CN115541891A - 一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法,涉及医疗器械的技术领域,所述试剂盒包括磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂、酶结合物试剂、发光底物液、质控品、校准品以及清洗液;所述磁微粒试剂含有包被有多聚过敏原的磁微粒,所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂含有标记的鼠抗人IgE抗体,所述发光底物液包括底物A液和底物B液。本申请制备的试剂盒可在检测时有效提高过敏原特异性IgE抗体检测灵敏度,且有效降低了检测时杂蛋白的干扰。
Description
技术领域
本申请涉及医疗器械的技术领域,尤其是涉及一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒是用于检测过敏原特异性IgE抗体的,通过检测过敏原特异性IgE抗体可作为Ⅰ型变态反应中最常用的辅助诊断方法。
随着科学技术的不断发展,目前,市面上的过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒较为常见的一种检测方法为磁微粒化学发光免疫分析法,它是将磁性分离技术、化学发光技术和免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法,该分析方法充分利用了磁性分离技术的快速易自动性和免疫分析的特异性,因而在生物医学分析上已展现出不可替代的作用。
目前,现有的传统检测体系通过采用生物素标记过敏原、链霉亲和素包被的磁微粒与待测样本一起进行反应,利用生物素标记的过敏原去捕获待测样本中的过敏原特异性IgE抗体,反应结束后,经过磁分离和清洗,然后加入酶标记鼠抗人IgE抗体,从而使得酶标记鼠抗人IgE抗体与过敏原特异性IgE抗体进行结合;再然后,通过利用发光底物液可进行显色或发光,进而通过显色结果或发光强度来判断待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的含量,从而医生可根据检测结果辅助病情的诊断和判定。
针对上述中的相关技术,用于标记鼠抗人IgE抗体的标记物主要有:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等,当酶标记鼠抗人IgE抗体在与待测样本中的过敏原特异性IgE抗体结合时,两者的结合率偏低,从而会使得检测的灵敏度较低,可能会导致检测结果不准确的情况的出现。
发明内容
为了提高过敏原特异性IgE抗体检测的灵敏度,本申请提供一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法。
本申请提供的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,采用如下的技术方案:
一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒:所述试剂盒包括磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂、酶结合物试剂、发光底物液、质控品、校准品以及清洗液;所述磁微粒试剂含有包被有多聚过敏原的磁微粒,所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂含有标记的鼠抗人IgE抗体,所述发光底物液包括底物A液和底物B液。
优选的,所述标记的鼠抗人IgE抗体为标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;所述亲水聚合物为聚乙烯亚胺、九聚精氨酸中的一种。
优选的,所述标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体的标记物为生物素,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂;或所述标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体的标记物为异硫氰酸荧光素,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记的异硫氰酸荧光素抗体试剂。
优选的,所述包被有多聚过敏原的磁微粒为包被有多聚过敏原的甲苯磺酰基磁微粒。
本申请提供的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
S1、磁微粒试剂的制备
S11、将过敏原加入到离心管中,并使用0.1mol/L包被缓冲液进行稀释;将Pierce™ Traut试剂使用0.1mol/L包被缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的Pierce™Traut试剂与稀释后的过敏原一起混合均匀,并在室温条件下反应0.5小时,反应结束后,即得到多聚过敏原;将多聚过敏原进行超滤,超滤结束后,即得到经过纯化的多聚过敏原;
S12、将甲苯磺酰基磁微粒和0.1mol/L包被缓冲液加入到离心管中,并涡旋混匀;混匀后,将离心管进行超声,超声结束后,进行磁分离,并舍弃上清液;再次加入0.1mol/L包被缓冲液,并涡旋混匀,然后进行磁分离,并舍弃上清液;
S13、在S12所得到的磁微粒溶液中,加入0.1mol/L包被缓冲液,并涡旋混匀;混匀后,加入S11所得到的多聚过敏原,并加入1.3mol/L增强剂,搅拌混匀反应24小时;
S14、在S13所得到的磁微粒溶液中,加入1.5mol/L封闭剂,并且搅拌混匀8小时;
S15、对S14所得到的磁微粒溶液进行磁分离,并舍弃上清液,然后,使用磁微粒稀释液重悬磁微粒,稀释结束后,即得到包被有多聚过敏原的磁微粒试剂,磁微粒试剂于2~8℃保存;
S2、生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、将鼠抗人IgE抗体和0.1mol/L活化缓冲液加入到离心管中,并向离心管中加入亲水聚合物,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、亲水聚合物和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体进行超滤;超滤结束后,将亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体回收至离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液,得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、将生物素加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,然后,涡旋混匀,得到生物素溶液;
S24、将生物素溶液与S22所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液进行涡旋混匀,并于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24中所得到的标记产物吸取至透析袋中,并使用0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至离心管中,在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,并涡旋混匀,即得到生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
S3、辣根过氧化物酶标记亲和素试剂的制备
S31、将辣根过氧化物酶加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL,即得到辣根过氧化物酶溶液;
S32、在离心管中加入20㎎/mL辣根过氧化物酶溶液和22mmol/L高碘酸钠溶液,于2~8℃条件下反应1小时,即得到辣根过氧化物酶活化产物;并将辣根过氧化物酶活化产物进行超滤;
S33、将亲和素与S32超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物进行混合,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.26mol/L硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S34、在S33所得到的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后进行离心,并舍弃上清液;再然后,使用0.02mol/L的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S35、在离心管中加入S34所得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液,并加入甘油,然后涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素试剂;
S4、发光底物液的制备
S41、底物A液的配制
将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.35%鲁米诺钠盐以及0.02%对碘苯酚通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为9.0,并定容至1000mL,即得到底物A液;
S42、底物B液的配制
将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.01%硫代硫酸钠以及0.02%过氧化脲通过使用纯化水进行搅拌直至溶解,然后加入0.05%吐温-20进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为8.5,并定容至1000mL,即得到底物B液;
S5、清洗液的制备
将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.03%二水合磷酸二氢钠以及0.85%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入0.05%吐温-20和0.05%Proclin 300进行搅拌直至溶解;并定容至1000mL,即得到清洗液;
S6、校准品的制备和质控品的制备
S61、校准品与质控品稀释液的配制
将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.026%磷酸二氢钾、0.02%氯化钾以及0.8%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入0.5%吐温-20和0.05% Proclin 300进行搅拌直至溶解;并定容至1000mL,即得到校准品与质控品稀释液;
S62、校准品的配制
取人IgE抗体,通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.05、0.35、2、10、40、100 IU/mL的校准品;
S63、质控品的配制
取人IgE抗体,通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.35、20IU/mL的质控品;
制备方法中的S2或为:异硫氰酸荧光素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、将鼠抗人IgE抗体和0.1mol/L活化缓冲液加入到离心管中,并向离心管中加入亲水聚合物,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、亲水聚合物和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体进行超滤;超滤结束后,将亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体回收至离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液,得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、将异硫氰酸荧光素加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,然后,涡旋混匀,得到异硫氰酸荧光素溶液;
S24、将异硫氰酸荧光素溶液与S22所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液进行涡旋混匀,并于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24中所得到的标记产物吸取至透析袋中,并使用0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至离心管中,在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,并涡旋混匀,即得到异硫氰酸荧光素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
与S2相对应的S3为:辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂的制备
S31、将辣根过氧化物酶加入到离心管中,向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL,即得到辣根过氧化物酶溶液;
S32、在离心管中加入20㎎/mL辣根过氧化物酶溶液和22mmol/L高碘酸钠溶液,于2~8℃条件下反应1小时,即得到辣根过氧化物酶活化产物;并将辣根过氧化物酶活化产物进行超滤;
S33、将异硫氰酸荧光素抗体与S32超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物进行混合,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.26mol/L硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S34、在S33所得到的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后进行离心,并舍弃上清液;再然后,使用0.02mol/L的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S35、在离心管中加入S34所得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液,并加入甘油,然后涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂。
本申请提供的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的使用方法,包括如下检测步骤:
S1、向反应管中加入校准品、质控品、待测样本,并向反应管中加入磁微粒试剂以及标记的鼠抗人IgE抗体试剂,搅拌混合均匀后于37℃进行反应;
S2、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S3、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S4、然后向反应管中加入酶结合物试剂,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S5、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S6、重复S5的清洗步骤,共计三次;
S7、向反应管中加入等体积的底物A液和底物B液,搅拌混匀后于37℃进行反应;并将反应管置于光电盘中进行读数,测定发光值;
S8、利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线,检测仪器的操作软件将发光值带入四参数公式计算出待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的浓度值。
综上所述,本申请包括以下至少一种有益技术效果:
1.本申请将待测样本与磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂进行反应,反应结束后进行磁分离和清洗,从而将未结合的部分除去;然后加入酶结合物试剂,反应结束后再次进行磁分离和清洗,从而将未结合的部分除去;再然后,加入发光底物液,诱导快速化学发光反应,通过利用检测仪器检测化学发光强度,待测样本中的过敏原特异性IgE抗体含量与化学发光强度成正比。本申请通过在被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体上标记生物素或在被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体上标记异硫氰酸荧光素,由于生物素、异硫氰酸荧光素均为小分子物质,因而使得标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体在与过敏原特异性IgE抗体结合时,有效的降低了空间位阻的影响,从而提高了标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体和过敏原特异性IgE抗体的结合效率,进而提高了检测体系的灵敏度,有利于提高检测结果的准确性。
2.在现有的传统检测体系中,通过使用生物素标记过敏原,从而使得更多的被标记的过敏原固定在链霉亲和素包被的磁微粒上,进而生物素标记的过敏原去捕获待测样本中的过敏原特异性IgE抗体;但是,目前,过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒基本上使用天然过敏原作为捕获抗原,天然过敏原中含有大量的杂蛋白,在生物素标记过敏原时,生物素也会标记在杂蛋白上,在进行检测时,被生物素标记的杂蛋白会干扰检测,检测灵敏度较低,甚至会出现“假阳”或“漏检”的情况。在本申请中,将过敏原聚合后,直接将多聚过敏原包被在磁微粒上,由于没有使用生物素标记过敏原,因此不会出现生物素标记在杂蛋白上的情况,因而降低了杂蛋白产生非特异性吸附的程度,从而在使用检测仪器进行检测时,能够显著改善检测体系的信噪比,进而能够有效提高过敏原特异性IgE抗体的检测灵敏度,同时,降低了杂蛋白干扰检测的概率,有效减少了“假阳”或“漏检”情况的出现。
3.本申请通过Pierce™ Traut试剂将过敏原进行聚合,从而形成多聚过敏原,并将多聚过敏原固定在磁微粒上;有效提高了磁微粒表面过敏原的包被量,从而提高了过敏原与待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的结合率,进而提高了过敏原、过敏原特异性IgE抗体与标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体三者形成免疫复合物的结合率,进而有效提高检测体系的灵敏度。
4.本申请通过在鼠抗人IgE抗体上修饰亲水聚合物,然后将生物素或异硫氰酸荧光素标记在被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体上;从而可有效提高鼠抗人IgE抗体上生物素或异硫氰酸荧光素的标记量,进而可使得酶结合物试剂与免疫复合物结合进行显色发光时有效提高发光效率,进而提高检测的灵敏度。
附图说明
图1是校准品标准曲线示意图(横坐标为浓度(IU/mL),纵坐标为RLU均值)。
具体实施方式
本申请实施例公开一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法,一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒包括磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂、酶结合物试剂、发光底物液、质控品、校准品以及清洗液;所述磁微粒试剂含有包被有多聚过敏原的磁微粒,所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂含有标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体,所述发光底物液包括底物A液和底物B液。
所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂为生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记亲和素试剂。
所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂为异硫氰酸荧光素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂。
所述亲水聚合物为聚乙烯亚胺(分子量600,市售可得);所述亲水聚合物或为九聚精氨酸(分子量1423,市售可得)。
制备例:
1、磁微粒试剂制备时,所需用到的包被缓冲液、增强剂、封闭剂以及磁微粒稀释液的配制方法:
①、包被缓冲液的配制
称取0.6183g硼酸于容器中,并加入100mL纯化水进行搅拌直至溶解,调节溶液pH值为9.5,即得到0.1mol/L包被缓冲液;
②、增强剂的配制
称取1.7417g硫酸铵于容器中,并加入10mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到1.3mol/L增强剂;
③、封闭剂的配制
称取1g牛血清白蛋白于容器中,并加入10mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到1.5mol/L封闭剂;
④、磁微粒稀释液的配制
称取6.057g三羟甲基氨基甲烷、8.5g氯化钠以及10g牛血清白蛋白于容器中,并加入1.0mL吐温-20和1.0mLProclin300,再加入纯化水至1000mL,进行搅拌直至溶解,即得到磁微粒稀释液;
2、标记的鼠抗人IgE抗体试剂制备时,所需用到的活化缓冲液以及PBS缓冲液的配制方法:
①、活化缓冲液的配制
称取2-(N-吗啉基)乙磺酸19.524g加入到容器中,加入1000mL纯化水进行搅拌直至溶解,并调节溶液pH值为6.0,即得到0.1mol/L活化缓冲液;
②、PBS缓冲液的配制
称取5.8018g十二水合磷酸氢二钠、0.5928g二水合磷酸二氢钠以及8.5g氯化钠于容器中,并加入1000mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到0.02mol/L的PBS缓冲液;
3、酶结合物试剂制备时,所需用到的PBS缓冲液、饱和硫酸铵溶液、高碘酸钠溶液以及硼氢化钠溶液的配制方法:
①、PBS缓冲液的配制
称取0.5802g十二水合磷酸氢二钠、0.0593g二水合磷酸二氢钠以及0.85g氯化钠于容器中,并加入100mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到0.02mol/L的PBS缓冲液;
②、饱和硫酸铵溶液的配制
称取9.744g硫酸铵于容器中,并加入纯化水至12mL,进行加热搅拌溶解,于室温放置,容器底部析出硫酸铵晶体,上清液即为饱和硫酸铵溶液;
③、高碘酸钠溶液的配制
称取7.5㎎高碘酸钠于容器中,并加入1.5mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到22mmol/L高碘酸钠溶液;
④、硼氢化钠溶液的配制
称取15㎎硼氢化钠于容器中,并加入1.5mL纯化水进行搅拌直至溶解,即得到0.26mol/L硼氢化钠溶液。
实施例1:
本实施例1中一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
S1、磁微粒试剂的制备
S11、将0.5mg过敏原加入到离心管中,并使用0.1mol/L包被缓冲液稀释至0.4mg/mL;将25mg的Pierce™ Traut试剂(市售可得)使用0.1mol/L包被缓冲液溶解至10mg/mL,并涡旋混匀;吸取1.25mL已被溶解混匀的Pierce™ Traut试剂加入到离心管中从而与被稀释的过敏原一起混合均匀,并在室温条件下反应0.5小时,反应结束后,即得到多聚过敏原;使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm条件下超滤多聚过敏原,超滤结束后,即得到经过纯化的多聚过敏原;
S12、在15mL离心管中,加入100mg甲苯磺酰基磁微粒,并加入0.1mol/L包被缓冲液,使得终体积为5mL,然后涡旋混匀;混匀后,将离心管在超声波细胞粉碎机上进行超声,通过超声开三秒、超声关五秒的循环式操作,超声10分钟;超声完毕后,进行磁分离,并舍弃上清液;再次加入5mL包被缓冲液,并涡旋混匀,然后进行磁分离,并舍弃上清液;
S13、在S12所得到的磁微粒溶液中,加入3.5mL包被缓冲液,并涡旋混匀;混匀后,加入S11所得到的纯化多聚过敏原和1.5mL增强剂,并且搅拌混匀24小时;从而使得多聚过敏原包被在甲苯磺酰基磁微粒上;
S14、S13反应结束后,在所得到的磁微粒溶液中,加入0.1mL封闭剂,并且搅拌混匀8小时;当S13将多聚过敏原包被在甲苯磺酰基磁微粒上以后,甲苯磺酰基磁微粒仍然存在裸露部位和基团,通过使用封闭剂可对其进行填充;
S15、对S14所得到的磁微粒溶液进行磁分离,并舍弃上清液;然后,使用磁微粒稀释液重悬磁微粒,并使得稀释结束后的浓度为0.8㎎/mL,即为包被有多聚过敏原的磁微粒试剂,于2~8℃保存;
S2、生物素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、在15mL离心管中,加入5mg鼠抗人IgE抗体,并加入0.1mol/L活化缓冲液使得体积为5mL,再向离心管中加入20μl聚乙烯亚胺,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将5mg的EDC(市售可得)使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解并使得浓度为10㎎/mL;吸取50μl浓度为10㎎/mL的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、聚乙烯亚胺和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体通过使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm的条件下超滤10分钟;超滤结束后,将聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体回收至15mL离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液至终体积为5.0mL,得到聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、称量3mg生物素于1.5mL离心管中,加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,并涡旋混匀,得到生物素溶液;
S24、吸取S23得到的生物素溶液50μL至S22所得到的聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体溶液中,并涡旋混匀;于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24得到的全部标记产物吸取至截留分子量为50kDa的透析袋中,并使用2000mL0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至15mL离心管中,并在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,涡旋混匀,即得到生物素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
S3、辣根过氧化物酶标记亲和素试剂的制备
S31、称量5mg辣根过氧化物酶于1.5mL离心管中,并向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL,即得到辣根过氧化物酶溶液;
S32、在1.5mL离心管中,加入0.25mL辣根过氧化物酶溶液和0.25mL高碘酸钠溶液,于2~8℃条件下反应1小时,即得到辣根过氧化物酶活化产物;使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm的条件下超滤辣根过氧化物酶活化产物15分钟;超滤结束后,将辣根过氧化物酶活化产物回收至15mL离心管中;
S33、称量5mg亲和素与超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物混合均匀,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.5mL硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S34、向S33得到的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后,使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm条件下离心5分钟,离心结束后,舍弃上清液;再然后,加入5mL的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S35、将S34得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液吸取至15mL离心管中,并加入5mL甘油,涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素试剂;
S4、发光底物液的制备
S41、底物A液的配制
称取6.057g三羟甲基氨基甲烷、3.5g鲁米诺钠盐以及0.2g对碘苯酚于容器中,并加入950mL纯化水进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为9.0,并通过容量瓶定容至1000mL,混合均匀,即得到底物A液;
S42、底物B液的配制
称取6.057g三羟甲基氨基甲烷、0.1g硫代硫酸钠以及0.2g过氧化脲于容器中,并加入950mL纯化水进行搅拌直至溶解,然后加入0.5g吐温-20进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为8.5,并通过容量瓶定容至1000mL,混合均匀,即得到底物B液;
S5、清洗液的制备
称取2.9g十二水合磷酸氢二钠、0.296g二水合磷酸二氢钠以及8.5g氯化钠于容器中,并加入950mL纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入0.5mL吐温-20和0.5mL的Proclin 300进行搅拌直至溶解;并通过容量瓶定容至1000mL,混合均匀,即得到清洗液;
S6、校准品的制备和质控品的制备
S61、校准品与质控品稀释液的配制
称取2.9g十二水合磷酸氢二钠、0.26g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾以及8g氯化钠于容器中,并加入950mL纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入5mL吐温-20和0.5mL的Proclin 300进行搅拌直至溶解;并继续加入纯化水定容至1000mL,混合均匀,即得到校准品与质控品稀释液;
S62、校准品的配制
取人IgE抗体,通过使用S61得到的校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.05、0.35、2、10、40、100 IU/mL的校准品;
S63、质控品的配制
取人IgE抗体,通过使用S61得到的校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.35、20 IU/mL的质控品。
实施例2:
实施例1中过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的使用方法,包括如下检测步骤:
整个检测过程是在全自动化学发光免疫分析仪上进行的;
校准品、质控品在检测前应平衡至室温;
S1、向反应管中加入10μL校准品、质控品、待测样本,并向反应管中加入50μL磁微粒试剂以及20μL生物素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂,搅拌混匀后于37℃反应15分钟;
S2、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,加入400μL清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S3、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S4、然后向反应管中加入100μL辣根过氧化物酶标记亲和素试剂,搅拌混匀后于37℃反应15分钟;
S5、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,加入400μL清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S6、重复S5的清洗步骤,共计三次;
S7、向反应管中加入100μL底物A液和100μL底物B液,搅拌混匀后于37℃反应2.5分钟;并将反应管置于光电盘中进行读数,测定发光值;
S8、利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线,全自动化学发光免疫分析仪的操作软件将发光值带入四参数公式计算出待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的浓度值。
检测原理:
本申请采用磁微粒化学发光免疫分析间接法,测定人血清样本中过敏原特异性IgE抗体的浓度;具体到本实施例中:
将待测样本与多聚过敏原磁微粒试剂、生物素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂一起进行反应,反应结束后进行磁分离和清洗,从而将未结合部分洗去;清洗后,加入辣根过氧化物酶标记亲和素试剂进行反应,反应结束后,再次进行磁分离和清洗,从而将未结合的部分洗去;再然后,加入辣根过氧化物酶促化学发光底物液(鲁米诺及其衍生物),诱导快速化学发光反应,使用全自动化学发光免疫分析仪检测化学发光强度(即:检测发光值),化学发光强度与待测样本中的过敏原特异性IgE抗体含量成正比。
本申请与现有的传统检测体系相比较:
通过在聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体上标记生物素,由于生物素为小分子物质,且生物素有很长的连接臂,因此为聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体与过敏原特异性IgE抗体相结合提供了充足的空间,从而降低了空间位阻,提高了标记的被聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体和过敏原特异性IgE抗体的结合效率,进而提高了检测体系的灵敏度。
在现有的传统检测体系中,使用生物素标记过敏原;但是,目前,用于过敏原特异性IgE抗体检测的过敏原基本上为天然过敏原(如:花粉、螨虫、花生等),天然过敏原中含有大量杂蛋白,因此,在生物素标记过敏原时,生物素也会标记在杂蛋白上,从而被生物素标记的杂蛋白会干扰检测。在本申请中,过敏原聚合后,将多聚过敏原包被在磁微粒上,由于没有使用生物素标记过敏原,因此不会出现生物素标记在杂蛋白上的情况,因而降低了杂蛋白产生非特异性吸附的程度,从而在全自动化学发光免疫分析仪检测时,能够显著改善检测体系的信噪比,进而能够有效提高过敏原特异性IgE抗体的检测灵敏度,同时,降低了杂蛋白干扰检测的概率,减少了“假阳”或“漏检”情况的出现,提高了过敏原特异性IgE抗体检测结果的准确性。
由于将过敏原进行聚合,形成多聚过敏原,并将多聚过敏原固定在磁微粒上;因此有效提高了磁微粒表面过敏原的包被量,从而提高了过敏原与待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的结合率,进而提高了过敏原、过敏原特异性IgE抗体与生物素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体三者形成免疫复合物的结合率,增强了特异性,有效提高了检测体系的灵敏度。
由于在鼠抗人IgE抗体上修饰有聚乙烯亚胺,因此当标记生物素时,可有效提高鼠抗人IgE抗体上生物素的标记量,进而可使得辣根过氧化物酶标记亲和素试剂与免疫复合物结合进行显色发光时有效提高发光效率,进而提高检测的灵敏度。
实施例3:
本实施例3中一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,其中,磁微粒试剂的制备、发光底物液的制备、清洗液的制备以及校准品的制备和质控品的制备均与实施例1相同;区别点在于:
S2、异硫氰酸荧光素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体的制备方法与实施例1中的S21相同;
S22、聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体溶液的制备方法与实施例1中的S22相同;
S23、称量3mg异硫氰酸荧光素于1.5mL离心管中,加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,并涡旋混匀,得到异硫氰酸荧光素溶液;
S24、吸取S23得到的异硫氰酸荧光素溶液50μL至S22得到的聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体溶液中,并涡旋混匀;于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24得到的全部标记产物吸取至截留分子量为50 kDa的透析袋中,并使用2000mL0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至15mL离心管中,并在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,涡旋混匀,即得到异硫氰酸荧光素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
S3、辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂的制备
S31、辣根过氧化物酶溶液的制备方法与实施例1中的S31相同;
S32、辣根过氧化物酶活化产物的制备方法及其超滤操作与实施例1中的S32相同;
S33、称量10mg异硫氰酸荧光素抗体与超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物混合均匀,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.5mL硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S34、向S33得到的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后,使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm条件下离心5分钟,离心结束后,舍弃上清液;再然后,加入5mL的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S35、将S34得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液吸取至15mL离心管中,并加入5mL甘油,涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂。
实施例4:
实施例3中过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的使用方法,包括如下检测步骤,其中,步骤S2、S3、S5、S6、S7、S8均与实施例2中相对应的检测步骤相同,区别点在于:
S1、向反应管中加入10μL校准品、质控品、待测样本,并向反应管中加入50μL磁微粒试剂以及20μL异硫氰酸荧光素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂,搅拌混匀后于37℃反应15分钟;
S4、然后向反应管中加入100μL辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂,搅拌混匀后于37℃反应15分钟;
检测原理:
本实施例4的检测原理与实施例2的检测原理相同;实施例4与实施例2的区别点在于:
将待测样本与多聚过敏原磁微粒试剂、异硫氰酸荧光素标记聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体试剂一起进行反应,反应结束后进行磁分离和清洗,将未结合部分洗去;清洗后,加入辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂进行反应,反应结束后,再次进行磁分离和清洗,将未结合的部分洗去。
本申请与现有的传统检测体系相比较:
通过在聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体上标记异硫氰酸荧光素,由于异硫氰酸荧光素为小分子物质,其体积相对较小,因而使得标记的被聚乙烯亚胺修饰的鼠抗人IgE抗体在与过敏原特异性IgE抗体结合时,有效降低了空间位阻的影响,从而提高了二者的结合效率,进而提高了检测体系的灵敏度。
另外,在本申请中,由于没有使用生物素标记过敏原,因此不会出现生物素标记在杂蛋白上的情况,因而降低了杂蛋白产生非特异性吸附的程度,从而在检测时能够显著改善检测体系的信噪比,进而可有效提高过敏原特异性IgE抗体的检测灵敏度,同时,降低了杂蛋白干扰检测的概率,减少了“假阳”或“漏检”情况的出现,提高了检测结果的准确性。
而且,通过聚合过敏原,有效提高了磁微粒表面过敏原的包被量,进而提高了反应时免疫复合物的结合率,增强了特异性,有效提高检测的灵敏度;同时,通过在鼠抗人IgE抗体上修饰聚乙烯亚胺,有效提高了鼠抗人IgE抗体上异硫氰酸荧光素的标记量,从而在显色发光时有效提高发光效率。
实施例5:
本实施例5中一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,在本实施例中,所述亲水聚合物为九聚精氨酸;其中,磁微粒试剂的制备、辣根过氧化物酶标记亲和素试剂的制备、发光底物液的制备、清洗液的制备以及校准品的制备和质控品的制备均与实施例1相同;区别点在于:
S2、生物素标记九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、在15mL离心管中,加入5mg鼠抗人IgE抗体,并加入0.1mol/L活化缓冲液使得体积为5mL,再向离心管中加入20μl九聚精氨酸,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将5mg的EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解并使得浓度为10㎎/mL;吸取50μl浓度为10㎎/mL的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、九聚精氨酸和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体通过使用高速冷冻离心机在4℃、14000rpm的条件下超滤10分钟;超滤结束后,将九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体回收至15mL离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液至终体积为5.0mL,得到九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、生物素溶液的制备方法与实施例1中的S23相同;
S24、吸取S23得到的生物素溶液50μL至S22所得到的九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体溶液中,并涡旋混匀;于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24得到的全部标记产物吸取至截留分子量为50kDa的透析袋中,并使用2000mL0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至15mL离心管中,并在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,涡旋混匀,即得到生物素标记九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体试剂。
实施例6:
本实施例6中一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,在本实施例中,所述亲水聚合物为九聚精氨酸;其中,磁微粒试剂的制备、辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂的制备、发光底物液的制备、清洗液的制备以及校准品的制备和质控品的制备均与实施例3相同;区别点在于:
S2、异硫氰酸荧光素标记九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体制备方法与实施例5中的S21相同;
S22、九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体溶液制备方法与实施例5中的S22相同;
S23、异硫氰酸荧光素溶液制备方法与实施例3中的S23相同;
S24、吸取S23得到的异硫氰酸荧光素溶液50μL至S22得到的九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体溶液中,并涡旋混匀;于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24得到的全部标记产物吸取至截留分子量为50kDa的透析袋中,并使用2000mL0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至15mL离心管中,并在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,涡旋混匀,即得到异硫氰酸荧光素标记九聚精氨酸修饰的鼠抗人IgE抗体试剂。
实施例7:
在本实施例中或本申请的其他实施例中,在制备磁微粒试剂的过程中,所用到的磁微粒还可以为氨基磁微粒、或为羧基磁微粒、或为醛基磁微粒(本申请所述的甲苯磺酰基磁微粒、氨基磁微粒、羧基磁微粒、醛基磁微粒均市售可得)。
通过使用功能基团修饰磁微粒,如:甲苯磺酰基、氨基、羧基或醛基,能够使得多聚过敏原与磁微粒上的功能基团形成稳定的共价键,从而使得多聚过敏原可更加牢固的包被在磁微粒上,进而有利于多聚过敏原磁微粒、标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体与待测样本进行反应。
对比例1:
本对比例为背景技术中所述的现有传统检测体系,与本申请的实施例1相对比。
现有传统检测体系与实施例1的区别点在于:
在现有传统检测体系中,将待测样本与生物素标记过敏原、亲和素包被的磁微粒一起进行反应,反应结束后进行磁分离和清洗,从而将未结合部分洗去;清洗后,加入辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgE抗体进行反应,反应结束后,再次进行磁分离和清洗,从而将未结合的部分洗去;再然后,加入辣根过氧化物酶促化学发光底物液(鲁米诺及其衍生物),诱导快速化学发光反应,使用全自动化学发光免疫分析仪检测化学发光强度(即:检测发光值),化学发光强度与待测样本中的过敏原特异性IgE抗体含量成正比。
利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线:
每一支校准品检测5次,计算发光值(RLU)均值和变异系数(CV)。CV≤10%时,RLU均值有效;CV>10%时,再次检测该浓度的校准品5次,计算RLU均值和CV,直至CV符合要求。
通过四参数模式“Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d”拟合标准曲线,标准曲线参见附图1;参数a为1119.19592285,参数b为1.1906563,参数c为558.91772461,参数d为154331440,相关系数r为0.999170977357,附图1横坐标为浓度(IU/mL),纵坐标为RLU均值。
现有传统检测体系的最低检出限(LOD)与本申请实施例1的最低检出限(LOD)的比较:
使用相同的低浓度样本评估传统检测体系和本申请实施例1的最低检出限。以校准品与质控品稀释液作为S0样本,重复检测20孔,计算RLU均值、标准差SD、RLU均值+2SD;S1重复检测5次,使用S0、S1的浓度值和发光值拟合成一次函数“y=kx+b”;将RLU均值+2SD代入上述标准曲线,计算对应的浓度值,即最低检出限(LOD)。
通过检测发现,现有传统检测体系的S1/S0≈1.0,本申请实施例1的S1/S0≥2.1,即现有传统检测体系无法检出S1。
配制高浓度SH样本,再次评估现有传统检测体系和本申请实施例1的最低检出限(LOD)。实验数据如下表:
综上,现有传统检测体系中最低检出限(LOD)为0.067IU/mL,本申请的最低检出限可达到0.010IU/mL,有效提升了过敏原特异性IgE抗体检测的灵敏度。
以上均为本申请的较佳实施例,并非依此限制本申请的保护范围,故:凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化,均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂、酶结合物试剂、发光底物液、质控品、校准品以及清洗液;所述磁微粒试剂含有包被有多聚过敏原的磁微粒,所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂含有标记的鼠抗人IgE抗体,所述发光底物液包括底物A液和底物B液。
2.根据权利要求1所述的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,其特征在于:所述标记的鼠抗人IgE抗体为标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;所述亲水聚合物为聚乙烯亚胺、九聚精氨酸中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,其特征在于:所述标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体的标记物为生物素,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂;或所述标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体的标记物为异硫氰酸荧光素,且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记的异硫氰酸荧光素抗体试剂。
4.根据权利要求1—3中任意一项所述的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,其特征在于:所述包被有多聚过敏原的磁微粒为包被有多聚过敏原的甲苯磺酰基磁微粒。
5.根据权利要求1—3中任意一项所述的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1、磁微粒试剂的制备
S11、将过敏原加入到离心管中,并使用0.1mol/L包被缓冲液进行稀释;将Pierce™Traut试剂使用0.1mol/L包被缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的Pierce™ Traut试剂与稀释后的过敏原一起混合均匀,并在室温条件下反应0.5小时,反应结束后,即得到多聚过敏原;将多聚过敏原进行超滤,超滤结束后,即得到经过纯化的多聚过敏原;
S12、将甲苯磺酰基磁微粒和0.1mol/L包被缓冲液加入到离心管中,并涡旋混匀;混匀后,将离心管进行超声,超声结束后,进行磁分离,并舍弃上清液;再次加入0.1mol/L包被缓冲液,并涡旋混匀,然后进行磁分离,并舍弃上清液;
S13、在S12所得到的磁微粒溶液中,加入0.1mol/L包被缓冲液,并涡旋混匀;混匀后,加入S11所得到的多聚过敏原,并加入1.3mol/L增强剂,搅拌混匀反应24小时;
S14、在S13所得到的磁微粒溶液中,加入1.5mol/L封闭剂,并且搅拌混匀8小时;
S15、对S14所得到的磁微粒溶液进行磁分离,并舍弃上清液,然后,使用磁微粒稀释液重悬磁微粒,稀释结束后,即得到包被有多聚过敏原的磁微粒试剂,磁微粒试剂于2~8℃保存;
S2、生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、将鼠抗人IgE抗体和0.1mol/L活化缓冲液加入到离心管中,并向离心管中加入亲水聚合物,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、亲水聚合物和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体进行超滤;超滤结束后,将亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体回收至离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液,得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、将生物素加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,然后,涡旋混匀,得到生物素溶液;
S24、将生物素溶液与S22所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液进行涡旋混匀,并于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24中所得到的标记产物吸取至透析袋中,并使用0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至离心管中,在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,并涡旋混匀,即得到生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
S3、辣根过氧化物酶标记亲和素试剂的制备
S31、将辣根过氧化物酶加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL,即得到辣根过氧化物酶溶液;
S32、在离心管中加入20㎎/mL辣根过氧化物酶溶液和22mmol/L高碘酸钠溶液,于2~8℃条件下反应1小时,即得到辣根过氧化物酶活化产物;并将辣根过氧化物酶活化产物进行超滤;
S33、将亲和素与S32超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物进行混合,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.26mol/L硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S34、在S33所得到的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后进行离心,并舍弃上清液;再然后,使用0.02mol/L的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液;
S35、在离心管中加入S34所得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液,并加入甘油,然后涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记亲和素试剂;
S4、发光底物液的制备
S41、底物A液的配制
将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.35%鲁米诺钠盐以及0.02%对碘苯酚通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为9.0,并定容至1000mL,即得到底物A液;
S42、底物B液的配制
将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.01%硫代硫酸钠以及0.02%过氧化脲通过使用纯化水进行搅拌直至溶解,然后加入0.05%吐温-20进行搅拌直至溶解;调节溶液pH值为8.5,并定容至1000mL,即得到底物B液;
S5、清洗液的制备
将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.03%二水合磷酸二氢钠以及0.85%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入0.05%吐温-20和0.05% Proclin 300进行搅拌直至溶解;并定容至1000mL,即得到清洗液;
S6、校准品的制备和质控品的制备
S61、校准品与质控品稀释液的配制
将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.026%磷酸二氢钾、0.02%氯化钾以及0.8%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解;然后加入0.5%吐温-20和0.05% Proclin 300进行搅拌直至溶解;并定容至1000mL,即得到校准品与质控品稀释液;
S62、校准品的配制
取人IgE抗体,通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.05、0.35、2、10、40、100 IU/mL的校准品;
S63、质控品的配制
取人IgE抗体,通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.35、20 IU/mL的质控品;
制备方法中的S2或为:异硫氰酸荧光素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备
S21、将鼠抗人IgE抗体和0.1mol/L活化缓冲液加入到离心管中,并向离心管中加入亲水聚合物,于室温条件下涡旋混匀10分钟;将EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解,并涡旋混匀;将溶解混匀的EDC溶液加入到离心管中,于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、亲水聚合物和EDC一起涡旋混匀反应45分钟,反应结束后,即得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体;
S22、将S21所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体进行超滤;超滤结束后,将亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体回收至离心管中,并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液,得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液;
S23、将异硫氰酸荧光素加入到离心管中,并向离心管中加入纯化水至终浓度为10㎎/mL,然后,涡旋混匀,得到异硫氰酸荧光素溶液;
S24、将异硫氰酸荧光素溶液与S22所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液进行涡旋混匀,并于室温静置反应0.5小时,得到标记产物;
S25、将S24中所得到的标记产物吸取至透析袋中,并使用0.02mol/L的PBS缓冲液在2~8℃进行过夜透析;
S26、将透析完毕的标记产物吸取至离心管中,在离心管中加入与标记产物等体积的甘油,并涡旋混匀,即得到异硫氰酸荧光素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂;
与S2相对应的S3为:辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂的制备
S31、将辣根过氧化物酶加入到离心管中,向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL,即得到辣根过氧化物酶溶液;
S32、在离心管中加入20㎎/mL辣根过氧化物酶溶液和22mmol/L高碘酸钠溶液,于2~8℃条件下反应1小时,即得到辣根过氧化物酶活化产物;并将辣根过氧化物酶活化产物进行超滤;
S33、将异硫氰酸荧光素抗体与S32超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物进行混合,于2~8℃且避光条件下反应2小时;反应结束后,加入0.26mol/L硼氢化钠溶液,于2~8℃且避光条件下反应0.5小时,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S34、在S33所得到的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,于2~8℃条件下静置0.5小时;然后进行离心,并舍弃上清液;再然后,使用0.02mol/L的PBS缓冲液溶解沉淀,即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液;
S35、在离心管中加入S34所得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体溶液,并加入甘油,然后涡旋混匀,即得到辣根过氧化物酶标记异硫氰酸荧光素抗体试剂。
6.根据权利要求1—4中任意一项所述的一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的使用方法,其特征在于:包括如下检测步骤:
S1、向反应管中加入校准品、质控品、待测样本,并向反应管中加入磁微粒试剂以及标记的鼠抗人IgE抗体试剂,搅拌混合均匀后于37℃进行反应;
S2、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S3、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S4、然后向反应管中加入酶结合物试剂,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S5、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;
S6、重复S5的清洗步骤,共计三次;
S7、向反应管中加入等体积的底物A液和底物B液,搅拌混匀后于37℃进行反应;并将反应管置于光电盘中进行读数,测定发光值;
S8、利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线,检测仪器的操作软件将发光值带入四参数公式计算出待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的浓度值。
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