CN103033611A - 致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法，所述诊断试剂盒包括包被有致敏性变应原的微孔板、辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体，化学发光底物液A和B以及洗涤液。其中，致敏性变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种。本发明克服了不同蛋白在一个诊断试剂盒中灵敏度的差异，通过反复试验，调节各包被变应原量、酶标抗体浓度、化学发光底物液的配方和浓度，使每种变应原检测灵敏度达到最高。本发明的试剂盒比ELISA、免疫印迹、RAST方法变应原诊断试剂盒具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，成本低廉。

Description

致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及致敏性变应原检测领域，具体地说，涉及一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

变应性疾病（又称过敏性疾病）包括特应性皮炎、食物过敏、变应性鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变应性疾病列为21世纪重点研究和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如纤维支气管镜的开展，已对该病达成共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞（包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等）浸润。该病的发病主要涉及变应原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15-20分钟所发生的速发相反应主要与肥大细胞有关，而在激发后4-24小时所发生的迟发相反应则被认为有嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞（TH）中的一个亚型TH₂。变应原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治过敏性疾病有重要意义。

过敏性疾病大多为I型变态反应性疾病，是临床多发病症，具有季节性和区域性高发的特点。多因吸入尘螨、植物花粉、毛屑等变应原或因呼吸道感染病原微生物感染而引起。

呼吸道过敏反应最常见的典型疾病是变应性鼻炎和支气管哮喘。支气管哮喘在许多国家其患病率和死亡率有增加的趋势，如美国、英国、澳大利亚、新西兰等国近一年内的哮喘发生率在10-30%之间。2003年中国城区儿童哮喘患病率调查结果显示：0-15岁儿童哮喘现患病率为0.12-3.34%，全国平均为1.54%；累计患病率为1.97%，与10年前（1988-1990抽样调查，0.11-2.03%）相比明显增加。70%患儿首次喘息发作为3岁内；以呼吸道感染和过敏为诱因导致发作者占94.62%，分析认为其中部分可能为过敏性鼻炎症状。该调查显示，哮喘给患儿、患儿家庭和社会经济造成了严重的影响。病人及家长医疗需求迫切。关于哮喘的诱发因素，有大量的研究表明，过敏是致喘的重要因素，其中尘螨、室尘、花粉较为重要。

特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）是儿童期最常见的一种慢性皮肤炎症，全世界儿童5%-20%患有特应性皮炎，其中60%进入青春期后仍有特应性皮炎表现。将近80%患者有发生呼吸道变态反应的危险，包括变应性鼻炎和哮喘。吸入性变应原，包括室内尘螨和动物皮毛，是特应性皮炎的潜在诱因。在一个双盲对照研究中，Tan等发现尘螨避免可改善特应性皮炎。由此可见，进行皮肤点刺试验或特异性血清IgE测定对确定特应性皮炎患者是否有气传变应原变态反应及采取合适的变应原避免措施很有用。

慢性荨麻疹、湿疹是常见的复发性、过敏性皮肤病，病因复杂，往往无法根治，易复发；前者为机体接触变应原后发生Ⅰ型或Ⅲ型变态反应及非变态反应两条途径致病，后者是由内外激发因子引起的一种迟发型变态反应。其中60-80%发病与特异性变应原有关，一次变应原的作用是发病关键，若能及时检测出患者的变应原，对预防和治疗这类疾病极有意义。

过敏性疾病变应原的诊断方法分为体内试验和体外试验，体内试验有皮内试验和点刺试验两种方法。体外试验的方法主要有免疫印迹、酶联免疫分析法、放射性免疫分析法和荧光免疫分析。

皮肤试验的原理是使微量无害的变应原进入皮肤，与皮下肥大细胞表面的特异性IgE抗体结合，经过一系列的酶激活，使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等多种化学介质，从而使局部血管扩张、通透性增加，出现丘疹和红晕反应。临床上根据反应情况，对I型变态反应性疾病的病因进行诊断。其试验方法有多种，较常用的有皮内试验和皮肤点刺试验（SPT）。皮内试验变应原液是进入真皮，而SPT变应原液仅进入表皮。

过敏性疾病变应原的诊断，是一个系统性排除筛查试验，往往为了确诊患者的过敏原，需要进行几十种疑似变应原的筛查，初次筛查利用体内皮肤试验，会给患者带来很多不必要的痛苦。在过敏性疾病变应原诊断的流程中，先通过体外诊断试剂盒初筛确诊具体变应原，然后通过体内试验确认过敏变应原。所以过敏性疾病变应原体内诊断和体外诊断的方法是相辅相成，体外诊断避免了用体内试验带来的不必要痛苦和危害。

过敏性疾病变应原体外诊断的主要原理为变应原与患者血清中的特异性IgE结合，然后再与酶标、放射性同位素标记、荧光素标记的二抗结合，再与底物反应，病人血清中的特异性IgE与底物反应的强度成正比。

目前市面上的过敏性疾病变应原体外诊断试剂盒为主要以免疫印迹和酶联免疫分析为原理的试剂盒，由于方法的检测极限较低，诊断的灵敏度低，假阴性率高。而荧光免疫分析系统，灵敏度和特异性相对比较高，但此系统用来变应原疾病的诊断，成本比较高，患者难以承受高昂的诊断费用。

化学发光免疫分析（chemiluminesence Immunoassay,CLIA）于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制成功和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段，化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有化学发光的高灵敏度（检测限度可达10^-15-10^-18mol/L）。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光酶免分析是以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂的作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP），HRP常用底物为鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol）或衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼）等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免反应物中酶的浓度。

化学发光免疫分析已经成功的用于传染性疾病和肿瘤抗原的诊断中，灵敏度高、特异性高，是一种备受欢迎的体外诊断方法。但在过敏性疾病变应原诊断中，目前一直处于空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒，包括包被有致敏性变应原的微孔板、辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体，化学发光底物液A和B，洗涤液；其中，所述致敏性变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种；所述化学发光底物液A为含Luminol、TritonX100和化学发光增强剂的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7~9；所述化学发光底物液B为含H₂O₂的0.1M柠檬酸缓冲液，pH4~6；所述洗涤液的成分为：NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L和Tween 200.5ml/L，以水配制。

前述的诊断试剂盒，所述致敏性变应原包括屋尘螨和/或粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛和/或猫毛、蟑螂、葎草花粉、霉菌混合、树花粉组合等中的一种或多种。其中，所述霉菌混合为枝状枝孢、烟曲霉和/或链格孢等混合，所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树等组合。

前述的诊断试剂盒，所述致敏性变应原包括春季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ、树花粉组合等中的一种或多种；其中，所述春季花粉Ⅰ为柳杉、杉木、杨树、榆树、柳树等中的一种或多种；所述春季花粉Ⅱ为桦树、槭树、栎树、胡桃、油菜等中的一种或多种；所述多价真菌Ⅰ为产黄青霉、黑曲霉、康氏木霉、总状毛霉、匐枝根霉等中的一种或多种；所述多价真菌Ⅱ为匐柄霉、弯孢霉、大孢芽枝菌、蠕孢菌、面包酵母等中的一种或多种；所述多价真菌Ⅲ为好食串株菌、玉米黑粉菌、禾谷镰刀菌、麦散黑粉菌、头孢菌等中的一种或多种；所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树等组合。

前述的诊断试剂盒，所述致敏性变应原包括夏秋花粉Ⅰ、夏秋花粉Ⅱ、蒿属花粉、葎草花粉、豚草花粉、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ等中的一种或多种；其中，所述夏秋花粉Ⅰ为向日葵、苍耳、灰藜、大麻等中的一种或多种；所述夏秋花粉Ⅱ为玉米花粉、高粱花粉、莎草花粉、蓖麻花粉等中的一种或多种。

前述的诊断试剂盒，所述致敏性变应原包括牛奶、蛋清、花生、大豆、腰果、鱼、虾、蟹、牛肉、羊肉、小麦面、芒果、苹果、橘子等中的一种或多种。

前述的诊断试剂盒，所述化学发光增强剂为对碘苯酚、2-甲基-5-氨基-6羟基苯并噻唑、2-氨基-6-硝基苯并噻唑、1,3-二苯基苯酚等中的一种或多种。

前述的诊断试剂盒，所述化学发光底物液A的成分优选为：0.1MTris-HCl缓冲液+1×10^-3～1×10^-5mmol Luminol+1μl～10μl/LTritonX100+0.1～50mmol化学发光增强剂，pH7~9。

前述的诊断试剂盒，所述化学发光底物液B的成分优选为：0.1M柠檬酸缓冲液+30%H₂O₂，pH4~6。

本发明还提供制备上述诊断试剂盒的方法，包括以下步骤：

1）包被有致敏性变应原的微孔板的制备：将包被用变应原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μl，4℃过夜，用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板2遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；

其中，变应原的制备方法按照CN101972472A中的描述。

2）辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体的制备：采用改良的过碘酸钠法将羊抗人IgE抗体和辣根过氧化物酶联结在一起，具体为：

a.称取25mg HRP溶解于1ml双蒸水中；

b.向上述溶液中加入新鲜配制的0.1M NaIO₄溶液1ml，室温下避光搅拌30分钟；

c.将上述溶液装入透析袋中，于1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；

d.向经过透析的溶液中加入0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液100μl，调pH至9.0～9.5，然后加入含有50mg羊抗人IgE的0.01M碳酸盐缓冲液5ml，室温避光轻轻搅拌2h；

e.将上述溶液装入透析袋中，于0.15M pH7.4的PBS液中4℃透析过夜；

f.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1h；

g.于3000rpm离心0.5h，收集沉淀，溶于少量0.15M pH7.4的PB缓冲盐溶液中透析，除去铵离子后，于10,000rpm离心30分钟，收集上清，即得所需的酶标记物，加入等量丙三醇，分装，-20℃保存；3）化学发光底物液A和B以及洗涤液的配制：

化学发光底物液A的配制：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配制成0.1M pH7~9的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入Luminol、TritonX100和化学发光增强剂，混匀；

化学发光底物液B的配制：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH4~6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入H₂O₂溶液，混匀；

使用前将化学发光底物液A和B按1:1的体积比混合后使用；

洗涤液的配制：在双蒸水中依次加入NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄和Tween 20，混匀。

本发明进一步提供上述致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒的检测方法，其包括：

（1）自2-8℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

（2）取出包被板，插入板架上。

（3）在对应的质控孔和各变应原孔中，加入患者血清100μl，震荡均匀后贴上封板膜，置37℃温育30分钟。

（4）弃去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在洁净的吸水纸上扣干。

（5）每孔加入酶标记物100μl，贴上封板膜，置37℃温育30分钟。

（6）弃去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在洁净的吸水纸上扣干。

（7）使用前将化学发光底物液A和B以1:1的体积比混合，各孔均加入50μl的化学发光底物混合液，混合均匀，置室温避光反应5分钟。

（8）在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU）。

（9）用IgE标准品建立IgE抗体浓度和化学发光强度的标准曲线，将各孔化学发光强度值用标准曲线换算成IU/ml，确定过敏级别（0级：<0.35IU/ml,1级：0.35-0.7IU/ml,2级：0.71-3.5IU/ml,3级：3.51-17.5IU/ml,4级：17.51-50.0IU/ml,5级：50.01-100.0IU/ml,6级：>100IU/ml）。

本发明提供的致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒相对目前市面上的变应原体外诊断试剂盒的优点在于：

（一）相比免疫印迹和酶联免疫分析法的变应原体外诊断试剂盒，化学发光变应原体外诊断试剂盒灵敏度高，能检测出<0.35IU/mlsIgE。

（二）相比荧光免疫分析系统（Phadia UniCAP），不仅灵敏度提高了，而且快速、准确、重复性好、效期长，成本低，诊断费用低，可实现对过敏性疾病患者采用定量变应原体外诊断试剂盒筛查变应原。

（三）常规的变应原诊断，需将几种变应原置于同一包被板（或包被条）上，由于化学发光对酶标抗体的灵敏度不同，不同变应原与特异性IgE抗体的反应性不同。本发明经反复研究和大量试验数据的摸索，使同一包被板上的变应原与特异性IgE反应的灵敏度达到最高，成功开发出致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒I的制备

1.1包被有致敏性变应原的化学发光板的制备

制备变应原屋尘螨/粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛/猫毛、蟑螂、葎草花粉、霉菌混合。将各变应原用50mM碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃1.59g/L和NaHCO₃2.93g/L）稀释到2.5μg/ml，加至对应发光板内，每孔100μl，4℃孵育过夜，用含Tween 20的磷酸缓冲液洗涤发光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液（NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L、Tween 200.5ml/L、5%BSA），室温静置2h后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝袋真空包装，完成变应原包被的预包被发光板的制备。

其中，变应原的制备方法按照CN101972472A中的描述。

1.2用辣根过氧化酶标记抗人IgE抗体

采用改良的过碘酸钠法将标记用羊抗人IgE抗体和辣根过氧化物酶结合在一起，得到用辣根过氧化物酶的酶标结合物，具体为：

a.称取25mg HRP溶解于1ml双蒸水中；

b.向上述溶液中加入新鲜配制的0.1M NaIO₄溶液1ml，室温下避光搅拌30分钟；

c.将上述溶液装入透析袋中，于1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；

d.向经过透析的溶液中加入0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液100μl，调pH至9.0～9.5，然后加入含有50mg羊抗人IgE的0.01M碳酸盐缓冲液5ml，室温避光轻轻搅拌2h；

e.将上述溶液装入透析袋中，于0.15M pH7.4的PBS液中4℃透析过夜；

f.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1h；

g.于3000rpm离心0.5h，收集沉淀，溶于少量0.15M pH7.4的PB缓冲盐溶液中透析，除去铵离子后，于10,000rpm离心30分钟，收集上清，即得所需的酶标记物，加入等量丙三醇，分装，-20℃保存；

1.3化学发光底物液的制备

化学发光底物液A：在双蒸水中加入0.605g Tris和150μl 8M HCl配成50ml0.1M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入0.3gLuminol、20μl TritonX100及0.03g 2-甲基-5氨基苯并噻唑，混合均匀。

化学发光底物液B：在双蒸水中加入0.36g柠檬酸三钠和0.22g柠檬酸，配制成50ml 0.1M pH4.6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入50μl30%过氧化氢溶液。

使用前将A液和B液按1:1的体积比混合后使用。

1.4标准品IgE的制备

将人IgE抗体用含0.1M NaCl、0.2%BSA、0.01%硫柳汞的50mMHEPES（pH值7）配制成1mL 100IU/mL。

1.5洗涤液的配制

在双蒸水中加入NaCl 80g、KCl 2g、Na₂HPO₄28.7g、KH₂PO₄2g和Tween 205ml，配制成1L 10×洗涤液。

实施例2致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒II的制备

1.1包被有致敏性变应原的化学发光板的制备

制备变应原春季花粉Ⅰ（柳杉/杉木/杨树/榆树/柳树）、春季花粉Ⅱ（桦树/槭树/栎树/胡桃/油菜）、多价真菌Ⅰ（产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉）、多价真菌Ⅱ（匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母）、多价真菌Ⅲ（好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌）、树花粉组合（柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/洋白蜡/榆树）。将各变应原用50mM碳酸盐稀缓冲液（Na₂CO₃1.59g/L和NaHCO₃2.93g/L）释到5μg/ml，加至对应发光板内，每孔100μl，4℃孵育过夜，用含Tween 20的磷酸缓冲液洗涤发光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液（NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L、Tween 200.5ml/L、5%BSA），室温静置2h后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝袋真空包装，完成变应原包被的预包被发光板的制备。

其中，变应原的制备方法按照CN101972472A中的描述。

1.2用辣根过氧化酶标记抗人IgE抗体

同实施例1的描述。

1.3化学发光底物液的制备

化学发光底物液A：在双蒸水中加入0.605g Tris和180μl 8M HCl配制成50ml0.1M pH8.0的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入0.25gLuminol、25μl TritonX100及0.05g 1,3-二苯基苯酚，混合均匀。

化学发光底物液B：在双蒸水中加入0.36g柠檬酸三钠和0.22g柠檬酸，配制成50ml 0.1M pH4.6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入50μl30%过氧化氢溶液。

使用前将A液和B液按1:1的体积比混合后使用。

1.4标准品IgE和洗涤液的制备

同实施例1的描述。

实施例3致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒III的制备

1.1包被有致敏性变应原的化学发光板的制备

制备变应原夏秋花粉Ⅰ(向日葵/苍耳/灰藜/大麻)、夏秋花粉Ⅱ（玉米花粉/高粱花粉/莎草花粉/蓖麻花粉）、蒿属花粉、葎草花粉、豚草花粉、多价真菌Ⅰ（产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉）、多价真菌Ⅱ（匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母）、多价真菌Ⅲ（好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌）。将各变应原用50mM碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃1.59g/L和NaHCO₃2.93g/L）稀释到5μg/ml，加至对应发光板内，每孔100μl，4℃孵育过夜，用含Tween 20的磷酸缓冲液洗涤发光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液（NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L、Tween 20 0.5ml/L、5%BSA），室温静置2h后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝袋真空包装，完成变应原包被的预包被发光板的制备。

其中，变应原的制备方法按照CN101972472A中的描述。

1.2用辣根过氧化酶标记抗人IgE抗体

同实施例1的描述。

1.3化学发光底物液的制备

化学发光底物液A：在双蒸水中加入0.605g Tris和140μl 8M HCl配制成50ml 0.1M pH8.6的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入0.2gLuminol、35μlTritonX100及0.1g 2-氨基-6-硝基苯并噻唑，混合均匀。

化学发光底物液B：在双蒸水中加入0.36g柠檬酸三钠和0.22g柠檬酸，配制成50ml0.1M pH4.6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入50μl30%过氧化氢溶液。

使用前将A液和B液按1:1的体积比混合后使用。

1.4标准品IgE和洗涤液的制备

同实施例1的描述。

实施例4致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒IV的制备

1.1包被有致敏性变应原的化学发光板的制备

制备变应原牛奶、鸡蛋清、海虾、花生/大豆/腰果、鱼/虾/蟹、牛肉/羊肉、小麦面、芒果/苹果/橘子。将各变应原用50mM碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃1.59g/L和NaHCO₃2.93g/L）稀释到7.5μg/ml，加至对应发光板内，每孔100μl，4℃孵育过夜，用含Tween 20的磷酸缓冲液洗涤发光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液（NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L、Tween 20 0.5ml/L、5%BSA），室温静置2h后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝袋真空包装，完成变应原包被的预包被发光板的制备。

其中，变应原的制备方法按照CN101972472A中的描述。

1.2用辣根过氧化酶标记抗人IgE抗体

同实施例1的描述。

1.3化学发光底物液的制备

化学发光底物液A：在双蒸水中加入0.605g Tris和140μl 8M HCl配制成50ml 0.1M pH8.6的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入0.15gLuminol、30μl TritonX100及0.01g对碘苯酚，混合均匀。

化学发光底物液B：在双蒸水中加入0.36g柠檬酸三钠和0.22g柠檬酸，配制成50ml 0.1M pH4.6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入50μl30%过氧化氢溶液。

使用前将A液和B液按1:1的体积比混合后使用。

1.4标准品IgE和洗涤液的制备

同实施例1的描述。

实施例5致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒灵敏度考察试验

采用WHO推荐的变应原定量诊断的方法-变应原荧光免疫分析系统（Phadia UniCAP）做对照，将本发明试剂盒中的变应原特异血清用UniCAP标定sIgE含量。将以上各变应原特异血清稀释到0.35IU/ml(UniCAP检测最低极限)，再将各稀释到0.35IU/ml变应原特异血清依次加到本发明过敏性疾病变应原化学发光诊断试剂盒对应的孔中，各100μl，设阴阳性对照。按以下操作方法操作。

（1）取出包被板，插入板架上。

（2）在对应的质控孔和各变应原孔中，加入患者血清100μl，震荡均匀后贴上封板膜，置37℃温育30分钟。

（3）弃去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在洁净的吸水纸上扣干。

（4）每孔加入酶标记物100μl，贴上封板膜，置37℃温育30分钟。

（5）弃去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

（6）使用前将化学发光底物液A和B以1:1的体积比混合，各孔均加入50μl的化学发光底物混合液，混合均匀，置室温避光反应5分钟。

在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU）。结果见表1-4。

表10.35IU/ml特异性血清在实施例1的化学发光诊断试剂盒I上的发光值

表20.35IU/ml特异性血清在实施例2的化学发光诊断试剂盒II上的发光值

表30.35IU/ml特异性血清在实施例3的化学发光诊断试剂盒III上的发光值

表40.35IU/ml特异性血清在实施例4的化学发光诊断试剂盒IV上的发光值

从表1-表4可知，将特异性变应原血清用Phadia UniCAP标定后，均稀释到0.35IU/ml,此值是UniCAP系统的最低检测极限，将稀释到0.35IU/ml的血清，用本发明的过敏性性疾病变应原诊断试剂盒检测，结果各变应原对应的化学发光值和阴性对照发光值的比>5，此试验表明，采用本发明的致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒检测变应原的灵敏度优于Phadia UniCAP分析系统。

实施例6致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒临床试验

致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒临床试验方案采用多中心、对照、平行、双盲试验。本临床试验以Phadia UniCAP变应原荧光免疫分析系统为平行对照，三家临床试验中心为：北京协和医院变态反应科、华中科技大学同济医学院同济医院变态反应科、中国医学科学院南京皮肤病医院。三家临床中心病例数分布见表5。临床样本量为1210例，主要评价指标为该试剂盒的灵敏度和特异度。

所有安全性和疗效结果均按阳性组和阴性组分别进行描述，对连续变量描述观察值的数量、均值、标准差、中位数、最小值和最大值，对分类变量描述其每一种类的例数和百分比。未作特殊说明，统计检验均采用双侧检验，检验水准0.05。

表5三家临床中心病例数分布

致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒临床试验采用多中心、平行对照双盲试验方法在三家临床中心进行了2310样本量临床试验，试验中以国际上公认的最权威的变应原体外诊断系统UniCAP为对照，评价该变应原诊断系统的灵敏度和特异度。该化学发光变应原诊断试剂盒的灵敏度为99%，特异度为98.5%，优于UniCAP变应原体外诊断分析系统。

实施例1~4包括四种变应原组合，本发明克服了不同蛋白在一个诊断试剂盒上灵敏度的差异，通过反复试验，调节组合中包被变应原量、酶标抗体浓度、化学发光底物液的配方和浓度，使组合内每种变应原检测灵敏度达到最高。本发明的试剂盒比ELISA、免疫印迹、RAST方法变应原诊断试剂盒具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，成本低廉。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒，其特征在于，包括包被有致敏性变应原的微孔板、辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体，化学发光底物液A和B，洗涤液；

其中，所述致敏性变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种；

所述化学发光底物液A为含Luminol、TritonX100和化学发光增强剂的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7~9；

所述化学发光底物液B为含H₂O₂的0.1M柠檬酸缓冲液，pH4~6；

所述洗涤液的成分为：NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L和Tween 200.5ml/L，以水配制。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括屋尘螨和/或粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛和/或猫毛、蟑螂、葎草花粉、霉菌混合、树花粉组合中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述霉菌混合为枝状枝孢、烟曲霉和/或链格孢混合，所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树组合。

4.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括春季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ、树花粉组合中的一种或多种；

其中，所述春季花粉Ⅰ为柳杉、杉木、杨树、榆树、柳树中的一种或多种；所述春季花粉Ⅱ为桦树、槭树、栎树、胡桃、油菜中的一种或多种；所述多价真菌Ⅰ为产黄青霉、黑曲霉、康氏木霉、总状毛霉、匐枝根霉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅱ为匐柄霉、弯孢霉、大孢芽枝菌、蠕孢菌、面包酵母中的一种或多种；所述多价真菌Ⅲ为好食串株菌、玉米黑粉菌、禾谷镰刀菌、麦散黑粉菌、头孢菌中的一种或多种；所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树组合。

5.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括夏秋花粉Ⅰ、夏秋花粉Ⅱ、蒿属花粉、葎草花粉、豚草花粉、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ中的一种或多种；

其中，所述夏秋花粉Ⅰ为向日葵、苍耳、灰藜、大麻中的一种或多种；所述夏秋花粉Ⅱ为玉米花粉、高粱花粉、莎草花粉、蓖麻花粉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅰ为产黄青霉、黑曲霉、康氏木霉、总状毛霉、匐枝根霉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅱ为匐柄霉、弯孢霉、大孢芽枝菌、蠕孢菌、面包酵母中的一种或多种；所述多价真菌Ⅲ为好食串株菌、玉米黑粉菌、禾谷镰刀菌、麦散黑粉菌、头孢菌中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括牛奶、蛋清、花生、大豆、腰果、鱼、虾、蟹、牛肉、羊肉、小麦面、芒果、苹果、橘子中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光增强剂为对碘苯酚、2-甲基-5-氨基-6羟基苯并噻唑、2-氨基-6-硝基苯并噻唑、1,3-二苯基苯酚中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液A的成分为：0.1M Tris-HCl缓冲液+1×10^-3～1×10^-5mmolLuminol+1μl～10μl/L TritonX100+0.1～50mmol化学发光增强剂，pH7~9。

9.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液B的成分为：0.1M柠檬酸缓冲液+30%H₂O₂，pH4~6。

10.制备权利要求1-9任一项所述诊断试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）包被有致敏性变应原的微孔板的制备：将包被用变应原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μl，4℃过夜，用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板2遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；

2）辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体的制备：采用改良的过碘酸钠法将羊抗人IgE抗体和辣根过氧化物酶联结在一起，具体为：

a.称取25mg HRP溶解于1ml双蒸水中；

b.向上述溶液中加入0.1M NaIO₄溶液1ml，室温下避光搅拌30分钟；

c.将上述溶液装入透析袋中，于1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；

d.向经过透析的溶液中加入0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，调pH至9.0～9.5，然后加入含有50mg羊抗人IgE的0.01M碳酸盐缓冲液5ml，室温避光搅拌2h；

e.将上述溶液装入透析袋中，于0.15M pH7.4的PBS液中4℃透析过夜；

f.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1h；

g.于3000rpm离心0.5h，收集沉淀，溶于少量0.15M pH7.4的PB缓冲盐溶液中透析，除去铵离子后，于10,000rpm离心30分钟，收集上清，即得；

3）化学发光底物液A和B以及洗涤液的配制：

化学发光底物液A的配制：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配制成0.1M pH7~9的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入Luminol、TritonX100和化学发光增强剂，混匀；

化学发光底物液B的配制：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH4~6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入H₂O₂溶液，混匀；

洗涤液的配制：在双蒸水中依次加入NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄和Tween 20，混匀。