CN1731186A - 虾类食品过敏的诊断方法及所用的渗滤装置 - Google Patents

Abstract

一种虾类食品过敏的诊断方法，其特征在于将待检血清加在纤维素膜层上，用洗液清洗后，加入胶体金标记的虾类过敏原，根据纤维素膜层上是否形成红棕色的印迹，确定患者是否对虾类食品过敏。所用的渗滤装置有一下部有底的空壳，该空壳的上部由一带孔反应板封住，在空壳内带孔反应板之下依次为纤维素膜层、滤纸层和吸水材料层；此外还配备2个药瓶，一个装洗液，另一个装胶体金标记的虾类过敏原。本发明特异性强，敏感性高，胶体金标记对虾类过敏原的抗原性影响很小，且具有很高的标记率，操作简便、快速，可大幅度缩短诊断时间，显示诊断结果形象，直观、准确、明了，不会出现假阳性和误判，投资少，成本低。

Description

虾类食品过敏的诊断方法及所用的渗滤装置

技术领域

本发明涉及一种食品过敏的诊断方法及显示器具，特别是涉及一种虾类食品过敏的快速诊断方法及所用的渗滤装置。

背景技术

人们食用某些海产品后容易引起皮肤骚痒、胃肠功能紊乱等不良反应，这些症状称为过敏。研究发现，海产品中含有一些能引起特定人群产生过敏反应的物质，这些物质一般称作变应原。食物过敏就是由于摄入含有一种或多种变应原的食品而引起的一种以免疫损伤为主要表现形式的免疫应答。过敏反应可影响身体的各个部位及细胞，主要包括呼吸系统、肠胃系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉、骨骼等不同形式的临床症状，有时可能产生过敏休克甚至危及生命。根据过敏在临床上表现的器官不同可分为消化系统过敏反应，非消化系统过敏反应及二者混合的过敏反应。消化系统食物过敏反应可遍及全消化系统，主要表现为唇及舌部的血管神经性水肿、复发性口腔溃疡、以及胃痛、恶心、呕吐、厌食、腹胀、腹痛、腹泻、排粘液便等；非消化系统食物过敏反应主要表现为皮肤症状，如荨麻疹、血管神经性水肿、慢性湿疹、搔痒症、过敏性紫癜等，神经系统表现为偏头痛或全头痛，在呼吸道表现为支气管哮喘，极少数病人可以出现过敏性休克；消化系统及非消化系统混合食物过敏反应主要表现为腹绞痛、关节红肿疼痛，同时出现紫癜。所以过敏对人类健康的影响是巨大的，但由于其临床症状与其他疾病非常相似，这给临床诊断带来了很大的困难。

近几十年来，食品过敏正逐渐成为食品工业和临床变态学的一个重要瓶颈，过敏疾病发病率呈逐年上升趋势。由联合国粮农组织(FAO)提出的容易引起过敏的八大类食品中，海产品是其中最主要的种类之一。目前已有几种诊断过敏的方法：

1.双盲对照食物激发实验(double-blinded，placebo-controlled food challenges，DBPCFC)DBPCFC结果受多因素影响，甚至包括心理反应而出现自发性症状。实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及双盲控制等环节还有待完善。

2.皮肤针刺试验(skm prick testing，SPT)

SPT虽然简便易行，但往往需要多达数十点针刺，对试验者造成创伤和极大痛苦，此外，病人必须符合并在严格控制的条件下进行实验，如：皮肤完整、未使用对皮肤反应有极大影响的药物，实验物质必须保证除了过敏原特性外而不具传染性及毒性。

3.组胺释放实验(histamine releasing test，HRT)

由于组胺测定必须在抽血后24h内进行，造成该技术应用于食物过敏原检测与评价有一定局限性。但由于体外细胞组胺释放的影响因素较为复杂，且组胺测定方法也较为繁琐，该方法仍未推广应用。

4.特异性IgE的检测

目前有多种ELISA方法已用于特异性IgE检测，检测限可达0.005ng/ml，但操作复杂，且需要用4种试剂才能完成试验操作，对操作人员的技术水平要求较高，无法实现现场快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异、敏感、快速、简便的虾类食品过敏的诊断方法及所用的渗滤装置，它能弥补现有技术上述之不足。

一种虾类食品过敏的诊断方法其特征在于将待检血清加在纤维素膜层上，用洗液清洗后，加入胶体金标记的虾类过敏原，根据纤维素膜层上是否形成红棕色的印迹，确定患者是否对虾类食品过敏。

上述诊断方法所用的渗滤装置，其特征是有一下部有底的空壳，该空壳的上部由一带孔反应板封住，在空壳内带孔反应板之下依次为纤维素膜层、滤纸层和吸水材料层；此外还配备2个药瓶，一个装洗液，另一个装胶体金标记的虾类过敏原。

本发明具有如下积极效果：

(1)本发明的渗滤装置特异性强，敏感性高。金标抗原中金颗粒与虾类过敏原分子之间无共价键形成，而是通过电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对虾类过敏原的抗原性影响很小，且具有很高的标记率，具有特异性强，敏感性高的特征。

(2)本发明的方法和装置操作简便、快速，可大幅度缩短诊断时间，只要将待测样品滴入渗滤装置，在10分钟内即可判断诊断结果。

(3)显示诊断结果形象，直观、准确、明了，不会出现假阳性和误判。

(4)无需专业检测人员，投资少，成本低，可实现现场操作诊断，将会深受客户欢迎。

附图说明

附图为本发明的渗滤装置结构示意图。

具体实施方式

本发明由两个独立的渗滤装置组成，分别为检测单元和阳性对照单元。检测单元由下部有底的空壳1作为反应的载体；该空壳1的上部有一带孔的反应板2封住，后者由PVC材料制成；在空壳1内带孔反应板2之下依次为纤维素膜层3、滤纸层4和吸水材料层5；此外还配备2个药瓶，一个装洗液，另一个装胶体金标记的虾类过敏原。纤维素膜层3选用硝酸纤维素膜，其上包被有抗IgE抗体；滤纸层4选用Whatman滤纸；吸水材料层5选用高分子吸水材料。这三层依次层叠在反应孔2下构成反应区。阳性对照单元的组成和检测单元相同，不同之处在于阳性对照单元的纤维素膜层3上包被有IgE抗体。

本发明的装置可应用于人过敏疾病的快速诊断，为此，首先必须完成虾类过敏原的纯化，制备抗过敏原的多克隆抗体，购买抗人IgE抗体，用于制备金标抗原和纤维层

(1)虾类过敏原的纯化

首先用组织捣碎机将虾肉捣碎，用生理盐水悬浮，将悬液冰浴5分钟，加入-20℃预冷的丙酮，充分混匀，在0℃的条件下作用30分钟，其间混匀3-6次，离心收集沉淀物。用-20℃预冷的丙酮再次悬浮沉淀物，作用10分钟后，再次离心收集沉淀物，将沉淀物分散并让其在室温下风干。将所得的粉状物溶解在1M的氯化钾抽提液中抽提过夜，离心取上清液，将上清液调pH至4.2～5.6，并搅拌30分钟，离心后将所得沉淀重新溶解于上述抽提液中，重复一次此过程，沉淀溶解于0.5mM的二硫苏糖醇(DTT)中并对0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析，所得的抽提物过Sephdex100凝胶柱，分部收集，获得纯化的虾类过敏原，用于制备抗虾类过敏原的多克隆抗体。

(2)制备抗虾类过敏原多克隆抗体

取健康5～7周龄雌性二级Balb/c小鼠进行免疫。第一次基础免疫，将免疫原(浓度以蛋白计为1mg/ml)与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔、足垫多点注射(注射量0.2ml/只)。2周后开始进行加强免疫，每隔2周加强免疫一次，在每次加强注射后的7～10d，从Balb/c小鼠的尾部采血。最后一次免疫后，收集到的血液在37℃下放置1h，4℃下过夜，以10000r/min离心5min，吸取血清，分装；冻存。

(3)制备金标抗原

以枸橼酸钠还原法制备胶体金，先将100ml 0.01％(质量百分浓度，下同)HAuCl4溶液放入微波炉中，沸腾2min，迅速一次加入4.0ml的1％柠檬酸三钠水溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1M的盐酸调节胶体金pH至5.0～6.0，以1∶1000～1∶3000的标记比将待标记的虾类过敏原加入胶体金中，室温下标记10min后，加5mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.2mg/ml，4℃1000～3000r/min离心20min，除去末结合的金颗粒，然后4℃12000r/min离心30～60min，弃去上清液，获得初步纯化的金标抗原标记物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金际记的抗原。

(4)抗人IgE抗体购于Sigma公司。

(5)虾类过敏疾病快速诊断渗滤装置待测血清的制备

对待检人员进行静脉采血2～5ml，3000r/min离心或静置2h分离出血清，作为待测样品。

(6)将待测血清滴加到免疫渗滤装置的反应板2的孔中以后，血清就接触纤维素膜层3，并由滤纸层4和吸水材料层5渗滤，在渗滤过程中，血清中的IgE抗体就会和固定在硝酸纤维素膜层3上的鼠抗人IgE抗体结合，加入纳米金标记的虾类过敏原后，吸附在纤维素膜层3上的IgE抗体就可以与虾类过敏原结合，产生金标抗原-IgE抗体-鼠抗人IgE抗体的结合物，形成红棕色的印迹。若血样中不含有IgE抗体，就不能形成金标抗原-IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物，因此在硝酸纤维素膜层3上就不会出现红棕色的印迹。阳性对照单元在加入纳金标记虾类过敏原后，与固定在硝酸纤维素膜层3上的IgE抗体结合，形成红棕色的金标抗原-IgE抗体的结合物。如果阳性对照单元的纤维素膜层3上没有出现红棕色的印迹，则表明该已经失效，不能再用于检测。

(7)诊断方法：将检测单元的反应区用含有1％BSA，0.01M、pH7.4的PBS1滴活化并封闭，约15s待其完全渗入以后，加待测血清样品15μl，待完全渗入后，加入1滴含0.1％吐温的PBS(PBST)清洗，然后加入纳米金标记的虾类过敏原试剂1滴，完全渗入后，加入1滴0.01M的PBST清洗，观察结果。阳性对照单元在活化并封闭后，加入纳米金标记的虾类过敏原试剂1滴，其余步骤与上述检测单元相同。如果在检测单元和阳性对照单元的硝酸纤维膜层3上均显示有红棕色印迹，表示检测样品呈阳性，即所采人的血样中存在IgE抗体，被检测者对虾类过敏；如果仅阳性对照单元的硝酸纤维膜层3上显示有红棕色印迹，表示所检血液样品呈阴性，说明被检血液中不存在IgE抗体，即被检测者对虾类不过敏，如果阳性对照单元的硝酸纤维膜层3上不显示标记，即表示该渗滤装置已失效。

Claims (2)

1.一种虾类食品过敏的诊断方法，其特征在于将待检血清加在纤维素膜上，用洗液清洗后，加入胶体金标记的虾类过敏原，根据纤维素膜上是否形成红色的印迹，确定患者是否对虾类食品过敏。

2.实施权利要求1所述的方法所用的渗滤装置，其特征是有一下部有底的空壳(1)，该空壳(1)的上部由一带孔反应板(2)封住，在空壳(1)内带孔反应板(2)之下依次为纤维素膜层(3)、滤纸层(4)和吸水材料层(5)；此外还配备2个药瓶，一个装洗液，另一个装胶体金标记的虾类过敏原。