CN101387643A - 多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法，试剂盒组成包括已固化的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉菌类环境过敏原蛋白的硝酸纤维膜条，胶体金标记抗人IgE抗体、缓冲液和分级比色卡。采用该试剂盒，目测可定性判断结果，使用比色卡可对检测结果进行半定量分级，临床检测中可以一次加样，每一个通道可快速检测10－20种过敏原，多个通道可同时检测60－100种不同的过敏原，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，为体外辅助诊断确定使患者致敏的过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。

Description

多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及了一种定性和半定量检测人血清中过敏原特异性抗体IgE含量的多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

过敏性疾病是现代社会中最常见的一种疾病，它是由广泛存在的过敏原引发的，我国大约5-10％、美国和欧洲约有5-25％的人受过敏性疾病侵扰，其中幼儿和青少年的病症尤为明显，威胁较严重。过敏反应(allergic reaction)又称变态反应；过敏原(allergen)又称变应原。根据欧洲过敏和临床免疫学学会(European Academy of Allergy and Clinical Immunology，EAACI)发表的观点，免疫介导的过敏反应有两种类型：IgE介导的过敏反应和非IgE介导的过敏反应(Johansson SGO.et al，2001，Allergy，56：813-824)。IgE介导的过敏反应是过敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(sIgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型过敏原刺激时，过敏原使IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、平滑肌痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，如：花粉症、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性休克、荨麻疹、湿疹、血管性水肿、关节炎、头痛、肠胃功能失调及其它慢性症状(周光炎等译，2002，免疫学，PP323-369，人民卫生出版社；Sampson HA，1999，Food allergy，part1，J Allergy Clin Immunol，103：717-728)。

过敏原致敏传递方式分三类：食物型，通过口腔摄入食物过敏原致敏；吸入型，通过鼻腔等吸入花粉、粉尘等环境过敏原致敏；接触型，通过接触皮肤，经毛孔传递引发过敏，如镍、铬制品，橡胶制品等。本试剂盒涉及的过敏原为食物型和吸入型的大分子过敏原蛋白或多肽。

食物过敏原分两大类：植物蛋白和动物蛋白，一般为分子量10kD—70kD的糖蛋白。由它们的结构和功能特性分成为含过敏原的植物蛋白的是豆科植物、树坚果、谷物、水果、蔬菜等中的醇溶蛋白的超家族，花生、树坚果、大豆等的种子贮藏蛋白的杯状蛋白超家族和谷物的α-淀粉酶、蛋白酶抑制剂等植物防卫系统的蛋白家族(Aalberse RC，2000，Structural biology of allergens，J AllergyClin Immunol，106：228-238；Breiteneder H er al，2004，A classification of plantfood allergens，J Allergy Clin Immunol，113：821-830)；含过敏原的动物蛋白的来源为以牛IgE白蛋白为代表的哺乳动物及鸟类的肉、乳蛋白，以小清白蛋白为代表的鱼类肉蛋白，以原肌蛋白为代表的甲壳动物、软体动物、两栖动物和爬行动物等的肉蛋白(Chapman JA et al，2006，Food allergy：a practice parameter，Ann Allergy Asthma Immunol，96：S1-S68)；以它们为原料还产生了数不清的“营养健康食品”(Wal JM，1999，Nahrung，43：s168-174)。

吸入型物质的过敏原是以Bet v1为代表的树花粉蛋白，以Ph1 p2为代表的草花粉蛋白，以Fel d1为代表的动物皮屑蛋白，以Pen c3为代表的霉菌类蛋白，以Der p1为代表的螨虫蛋白和以Bla g1为代表的蟑螂蛋白等(Hiller R et al，2002，FASEB J，16：414-418)。

IgE介导的过敏反应的致敏过敏原检测在临床上可以通过皮肤试验及各种体外检测方法，如放射性过敏原吸附检测(RAST)、免疫印迹(IS)及酶免疫分析(EIA)等，结合病史、病症的问诊来确定致敏的过敏原。体外检测是测定血液样本中的IgE，特别是过敏原特异性IgE(sIgE)抗体浓度。酶免疫分析中有多种检测结合酶的方法，即荧光法，化学发光法和免疫层析法等，且均有产品被美国FDA批准(Chapman JA et al，2006，Food allergy：a practice parameter，Ann Allergy Asthma Immunol，96：S1-S68)，美国临床实验室标准化委员会(CLSI)专门制定了人IgE抗体免疫分析方法评价的纲要(I/LA20—A，NCCLS，1997，17(20))，使用多通道免疫层析法，仅用少量样品就可以同时检测几种至数十种过敏原，所以可以简便、快速的检测出过敏原特异性抗体IgE含量，目测可定性判断阳性或阴性结果，使用比色卡可半定量分级，试剂操作方便，既可用于医院床边快速诊断，也可用于社区诊所或乡村医院甚至家庭。尤其适合我国当前的国情。

多通道免疫层析法，采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术来定性和半定量检测血清中的特异性IgE抗体。当固化于硝酸纤维膜载体表面的致敏性抗原与病人血清在一起反应后，血清中特异性IgE就会特异地结合到抗原上，此特异结合的抗体被标记的抗人IgE抗体所识别，颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例；根据人血清中特异性IgE的浓度建立的分级比色卡，评判筛查出的过敏原的致敏程度。

免疫层析法应用的多种技术，如过敏原蛋白的提取纯化方法，人IgE抗体和抗人IgE抗体的制备、纯化，胶体金标记抗人IgE抗体的制取纯化等均已成熟，为多通道过敏原快速检测试剂的商品化生产奠定了技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法，每一个通道可快速检测10—20种过敏原，多个通道可同时检测60—100种不同的过敏原，多通道过敏原快速检测试剂准确性高、特异性强、重现性好，使用方便、快速，可定性和半定量检测人血清过敏原特异性抗体IgE的含量，用以筛查和确诊两级试剂检测患者致敏的过敏原并确定患者致敏反应的程度。

本发明的多通道过敏原快速检测试剂盒，其组成包括已固化的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉菌类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条，胶体金标记的抗体，缓冲液，分级比色卡；

其中：

已固化的奶类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：牛奶、羊奶；

已固化的蛋类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：家禽蛋白、家禽蛋黄；

已固化的肉类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；

已固化的谷物类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；

已固化的坚果类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；

已固化的水果类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；

已固化的蔬菜类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；

已固化的水产类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；

已固化的豆类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；

已固化的吸入型螨虫类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：尘螨、粉螨、屋尘；

已固化的吸入型动物皮屑类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：猫、狗、马、牛、羊；

已固化的吸入型鸟羽绒类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：鸡、鸭、鹅、鸽；

已固化的吸入型花粉类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：桦树、枫树、桤树、构树、棕榈、葵树、榛树、柏树、松树、杉木、栗树、栎树、梧桐、杨树、柳树、桑树、榆树、艾蒿、豚草、藜草、车前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、芦苇、葎草、苍耳、香蒲、莎车、芨芨草、向日葵；

已固化的吸入型蟑螂类过敏原蛋白的硝酸纤维膜玻片包括：德国小蠊、美洲大蠊；

已固化的吸入型霉菌类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：点青霉菌、多主枝孢霉菌、烟曲霉菌、交链孢霉菌、黑根霉菌、酿酒酵母菌、小麦黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；

胶体金标记抗体：胶体金标记的抗人IgE抗体；

多通道加样槽：由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造的多通道加样槽；

缓冲液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

分级比色卡：根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系，制作的分级比色卡(颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例，随特异性IgE浓度的升高，颜色逐渐变深)。

上述的过敏原蛋白的硝酸纤维膜条置于多通道加样槽中。

本发明的多通道过敏原快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)过敏原蛋白的制备：将含过敏原蛋白的材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；

2)胶体金标记抗体的制备：用胶体金标记的抗人IgE抗体；

3)用过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条，并封闭；

4)将过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条放入多通道加样槽中；

5)配制缓冲液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％ Tween-20和20mg/L庆大霉素；

6)根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系，制作分级比色卡。(颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例，随特异性IgE浓度的升高，颜色逐渐变深)。

上述的多通道加样槽由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造。

本发明的试剂盒的使用方法，包括如下操作步骤：

(1)加入样品液到加样孔中，使样品液中的过敏原特异性IgE抗体各自与相应的固相过敏原蛋白结合或质控线中人IgE相结合，过敏原特异性IgE抗体再与胶体金标记的抗人IgE抗体结合。

(2)加入缓冲液加样孔中，加快血清标本迁移速度，被结合区域显色；

(3)20—30分钟后，用分级比色卡观察结果；颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例，随特异性IgE浓度的升高，颜色逐渐变深。

固化在硝酸纤维膜条微孔表面上的抗原捕获样品血清中的特异性IgE抗体，胶体金标记抗人IgE抗体识别特异性IgE并与之结合，形成抗原—特异性IgE—胶体金标记抗人IgE抗体的复合物，颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例，随特异性IgE浓度的升高，颜色逐渐变深，目测可定性判断结果，使用比色卡可对检测结果进行半定量分级。

本发明的有益效果在于：

本发明建立了多通道免疫层析法测定样品液中的过敏原特异性IgE抗体含量，定性和半定量筛查致敏过敏原，检测灵敏度小于0.3IU/ml，使用比色卡可对检测结果进行半定量分级，目测可定性判断结果。临床检测中可以一次加样，每一个通道可快速检测10—20种过敏原，多个通道可同时检测60—100种不同的过敏原，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，为体外辅助诊断确定使患者致敏的过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。既可用于医院床边快速诊断，也可用于社区诊所或乡村医院甚至家庭。

附图说明

图1是一块多通道过敏原快速检测试剂板的俯视图；

图2是大麦等谷物的贮藏蛋白的抗体结合表位区域的氨基酸组成序列(具有相同氨基酸残基的底色为灰色)；

图3是苹果等水果的脂转移蛋白的抗体结合表位区域的氨基酸组成序列(具有相同氨基酸残基的底色为灰色)；

图4是三种螨虫主要过敏原蛋白Derp1、Der f1 c1、Eur m1的氨基酸序列比较(具有相同氨基酸残基的底色为灰色)；

图5是三种螨虫主要过敏原蛋白Der p2、Der f2、Eur m2的氨基酸序列比较(具有相同氨基酸残基的底色为灰色)；

图6是过敏原蛋白chea2、ph1pp11及Olee2 Betv2的氨基酸序列比较(具有相同氨基酸残基的底色为灰色)。

具体实施方法

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

本发明的多通道过敏原快速检测试剂盒，其组成包括已固化的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉菌类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条，多通道加样槽，胶体金标记抗人IgE抗体、缓冲液、分级比色卡。

本发明的多通道过敏原快速检测试剂盒的制备方法：

1.过敏原蛋白的制备

1.1 过敏原蛋白的粗浸提液

1.1.1 奶类提取液

奶类浸液的制作有两种方法：

(1)先用离心法(2400转/分钟)离心15分钟，用小匙除去上层脂肪，取400ml脱脂乳，加入5ml 1％凝乳酶或乳冻片，不搅拌，放入37℃恒温水浴或孵箱内30分钟，如乳清蛋白与酪蛋白(casein)分离，用干净纱布过滤，再用普通滤纸过滤。按1：2(W/V)的比例，用缓冲盐水提取液稀释乳清蛋白即为乳清蛋白提取液。

(2)将含有乳清的滤液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用离心法除去上清液，再用丙酮浸洗几次，干燥后研细成粉未贮存。提取时按1：50(W/V)用缓冲盐水提取液在冰箱内提取48小时，每日搅拌或振荡2小时。

酪蛋白用丙酮和乙醚反复脱脂、最后研磨，用3号或4号筛筛出，按1：50(W/V)比例提取。

1.1.2 蛋类提取液

蛋白和蛋黄均按1：20(W/V)的比例用缓冲盐水提取液稀释，充分混匀后直接过滤和除菌，不需提取，亦无需作毒性试验。

蛋黄也可制成干粉，方法是加入丙酮脱脂2-3小时，倾去丙酮层，待挥发干燥后，用打碎机打碎，再用乙醚脱脂4小时备用。蛋黄干粉按1：50比例(W/V)用缓冲盐水提取液提取。

1.1.3 肉类提取液

取新鲜瘦肉，去掉脂肪和结缔组织，剁成碎末，或用绞肉机绞碎。交替用甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶剂反复脱脂，室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。

按1：25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。

粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。

1.1.4 谷物、坚果、豆类蛋白提取液

(1)干燥、去壳、脱皮、磨粉贮存；在索氏提取器中按粉：正己烷＝1：10(W/V)的比例脱脂6小时，干燥脱脂粉再磨细贮于-20℃下的密封容器中备用。

(2)脱脂粉用提取缓冲液(含20mmol NaH2PO4，1mol/L NaCl，pH7.0)提取蛋白；脱脂粉：提取缓冲液的比例为1g：10ml(W/V)，室温提取1.5小时，然后4℃下20000g离心30分钟，保存上清液。

1.1.5 水果、蔬菜类蛋白提取液

将100g水果(包括果皮、去核)、蔬菜洗净、凉干、切碎后加入150ml 20mmol/lPBS(pH7.4)溶液，其中含2％的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)悬浮颗粒，2mmol/l的EDTA，10mmol/l的二乙二硫基氨基甲酸酯(DIECA)钠和3mmol/l的NaN3，匀浆4℃提取4小时后，12000g4℃下离心30分钟，上清液-20℃下保存。

1.1.6 水产类蛋白提取液

取新鲜水产肉，去脂肪，粉碎。用丙酮或乙醚反复脱脂、室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。

按1：25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。

粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。

1.1.7 吸入型螨虫类蛋白提取液

取50g饲养的螨虫，加入80ml丙酮或无水乙醇清洗灭活后用多层纱布过滤除去溶剂，风干、研细，再加入100ml乙醚，反复振摇1小时脱脂；挥净乙醚的脱脂粉以1：100(w/v)的量加入0.125mol/l NH4HCO3缓冲液(pH8.3)，内含0.1％NaN3溶液室温提取3小时，期间经常搅拌；10000g离心20分钟，上清液-20℃下贮存。

1.1.8 吸入型动物皮屑和鸟羽绒类蛋白提取液

采集的皮屑和剪碎的羽绒用2倍以上苯、丙酮等溶剂浸泡1.5小时，不断振摇脱脂，倒掉溶剂、挥净残余溶剂后用5％(W/V)的0.125mol/l NH4HCO3缓冲液(pH8.3)4℃下提取20小时，不断振摇，然后13000g4℃离心15分钟，上清液过三层纱布过滤，滤液-20℃下贮存。

1.1.9 吸入型花粉类蛋白提取液

采集的花粉过筛去除杂质，加入3倍乙醚浸泡振摇脱脂2小时，弃去溶剂，挥净残余乙醚。取脱脂后的花粉1g在40ml 0.125mol/l NH4HCO3缓冲液(pH8.3)4℃下搅拌过夜(20小时以上)，然后15000g离心15分钟除去不溶物。该提取上清液每50μl加入400μl冷甲醇，4℃静置过夜沉淀蛋白，离心，N2气下干燥后的沉淀溶于含SDS的缓冲盐溶液(pH7.0)中，待用。

1.1.10 吸入型蟑螂类蛋白提取液

蟑螂放冰箱冷冻灭活，加入无水乙醇浸泡半小时、洗去虫体表面微生物后风干，在粉碎机中以2400rpm打成粉末；加入3倍体积的乙醚+乙酸乙酯(1+1，V/V)浸泡振摇脱脂2小时，弃去带脂溶剂，残余乙醚挥干后，30g粉末加入200ml含6mmol/l β-巯基乙醇和1/1000体积的蛋白酶抑制剂的PBS(pH7.4)溶液，缓缓搅拌4℃下过夜，且每毫升加入1mg的1-苯基-3-(2-硫腙基)-2-硫脲防止溶液黑褐化；然后将提取液在4℃下以10000g离心30分钟，上清液过0.45μm滤膜后-20℃下贮存。

1.1.11 吸入型霉菌类蛋白提取液

干燥的霉菌块状固体，用高速种籽粉碎机打成粉末，过4号筛；取适量粉末加入3倍体积的乙醚浸泡振摇2小时，弃去乙醚并将样品中残余乙醚挥尽，再加入2倍体积的甲醇浸泡振摇1小时，离心除去甲醇，N2气下干燥；5g菌粉中加入100ml含2mmol/l EDTA和8mmol/l的β-巯基乙醇的PBS溶液4℃下搅拌提取过夜，然后15000g4℃离心30分钟，上清液-20℃下贮存。

1.2 过敏原蛋白的提取

过敏原蛋白的粗提取液需经透析、SDS-PAGE电泳免疫印迹确认、割胶、离心提取的较纯的过敏原蛋白组分。

(1)将浸提液在透析袋(MWCO 10000)中对10mmol/L PBS(pH7.2)透析48小时，期间缓缓搅动PBS溶液，并更换PBS液4次；

(2)透析后的过敏原蛋白溶液过0.45μm滤膜，并稀释成4mg/ml的蛋白溶液；

(3)过敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的胶柱，电泳分离；在分子量10-100kD的区域用病人阳性血清在一个电泳胶柱进行免疫印迹，显色；

(4)切割下其余胶柱过敏原蛋白定位的相应条带，加入适量PBS溶液后，室温2000g离心10分钟；

(5)测出过敏原蛋白溶液的浓度，加入适量防腐剂，-20℃下冷冻贮存。

2.胶体金标记抗体的制备

2.1 胶体金制备

胶体金的制备多采用还原法。氯金酸(HauCl₄)是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：a.将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸；b.搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液；c.继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min；冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。

2.2 胶体金标记抗人IgE抗体

用胶体金标记蛋白质，就是指蛋白质吸附到胶体金颗粒表面。胶体金表面带有负电荷，能与蛋白质的正电荷静电吸引而形成牢固的结合。由于这种结合主要是物理作用，所以不会引起蛋白质活性的改变。标记前，需确定胶体金与待标记蛋白质的比例和将pH值调节到标记蛋白质IgG的等电点或略高(pH8.2)。标记时，将待标记抗人IgE抗体1mg加15ml胶体金溶液(1OD)，混合，室温搅拌15分钟，在磁性搅拌下加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，混合5分钟，离心，再通过离心法或凝胶层析法纯化标记的抗人IgE抗体。放在4℃达2年半仍然保持良好性能。

3.用过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条

3.1 材料

(1)活化处理过的硝酸纤维素膜(Millipore，MDI，S&S，whatman等国外公司的硝酸纤维素膜)，能与蛋白质分子中的氨基基团反应形成稳定的共价键。

(2)过敏原蛋白；

(3)0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)或活化增强剂；

(4)0.01mol/L PBS溶液；

(5)3％ BSA封闭液；

(6)纳米芯片喷点系统；

(7)金属箔袋及真空封口机等。

3.2 步骤

(1)过敏原蛋白的硝酸纤维素膜条制备

采用Millipore，MDI，S&S，whatman中等流速的硝酸纤维素滤膜。试剂垫、样本垫、吸收垫采用Millipore公司产品，与玻片相比，膜的优点是与蛋白亲和力强，检测技术成熟，通常无需另外修饰。硝酸纤维素膜、尼龙膜、PvDF膜等都是带有微孔的滤膜，其孔径一般在0.45μm左右，在显微镜下这种膜就是一个立体的纤维网络，可以结合更多的蛋白质探针，使检测更加灵敏。同时，这种多孔结构可使液体在其中进行自由扩散，当在膜的一端给以液体扩散压力时，液体将沿一定方向扩散，是层析的良好材料，是制作层析过敏原蛋白的非常理想的载体。

(2)点样

具体采用0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6或根据过敏原蛋白的特性选择的缓冲液适当稀释过敏原蛋白溶液成0.05μg/ml-10μg/ml的浓度。稀释后将过敏原蛋白(100μl)加到喷样储液瓶内，应用微量连续型点膜机(如BIO-DOT公司的产品)，将变应原溶液喷线于膜的相应的位点非接触式连续点样，即喷点，每次点样1μl，连续3次；喷点后的硝酸纤维素膜放置2—8℃下反应过夜。用3％BSA封闭液，37℃下保温2小时。层析膜条一般25—30mm长，可以喷线2—10条线或喷点2—30点，

(3)固化人IgE阳性的质控带

a.材料

人IgE抗体：来源于人血浆中经亲和色谱纯化，纯度>95％的人IgE抗体(购自美国Biodesign公司)。

b.步骤

用样品稀释液将人IgE抗体配制成浓度为50IU/ml，在过敏原蛋白硝酸纤维素膜条上端固化人IgE抗体即为阳性质控带。

4.将过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条放入多通道加样槽中

采用切割机将固化好的过敏原蛋白硝酸纤维素膜条切成所需的规格和形状，放入相应的多通道加样槽中，再加入干燥剂装入金属箔袋内密封，在2—8℃下贮存。

多通道过敏原快速检测试剂盒具有20块多通道过敏原快速检测试剂板，每块试剂板如图1所示，图中1为样品加样窗，2为过敏原蛋白固化的硝酸纤维膜条，3为加样槽微流通道，4为吸水垫出口窗。

5.配制缓冲液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％ Tween-20和20mg/L庆大霉素

6.分级比色卡制作

根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系，印制分级比色卡。

本发明的多通道过敏原快速检测试剂盒的使用方法

1.检测步骤

(1)将所有试剂平衡至室温(20—25℃)。

(2)测定时用加样吸管向检测板上标本孔内加入2～3滴血清(若使用定量加样器，每孔加100～150μl血清)，血清标本迁移至质控带指示线时加入缓冲液1滴。

(3)20—30分钟观察结果。

2.结果判断

a.目测：

(1)阳性结果：在检测板上质控线和相应的过敏原平行处的检测线出现红色反应带。

(2)阴性：仅质控线出现一条红色条带

(3)无效：质控线未出现红色条带

b.使用分级比色卡可半定量分级判断阳性结果：

呈阳性的指标应与分级比色卡级别应基本一致，其分级结果只允许在相邻两个级别间变化。

国际上过敏原特异性IgE浓度的分级方法：

实施例2 筛查型多通道过敏原快速检测试剂盒中共同固化过敏原蛋白的选择在分子水平上通过细胞结合IgE反应性的蛋白质的IgE结合抗原决定簇的识别来推测蛋白质的过敏反应性。美国过敏、哮喘和免疫学学会(the AmericanAcademy of Allergy，Asthma and Immunology(AAAAI))和美国过敏、哮喘和免疫学学院(the American college of Allergy，Asthma and Immunology(ACAAI))联合接受的文件：“食物过敏：实用参数(Food allergy：a practice parameter)”中认为，蛋白质促发过敏反应是因为蛋白质存在的功能氨基酸序列，包括线性序列上或构象上能与B细胞上特定的受体蛋白结合的结构，即抗原决定簇。如果两种蛋白质或多肽均含有的一个或几个主要过敏原蛋白的氨基酸序列的等同性达70％或两个蛋白质或多肽共享8个或8个以上连续相同的氨基酸序列，就可认为该两个蛋白质或多肽存在着相同过敏症状的抗原决定簇(Chapman JA etal，2006，Food allergy：a practice parameter，Ann Allergy Asthma Immunol，96：S1-S68)。依据这一原则，从互联网上的大型数据库：NCBI、PubMed、EBI或文献中检索比对同类型致敏材料的主要过敏原蛋白的氨基酸序列，将符合该原则的材料的过敏原蛋白等量混合，共同固化在硝酸纤维素膜条的同一位点表面。例如比较图2中大麦等五种谷物的主要过敏原蛋白(种子贮藏蛋白)的抗原决定簇区域的氨基酸序列的等同性约为40％，而玉米、大米、小米等三种谷物的等同性约为70％，于是就将这三种谷物的过敏原蛋白固化在硝酸纤维素膜条的同一位点表面。苹果等六种水果的主要过敏原蛋白(脂转移蛋白，LTP)的抗原决定簇区域的氨基酸序列的等同性达72％，且存在两个8个连续相同氨基酸序列的区域(图3)，也将它们的过敏原蛋白共同固化在硝酸纤维素膜条的同一位点表面。

普遍存在的吸入型过敏物质螨虫，世界上主要有三种类型：Dermatophagoides pteronyssinus、Dermatophagoides farinae和Euroglyphusmaynei。从它们所含的过敏原蛋白的蛋白组学分子研究可知，主要过敏原蛋白Der p1、Der f1、Eur m1及Der p2、Der f2、Eur m2的氨基酸序列有84-86％的等同性(见图4，图5)，将三种螨虫过敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纤维素膜条的同一位点表面，筛选螨虫致敏。

吸入型过敏物质花粉中也有很多符合该原理的例子，如藜科植物花粉的过敏原蛋白的Chea2与梯牧草花粉过敏原蛋白ph1p11，橄榄及桦树花粉过敏原蛋白的Olee2 Betv2的氨基酸序列的等同性也达70％以上(图6)。将Chea2与梯牧草花粉过敏原蛋白ph1p11；橄榄及桦树花粉过敏原蛋白的Olee2 Bet v2过敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纤维素膜条的同一位点表面。

实施例3 用多通道过敏原快速检测试剂试验

对73例过敏患者(2—18岁的30人，18—70岁的43人)，抽取血液制备血清定性筛查(牛奶；蛋白/蛋黄；淡水鱼；虾/蟹；海水鱼；蟑螂；尘螨/粉螨；猫/狗皮屑；霉菌类；春季花粉；秋季花粉；坚果类)过敏原。

按上述多通道过敏原快速检测试剂盒的使用方法测出患者血清在不同过敏原特异性IgE浓度，根据分级比色卡判断为阳性结果。检测结果如下表：

 

过敏原	牛奶	蛋白蛋黄	虾蟹	海水鱼	淡水鱼	坚果类	蟑螂	尘螨粉螨	猫狗皮屑	霉菌类	春季花粉	秋季花粉
													阳性检出人数	6	7	9	5	3	5	12	38	2	3	5	10
阳性检出率(％)	8.2	9.5	10.8	12.3	4.0	6.8	12.5	16.4	2.7	4.1	6.8	13.6

检测结果表明，采用本发明的试剂盒能够简便、快速、准确地检测出致敏过敏原，灵敏度达92.0％，特异性达85.0％，准确性86％。

Claims (3)

1、多通道过敏原快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括：已固化的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉菌类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条，胶体金标记的抗体，缓冲液，分级比色卡；

其中：

已固化的奶类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：牛奶、羊奶；

已固化被的蛋类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：家禽蛋白、家禽蛋黄；

已固化的肉类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；

已固化的谷物类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；

已固化的坚果类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；

已固化的水果类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；

已固化的蔬菜类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；

已固化的水产类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；

已固化的豆类食物过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；

已固化的吸入型螨虫类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：尘螨、粉螨、屋尘；

已固化的吸入型动物皮屑类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：猫、狗、马、牛、羊；

已固化的吸入型鸟羽绒类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：鸡、鸭、鹅、鸽；

已固化的吸入型花粉类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：桦树、枫树、桤树、构树、棕榈、葵树、榛树、柏树、松树、杉木、栗树、栎树、梧桐、杨树、柳树、桑树、榆树、艾蒿、豚草、藜草、车前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、芦苇、葎草、苍耳、香蒲、莎车、芨芨草、向日葵；

已固化的吸入型蟑螂类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条片包括：德国小蠊、美洲大蠊；

已固化的吸入型霉菌类过敏原蛋白的硝酸纤维膜条包括：点青霉菌、多主枝孢霉菌、烟曲霉菌、交链孢霉菌、黑根霉菌、酿酒酵母菌、小麦黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；

胶体金标记的抗体：胶体金标记的抗人IgE抗体；

缓冲液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

比色卡：根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系，制作的分级比色卡。

2.根据权利要求1所述的多通道过敏原快速检测试剂盒，其特征在于过敏原蛋白的硝酸纤维膜条置于多通道加样槽中。

3.根据权利要求1所述的多通道过敏原快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)过敏原蛋白的制备：将含过敏原蛋白的材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；

2)胶体金标记抗体的制备：用胶体金标记的抗人IgE抗体；

3)用过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条，并封闭；

4)将过敏原蛋白均一固化硝酸纤维膜条放入多通道加样槽中；

5)配制缓冲液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

6)根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系，制作分级比色卡。

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