JPH09136897A

JPH09136897A - 大豆抗原組成物、その製造法、抗大豆抗体の検出・測定方法及び大豆アレルギー診断薬

Info

Publication number: JPH09136897A
Application number: JP29671795A
Authority: JP
Inventors: Takashi Matsui; 隆松井; Kazuhiko Obara; 和彦小原; Tatsuya Igawa; 達也井川; Masaharu Ohara; 雅春大原; Kohei Yamashita; 耕平山下; Mitsuo Yamaki; 光男山木; Yoshiki Nakao; 義喜中尾
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1995-11-15
Filing date: 1995-11-15
Publication date: 1997-05-27

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】大豆アレルギー患者に対する陽性率が高い大
豆抗原組成物、その製造法、抗大豆抗体の検出・測定方
法及び大豆アレルギー診断薬を提供する。【解決手段】ａ）分子量１６〜２２ＫＤ、ｂ）分子量
２３〜２８ＫＤ、ｃ）分子量２９〜３６ＫＤ、ｄ）分子
量３７〜４５ＫＤ、ｅ）分子量４８〜５８ＫＤ、ｆ）分
子量６５〜７２ＫＤ、ｇ）分子量７３〜８０ＫＤ及び
ｈ）分子量８９〜９９ＫＤの各大豆タンパク質を含有
し、タンパク質総量１００重量部当りｂ）とｄ）成分計
４〜４０重量部、ｆ）とｇ）成分計２０〜６０重量部、
ａ）、ｃ）、ｅ）及びｈ）の各成分計それぞれ１〜４０
重量部、５〜８０重量部、３〜６０重量部及び１〜４０
重量部を含有する大豆抗原組成物、その製造法、それを
抗原とする抗大豆抗体の検出・測定方法及びこれを有効
成分とする大豆アレルギー診断薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大豆抗原組成物、
その製造法及び大豆アレルギー診断薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】大豆アレルギーは、牛乳アレルギー、卵
アレルギーと共に三大食物アレルギーの１つである。ア
レルギー疾患の診断と治療においては、その原因物質
（アレルゲン）の正確な同定が必要である。大豆アレル
ギーに関しては、そのアレルゲンについて、これまでに
いくつか報告されている。例えば、等電点沈殿法とゲル
ろ過法による大豆主要タンパク質の分画が報告され（J.
Agric. Food. Chem. : 24, 1117-1121, (1976)）、得
られた画分についてのアレルゲン性の検討も報告されて
いる（J. Agric. Food. Chem. : 29, 336-340, (198
1)）。また、Shibasakiら及び越山らは、2Sグロブリン
画分のアレルゲン性が高いことを報告している（Int. A
rchs. Allergy. Appl. Immun. : 61, 441-448, (1980)
及び特公昭63-7165号公報）。さらに、7Sグロブリン画
分はIgE力価が高いことも報告されている（J. Allergy.
Clin. Immunol. : 81, 1135-1142, (1988)）。

【０００３】一方、大豆の主要アレルゲンについては、
Ogawaらは分子量約32KDのGly m Iを報告し（J. Nutr. S
ci. Vitaminol. : 37, 555-565, (1991)）、また、Kali
nskiらは油脂タンパク質を分離しているが（J. Biologi
cal. Chem. : 267, 12068-12076, (1992)）、Gly m Iと
油脂タンパク質中の34KD成分が同一であることも報告さ
れている（Biosci. Biotech. Biochem. : 57, 1030-103
3, (1993)）。これは大豆アレルギー患者の約65％がア
レルゲンとして認識するといわれている（J. Nutr. Sc
i. Vitaminol. : 37, 555-565, (1991)）。また、Ogawa
らは、7Sグロブリン画分の成分である分子量約70KDのβ
コングリシニンαサブユニットがアレルゲン性が高いこ
とを報告している。これは大豆アレルギー患者の約25％
がアレルゲンとして認識するといわれている（Biosci.
Biotech. Biochem. : 59, 831-833 (1995)）。さらに、
大豆のトリプシンインヒビタにアレルゲン性があること
も報告されている（Moroz, L.A. et al., New England
J. Medicine : 302, 20, 1126-1128(1980)）。また、大
豆の構成タンパク質としては、上述したもの以外に、グ
リシニン酸性サブユニット、グリシニン酸性サブユニッ
ト、コングリシニンαサブユニット、コングリシニン
α’サブユニット、コングリシニンβサブユニット、コ
ングリシニンγサブユニットが存在することが報告され
ている（Brooks J.R. et al. : J. Am. Oil Chem. So
c., 62(9), 1347-1345(1985)）。

【０００４】しかし、患者による認識アレルゲンは多様
であり、最もアレルゲン性が強いと考えられているGly
m Iでも特異IgEの陽性率は約65％である（J. Nutr. Sc
i. Vitaminol. : 37, 555-565, (1991)）。7Sグロブリ
ン画分は主成分としてβコングリシニンαサブユニット
を含有し、さらにGly m Iも含有する。しかしながら、G
ly m Iの含有量はもともと少ない上、精製のためこの画
分をさらにゲルろ過すると、Gly m Iは7Sグロブリン画
分から分離してしまう（Biosci. Biotech. Biochem. :
57, 1030-1033, (1993)及びJ. Agirc. Food Chem. : 2
4, 1117-1121(1976)）。また、2S 画分は主要アレルゲ
ンであるGly m I及びβコングリシニンαサブユニット
を含有していない（J. Nutr. Sci. Vitaminol. : 37, 5
55-565, (1991)）。このように、これまで報告されてい
る画分は、アレルゲン性の高い成分が流出しているとい
う問題があり、大豆アレルギー診断のため上記画分を単
独で抗原として使用する場合、陽性の患者を陰性と誤診
するおそれがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
は、大豆アレルギー患者に対する陽性率が高い大豆抗原
組成物を提供するものである。請求項２記載の発明は、
大豆アレルギー患者に対する陽性率が高い大豆抗原組成
物の製造法を提供するものである。請求項３記載の発明
は、請求項２記載の発明の効果に加え、免疫グロブリン
に対する抗体価が高い大豆抗原組成物の製造法を提供す
るものである。請求項４記載の発明は、大豆アレルギー
患者に対する陽性率が高い抗大豆抗体の検出・測定方法
を提供するものである。請求項５記載の発明は、大豆ア
レルギー患者に対する陽性率が高い大豆アレルギー診断
薬を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）分子量
１６〜２２Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｂ）分子量
２３〜２８Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｃ）分子量
２９〜３６Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｄ）分子量
３７〜４５Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｅ）分子量
４８〜５８Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｆ）分子量
６５〜７２Ｋダルトンの大豆タンパク質、（ｇ）分子量
７３〜８０Ｋダルトンの大豆タンパク質及び（ｈ）分子
量８９〜９９Ｋダルトンの大豆タンパク質を含有し、
（ｂ）成分と（ｄ）成分の含有量の総量が４〜４０重量
部、（ｆ）成分と（ｇ）成分の含有量の総量が２０〜６
０重量部、（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｈ）の各成分
の含有量が、それぞれ、１〜４０重量部、５〜８０重量
部、３〜６０重量部及び１〜４０重量部であってタンパ
ク質を総量で１００重量部含有してなる大豆抗原組成物
に関するものである。

【０００７】また、本発明は、（1a）大豆もしくは脱脂
大豆をpH８〜８．６の緩衝液に懸濁し、遠心分離して上
清を取得し、（1b）得られた上清のpHを６〜６．５にし
て撹拌し、遠心分離して上清を取得するか又は（２）大
豆もしくは脱脂大豆をpH６〜６．５の緩衝液に懸濁し、
遠心分離して上清を取得し、（３）前記（1b）工程又は
（２）工程で得られた上清のpHを４．５〜５にして撹拌
し、遠心分離して沈殿を取得する、ことを特徴とする大
豆抗原組成物の製造法に関するものである。また、本発
明は、豆乳を遠心分離して油脂層を取得し、炭酸ナトリ
ウム水溶液を添加して撹拌し、遠心分離して水層を取得
し、この水層を前記沈殿と混合する前記大豆抗原組成物
の製造法に関するものである。

【０００８】また、本発明は、前記大豆抗原組成物を抗
原として用いることを特徴とする、抗大豆抗体の検出・
測定方法に関するものである。また、本発明は、前記大
豆抗原組成物を有効成分とする、大豆アレルギー診断薬
に関するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】

（ａ）分子量１６〜２２Ｋダルトン大豆のタンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量２１Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はトリプシンインヒビタであると推定される。（ｂ）分子量２３〜２８Ｋダルトンの大豆タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量２３Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はグリシニン塩基性サブユニットであると推定される。（ｃ）分子量２９〜３６Ｋダルトンの大豆タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量３３Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はＧｌｙｍＩタンパク質であると推定される。

【００１０】（ｄ）分子量３７〜４５Ｋダルトンの大豆
タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動させたときに、分子量４０Ｋダルト
ン付近の位置にバンドを呈するタンパク質である。この
タンパク質はグリシニン酸性サブユニットであると推定
される。（ｅ）分子量４８〜５８Ｋダルトンの大豆タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量５３Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はコングリシニンβサブユニットであると推定される。（ｆ）分子量６５〜７２Ｋダルトンの大豆タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量７０Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はコングリシニンαサブユニットであると推定される。

【００１１】（ｇ）分子量７３〜８０Ｋダルトンの大豆
タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動させたときに、分子量７５Ｋダルト
ン付近の位置にバンドを呈するタンパク質である。この
タンパク質はコングリシニンα′サブユニットであると
推定される。（ｈ）分子量８９〜９９Ｋダルトンの大豆タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動させたときに、分子量９４Ｋダルトン付近の位
置にバンドを呈するタンパク質である。このタンパク質
はコングリシニンγサブユニットであると推定される。

【００１２】（ｂ）成分と（ｄ）成分は、大豆に多量に
含まれる成分であるが、これらの成分を抗原とする患者
数は少ない。（ｂ）成分と（ｄ）成分は、生化学的な挙
動が類似しており、タンパク質の精製工程においては、
通常、これらの成分が一緒に取得される。また、（ｆ）
成分と（ｇ）成分は、大豆に少量しか含まれない成分で
あるが、これらの成分を抗原とする患者数は多い。
（ｆ）成分と（ｇ）成分は、生化学的な挙動が類似して
おり、タンパク質の精製工程においては、通常、これら
の成分が一緒に取得される。

【００１３】本発明は、特定の成分を抗原として認識す
る抗体しか保有しない患者を陰性と誤診することを防
ぎ、かつ、陽性率を高める観点から、組成物中のタンパ
ク質の総量を１００重量部とするときに、（ｂ）成分と
（ｄ）成分の含有量の総量を減少させて４〜４０重量部
とし、（ｆ）成分と（ｇ）成分の含有量の総量を増加さ
せて２０〜６０重量部とすることを特徴とする。これら
の成分の総量が上記割合を下回ると、大豆アレルギー患
者でありながら、大豆タンパク質に対する抗体として特
定の成分を抗原として認識する抗体しか保有しない患者
を陰性と誤診することがあり、上記割合を上回ると、他
の成分の含有量が相対的に低下するため、陽性率が低下
する。

【００１４】陽性率を高める観点から、（ｂ）成分と
（ｄ）成分の含有量の総量は、（ｆ）成分と（ｇ）成分
の含有量の総量より少ないことが好ましい。特に、組成
物中のタンパク質の総量を１００重量部としたとき、
（ｂ）成分と（ｄ）成分の含有量の総量は５〜２５重量
部であって、（ｆ）成分と（ｇ）成分の含有量の総量は
３０〜５０重量部とすることが好ましい。なお、患者
が、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｇ）のいずれかの成
分に対する抗体を有していれば陽性と判定できるように
する点から、組成物中のタンパク質の総量を１００重量
部としたときの（ｂ）成分と（ｄ）成分の含有量は、そ
れぞれ、１〜３０重量部とすることが好ましく、２〜２
０重量部とすることがより好ましい。同様に、（ｆ）成
分と（ｇ）成分の含有量は、それぞれ、５〜５５重量部
とすることが好ましく、１０〜３０重量部とすることが
より好ましい。

【００１５】また、本発明の大豆抗原組成物は、
（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｈ）の各成分も含有してお
り、組成物中のタンパク質の総量を１００重量部とした
場合のそれらの含有量は、それぞれ、１〜４０重量部、
５〜８０重量部、３〜６０重量部、１〜４０重量部であ
る。これらの成分の含有量が上記割合を下回ると、大豆
アレルギー患者でありながら、大豆タンパク質に対する
抗体として特定の成分を抗原として認識する抗体しか保
有しない患者を陰性と誤診することがあり、上記割合を
上回ると、他の成分の含有量が相対的に低下するため、
陽性率が低下する。さらに、大豆アレルギー患者に対す
る陽性率を高める観点から、組成物中のタンパク質の総
量を１００重量部とした場合の（ａ）、（ｃ）、
（ｅ）、（ｈ）の各成分の含有量を、それぞれ、２〜３
０重量部、１０〜７０重量部、５〜４０重量部、２〜３
０重量部とすることが好ましい。なお、本発明におい
て、タンパク質量は、ローリー法を用いてウシ血清アル
ブミン換算で求められた値である。

【００１６】本発明の大豆抗原組成物は、例えば、下記
のようにして製造することができる。（1a）大豆もしくは脱脂大豆をpH８〜８．６の緩衝液に
懸濁し、遠心分離して上清を取得し、（1b）得られた上
清のpHを６〜６．５にして撹拌し、遠心分離して上清を
取得するか又は（２）大豆もしくは脱脂大豆をpH６〜
６．５の緩衝液に懸濁し、遠心分離して上清を取得し、
（３）前記工程（1b）又は工程（２）で得られた上清の
pHを４．５〜５にして撹拌し、遠心分離して沈殿を取得
する。

【００１７】工程（1a）又は工程（２）で使用する大豆
の種類は特に限定されず、市販の大豆を使用することが
できる。なお、タンパク質の収率を向上させる点から、
大豆を粉末状にしておくのが好ましい。工程（1a）又は
工程（２）で使用する脱脂大豆の種類は特に限定され
ず、市販の大豆を使用することができる。また、タンパ
ク質の収率を向上させる点から、脱脂大豆を粉末状にし
ておくのが好ましい。このような粉末状の脱脂大豆とし
ては、例えば、脱脂粉末大豆ＴｙｐｅＩ（ＳＩＧＭＡ社
商品名）がある。脱脂されていない大豆を脱脂するに
は、例えば、粉末状にされた大豆をエーテル、アセトン
に入れて撹拌し、１，５００×ｇ、２０〜３０分間遠心
分離し、沈殿を取得する。

【００１８】工程（1a）で使用するpH８〜８．６の緩衝
液としては、例えば、pH８〜８．６に調製された３０〜
６０ｍＭトリス塩酸緩衝液が挙げられる。pHの調整に
は、例えば、２Ｎの塩酸が用いられる。タンパク質中の
ジスルフィド結合を抑制する点から、これらの緩衝液に
は１０ｍＭ程度の２−メルカプトエタノールを含有させ
るのが好ましい。工程（1a）において、大豆もしくは脱
脂大豆を上記緩衝液に懸濁するには、例えば、マグネチ
ックスターラーを用い、室温で１時間撹拌する。そし
て、撹拌後の懸濁液を、例えば、１，５００×ｇ、２０
分間遠心分離し、上清を取得する。工程（1b）は、例え
ば、取得した上清のpHを２Ｎの塩酸を用いて６〜６．５
にし、上記のように撹拌・遠心分離し、上清を取得す
る。

【００１９】工程（２）で使用するpH６〜６．５の緩衝
液としては、例えば、pH６〜６．５に調製された３０〜
６０ｍＭトリス塩酸緩衝液が挙げられる。pHの調整に
は、例えば、２Ｎの塩酸が用いられる。タンパク質中の
ジスルフィド結合を抑制する点から、これらの緩衝液に
は、１０ｍＭ程度の２−メルカプトエタノールを含有さ
せるのが好ましい。工程（２）の操作は、使用する緩衝
液をpH６〜６．５のものにする以外は工程（1a）に従う
ことができる。工程（３）は、例えば、工程（1b）又は
工程（２）で得られた上清のpHを２Ｎの塩酸を用いて４
〜４．５にし、工程（1b）のように撹拌・遠心分離し、
沈殿を取得する。

【００２０】得られる沈殿には、組成物中のタンパク質
総量を１００重量部とする場合、通常、（ａ）成分が２
〜１０重量部、（ｂ）成分が２〜２０重量部、（ｃ）成
分が５〜３０重量部、（ｄ）成分が２〜２０重量部、
（ｅ）成分が５〜３０重量部、（ｆ）成分が１０〜５０
重量部、（ｇ）成分が１０〜５０重量部、（ｈ）成分が
５〜２０重量部含有される。

【００２１】さらに、タンパク質組成を抗原として最適
化するために、この沈殿を用い、例えば、下記の操作を
行ってもよい。即ち、まず、上記沈殿を３０〜６０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（pH８〜８．６）に溶解させ、上記工
程（1b）の操作を行い、取得された上清を用いて上記工
程（３）の操作を行う。続いて、得られた沈殿を３０〜
６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８〜８．６）に溶解さ
せ、この溶液を用いて再度工程（1b）及び（３）の操作
を行う。

【００２２】また、本発明の大豆抗原組成物は、次のよ
うにして製造することもできる。まず、豆乳を遠心分離
して油脂層を取得する。豆乳を得るには、例えば、大豆
を水又は緩衝液で膨潤させ、ミキサー等で破砕し、これ
を晒布等で濾過し、濾液を取得する。緩衝液としては、
例えば、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８〜８．６）を
用いることができる。この豆乳を、例えば、５０，００
０×ｇ、２０分間遠心分離し、最上層（油脂層）を取得
する。ここで、油脂層における分子量２９〜３６Ｋダル
トンの大豆タンパク質の含有割合を高めるため、上記油
脂層に、低塩濃度緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（pH８〜８．６）等）及び高塩濃度緩衝液（０．５Ｍ塩
化ナトリウム含有０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８〜
８．６）等）に順次再懸濁し、５０，０００×ｇ、２０
分間遠心分離し、下層（水層）を除去し、これにより、
油脂タンパク質以外の可溶性タンパク質を除去すること
が好ましい。そして、上記油脂層に０．１Ｍの炭酸ナト
リウム水溶液を添加して撹拌し、氷上に１時間静置し、
５０，０００×ｇ、２０分間遠心分離して下層（水層）
を取得し、この水層を前記沈殿と混合する。

【００２３】上記水層には、組成物中のタンパク質総量
を１００重量部とする場合、通常、（ｂ）、（ｄ）〜
（ｈ）成分が、それぞれ、５〜２０重量部、（ｃ）成分
が４０〜８０重量部、分子量約２４Ｋダルトンの油脂性
タンパク質が５〜２０重量部含有される。上記水層と前
記沈殿の混合割合は特に限定されないが、大豆アレルギ
ー診断における信頼性を高める点から、含有されている
タンパク質の質量の比で、前者／後者が１／２〜２／１
とするのが好ましく、１／１とするのがより好ましい。
本発明の大豆抗原組成物は、上記水層と前記沈殿を混合
した状態では液体であるが、乾燥させて固体にしてもよ
い。本発明の大豆抗原組成物を大豆アレルギーの診断に
使用する場合は、例えば、この大豆抗原組成物を含有す
る溶液をマイクロタイタープレートのウェルに注ぎ、静
置してタンパク質をウェルに吸着させた後にウェル中の
液体を除去したものや、この溶液をセルロース性の糸に
塗布し、乾燥させたもの等を利用することができる。

【００２４】抗大豆抗体を検出・測定するには、例え
ば、上記大豆抗原組成物を担体に固定化し、検体を添加
し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、洗浄し、
この標識を直接的又は間接的に検出・測定すればよい。
担体としては、例えば、ラテックスの粒子やセルロース
の糸、その他プラスチック製のアッセイプレートや粒子
等を利用することができる。上記大豆抗原組成物を担体
に固定化するには、例えば、共有結合や物理吸着を利用
することができる。検体としては、例えば、ヒトの血清
等を使用することができる。なお、検体中の他の抗体等
が担体に非特異的に結合するのを防止するため、検体の
添加前に牛血清アルブミン等で担体の表面をブロッキン
グしておくことが望ましい。洗浄は、例えば、界面活性
剤を含むリン酸緩衝液等を利用して行うことができる。

【００２５】標識化された二次抗体としては、例えば、
標識化された抗ヒトモノクローナル抗体がある。標識と
しては種々のものが利用でき、例えば、アルカリフォス
ファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラーゼ
（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidase）、β
−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の酵素、フ
ルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質を利用する
ことができる。また、抗体と標識物の間にビオチン（Bi
otin）、アビジン（Avidin）、ストレプトアビジン（St
reptoavidin）、ディゴキシゲニン（Digoxigenin）等の
化学物質を介在させてもよい。標識を直接的又は間接的
に検出・測定するには、例えば、その標識が酵素である
場合は基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光
や発色を検出・測定するか吸光度の変化を測定すればよ
い。また、標識が蛍光物質である場合は反応系に紫外線
を照射し、発生する蛍光を検出・測定すればよい。必要
に応じ、増感剤を使用することができる。

【００２６】本発明の大豆アレルギー診断薬としては、
例えば、本発明の大豆抗原組成物を上記担体に固定化し
た基材が挙げられる。また、上記基材の他に、標識化さ
れた二次抗体、基質等が必要量同封されたキツトも挙げ
られる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。実施例１大豆タンパク質の分画脱脂大豆粉末（シグマ社製、ＴｙｐｅＩ）７．５ｇに１
０ｍＭ２−メルカプトエタノール含有３０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（pH８．６）（以下緩衝液１という）１５０
mlを加え、マグネチックスターラーを用いて室温で１時
間撹拌した。これを１０，０００rpm、２０分間遠心分
離して上清を取得した。上清の一部を取り、全抽出タン
パク質画分とした。残りの上清に２Ｎ塩酸を滴下してpH
を６．４とし、４℃で１６時間静置し、１０，０００×
ｇ、２０分間遠心分離し、沈殿（粗Ａ画分）と上清を別
々に取得した。取得した上清にさらに２Ｎ塩酸を滴下し
てpHを４．８とし、４℃で４時間静置し、１０，０００
×ｇ、２０分間遠心分離し、沈殿（粗Ｂ画分）と上清
（Ｃ画分）を別々に取得した。

【００２８】粗Ａ画分を１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール含有３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH６．４）（以
下緩衝液１’という）に懸濁し、５０，０００×ｇ、２
０分間遠心分離して沈殿を取得（沈殿の洗浄）し、この
沈殿を３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．６）（以下緩
衝液２という）に溶解し、Ａ画分とした。一方、粗Ｂ画
分を緩衝液１に溶解し、これに２Ｎ塩酸を滴下してpHを
６．２とし、４℃で１６時間静置し、１０，０００×
ｇ、２０分間遠心分離し、上清を取得した。この上清に
２Ｎ塩酸を滴下してpHを４．８とし、４℃で４時間静置
し、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分離し、沈殿を取
得した。この沈殿を緩衝液２に溶解してＢ画分とした。
こうして得た４種の画分を、それぞれ、１００容の緩衝
液２に対して４℃、１８時間透析した。透析膜として、
カットオフ分子量が３，５００ダルトンのセルロースエ
ステル膜（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製、商品名：Spectra/Po
r CE MWCO3,500）を使用した。透析後の各画分をドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）させた。結果を図１に示す。

【００２９】実施例２ＧｌｙｍＩ画分の分画大豆１００ｇを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．６）
２００mlに浸し、４℃で一晩静置して大豆を膨潤させ
た。この大豆に、この緩衝液１００mlを加えてミキサー
で破砕し、晒布で濾して豆乳を得た。この豆乳を５０，
０００×ｇ、２０分間遠心分離し、油脂層（最上層）を
取得した。これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．
６）に懸濁し、５０，０００×ｇ、２０分間遠心分離
し、油脂層（最上層）を取得した。さらに、これを０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH
８．６）に懸濁し、５０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、油脂層（最上層）取得した。これに０．１Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液を添加し、５０，０００×ｇ、２０分
間遠心分離し、水層（ＧｌｙｍＩ画分）を取得した。こ
れを、実施例１と同様にして緩衝液２で透析した。透析
後の各画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動させた。結果を図１に示す。

【００３０】実施例３ＥＬＩＳＡによるＩｇＥ力価の
測定実施例１及び２において分離した画分を、９６ウェルＥ
ＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＫ社製、商品名：Maxi Sorp
F96）に添加し、４℃で１６時間静置することにより、
抗原をプレートに固定した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）を用い、各画分について、大豆特異ＩｇＥ陽性血清
中における大豆特異ＩｇＥの力価を評価した。なお、大
豆特異ＩｇＥ陽性血清としては、マストイムノシステム
ズ（マスト社商品名）で大豆陽性と判定された血清を用
いた。上記の各画分のタンパク質濃度をＤＣプロテイン
アッセイキット（バイオラッド社製）で測定し、それぞ
れタンパク質濃度が１０μg/mlとなるように緩衝液２で
希釈し、抗原溶液とした。抗原溶液を９６ウェルＥＬＩ
ＳＡプレートに５０μl/ウェルずつ注入し、４℃で一晩
静置した。

【００３１】抗原溶液を吸引除去した後、リン酸緩衝生
理的塩類溶液（タルベッコＰＢＳ（−）「ニッスイ」
（日水製薬(株)商品名）、以下ＰＢＳという）に１％ウ
シ血清アルブミンを含有させた溶液を３００μl/ウェル
ずつ注入し、室温で３時間静置した（ブロッキング）。
プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以
下、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎという）で５回洗浄し、ＰＢＳ
で５倍希釈した大豆特異的ＩｇＥ陽性血清を５０μl/ウ
ェルずつ添加した。なお、陰性対照（ブランク）として
はＰＢＳを５０μl/ウェル添加した。プレートを室温で
１時間振とうし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。
抗原と反応したＩｇＥを検出するため、１μg/mlのペル
オキシターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ社製）
を含む１０％ヤギ血清含有ＰＢＳを５０μl/ウェル添加
した。プレートを室温で１時間振とうし、ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎで５回洗浄した。さらに、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ社
製商品名）を１００μl/ウェル添加し、プレートを１０
分間振とうし（発色反応）、１Ｍリン酸を１００μl/ウ
ェル添加した（発色反応の停止）。

【００３２】マイクロプレートリーダ（東ソー製）を用
い、６００nmのＯＤ値を対照とした４５０nmのＯＤ値
（ＯＤ４５０−６００）を測定し、各サンプルのＯＤ４
５０−６００からブランクのＯＤ４５０−６００を差し
引いた値を大豆特異的ＩｇＥ力価とした。また、各大豆
画分の大豆特異的ＩｇＥ力価と全抽出タンパク質画分の
大豆特異的ＩｇＥ力価の比をとり、相対的な評価をし
た。Ａ画分、Ｂ画分、Ｃ画分、ＧｌｙｍＩ画分及びＢ画
分とＧｌｙｍＩ画分の混合画分について、それぞれ、６
３、１３２、６３、１３２及び６９検体の大豆特異的Ｉ
ｇＥ陽性血清を用い、上記ＥＬＩＳＡ法により大豆特異
的ＩｇＥ力価を求め、さらに、全抽出タンパク質画分の
大豆特異的ＩｇＥ力価に対するこれらの力価の比（相対
的な力価）を求め、結果を表１に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１から明らかなように、Ｂ画分は、全抽
出タンパク質画分の約２．２倍の力価（平均値）を持
ち、全抽出タンパク質画分より強く反応した血清（検
体）の割合が約８２％となっていた。また、ＧｌｙｍＩ
画分は、全抽出タンパク質画分の約３．６倍の力価（平
均値）を持ち、全抽出タンパク質画分より強く反応した
血清（検体）の割合が約６４％となっていた。さらに、
Ｂ画分とＧｌｙｍＩ画分の混合画分は、全抽出タンパク
質画分の約４倍の力価（平均値）を持ち、全抽出タンパ
ク質画分より強く反応した血清（検体）の割合が約８３
％となっていた。これに対し、Ａ画分は、全抽出タンパ
ク質画分の約０．５倍の力価（平均値）をしかなく、全
抽出タンパク質画分より強く反応した血清（検体）の割
合も約５％しかなかった。また、Ｃ画分は、全抽出タン
パク質画分の約０．７倍の力価（平均値）をしかなく、
全抽出タンパク質画分より強く反応した血清（検体）の
割合も約１３％しかなかった。なお、Ａ画分又はＣ画分
と強く反応する血清も少数ではあるが認められた。

【００３５】図１において、上欄の数字の１〜６は、レ
ーンの番号を示し、レーン１は分子量マーカーを、レー
ン２は全抽出タンパク質画分を、レーン３はＡ画分を、
レーン４はＢ画分を、レーン５はＣ画分を、レーン６は
ＧｌｙｍＩ画分を、それぞれ電気泳動させたレーンであ
る。また、左端の９４、６７、４３、３０、２０．１、
１４．４の数字はいずれも分子量（単位：Ｋダルトン）
を示す。図１から明らかなように、Ｂ画分には、分子量
約９４Ｋダルトンのタンパク質、分子量約７０〜７５Ｋ
ダルトンのタンパク質、分子量約５３Ｋダルトンのタン
パク質、分子量約４０Ｋダルトンのタンパク質、分子量
約３３Ｋダルトンのタンパク質、分子量約２３Ｋダルト
ンのタンパク質及び分子量約２１Ｋダルトンのタンパク
質が含まれていた。

【００３６】また、ＧｌｙｍＩ画分には、分子量約３３
Ｋダルトンのタンパク質及び分子量約２４Ｋダルトンの
油脂性タンパク質が含まれていた。上記電気泳動させた
ゲルをデンシトメータ（丸善石油化学製、形式名：ＥＰ
Ａ−３０００）で解析した。その結果、Ｂ画分には、分
子量約９４Ｋダルトンのタンパク質が約９％、分子量約
７０〜７５Ｋダルトンのタンパク質が合計約３４％、分
子量約５３Ｋダルトンのタンパク質が約１５％、分子量
約４０Ｋダルトンのタンパク質が約８％、分子量約３３
Ｋダルトンのタンパク質が約１３％、分子量約２３Ｋダ
ルトンのタンパク質が約５％、分子量約２１Ｋダルトン
のタンパク質が約５％含まれていた。したがって、Ｂ画
分には主要アレルゲンであるタンパク質が高濃度で含有
されており、かつ、主要アレルゲンではないが大豆抗原
であるその他のタンパク質も適量含有されていることが
わかった。

【００３７】表１及びデンシトメータによる解析の結果
から、Ｂ画分を大豆抗原組成物として用いる場合、Ｇｌ
ｙｍＩ画分と比べ、高い陽性率が期待でき、さらに、Ｂ
画分とＧｌｙｍＩ画分の混合画分はより高い陽性率が期
待できる。

【００３８】

【発明の効果】請求項１記載の大豆抗原組成物は、大豆
アレルギー患者に対する陽性率が高く、大豆アレルギー
診断薬に好適である。請求項２記載の大豆抗原組成物の
製造法は、大豆アレルギー患者に対する陽性率が高い大
豆抗原組成物の製造に好適である。請求項３記載の大豆
抗原組成物の製造法は、請求項２記載の大豆抗原組成物
の製造法の効果を奏し、さらに、免疫グロブリンに対す
る抗体価が高い大豆抗原組成物の製造に好適である。請
求項４記載の抗大豆抗体の検出・測定方法は、大豆アレ
ルギー患者に対する陽性率が高く、大豆アレルギーの診
断に好適である。請求項５記載の大豆アレルギー診断薬
は、大豆アレルギー患者に対する陽性率が高く、大豆ア
レルギーの診断に好適である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例で取得した各画分のドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｋ 39/35 (72)発明者大原雅春茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者山下耕平茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者山木光男茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者中尾義喜茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）分子量１６〜２２Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｂ）分子量２３〜２８Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｃ）分子量２９〜３６Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｄ）分子量３７〜４５Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｅ）分子量４８〜５８Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｆ）分子量６５〜７２Ｋダルトンの大
豆タンパク質、（ｇ）分子量７３〜８０Ｋダルトンの大
豆タンパク質及び（ｈ）分子量８９〜９９Ｋダルトンの
大豆タンパク質を含有し、（ｂ）成分と（ｄ）成分の含
有量の総量が４〜４０重量部、（ｆ）成分と（ｇ）成分
の含有量の総量が２０〜６０重量部、（ａ）、（ｃ）、
（ｅ）及び（ｈ）の各成分の含有量が、それぞれ、１〜
４０重量部、５〜８０重量部、３〜６０重量部及び１〜
４０重量部であってタンパク質を総量で１００重量部含
有してなる大豆抗原組成物。
【請求項２】（1a）大豆もしくは脱脂大豆をpH８〜
８．６の緩衝液に懸濁し、遠心分離して上清を取得し、
（1b）得られた上清のpHを６〜６．５にして撹拌し、遠
心分離して上清を取得するか又は（２）大豆もしくは脱
脂大豆をpH６〜６．５の緩衝液に懸濁し、遠心分離して
上清を取得し、（３）前記（1b）工程又は（２）工程で
得られた上清のpHを４．５〜５にして撹拌し、遠心分離
して沈殿を取得する、ことを特徴とする大豆抗原組成物
の製造法。
【請求項３】豆乳を遠心分離して油脂層を取得し、炭
酸ナトリウム水溶液を添加して撹拌し、遠心分離して水
層を取得し、この水層を沈殿と混合する請求項２記載の
大豆抗原組成物の製造法。
【請求項４】請求項１記載の大豆抗原組成物を抗原と
して用いることを特徴とする、抗大豆抗体の検出・測定
方法。
【請求項５】請求項１記載の大豆抗原組成物を有効成
分とする、大豆アレルギー診断薬。