピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、上記実施形態のいずれかに記載の抗体の使用も提供する。
配列：
本発明は、新規なポリペプチドのある範囲、より具体的には、以下を含む：
本発明は、以下の非限定的実施例によってさらに例証され、上記実施例から本発明のさらなる特徴、実施形態、局面および利点が理解され得る。
１．実施例１：ピーナッツ感作患者に由来する血清中のＡｒａ ｈ ７アイソタイプに対するＩｇＥ抗体のＥＬＩＳＡによる検出
１．１．組換えタンパク質
組換えアレルゲンの異種発現および精製
Ａｒａ ｈ ７．０１０１（配列番号１１）、Ａｒａ ｈ ７．０２０１（配列番号１２）、Ａｒａ ｈ ７．０（配列番号１３）、Ａｒａ ｈ ６（配列番号１５）およびＡｒａ ｈ ２（配列番号１４）を、Ｓｉｔａｒｕ Ｃ， Ｄａｈｎｒｉｃｈ Ｃ， Ｐｒｏｂｓｔ Ｃ， Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋｉ Ｌ， Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｉ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ， Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ Ｗ， Ｒｏｓｅ Ｃ， Ｓｔoｃｋｅｒ Ｗ， Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ Ｄ． Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ １６ｔｈ ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＰ１８０ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００７ Ｓｅｐ；１６（９）：７７０−７によって記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてそれぞれの配列番号によって示される配列を有するＨｉｓ６融合タンパク質として発現させ、精製した。精製を、固定化金属イオンクロマトグラフィーによって変性条件下で行った。
１．２．ＥＬＩＳＡによるＩｇＥ結合の検出
３種のＡｒａ ｈ ７アイソフォームのＩｇＥ結合能力を、ピーナッツ抽出物に関してＩｇＥ陽性である３３名の患者の血清とともにインキュベートした酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析した（図１）。さらに、ピーナッツ感作なしのアトピー患者の１０の血清および２３名の健康な血液ドナーの血清を、陰性コントロールとしてインキュベートした（全て陰性として反応、データは示さず）。
マイクロタイタープレートを、組換えピーナッツアレルゲン（ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中９μｇ／ｍｌ）で２時間、４℃において、Ｓｉｔａｒｕらによって記載されるようにコーティングした。血清を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−０，１％ ウシ血清アルブミン）中でｖ／ｖ １／１０希釈し、１００μｌ／ウェルを二連で上記プレートに適用し、４℃において一晩反応させた。
結合した抗体を、抗ヒトＩｇＥペルオキシダーゼ結合体を使用して検出し、テトラメチルベンジジン（Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ ＥＶ ３８４０−９６０１ Ｅ， Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ， Ｌｕｂｅｃｋ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。光学密度（ＯＤ）を、自動化分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｉｎｉ， Ｔｅｃａｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４５０ｎｍにおいて、６２０ｎｍでの基準とともに読み取った。
結果
Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０１０１、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１およびＡｒａ ｈ ７．０に対するＩｇＥ反応性を、６６のヒト血清において測定した。２３名の血液ドナーのうちのいずれも、およびピーナッツ抽出物に対するＩｇＥを全く有しないアレルギー患者由来の１０の血清のうちのいずれも、陽性反応ではなかった。２３のピーナッツ抽出物陽性血清のうち、１１が、Ａｒａ ｈ ７．０２０１と陽性結果を示したが、６および１０のみが、それぞれＡｒａ ｈ ７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７と陽性結果を示した。
陽性反応血清の中では、平均ＯＤは、Ａｒａ ｈ ７．０２０１に関しては１．０であった。Ａｒａ ｈ７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７．０に関する平均ＯＤは極めて低かった（ともに０．４）。
これらの結果は、他方で、Ａｒａ ｈ ７．０２０１が、患者ＩｇＥとより強く反応し、他方で、より多くの患者が、他の２種のアイソフォームと比較して、標的抗原としてＡｒａ ｈ７．０２０１を使用するＩｇＥ抗体の検出によって正確に診断され得ることを示す（図１）。実際に、いくらかの患者は、Ａｒａ ｈ ７．０２０１に対する抗体が検出される場合に、アレルギーとして同定および診断され得るのみ（！）である。
実施例２：ラインブロットによるＩｇＥ抗体の検出
２ＳアルブミンＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、および３種のＡｒａ ｈ ７アイソフォームのＩｇＥ結合能力を、イムノブロット分析によって調査した。３４名のピーナッツ感作被験体に由来する血清サンプル（図２）を、ラインブロット−イムノブロットによりインキュベートし、強度を、ＥＵＲＯＬＩＮＥＳｃａｎソフトウェアで評価した。さらに、ピーナッツ感作のないアトピー被験体の２０の血清および１７名の健康な血液ドナーの血清を、陰性コントロールとしてインキュベートした（全て陰性、データは示さず）。
ラインブロットイムノブロットに関して、組換えアレルゲンを、標準的な方法を使用して、ナイロンベースの膜上にコーティングした。その後、上記膜をブロックし、乾燥させ、薄片に固定した。この薄片を、千切りにし、これを血清とともにインキュベートした。
血清サンプルの手動インキュベーションを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮイムノブロット説明書（例えば、ＤＰＡ−Ｄｘ ｐｏｌｌｅｎ １、ＤＰ ３２１０−１６０１−１ Ｅ中）に従って行った。全てのインキュベーションおよび洗浄工程を、室温（＋１８℃〜＋２５℃）において振動式振盪機で行った。試薬を、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮによって供給されるキット（ＤＰＡ−Ｄｘ ｐｏｌｌｅｎ １、ＤＰ ３２１０−１６０１−１ Ｅ）から取り出した。イムノブロットストリップを、作業強度ユニバーサル緩衝液（ＷＳＵＢ）とともに５分間予めインキュベートした。全ての液体を除去した後、ストリップを、第１の工程において、１．０ｍｌ ＷＳＵＢで希釈した各血清サンプルのうちの１００μｌとともに一晩（１２〜２４時間）インキュベートした。第２の工程において、上記ストリップを、１．０ｍｌ 酵素結合体（アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＩｇＥ）とともに６０分間インキュベートした。工程１および工程２の後、その液体をそれぞれ吸引し、上記ストリップを３×５分間、１．０ｍｌ ＷＳＵＢで洗浄した。第３の工程において、上記ストリップを、１．０ｍｌ クロモゲン／基質溶液とともに１０分間インキュベートした。その後、その液体を再び吸引し、各ストリップを３×１分間、脱イオン水もしくは蒸留水で洗浄することによって酵素反応を停止した。最後に、上記試験ストリップを、評価プロトコルに置き、風乾し、ＥＵＲＯＬＩＮＥＳｃａｎソフトウェアで評価した。
結果
合計７１サンプルにおいて、イムノブロットで分析した。ピーナッツ抽出物に対する特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）のないアトピー被験体に由来する２０の血清、および健康な血液ドナーに由来する１７の血清のうちのいずれにおいても、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、およびＡｒａ ｈ ７の全３種のアイソフォームに対するｓＩｇＥは全く検出されなかった。ピーナッツ抽出物に対するｓＩｇＥを有する被験体に由来する３４のサンプルのうち、それぞれ、１７のサンプルが、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ６と陽性反応し、１５のサンプルが、Ａｒａ ｈ ７．０２０１と陽性反応し、１４のサンプルがＡｒａ ｈ ７．０１０１と陽性反応し、１１のサンプルがＡｒａ ｈ ７．０と陽性反応した。
陽性反応血清の中で、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６およびＡｒａ ｈ ７．０２０１に由来するイムノブロット強度の平均は、８４、５９、および７４であった一方で、Ａｒａ ｈ ７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７の平均強度は、極めて低かった（２０および２８）（図２）。
その結果は、ピーナッツ抽出物に対するｓＩｇＥを有する被験体が、Ａｒａ ｈ ７．０１０１およびＡｒａ ｈ ７．０より高いＡｒａ ｈ ７．０２０１の平均ＩｇＥレベルを示すことを示す。さらに、ピーナッツ抽出物ＩｇＥ陽性被験体は、Ａｒａ ｈ ２およびＡｒａ ｈ ７．０２０１ ＩｇＥの非常に類似の平均レベルを有する。これは、Ａｒａ ｈ ７．０２０１ ＩｇＥが、Ａｒａ ｈ ２と同様に、ピーナッツアレルギーの別の主要なアレルゲン構成要素であり得ることを示す。
実施例４：ペプチドマイクロアレイを使用する特異的Ａｒａ ｈ ７エピトープに対するＩｇＥ抗体の検出
ペプチドマイクロアレイインキュベーションおよび視覚化
重複する配列（オフセット： １、あらゆるペプチドを二連でプリントした）を伴うＡｒａ ｈ ７．０２０１の１５ｍｅｒのペプチド（配列番号２）を含むペプチドマイクロアレイを、商業的に入手した（ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ）（これは、Ａｒａ ｈ ７．０２０１のＣ末端（配列番号６）をカバーする）。インキュベーション実験のために、このマイクロアレイを、作業強度ユニバーサル緩衝液（ＷＳＵＢ、実施例２を参照のこと）で、１時間室温において、軌道式振盪機でブロックした。全てのさらに記載されるインキュベーションをまた、ＷＳＵＢ中で行った。３名のピーナッツ陽性患者および２名のピーナッツ陰性患者の血清を１：４希釈し、一晩４℃でインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体の検出のために、ビオチン化抗ＩｇＥ ＩＴ−２８（Ｓｑｕａｒｉｘ）を１：５０００希釈し、室温において１時間、上記アレイ上でインキュベートした。洗浄後、そのアレイを、１時間室温において１：５０００希釈した蛍光Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ ８００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともにインキュベートした。上記ペプチドマイクロアレイスライドを、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒで波長８００ｎｍ（強度：８．５）においてスキャンした。画像焦点を０．８ｍｍに設定し、最大画像解像度（２１μｍ）を選択して、最大感度を保証した。
評価
スキャン後に、ＴＩＦＦ画像およびペプチドマップファイルを、各単一ペプチドに対応するシグナルの定量のために、Ｐｅｐｓｌｉｄｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＩＣＡＳＹＳ）にロードした。生データをＣＳＶファイルとしてエクスポートし、上記アレイ上の各単一Ａｒａ ｈ ７ペプチド（ＳＡｒａ）および空のスポット（Ｓブランク）のシグナル−対−ノイズ比のｌｏｇ２を計算した。より強くかつ正規化した評価のために、各単一ペプチドのｚ−スコア（Ｚｉ）を、以下の式に従って計算した：
それらの計算に基づいて、陽性結合エピトープを、３．０もしくはこれより高いｚ−スコアを含む少なくとも６個のその後のペプチドの検出として定義した（ｐ＝０．００３）。データ視覚化を、マイクロソフトエクセルを使用して行った（図５）。
結果
上記２個の陰性血清によってエピトープは全く検出されなかった一方で、血清３を使用すると、以前に未知であったＡｒａ ｈ ７．０２０１エピトープを検出でき、これは配列ＧＦＲＳＰＳ（アミノ酸１２９〜１３４）（配列番号２に従うアミノ酸残基番号）を含んでいた。ｚ−スコアカットオフを下回るものの、このエピトープはまた、血清１に関して検出可能である。この配列はＡｒａ ｈ ７．０２０１に特有であるので、このエピトープは、２種の他のアイソフォームと比較してＡｒａ ｈ ７．０２０１の増強された反応性と関連するものであることが、結論づけられ得る。
表
ＩＱＲ：四分位範囲。ＡＵＣ：曲線下面積。ＣＩ：信頼区間。
＊陽性試験に関して、製造業者推奨のカットオフ値を使用する。†寛容性被験体とアレルギー性被験体との間の陽性試験の数における差のｐ値（χ２乗検定）。‡ｎ＝７９

Claims (22)

  1. 被験体に由来するサンプル中で、Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に対する、最も好ましくは、配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含む、診断上有用なキャリアであって、
    ここで該キャリアは、ビーズ、試験ストリップ、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、セルロースに由来する固体ポリマー、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群からのブロット、ガラス表面、スライド、バイオチップならびに膜を含む群より好ましくは選択され、そして最も好ましくは、マイクロタイタープレートまたはラインブロットである、
    診断上有用なキャリア。
  2. 前記キャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体、より好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２に対する抗体を特異的に捕捉するための手段をさらに含む、請求項１に記載の診断上有用なキャリア。
  3. 請求項１〜２のいずれか１項に記載の診断上有用なキャリア、ならびに必要に応じて、捕捉された抗体を特異的に検出するための手段も含む、キット。
  4. 前記診断上有用なキャリアは、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５の群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための手段を含み、
    アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、別個のキャリア上に存在するか、または
    Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは 配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体を特異的に捕捉するための前記手段、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体を特異的に捕捉するための該手段は、１個のキャリア上に存在し、好ましくは１個のキャリアに共有結合して存在する、
    請求項３に記載のキット。
  5. Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する、好ましくは配列番号６に対する、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対する抗体の存在を、被験体から単離されたサンプル中で検出する工程を包含する方法。
  6. 好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５を含む群から、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３およびＡｒａ ｈ ９を含む群から選択される１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在を、被験体から単離されたサンプル中で検出する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  7. Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原、好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６に対する抗体の存在は、同時に検出される、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号８に対する抗体の存在または非存在、ならびに１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、空間的に離れた結合反応において検出される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１に対する抗体の存在、および１もしくはこれより多くのさらなる抗原に対する抗体の存在は、１ポット反応において検出される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して、好ましくはアイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である、請求項１もしくは２に記載のキャリア、または請求項３もしくは４に記載のキット。
  11. アイソタイプ７．０２０１に対する前記抗体は、Ａｒａ ｈ ７に対して、好ましくはアイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、最も好ましくは配列番号８に対して単一特異的な抗体である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチド、ならびに好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ８およびＡｒａ ｈ ５ならびにこれらの改変体を含む群からの、より好ましくはＡｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ９およびこれらの改変体を含む群からの１もしくはこれより多くのさらなる抗原、最も好ましくはＡｒａ ｈ ２および／またはＡｒａ ｈ ６を含む、薬学的組成物。
  13. 配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、組換えタンパク質、固定化された精製タンパク質または融合タンパク質であり、好ましくは精製され、かつ組換えられ、かつ固定化されているタンパク質である、ポリペプチド。
  14. ピーナッツアレルギーの診断のための、請求項１３に記載のポリペプチドを含む組成物、請求項１〜２のいずれか１項に記載のキャリア、または請求項３〜４のいずれか１項に記載のキットであって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、組成物、キャリアまたはキット。
  15. ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための請求項１３に記載のポリペプチドの使用であって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、使用。
  16. 請求項１３に記載のポリペプチドを含む、ピーナッツアレルギーの診断のためのキットであって、ここで好ましくは該診断の感度は増大される、キット。
  17. 前記ポリペプチドは、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む、請求項１２に記載の薬学的組成物、請求項１３に記載のポリペプチド、または請求項１４に記載の組成物。
  18. 前記ポリペプチドは、配列番号８、より好ましくは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列、より好ましくは配列番号６、最も好ましくはＡｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１もしくはその改変体を含む、請求項１５に記載の使用。
  19. Ａｒａ ｈ ７アイソタイプ７．０２０１、好ましくは配列番号６、より好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含む群からの配列に、最も好ましくは配列番号８に特異的に結合する抗体、好ましくはＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４クラスの抗体であって、該抗体は、好ましくは単離されている、抗体。
  20. ピーナッツアレルギーの診断のためのキットの製造のための、請求項１９に記載の抗体の使用。
  21. ピーナッツアレルギーの診断のための、請求項１９に記載の抗体を含む組成物。
  22. ピーナッツアレルギーの診断のための、請求項１９に記載の抗体を含むキット。

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