CN103995118A - 用于肉类过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条，所述试纸条包被有胶体金标记的肉类抗原。本发明利用胶体金标记技术，首次用胶体金标记特异性肉类过敏原，然后将标记后的过敏原均匀喷线于醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜上，制备成试纸条产品进行过敏原检测，操作简便，结果准确，成本低廉，可实现多项自由检测。

Description

用于肉类过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及胶体金标记技术领域，具体地说，涉及一种用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法。
背景技术
过敏性疾病是当代社会中最常见的一种疾病，它是由广泛存在的过敏原引起的，我国约5～10％、美国和欧洲约5～25％的人群遭受过过敏性侵扰，其中幼儿和青少年尤为明显，危害较严重。过敏反应(allergy)是免疫机体再次接触相同变应原时，发生反应过度剧烈而引起的生理功能紊乱和组织损伤的病理性免疫反应。涉及临床各科，如内科包括支气管哮喘、过敏性休克、血清病、结缔组织病、肾小球肾炎、偏头痛等，外科包括移植排异反应、耳鼻喉科有过敏性鼻炎、渗出性中耳炎、美尼尔病等，妇产科包括新生儿溶血症，眼科包括过敏性结膜炎、交感性眼炎，口腔科包括复发性口疮，皮肤科约半数以上的疾病为过敏反应病，另外还有输血反应、药物过敏、过敏性休克等。
2011年4月国家统计局颁布的的调查统计数据显示，全国城市人口约5.7亿，其中有1.5亿城市过敏原发病人口，常年处于过敏原状态的人群达5122万人。据此估算，中国人口城市变态反应疾病发病率为27％，加上非城市人口，实际中国变态反应疾病发病人数约为3.6亿。然而，近十年来，我国过敏原患者的诊治率不到1％，近99％的过敏原患者得不到及时的诊断和治疗。
据不完全统计，全国15000家县级以上医院中引进UniCAP的不足150家，引进率仅占1％。这一比例与其他生化检测设备(约40～50％)的引进率相比，足以说明过敏原的体外诊断领域存在着巨大发展空间。同时，体外过敏原检测设备和试剂主要依赖进口，这些原料均采自欧美的进口过敏原试剂，与我国患者的地域差和人种差也有待验证。基于上述情况，开发一种符合本土化要求的过敏原检测系统，包括我国自主创新的过敏原检测仪和试剂在内的研发势在必行。
过敏原检测的方法主要分为体内诊断和体外诊断。体内诊断包括皮肤诊断(定性检查)和激发诊断。常见的皮肤诊断包括皮内实验、点刺实验、划痕实验、斑贴实验等。激发诊断包括结膜实验、鼻实验、支气管实验、食物实验、药物激发实验、物理性激发实验等。由于体内诊断的影响因素复杂，准确性低，结果只能进行定性，且检查本身给患者带来痛苦，对严重过敏患者甚至存在生命危险等诸多因素，限制了体内诊断的进一步发展。
体外诊断的原理是基于IgE抗体诊断，在诊断技术上包括免疫印记法、放射变应原吸附诊断(RAST)、荧光酶标法(FEIA)、酶联免疫法(ELISA)等。
目前，国内常用的临床检测过敏原的方法是以皮肤针刺试验(SPT)为主的体内试验方法，即用稀释过敏原液直接点刺皮肤，观察检测点是否出现风团或潮红反应，进行阴性或阳性判定。SPT虽然有简便，成本低，患者可见结果等优点。但是其结果受诸多因素影响，准确性低，检查本身给患者尤其是小儿患者带来痛苦，对严重过敏患者甚至有生命危险。国内体外诊断领域处于落后状态，基本集中在手工操作和半定量半自动分析状态。存在操作烦琐、灵敏度和精密度差，测试时间长的缺点。
与体内试验相比，只需少量血清即可筛选和确定百种过敏原，具有效能参数可靠，不受药物影响，无全身反应危险等显著优点。应用比较突出的是PHARDIA UNICAP系统和SIEMENS诊断系统。PHARDIA UNICAP系统自70年代问世以来，一直被作为过敏原诊断的金标准。80年代进入中国，一直处于垄断地位。而SIEMENS诊断系统是过敏原自动化新技术的代表，是近几年新兴的过敏原诊断系统，尚未进入中国市场。
在发达国家，临床上通行的全自动过敏原检测是基于酶联免疫法。常用两种方法：酶联免疫荧光测定法和生物素-亲和素系统-酶联免疫法。
酶联免疫荧光测定法的经典系统是Pharmacia(法玛西亚)公司的Immuno CAP检测系统，它采用纤维素固相载体，该固相载体经溴化氧活化后与过敏原共价结合。过敏原预先结合在固相载体上，加入血样后37℃孵育,如患者血清中有针对该过敏原的特异性IgE，即形成抗此过敏原抗体复合物。洗脱后加入酶标记的酶标二抗，形成固相载体-过敏原-特异性IgE-酶标二抗的结合物。再次洗脱后加入底物，产生酶催化荧光产物。测定荧光值。根据荧光吸光度的大小换算成特异性IgE含量。
生物素-亲和素系统-酶联免疫法采用Fooke公司的ALLERG-O-LIQ测定系统，酶标板由抗人IgE抗体包被，可用来检测总IgE和特异性IgE。加入血样后孵育和洗涤，酶标板结合所有IgE，洗涤可避免其他免疫球蛋干扰(如特异性抗原)，再加入生物素标记的过敏原，然后加入结合了酶的链霉亲和素结合物和显色底物，通过酶与底物反应后吸光度的变化来检测针对特异性过敏原的IgE含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条。
本发明的另一目的是提供所述试纸条的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条，所述试纸条包被有胶体金标记的肉类抗原。
具体地，本发明所述试纸条为包被有胶体金标记的肉类抗原的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
其中，所述试纸条的pH值为8.5-10，胶体金颗粒与肉类抗原之间的摩尔比为20-40:1。肉类的来源为猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等。肉类的肌肉组织中引起过敏反应的蛋白成分复杂，目前尚处于研究探索中。
所述牛肉抗原的制备方法为：取牛肉肌肉组织100g，用组织粉碎机打碎后，分别用300mL丙酮分析纯溶液和300mL苯的分析纯溶液交替脱脂5-6次(例如，用丙酮分析纯溶液和苯的分析纯溶液各脱脂3次)，每次脱脂前，均用粉碎机粉碎一次；脱脂结束后进行离心，离心后的物质置于通风橱中，将残余的丙酮和苯挥发完全，所得物质再次研磨粉碎，即得牛肉抗原。
本发明还提供所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)肉类抗原溶液的制备：将待标记的肉类抗原溶解在0.9％pH7.0的NaCl溶液中，使其终浓度为50-500μg/ml，即得肉类抗原溶液；
2)胶体金溶液的制备：用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl调0.01％HAuCl4胶体金溶液的pH值至8.5-10，使胶体金的粒径达到40-60nm，浓度达到0.5-2％，即得胶体金溶液；
3)胶体金与肉类抗原的结合：用0.1M K2CO3溶液调步骤1)的抗原溶液的pH值至8.5-10，边搅拌边向其中加入步骤2)的胶体金溶液，抗原溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止肉类抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-肉类抗原结合物；所述稳定剂为BSA(牛血清白蛋白)和分子量20KD的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％；
4)胶体金标记的肉类抗原的纯化：将步骤3)中制备的胶体金-肉类抗原结合物经1500r/min离心20min；收集沉淀溶于稳定剂中，使其浓度达到5-30％；然后加至Sephacryl S-400层析柱上进行纯化，将纯化的胶体金标记的肉类抗原溶液过滤除菌，4℃保存；所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液；
5)试纸条的包被：将步骤4)中制备的胶体金标记的肉类抗原溶液喷线于试纸条上，干燥后即得用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条成品。
前述的制备方法，步骤4)中加样量为Sephacryl S-400层析柱体积的1/10，以稳定剂作为洗脱液，流速为5-10ml/h；所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液。
使用时，将本发明的试纸条浸入人血清中，使血清中IgE抗体与特异性过敏原结合，产生紫色条带。根据条带颜色的深浅对照比色卡进行分级，
本发明利用胶体金标记技术，首次用胶体金标记特异性肉类过敏原抗原，然后将标记后的过敏原均匀喷线于醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜上，制备成试纸条产品进行过敏原检测，操作简便，结果准确，成本低廉，可实现多项自由检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法
用于特异性牛肉过敏原IgE筛查的试纸条的制备包括待标记抗原溶液的制备、待标胶体金溶液的制备、胶体金标记牛肉抗原、胶体金牛肉抗原的纯化、胶体金蛋白颗粒的粒径鉴定以及试纸条的包被。具体步骤如下：
1、待标记抗原溶液的制备
所述牛肉抗原的制备方法为：取牛肉肌肉组织100g，冷冻后用组织粉碎机打碎后，分别用300mL丙酮分析纯溶液和300mL苯的分析纯溶液交替脱脂各3次；脱脂结束后进行离心，离心后的物质置于通风橱中，将残余的丙酮和苯挥发完全，所得物质再次研磨粉碎，即得牛肉抗原。
将待标记的牛肉抗原溶解在0.9％pH7.0的NaCl溶液中，使其终浓度为50-500μg/ml，即得牛肉抗原溶液。
2、待标胶体金溶液的制备
用0.1M K2CO3溶液或0.1M HCl调胶体金溶液的pH值至9.0，使胶体金的粒径达到50nm，浓度达到1％。
3、胶体金标记牛肉抗原：将胶体金和抗原溶液分别用0.1M K2CO3溶液调pH至9.0，电磁搅拌抗原溶液，加入胶体金溶液，抗原溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，继续搅拌10min，加入稳定剂BSA和分子量20KD的聚乙二醇，得到1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液。此过程需要调整抗原的用量，以胶体金标记抗原完成后的溶液呈葡萄酒红色为最佳。
4、胶体金标记的牛肉抗原的纯化：将步骤3中制备的胶体金-牛肉抗原结合物经1500r/min离心20min；收集沉淀溶于稳定剂(所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液)中，使其浓度达到5-30％；然后加至Sephacryl S-400层析柱上进行纯化，将纯化的胶体金标记的牛肉抗原溶液过滤除菌，4℃保存。
纯化过程中，加样量为Sephacryl S-400层析柱体积的1/10，以稳定剂(所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液)作为洗脱液，流速为5-10ml/h。
5、胶体金蛋白颗粒的粒径鉴定
胶体金颗粒平均直径的测量：在透射电镜下观察胶体金颗粒，计算100个金颗粒的平均直径应在40～60nm范围内。
6、试纸条的包被
将阴性对照溶液(含40-70％牛血清白蛋白的PBS溶液)，步骤4纯化的抗原溶液进行均匀喷线。
在免疫层析试纸硝酸纤维素膜表面进行阴性对照和抗原溶液的喷线。用气动喷头进行定量操作。用三维平台往复来回间隔喷线。最后将喷好的硝酸纤维素膜干燥并裁切成条。
7、结果判断
根据条带颜色的深浅对照比色卡进行分级，分级方法见表1：
表1分级标准
血清中IgE浓度 分级 特异性IgE含量
＜0.35IU/mL 0 无
0.35-0.75IU/mL 1 低
0.75-3.5IU/mL 2 增加
3.5-17.5IU/mL 3 显著增加
17.5-50IU/mL 4 显著增加
50-100IU/mL 5 较高
＞100IU/mL 6 极高
目测比色中，比色卡上的条带为在免疫层析试纸硝酸纤维素膜表面直接进行葡萄皮红喷线。根据喷线葡萄皮红的浓度不同形成梯度(表2)：
表2不同IgE浓度对应于比色卡上葡萄皮红的浓度
血清中IgE浓度 葡萄皮红浓度
＜0.35IU/mL 无
0.35-0.75IU/mL 0.25g/L
0.75-3.5IU/mL 0.5g/L
3.5-17.5IU/mL 2g/L
17.5-50IU/mL 5g/L
50-100IU/mL 9g/L
＞100IU/mL 12g/L
本发明提供的用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条适于工业化大规模生产，降低了生产成本，大大降低了过敏原单项检测的价格。另外，对具有中国本土特点的过敏原原料，实现本土化，更适于中国人群过敏原的诊断，提高了诊断的准确性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条，其特征在于，所述试纸条包被有胶体金标记的肉类抗原。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条为包被有胶体金标记的肉类抗原的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的pH值为8.5-10，胶体金颗粒与肉类抗原之间的摩尔比为20-40:1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，肉类的来源为猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉。
5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述肉类抗原为牛肉抗原；所述牛肉抗原的制备方法为：取牛肌肉组织100g，冷冻后用粉碎机打碎后，分别用300mL丙酮分析纯溶液和300mL苯的分析纯溶液交替脱脂5-6次；脱脂结束后进行离心，离心后的物质置于通风橱中，将残余的丙酮和苯挥发完全，所得物质再次研磨粉碎，即得牛肉抗原。
6.权利要求1-5任一项所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)肉类抗原溶液的制备：将待标记的肉类抗原溶解在0.9％pH7.0的NaCl溶液中，使其终浓度为50-500μg/ml，即得肉类抗原溶液；
2)胶体金溶液的制备：用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl调0.01％HAuCl4胶体金溶液的pH值至8.5-10，使胶体金的粒径达到40-60nm，浓度达到0.5-2％，即得胶体金溶液；
3)胶体金与肉类抗原的结合：用0.1M K2CO3溶液调步骤1)的抗原溶液的pH值至8.5-10，边搅拌边向其中加入步骤2)的胶体金溶液，抗原溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止肉类抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-肉类抗原结合物；所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇；
4)胶体金标记的肉类抗原的纯化：将步骤3)中制备的胶体金-肉类抗原结合物经1500r/min离心20min；收集沉淀溶于稳定剂中，使其浓度达到5-30％；然后加至Sephacryl S-400层析柱上进行纯化，将纯化的胶体金标记的肉类抗原溶液过滤除菌，4℃保存；所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液；
5)试纸条的包被：将步骤4)中制备的胶体金标记的肉类抗原溶液喷线于试纸条上，干燥后即得用于特异性肉类过敏原IgE筛查的试纸条成品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中加样量为Sephacryl S-400层析柱体积的1/10，以稳定剂作为洗脱液，流速为5-10ml/h；所述稳定剂为1％BSA和0.1％分子量20KD的聚乙二醇溶液。
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