JP2007525643A5

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Publication number: JP2007525643A5
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Filing date: 2004-03-15
Publication date: 2011-04-21
Anticipated expiration: 2024-03-15

Description

有用な診断テストというものは患者のなかの卵巣癌の存在を検出できることだけであってはならず、それがまた安価、非侵襲性で使いやすいものであることが望ましい。テスト用基質として血液や血清を用いる診断テストは審査される患者から血液を抜き取らねばならず、時として抜き取った血液サンプルは更に分離、精製、または他の処理を必要とする。血液の抜き取りは訓練されたヘルスケア従事者によってなされねばならず、患者にとっては苦痛の多い侵襲的なもので、血液サンプルの貯蔵と輸送のための専門設備と試薬が必要で血液からの病原体の伝染の危険を有している。それに較べ、尿サンプルは殆ど又は全く専門的な設備を要さずに収集でき、ヘルスケア従事者によるしっかりした監視を必要とせず、患者の通常の生理上のプロセスの一部としてつくることができ、一般に伝染病の重要な原因とはならない。これらの理由から、テスト用基質として尿サンプルを用いた診断テストは血液サンプルで行われる同等のテストより好ましい。

１つの実施形態においては特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体と尿 (又は遠心分離した尿）を接触させることによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドを査定する。ＭＭＰＦＦペプチドがこの第１抗体と結合したかを査定することによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドの存在を査定することが出来る。例えば、ロボット装置で自動分析するのに適合した型のプラスチックのマルチウエルプレートのような基板に第１抗体を結合させることが出来る。ＭＭＰＦＦペプチドと第１抗体の結合は、例えば第１抗体と、特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第２抗体を接触させ、第１と第２の抗体が共局在しているかを査定することによって評価できる。第２抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団からなる群から選定された化合物などで検出可能に標識することが出来る。

例として、この方法は結合している抗ＭＭＰＦＦペプチド捕獲抗体を有するプレートと女性から採取した尿とを接触させることを含む。尿は１０分又は１時間などの時間プレートで任意でインキュベートすることが出来る。そのプレートは次いで、捕獲抗体が結合するよりも強くＭＭＰＦＦペプチドのエピトープと結合するビオチン化した第２抗体と接触することができる。ストレプトアビジン(streptavidin)結合酵素はビオチン化した抗体と結合して発色性基質（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)の発色性基質である３、３'、５、５’−テトラメチルベンジジン）の存在のもとに該抗体の検出を可能にする。勿論、第２抗体はそれに代えて蛍光標識、放射標識、または他の方法で検出できるように標識することが出来る。

卵巣癌を診断するための方法についての他の実施形態において、第１の抗体と尿を接触させた後に、第１の抗体とその標識リガンドとを接触させる。尿と接触した第１抗体と結合する標識リガンドの量と、尿と接触しなかった第１抗体の相当量と結合する標識リガンドの量を比較することによって尿からどのくらいの量のＭＭＰＦＦが第１抗体と結合したかを査定することができる。

本発明はメソセリン(mesothelin)、巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）、及びＭＰＦの可溶性変形物を含むタンパク質族と類似な重要なアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドが卵巣癌にかかっている女性の尿の中に存在しているという発見に関係してる。これらの尿ポリペプチドはその族のタンパク質に対して産生される抗体と特異的に結合する。患者の尿中にこれらのポリペプチドが存在しているということはその患者が卵巣癌にかかっているという診断である。ポリペプチドの量は卵巣癌の効果的な治療によって減少する。このように、尿ポリペプチドは抗卵巣癌治療の効果を査定するのにも用いられる。

「抗体」というのは集合的にまた個別に免疫性グロブリン分子、免疫性グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗原結合部位を含む分子に対して集合的及び個別に当てはまるものである。特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する分子はそのペプチドと結合するが、そのポリペプチドを天然に含んでいる試料（例えば尿サンプル）のなかの他の分子とは殆ど結合しない分子である。免疫性グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、抗体がそれぞれパパイン又はペプシンのような酵素で処理されることによって発生できるＦ(ab）とＦ(ab')２フラグメントが含まれている。ポリクローナルおよびモノクローナルの一方又は両方の抗体がここに記載される方法とキットに用いられる。

「モノクローナル抗体」という語は特定のエピトープと免疫学的に反応することのできる抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集団をいう。

「標識した」という語は抗体またはペプチドに関するもので、検出可能物質をペプチド又は抗体にカップリング（即ち物理的に結合する）することによって直接ペプチド又は抗体を標識することと、ペプチド又は抗体を直接標識されている他の試薬とカップリングすることによってペプチド又は抗体を間接的に標識することを含んでいる。間接標識の例には蛍光標識した二次抗体を用いて、および蛍光標識したストレプトアビジン(streptavidin)で検出できるようペプチドをビオチンで末端標識して、一次抗体を検出することを含んでいる。

ひとつの実施形態において、患者の尿中でのＭＭＰＦＦペプチドの存在が、特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体と尿の接触により、そしてＭＭＰＦＦペプチドが第１抗体と結合したかを査定することによって査定される。

この分野では多くのＭＭＰＦＦ結合抗体が知られている。例えば米国特許第５，３２０，９５６に記載され、受入番号ＨＢ１０５７０としてＡＴＣＣに預託されたハイブリドーマによって分泌される抗体を使うことが出来る。その抗体はチャングほか（１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140）に記載のように、特異的にメソセリンタンパク質の約４０キロダルトン部と結合する。他の好適な抗体についてはショラーほか（１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報ＷＯ００／５０９００に記載され、そのような抗体はＯＶ５６９，４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれている。

２つの抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を用いる診断用キットと方法において、２つの抗体は同じエピトープとの結合を競合しないことが好ましい。例を挙げれば、ショラーほかによってＯＶ５６９と呼ばれる抗体は４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれる抗体に結合されたエピトープと異なるエピトープの所で結合する。このように、例えばＯＶ５６９を基質と結合させて患者の尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドと適当な抗体結合条件のもとで結合する捕獲抗体として用いることが出来、抗体４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６のひとつを検出可能に標識して、捕獲抗体と患者の尿の接触後、捕獲抗体と接触させることができる。検出可能に標識された抗体と捕獲抗体との結合はＭＭＰＦＦペプチドが患者の尿に存在していたことを示している。捕獲抗体と共局在している検出可能な標識の量の分析から存在していたペプチドの量を示すことが出来る。

抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を患者から採取した尿と接触させる実施形態において、尿はその自然に分泌された状態で用いられるか使用前に部分的に精製するか浄化することが出来る。例えば、尿は標準の方法を用いて遠心分離され、その尿を抗体と接触させる前に沈殿物を実質上除いてもよい。代わりに、尿はその量を減らすか大きな不純物を除くために濾過または限外濾過してもよい。尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドは１０，０００から１００，０００ダルトンの範囲の分子量をもつポリペプチドであると思われるので、ＭＭＰＦＦペプチドが検出前に除かれてしまうのを防ぐために適切な濾過又は限外濾過の選定が必要である。例をあげれば、比較的大きな孔のフィルター（例えば、２５０，０００から百万ダルトンの分子量を有する球状粒子の通過を許す様なもの）が尿から粒状物質を除くのに用いることが出来て、約５０００ダルトンよりも大きな分子量をもつタンパク質の通過を除外するような膜を装備した限外濾過装置が濾液を濃縮するのに用いることが出来る。この実施例では、限外濾過装置のなかの残留物のなかのＭＭＰＦＦの存在を査定できる。

女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの存在を査定する1つの好ましい方法は通常［サンドイッチＥＬＩＳＡ］アッセイとして知られる処理法である（ＥＬＩＳＡは酵素免疫測定法の略称である）。この方法では、抗体はガラスビーズやプラスチックのマルチウエルアッセイプレートの底面のような基質に結合される。この抗体は「捕獲」抗体と呼ばれる。尿中に存在するいかなるＭＭＰＦＦペプチドも特異的に捕獲抗体と結合するように、女性からの未処理の、或いは浄化したり精製した尿を、種々の条件のもと（例えば、塩および洗浄剤の濃度が低くタンパク質変性でない条件）で基質と接触させる。基質は任意にはＭＭＰＦＦペプチドを含まない液体で洗浄して残りの尿及び結合していないＭＭＰＦＦを除く。次いで基質は捕獲抗体が結合しているエピトープの所と異なるエピトープの所でＭＭＰＦＦペプチドと特異的に結合する第２抗体と接触させる。第２抗体はリガンド又はリガンドの受容体のいずれかと検出可能に標識されるか結合する。どちらにせよ、基質を第２抗体を含まない液体で洗浄した後に第２抗体の結合が検出され（かつ任意で定量され）る。第２抗体の検出はＭＭＰＦＦペプチドの尿中での存在を示している。第２抗体の量が定量されれば、次いで尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が定量できる。例えば、既知量のＭＭＰＦＦを含む対照試料を用いて行った測定で検出した第２抗体の量を比較することによって定量できる。

抗体検出は抗体を検出可能物質とカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質がある。好適な酵素の例には西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase)、アルカリホスフォターゼ(alkaline phoaphatase)、ベータガラクトシダーゼ(beta-galactosidase)、又はアセチルコリンエステラーゼ(acetylcholinesterase)を含み、好適な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン(streptavidin/biotin)とアビジン／ビオチン(avidin/biotin)を含み、好適な蛍光物質の例はウンベリフェロン(umbelliferone)、フルオレセイン(fluorescein)、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)、ローダミン(rhodamine)、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン(dichlorotriazinylamine fluorescein)、塩化ダンシル(dansyl chloride)又はフィコエリトリン(phycoerythrin)を含み、発光物質の例はルミノール(luminol)を含み、生体発光性物質の例はルシフェラーゼ(luciferase)、ルシフェリン(luciferin)、及びエクオリン(aequorin)で、好適な放射性物質の例は^１２５I、^１３１I、^３５S、又は^３Ｈを含む。

標準化したアッセイ装置を使用することでここに記載された方法の自動化ができるようになる。例えば、２４、４８、９６、３８４のウエルのあるプラスチックプレートのような多くの異なった標準化したアッセイ用容器が知られている。これらの容器をロボット装置に収容されるように適合させた場合、試料の自動分析が達成でき、比較的短い時間で多くの試料を高処理量でスクリーニングできる。コンピュータ制御アッセイに使用するように適合した自動アッセイ装置と容器はこの分野で既知でありここに記載されたキットや方法に容易に適合されている。

女性から採取された尿中のＭＭＰＦＦペプチドの存在を査定するのに用いることの出来る免疫学的アッセイについての他のタイプは普通「競合」アッセイと呼ばれる。このアッセイでは、特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体が基質に固定される。尿中に存在するいかなるＭＭＰＦＦペプチドも抗体と結合するように、未処理の尿、浄化又は精製された尿を（好ましくは数分又は数時間の間）基質に接触させる。特異的に抗体と結合する標識リガンド（例えば、同じＭＭＰＦＦペプチド又は別のＭＭＰＦＦペプチドの標識されたのもの）が次いで基質と接触される（好ましくは数分又は数時間の間）。標識または標識リガンドを含まない液体で基質を洗浄した後、基質と結合した標識リガンドの量が査定される。基質と結合した標識の量が、患者の尿とは接触していないが他の点では同様に処理された基質に結合した標識の量と比較される。結合した標識のこの２つの量の差が基質に結合したＭＭＰＦＦペプチドの量を示すものであり、基質に適用された尿サンプル中に存在したＭＭＰＦＦペプチドの量を示唆するものである。

免疫学的競合アッセイが用いられると、基質と結合した抗体の標識リガンドは患者の尿中に存在していると判っているか又は存在していると思われるＭＭＰＦＦペプチドと出来るだけ同じでなければならない。例えば、そのリガンドとそのＭＭＰＦＦペプチドは同じアミノ酸配列を有するか含んでいなければならない。同様に患者の尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドがグリコシル化されたものと思われる場合、リガンドも同様に同じ位置で同じ程度にグリコシル化されていなければならない。このように、リガンドに対する抗体とＭＭＰＦＦペプチドに対する抗体の親和性の差は最小にする事が出来て競合アッセイの精度を改善することが出来る。

本発明は哺乳類（例えば女性）から採取された尿サンプル中のＭＭＰＦＦの存在を検出するためのキットも含んでいる。そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１の薬剤、そのＭＭＰＦＦペプチドとその薬剤との結合を査定するための第２の薬剤、尿と第１の薬剤を接触させることを記載した使用説明書を含む。これらのキットは患者が卵巣癌に罹患しているか発症の危険が高まっているかを決定するために用いることが出来る。例えば、キットは尿サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドを検出可能な標識化合物又は薬剤を含むことが出来る。そのキットは又、或いはその代わりに、サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドの量を決定する手段を含むことができる。キットはＭＭＰＦＦペプチドの量が正常レベル（例えば、実施例１の方法を用いて４５０ナノメータでの吸光度測定値が少なくとも０．２）の上か下であるとき検査した患者が卵巣癌にかかっているか発症のリスクを負っているかを査定するための説明書を含むものである。

抗体をベースにしたキットに関し、そのキットは、例えば、（１）特異的にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体（例えば、固形支持体に付けられた）とオプションとして、（２）特異的にＭＭＰＦＦペプチド（例えば、第１抗体が結合しているところのエピトープと別のエピトープのところ）か第１抗体のどちらかと結合し検出可能な薬剤と結合している第２の別の抗体を含むことができる。代わりに、そのキットは第１抗体とその第１抗体の標識リガンドを含むことが出来る。その第１抗体と女性の尿サンプルを接触させた後、標識リガンドと第１抗体の結合がここで記載されたような競合型アッセイで査定することができる。

アッセイを行うために、ｈＩｇＧ融合タンパク質希釈液、対照、又は尿サンプル、又は希釈尿サンプルの５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。そのプレートを１時間常温でインキュベートし、ウエルは０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝した食塩水（ｐH７．８から８）で洗浄した。ビオチン化モノクローナル抗体ＯＶ５６９（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報番号ＷＯ００／５０９００に記載）のリッター当たり２００ナノグラム懸濁液５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。常温で１時間プレートをインキュベートし、そのあと０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝した食塩水（ｐH７．８から８）で各ウエルを洗浄した後、ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ(streptavidin-horseradish peroxidase)（アラバマ州バーミンガムのサウザーンバイオテクノロジーアソシエートインクのカタログ番号７１００−０５から得た（Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Al. catalog no. 7100-05））の１:５０００希釈液５０マイクロリッターを個々のウエルに加え、そのプレートを常温で１時間インキュベートした。５０マイクロリッターの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）用発色基質；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を個々のウエルに加えて信号を発生する。そのプレートを常温で１５分インキュベートし５０マイクロリッタのＴＭＢストップ液（０．１規定硫酸；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を加えてペルオキシダーゼ反応を停止した。ペルオキシダーゼのＴＭＢへの反応により出来た青色をモレキュラーディバイセススペクトラマックス（登録商標）プラス３８４（Molecular Devices SpectraMax Plus 384)分光光度プレートリーダー(モデル番号０２５２３)を用いて４５０ナノメータでの吸光度を測定した。