CN101696973A

CN101696973A - 一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101696973A
Application number: CN200910110298A
Authority: CN
Inventors: 雷均平; 黄志坚; 邱于斌; 何素华; 薛晓英; 赵振军; 和水祥
Original assignee: Shenzhen Biocup Tech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Biocup Tech Co ltd
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2010-04-21

Abstract

本发明涉及免疫分析检测试剂盒，提供了一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒包括：与过敏原蛋白耦联的磁性微珠、与抗人IgE抗体耦联的磁性微珠、人IgE抗体标准品、碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体和碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD。其制备方法包括将过敏原蛋白耦联至磁性微珠上、将抗人IgE抗体耦联至磁性微珠上、制备人IgE抗体标准品、制备碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体、制备碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD及组合包装。本检测试剂盒具有灵敏度高、准确性高且反应快速、使用方便、用量低和成本低的优点，能帮助精确定量测定致敏过敏原，指导临床过敏反应治疗。

Description

一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析检测试剂盒，尤其涉及一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

过敏反应检测是进行过敏反应治疗的重要的先决条件，可通过检测患者血清中的特异性IgE抗体以确定究竟是何种过敏原对患者致敏以及致敏程度。

多年来，检测血清中特异性IgE抗体普遍采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法。相应的ELISA检测试剂盒包括已包被过敏原蛋白的酶标板、人IgE标准品、酶标记抗体和底物显色液。特异性IgE抗体在血清中的含量非常低，ELISA检测试剂盒难以提供足够高的灵敏度，尤其是对少量或微量特异性IgE抗体的检测结果准确性不高，且所耗费的时间较长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种灵敏度高、准确性高且反应快速、使用方便的过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：与过敏原蛋白耦联的磁性微珠、与抗人IgE抗体耦联的磁性微珠、人IgE抗体标准品、碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体和碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD。

该检测试剂盒以磁性微珠为固相载体，相比以酶标板为固相载体可增加吸附和反应的比表面积，官能团密度及选择性吸附能力增大，利于抗原和抗体之间充分且快速的结合，极大提高了检测的灵敏度和准确性且缩短了达到吸附平衡状态所需要的时间。另外，磁性微珠可稳定地悬浮在溶液中，提高免疫反应之间的结合效率。通过外加磁场磁性从反应溶液中磁性分离耦联有抗原抗体复合物的磁性微珠，提高了分离效率、速度以及分析方法的灵敏度。优选地，磁性微珠为超顺磁性微珠。其内部为12nm～15nm的超顺磁性四氧化三铁。该超顺磁性微珠在附加磁场时能具有较强的磁性以利于磁性分离，在去掉外磁场时磁性很快消失，因此能够在磁场中不被永久磁化，从而避免因聚集而产生的非特异性误差。

该检测试剂盒，进一步可包括不透光微孔板。不透光微孔板板体呈矩形，由不透光材料制成，一面设置有若干微孔，各微孔间设有隔层。板体底面可为平整板面或不平整板面，不平整板面涉及由若干圆弧底面构成、由若干锥形底面构成以及其他不规则底面构成。其中，微孔用于容纳磁性微珠并为整个使用过程提供反应空间，隔层用于防止各微孔内的化学发光信号影响到周围微孔内化学发光信号的检测，进而提高准确性。板状结构不仅适用于人工半自动检测，还适用于全自动仪器分析。该不透光微孔板不同于酶联免疫吸附分析(ELISA)中的酶标板，酶标板自身具有对蛋白的吸附能力，而在本发明中，不透光微孔板仅作为一种反应容器，没有且不能具有吸附蛋白的能力，否则会影响磁性微珠与反应物之间的结合。不透光材料可为塑料、陶瓷和木材等，颜色不限。优选地，该不透光微孔板为黑色塑料不透光微孔板。

该检测试剂盒，进一步可包括板式磁性分离器。板式磁性分离器板体呈矩形板状，具有磁性，可为磁性微珠提供外加磁场。两侧边各向板体的一面弯折成侧壁，侧壁内侧外端垂直延伸出挡板，且侧壁在一侧顶端沿板体边缘延伸出固定块。侧壁、挡板和固定块均无磁性。不透光微孔板的形状和大小与板式磁性分离器相匹配，可从一侧滑动地插入其中并固定地容置在其中，并由侧壁、挡板和固定块进行固定，以利于方便地从反应溶液中磁性分离出磁性微珠。

过敏原蛋白和磁性微珠以100μg～300μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联。过敏原蛋白在该浓度比例下相对磁性微珠是过量的，从而能保证单位重量的磁性微珠完全被包被。优选地，过敏原蛋白和磁性微珠以200μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联。

过敏原蛋白可与血清中的特异性IgE抗体相结合。耦联在磁性微珠上的过敏原蛋白为吸入性过敏原蛋白或食入性过敏原蛋白，来源于以下材料：螨类、蟑螂类、动物羽毛类、动物毛皮类、霉菌类、花粉类、杂草类、植物纤维类、蚕丝、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类、香料类和蚕蛹。此外，过敏原蛋白还可来源于蜂类、蝶类和蛾类等。

优选地，吸入性过敏原蛋白包括：屋尘螨过敏原蛋白、粉尘螨过敏原蛋白、腐食酪螨过敏原蛋白、美洲大蠊过敏原蛋白、德国小蠊过敏原蛋白、东方蜚蠊过敏原蛋白、褐斑蟑螂过敏原蛋白、鸡羽毛过敏原蛋白、鸭羽毛过敏原蛋白、鹅羽毛过敏原蛋白、鸽羽毛过敏原蛋白、猫毛皮过敏原蛋白、狗毛皮过敏原蛋白、马毛皮过敏原蛋白、牛毛皮过敏原蛋白、羊毛皮过敏原蛋白、猪毛皮过敏原蛋白、鼠毛皮过敏原蛋白、交链孢菌属过敏原蛋白、葡萄孢菌过敏原蛋白、多主枝孢属过敏原蛋白、新月弯孢属过敏原蛋白、串珠镰孢属过敏原蛋白、蠕孢菌过敏原蛋白、烟曲霉过敏原蛋白、蜂毛霉属过敏原蛋白、特异青霉过敏原蛋白、芽霉菌属过敏原蛋白、根霉菌属过敏原蛋白、豚草花粉过敏原蛋白、杨树花粉过敏原蛋白、柳树花粉过敏原蛋白、松树花粉过敏原蛋白、桃树花粉过敏原蛋白、茶树花粉过敏原蛋白、桦树花粉过敏原蛋白、柏树花粉过敏原蛋白、杉树花粉过敏原蛋白、艾蒿花粉过敏原蛋白、葎草花粉过敏原蛋白、紫菀过敏原蛋白、菊过敏原蛋白、大丽花过敏原蛋白、康乃馨过敏原蛋白、牡丹过敏原蛋白、玫瑰过敏原蛋白、勿忘我过敏原蛋白、天鹅草过敏原蛋白、鸭茅过敏原蛋白、黑麦草过敏原蛋白、梯牧草过敏原蛋白、龙须草过敏原蛋白、牛尾草过敏原蛋白、棉花纤维过敏原蛋白、亚麻布纤维过敏原蛋白、爪哇棉纤维过敏原蛋白和桑蚕丝过敏原蛋白中的一种或几种。

优选地，食入性过敏原蛋白包括牛奶过敏原蛋白、羊奶过敏原蛋白、鸡蛋过敏原蛋白、鸭蛋过敏原蛋白、鹅蛋过敏原蛋白、鸡肉过敏原蛋白、鸭肉过敏原蛋白、猪肉过敏原蛋白、羊肉过敏原蛋白、牛肉过敏原蛋白、火鸡肉过敏原蛋白、鹅肉过敏原蛋白、驴肉过敏原蛋白、玉米过敏原蛋白、荞麦过敏原蛋白、大麦过敏原蛋白、燕麦过敏原蛋白、黑麦过敏原蛋白、小麦过敏原蛋白、大米过敏原蛋白、小米过敏原蛋白、杏仁过敏原蛋白、花生过敏原蛋白、芝麻过敏原蛋白、腰果过敏原蛋白、核桃过敏原蛋白、板栗过敏原蛋白、苹果过敏原蛋白、香蕉过敏原蛋白、柠檬过敏原蛋白、芒果过敏原蛋白、荔枝过敏原蛋白、菠萝过敏原蛋白、橙子过敏原蛋白、葡萄过敏原蛋白、梨过敏原蛋白、西瓜过敏原蛋白、桃过敏原蛋白、柚子过敏原蛋白、芹菜过敏原蛋白、菠菜过敏原蛋白、洋葱过敏原蛋白、大蒜过敏原蛋白、卷心菜过敏原蛋白、茄子过敏原蛋白、西兰花过敏原蛋白、马铃薯过敏原蛋白、蘑菇过敏原蛋白、鲫鱼过敏原蛋白、鳙鱼过敏原蛋白、草鱼过敏原蛋白、青鱼过敏原蛋白、鲢鱼过敏原蛋白、基围虾过敏原蛋白、大闸蟹过敏原蛋白、龙虾过敏原蛋白、带鱼过敏原蛋白、黄鱼过敏原蛋白、花蛤过敏原蛋白、田螺过敏原蛋白、比目鱼过敏原蛋白、三文鱼过敏原蛋白、鳗鱼过敏原蛋白、鱿鱼过敏原蛋白、黄豆过敏原蛋白、豌豆过敏原蛋白、蚕豆过敏原蛋白、扁豆过敏原蛋白、眉豆过敏原蛋白、绿豆过敏原蛋白、红豆过敏原蛋白、辣椒过敏原蛋白、胡椒过敏原蛋白、八角过敏原蛋白和蚕蛹过敏原蛋白中的一种或几种。

抗人IgE抗体和磁性微珠以10～40μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。抗人IgE抗体在该浓度比例下相对磁性微珠是过量的，从而能保证单位重量的磁性微珠完全被包被。优选地，抗人IgE抗体和磁性微珠以20μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。耦联在磁性微珠上的抗人IgE抗体可为鼠抗人IgE抗体、兔抗人IgE抗体或羊抗人IgE抗体。

人IgE抗体标准品来源于人血清，经亲和色谱纯化处理，可与抗人IgE抗体结合。

本发明提供的碱性磷酸酶(ALP)和碱性磷酸酶化学发光底物(AMPPD)组成的化学发光免疫分析(CIA)系统，提高了检测信号的灵敏度和稳定性，同时减小背景干扰，从而克服传统酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测灵敏度相对较低的缺陷。其中，碱性磷酸酶化学发光底物(AMPPD)为3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷。

该检测试剂盒，进一步还可包括样品稀释液和样品洗涤液。优选地，样品稀释液为含有1％BSA和0.01％Proclin 300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。优选地，样品洗涤液为含有1％BSA和0.05％Tween 20的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

本发明提供的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

设置实验组，取与过敏原蛋白耦联的磁性微珠置于不透光微孔板的微孔中，加入待测人血清样品，室温孵育以使过敏原蛋白与待测人血清样品中的过敏原特异性IgE抗体充分结合，磁性洗涤分离过量的过敏原蛋白；

同时设置对照组，取与抗人IgE抗体耦联的磁性微珠置于不透光微孔板空白的微孔中，在不同微孔中分别加入经系列梯度稀释的人IgE抗体标准品，室温孵育以使抗人IgE抗体与人IgE抗体标准品中的IgE抗体充分结合，之后进行磁性洗涤分离；

分别在实验组和对照组中加入碱性磷酸酶(ALP)标记的抗人IgE抗体，待碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体分别与实验组和对照组中的IgE结合后，磁性分离洗涤，在微孔板中加入碱性磷酸酶化学发光底物(AMPPD)，室温反应，使用化学发光检测仪读取光信号强度；

依据梯度稀释后的各个浓度的人IgE抗体标准品的光信号强度，以化学发光强度为纵坐标，人IgE抗体浓度为横坐标，绘制标准曲线，进而对比定量分析待测人血清样品中的过敏原特异性IgE抗体浓度。

本发明的第二方面提供了一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：将过敏原蛋白耦联至磁性微珠上、将抗人IgE抗体耦联至磁性微珠上、制备人IgE抗体标准品、制备碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体、制备碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD，以及组合包装。

优选地，磁性微珠为超顺磁性微珠。其内部为12nm～15nm的超顺磁性四氧化三铁。

将过敏原蛋白耦联至磁性微珠上包括：制备过敏原蛋白提取液、活化磁性微珠、将活化的磁性微珠与过敏原蛋白提取液混合反应。将过敏原蛋白和磁性微珠以100μg～300μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联。优选地，过敏原蛋白和磁性微珠以200μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联。

将抗人IgE抗体耦联至磁性微珠上包括：制备抗人IgE抗体、活化磁性微珠、和将活化的磁性微珠与抗人IgE抗体混合反应。将抗人IgE抗体和磁性微珠以10～40μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。优选地，抗人IgE抗体和磁性微珠以20μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。耦联在磁性微珠上的抗人IgE抗体可为鼠抗人IgE抗体、兔抗人IgE抗体或羊抗人IgE抗体。

此外，该检测试剂盒的制备方法还可包括以下步骤中的一步或几步：

不透光微孔板的制备；

板式磁性分离器的制备；以及

样品稀释液和样品洗涤液的制备。

本发明的有益效果在于，提供了由磁性微珠化学发光免疫分析系统组成的过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法，其灵敏度高、准确性高且反应快速、使用方便，具有用量低，成本低的优点。本发明用于对人血清样品中的过敏原特异性IgE抗体水平进行精确定量检测分析，能帮助确定致敏过敏原，预测未来发生过敏反应的危险并指导临床过敏反应治疗。

附图说明

图1为不透光微孔板一个实施例的剖面图；

图2为不透光微孔板另一个实施例的剖面图

图3为板式磁性分离器的立体结构图；以及

图4为人IgE浓度标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方法对本发明做进一步阐述，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

实施例1：粉尘螨过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

粉尘螨过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与粉尘螨过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以100μg粉尘螨过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(2)与鼠抗人IgE抗体耦联的超顺磁性微珠，两者以10μg羊抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(3)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(4)碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体；以及(5)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)。

其中，超顺磁性微珠内部为12nm的超顺磁性四氧化三铁。

实施例2：芒果过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

芒果过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与芒果过敏原蛋白耦联的磁性微珠，两者以300μg芒果过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联混合；(2)与兔抗人IgE抗体耦联的磁性微珠，两者以40μg兔抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联混合；(3)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(4)碱性磷酸酶标记的羊抗人IgE抗体；(5)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)；以及(6)黑色塑料不透光微孔板。

如图1所示，黑色塑料不透光微孔板板体1呈矩形，由黑色不透光塑料制成，一面设置有若干微孔，板体1底部为平整的板面，微孔21与微孔22之间设有隔层3。隔层3用于防止微孔21内的化学发光信号影响到周围微孔22内化学发光信号的检测。微孔用于容纳磁性微珠并为整个使用过程提供反应空间。

实施例3：蜜蜂过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

蜜蜂过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与蜜蜂过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg蜜蜂过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(2)与羊抗人IgE抗体耦联的超顺磁性微珠，两者以30μg兔抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(3)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(4)碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体；(5)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)；(6)陶瓷不透光微孔板；以及(7)板式磁性分离器。

其中，超顺磁性微珠内部为15nm的超顺磁性四氧化三铁。

如图2所示，陶瓷不透光微孔板板体11呈矩形，一面设置有若干微孔，另一面由若干微孔的孔底圆弧面构成，微孔23与微孔24之间设有隔层31。隔层31用于防止微孔23内的化学发光信号影响到周围微孔24内化学发光信号的检测。微孔用于容纳磁性微珠并为整个使用过程提供反应空间。

如图3所示，板式磁性分离器板体4呈矩形片状，具有磁性，可为磁性微珠提供外加磁场。两侧边各向板体的一面弯折成侧壁5，侧壁5内侧外端垂直延伸出挡板6，且侧壁在一侧顶端沿板体边缘延伸出固定块7。侧壁5、挡板6和固定块7均无磁性，仅起固定作用。不透光微孔板的形状和大小与板式磁性分离器相匹配，可从一侧滑动地插入其中并固定地容置在其中，并由侧壁5、挡板6和固定块7进行固定，以利于从反应溶液中磁性分离出磁性微珠。

实施例4：金针菇过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

金针菇过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与金针菇过敏原蛋白耦联的磁性微珠，两者以200μg金针菇过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联混合；(2)与兔抗人IgE抗体耦联的磁性微珠，两者以20μg兔抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联混合；(3)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(4)碱性磷酸酶标记的羊抗人IgE抗体；(5)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)；(6)木质不透光微孔板；(7)板式磁性分离器；(8)稀释液，含有1％BSA和0.01％Proclin 300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4；以及(9)样品洗涤液，含有1％BSA和0.05％Tween 20的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

木质不透光微孔板结构同黑色塑料不透光微孔板。板式磁性分离器如前所述。

实施例5：吸入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

吸入性过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与屋尘螨过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg屋尘螨过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(2)与美洲大蠊过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg美洲大蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(3)与鸡羽毛过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg鸡羽毛过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(4)与猫毛皮过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg猫毛皮过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(5)与交链孢菌属过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg交链孢菌属过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(6)与豚草花粉过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg豚草花粉过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(7)与大丽花过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg大丽花过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(8)与梯牧草过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg梯牧草过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(9)与桦木过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg桦木过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(10)与棉花纤维过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg棉花纤维过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(11)与桑蚕丝过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg桑蚕丝过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(12)与羊抗人IgE抗体耦联的超顺磁性微珠，两者以20μg羊抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(13)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(14)碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体；以及(15)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)。

实施例6：食入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒

食入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，包括：(1)与牛奶过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg牛奶过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(2)与鸡蛋过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg鸡蛋过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(3)与鸡肉过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg鸡肉过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(4)与小麦过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg小麦过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(5)与杏仁过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg杏仁过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(6)与荔枝过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg荔枝过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(7)与芹菜过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg芹菜过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(8)与基围虾过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg基围虾过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(9)与黄豆过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg黄豆过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(10)与胡椒过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg胡椒过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(11)与蚕蛹过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，两者以200μg蚕蛹过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(12)与羊抗人IgE抗体耦联的超顺磁性微珠，两者以20μg羊抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠的比例耦联混合；(13)人IgE抗体标准品，来源于人血清，经亲和色谱纯化后浓度为100IU/mL(参照世界卫生组织公布的人IgE国际参考标准)；(14)碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体；(15)碱性磷酸酶化学发光底物3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-邻氧酰苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)；以及(16)黑色不透光微孔板；以及(17)板式磁性分离器。

黑色不透光微孔板和板式磁性分离器如前所述。

实施例7：一种粉尘螨过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的使用方法

一种粉尘螨过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)制备样品稀释液，含有1％BSA和0.01％Proclin 300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。制备样品洗涤液，含有1％BSA和0.05％Tween 20的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

(2)设置实验组，取与30μL粉尘螨过敏原蛋白耦联的磁性微珠置于不透光微孔板的12个微孔中。取10μL待测人血清样品加入2个微孔中设为复孔，室温孵育30分钟以使待测人血清样品中的粉尘螨过敏原特异性IgE抗体与粉尘螨过敏原蛋白充分结合。磁性分离洗涤去除过量的人血清样品。

棋盘法选择磁性微珠的用量。分别加磁性微珠0μL、5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL和100μL，当磁性微珠的量超过30μL时，并不能使发光信号增加，相反由于磁性微珠对光的遮蔽作用使发光信号减弱，因此选取30μL为磁性微珠的用量。

测定不同体积的待测人血清样品时发光强度。在取样量为10μL时，发光信号与血清中IgE抗体浓度有较好的线性关系。待测人血清样品量过少会造成取样困难，相对误差增大，并且在低浓度时可能检测不到信号，影响到实验的最低检测限。待测人血清样品量的增加伴随着反应试剂消耗量的增加，也可能使发光信号过强而达到饱和状态或超出仪器检测范围，并且还可能使非特异性吸附的量增加，增大反应的误差。因此选取10μL为待测人血清样品的用量。

测定分别在粉尘螨过敏原磁性微珠与待测人血清样品反应10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟后检测发光强度，检测结果显示30分钟后结合反应趋于完成，发光信号趋于稳定，因此选择30分钟为粉尘螨过敏原磁性微珠与待测人血清样品反应的时间。

(3)设置对照组，取30μL与羊抗人IgE抗体耦联的磁性微珠置于不透光微孔板的空白微孔中，取浓度为100IU/mL的人IgE标准液加入样品稀释液，分别按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243、1∶729和1∶2187梯度稀释，依次取10μL未稀释的标准液以及上述系列稀释后的标准液稀释液分别加入不同的微孔中，室温孵育30分钟以使人IgE与羊抗人IgE抗体充分结合。磁性分离洗涤。

(4)分别在实验组和对照组中加入20μL碱性磷酸酶(ALP)标记的兔抗人IgE抗体，室温反应20分钟，待碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体分别与实验组和对照组中的IgE结合后，磁性分离洗涤，在微孔板中加入20μL碱性磷酸酶化学发光底物(AMPPD)，室温反应30分钟，使用化学发光检测仪读取光信号强度。

棋盘法测定抗人IgE抗体的加入量。分别加入0μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体，当碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体体积增加到20μL后，再增加碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体，发光强度不再显著增加，因此选择20μL作为碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体的加入量。

测定碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体与过敏原特异性IgE抗体分别反应10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟后，结果显示反应20分钟后信号较为稳定，在60分钟后随着时间的延长，非特异性吸附随着增加，信号也有一定的增加，因此选择20分钟为碱性磷酸酶标记的兔抗人IgE抗体的反应时间。

测定加入AMPPD的量在1～20μL范围内，发光强度与AMPPD加入量近似于直线关系，加入量大于20μL时发光强度趋于平缓。因此，本发明中采用AMPPD的量为20μL。

在确定的AMPPD浓度下，由发光底物反应时间-发光强度的曲线读出随着反应时间的延长，发光信号增大，约经过30分钟达到平衡，产生较为稳定的检测信号，因此确定发光底物AMPPD加入反应体系的最佳反应时间为30分钟。

(5)依据梯度稀释后的各个浓度的人IgE抗体标准品的光信号强度，以化学发光强度为纵坐标，人IgE抗体浓度为横坐标，绘制标准曲线，进而对比定量分析待测人血清样品中过敏原特异性IgE抗体的浓度。

试验数据如图4显示，人IgE抗体在0.05IU/mL～100IU/mL范围呈良好的线性关系，其回归方程为y＝6395.8x+22602(n＝8)，相关系数为0.9786。由此，对比定量分析，计算得出待测人血清样品中粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度为5IU/mL。对比国际分级标准进行分级，该数据显示该血清提供者对粉尘螨过敏原呈高度敏感，需要在医生的指导下进行临床治疗。本检测的检出限为0.046IU/mL，比传统ELISA法降低了一个数量级以上。

另由酶联免疫吸附分析法(ELISA)对该份待测人血清中粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度进行检测，与上述磁性微珠化学发光免疫分析法的检测结果进行对比分析，显示两种方法间相关性为0.89。

实施例8：德国小蠊过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法

德国小蠊过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备德国小蠊过敏原蛋白提取液

德国小蠊经冷冻灭活后，使用高速万能粉碎机粉碎，称取一定重量的原材料，按1∶5(W/V)比例加入过敏原蛋白提取液(250mmol/L蔗糖、137mmol/LNaCl、5mmol/L EDTA、2.7mmol/L KCl、1mmol/L DTT、10mmol/L Na₂HP0₄、1.8mmol/LKH₂PO₄、0.02％硫柳汞，pH 7.4)，将其放置于4℃环境下提取24小时。以12000rpm/min高速冷冻离心20分钟，收集上清液。取5μL上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上。使用德国小蠊过敏病人阳性血清进行免疫印迹反应，确认上清液中含有该过敏原的过敏原蛋白组份。将上清液装在透析袋(截留分子量1万)中对10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)透析48小时，期间使用自动磁力搅拌器缓慢搅动液体，每隔12小时更换液体一次。经孔径0.22μm滤膜过滤后，冷冻干燥，测定蛋白浓度并稀释为50ug/mL，保存于-80℃冰箱。

(2)活化超顺磁性微珠

超顺磁性微珠表面连接有醛基基团。经磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤后，加入20倍体积含有5％戊二醛的磷酸盐缓冲液，室温避光振荡反应16小时后，进行磁性分离，多次清洗后获得活化的超顺磁性微珠。

经试验表明，将不同粒径(0.2μm、1μm、2μm、5μm)的超顺磁性微珠在相同的条件下制备成与德国小蠊过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠，用棋盘滴定法确定5μm粒径的磁性微珠反应发光值最高且本地发光值最低，适宜作为过敏原蛋白耦联的固相载体。0.2μm和1μm粒径的磁性微珠在手工半自动化操作过程中容易出现漂浮现象，不利于反应的重复性和准确性。2μm和5μm粒径的磁性微珠反应较好，既可全自动操作也可以手工操作，重复性达到质量控制要求。

(3)将德国小蠊过敏原蛋白耦联至超顺磁性微珠上

超顺磁性微珠与德国小蠊过敏原蛋白质提取液以200μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例混合，4℃搅拌24小时，磁性分离器分离超顺磁性微珠，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤三次，加入过量的5％牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐溶液室温反应2小时，以封闭未结合德国小蠊过敏原蛋白的游离醛基，即得到德国小蠊过敏原蛋白包被的免疫活性超顺磁性微珠。

经试验表明，分别加入与不同浓度的德国小蠊过敏原蛋白耦联的超顺磁性微珠(50μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠、100μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠、200μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠和300μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠)，用棋盘滴定法确定反应发光值。当每mg超顺磁性微珠包被的德国小蠊过敏原蛋白达到100μg时，发光信号清楚可测，在100μg～200μg时，发光强度持续增强并在最强处进入平稳状态，在超过300μg时，发光信号不再加强，因此，取德国小蠊过敏原蛋白与超顺磁性微珠耦联的比例为200μg德国小蠊过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠。德国小蠊过敏原蛋白在该浓度比例下相对超顺磁性微珠是过量的，从而能保证单位重量的超顺磁性微珠完全被包被。

(4)将鼠抗人IgE抗体耦联至超顺磁性微珠上

超顺磁性微珠与鼠抗人IgE抗体以20μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠的比例混合，4℃搅拌24小时，磁性分离器分离超顺磁性微珠，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤三次，加入过量的5％牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐溶液室温反应2小时，以封闭未结合鼠抗人IgE抗体的游离醛基，即得到鼠抗人IgE抗体包被的免疫活性超顺磁性微珠。

经试验表明，分别加入与不同浓度的鼠抗人IgE抗体耦联的超顺磁性微珠(10μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠、20μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠、30μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠和40μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠)，用棋盘滴定法确定反应发光值。当每mg超顺磁性微珠包被的鼠抗人IgE抗体达到10μg时，发光信号清楚可测，在10μg～20μg时，发光强度持续增强并在最强处进入平稳状态，在超过30μg时，发光信号不再加强，因此，取鼠抗人IgE抗体与超顺磁性微珠耦联的比例为20μg鼠抗人IgE抗体/mg超顺磁性微珠。鼠抗人IgE抗体在该浓度比例下相对超顺磁性微珠是过量的，从而能保证单位重量的超顺磁性微珠完全被包被。

(5)制备人IgE抗体标准品

人IgE抗体标准品来源于人血清，经亲和色谱纯化。

(6)制备碱性磷酸酶标记的羊抗人IgE抗体

将400μL羊抗人IgE抗体(500μg/mL)与400μL碱性磷酸酶(500μg/mL)溶液充分混匀后加入到透析袋中，在0.1mol/L的PB缓冲液(pH 6.8)中透析24小时，每隔8小时换透析液一次，再加入1％的戊二醛50μL，室温反应24小时。向混合液中加入1mol/L的甘氨酸100μL以封闭游离醛基，室温反应2小时，在0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)中透析24小时，期间换液4次。最后，以12000rpm/min高速冷冻离心30分钟后，收集上清，加等体积甘油4℃保存。

(7)制备碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD

将20μL化学发光底物AMPPD溶解在50mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中。

(8)组合包装。

实施例9：艾蒿花粉过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法

艾蒿花粉过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备艾蒿花粉过敏原蛋白提取液

艾蒿花粉经高压破碎机破壁之后，称取一定重量，按1∶10(W/V)比例加入过敏原提取液(250mmol/L蔗糖、137mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、2.7mmol/L KCl、1mmol/L DTT、10mmol/L Na₂HP0₄、1.8mmol/L KH₂PO₄、0.02％硫柳汞，pH 7.4)，将其放置于4℃环境下提取48小时。以12000rpm/min高速冷冻离心20分钟，收集上清液。取5μL上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上。使用艾蒿花粉过敏病人阳性血清进行免疫印迹反应，确认上清液中含有艾蒿花粉过敏原的过敏蛋白组份。将上清液装在透析袋(截留分子量1万)中对10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)透析48小时，期间使用自动磁力搅拌器缓慢搅动液体，每隔12小时更换液体一次。经孔径0.22μm滤膜过滤后，测定艾蒿花粉过敏原蛋白浓度并稀释为50ug/mL，保存于-80℃冰箱。

(2)活化超顺磁性微珠

(3)将艾蒿花粉过敏原蛋白耦联至超顺磁性微珠上

超顺磁性微珠与艾蒿花粉过敏原蛋白质提取液以200μg艾蒿花粉过敏原蛋白/mg超顺磁性微珠的比例混合，4℃搅拌24小时，磁性分离器分离超顺磁性微珠，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤三次，加入过量的5％牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐溶液室温反应2小时，以封闭未结合艾蒿花粉过敏原蛋白的游离醛基，即得到艾蒿花粉过敏原蛋白包被的免疫活性超顺磁性微珠。

(4)将鼠抗人IgE抗体耦联至超顺磁性微珠上、(5)制备人IgE抗体标准品、(6)制备碱性磷酸酶标记的羊抗人IgE抗体和(7)制备碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD均同实施例8中所述。

(8)黑色塑料不透光微孔板的制备

使用黑色不透光塑料一次性注塑形成微孔板。如图1所示，黑色塑料不透光微孔板板体1呈矩形，一面设置有若干微孔，另一面为平整的板面，微孔21与微孔22之间设有隔层3。

(9)板式磁性分离器的制备

取呈矩形片状的具有磁性的板体4，在其两侧边各向板体的一面弯折设置侧壁5，侧壁内侧外端垂直延伸出挡板6，且侧壁在一侧顶端沿板体边缘延伸出固定块7。侧壁5、挡板6和固定块7均无磁性，仅起固定作用。设置不透光微孔板的形状和大小与板式磁性分离器相匹配，可从一侧滑动地插入其中并固定地容置在其中，并由侧壁5、挡板6和固定块7进行固定。

(10)样品稀释液和样品洗涤液的制备

配制1％BSA和含0.01％Proclin 300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，混合得样品稀释液，调节为pH 7.4。配制1％BSA和0.05％Tween 20的10mmol/L磷酸盐缓冲液，混合得样品洗涤液，调节为pH 7.4。

(11)组合包装。

实施例10：吸入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法

吸入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别制备吸入组过敏原蛋白提取液

吸入性过敏原蛋白提取液包括：腐食酪螨过敏原蛋白提取液、东方蜚蠊过敏原蛋白提取液、鸭羽毛过敏原蛋白提取液、狗毛皮过敏原蛋白提取液、特异青霉过敏原蛋白提取液、葎草花粉过敏原蛋白提取液、勿忘我过敏原蛋白提取液、天鹅草过敏原蛋白提取液、榆科过敏原蛋白提取液、亚麻布纤维过敏原蛋白提取液和桑蚕丝过敏原蛋白提取液。

(2)活化超顺磁性微珠

(3)分别将吸入性过敏原蛋白耦联至不同的超顺磁性微珠上

(8)样品稀释液和样品洗涤液的制备

(9)组合包装。

实施例11：食入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法

食入组过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别制备食入组过敏原蛋白提取液

食入组过敏原蛋白提取液包括：羊奶过敏原蛋白提取液、鸭蛋过敏原蛋白提取液、猪肉过敏原蛋白提取液、燕麦过敏原蛋白提取液、核桃过敏原蛋白提取液、菠萝过敏原蛋白提取液、大蒜过敏原蛋白提取液、鲢鱼过敏原蛋白提取液、蚕豆过敏原蛋白提取液、辣椒过敏原蛋白提取液和蚕蛹过敏原蛋白提取液。

(2)活化超顺磁性微珠

(3)分别将食入性过敏原蛋白耦联至不同的超顺磁性微珠上

(8)陶瓷不透光微孔板的制备

烧制陶瓷一次性形成不透光微孔板。如图2所示，陶瓷不透光微孔板板体11呈矩形，一面设置有若干微孔，另一面由若干微孔的孔底圆弧面构成，微孔23与微孔24之间设有隔层31。

(9)板式分离器的制备

同实施例9中所述。

(10)样品稀释液和样品洗涤液的制备

(11)组合包装。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒，其特征在于，包括：与过敏原蛋白耦联的磁性微珠、与抗人IgE抗体耦联的磁性微珠、人IgE抗体标准品、碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体和碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述磁性微珠为超顺磁性微珠。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，进一步包括不透光微孔板。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，进一步包括板式磁性分离器。

5.如权利要求1～4中任一权利要求所述的检测试剂盒，其特征在于，所述过敏原蛋白和所述磁性微珠以100μg～300μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联，所述抗人IgE抗体和所述磁性微珠以20μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述过敏原蛋白来源于以下材料：螨类、蟑螂类、动物羽毛类、动物毛皮类、霉菌类、花粉类、杂草类、植物纤维类、蚕丝、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类、香料类和蚕蛹。

7.一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将过敏原蛋白耦联至磁性微珠上；

将抗人IgE抗体耦联至磁性微珠上；

制备人IgE抗体标准品；

制备碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体；

制备碱性磷酸酶化学发光底物AMPPD；以及

组合包装。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述磁性微珠为超顺磁性微珠。

9.如权利要求7所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，进一步包括制备不透光微孔板和板式磁性分离器。

10.如权利要求7～9中任一权利要求所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述过敏原蛋白和所述磁性微珠以100μg～300μg过敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦联，将所述抗人IgE抗体和所述磁性微珠以20μg抗人IgE抗体/mg磁性微珠的比例耦联。