CN111141908A - 乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法，属于免疫分析技术领域，在乙肝表面抗原酶联免疫吸附法试剂中，偶联酶和微孔载体的单克隆抗体采用鸡抗人单克隆IgG抗体，稀释液为生理盐水中加入葡萄球菌A蛋白，葡萄球菌A蛋白结合免疫球蛋白IgG分子中Fc段，而不与鸡抗体球蛋白结合，采用双抗体夹心法进行检测，葡萄球菌A蛋白不干扰检测试剂中的抗体，能消除血清中异常球蛋白的干扰。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法。
背景技术
乙肝病毒表面抗原是乙肝血清学5项检查中的第一项，其英文缩写是“HBsAg”，检测乙肝的抗原有许多方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、微粒子化学发光法、时间分辨免疫荧光法、微粒子酶免检测法、电化学发光法等，用不同的试剂检测，检测结果的数值各不相同，这些检测HBsAg的方法都可归为“定性”、“半定量”和“定量”三类。
乙肝病毒表面抗原测定原理为单克隆抗体（抗-HBS）吸附固相微孔载体表面，与血清中HBSAg结合，加入酶标记的抗-HBS则形成新的复合物，酶促反应对加入的底物产生颜色，酶标仪可以测出OD值，与阴阳性孔产生深浅对照判为阴性或阳性，OD值分析：P（样品）、N（空白或阴性），
P/N=待检样品OD-本底OD/阴性对照OD-本底OD
P/N≧2.1为阳性。
在检测试剂中，偶联酶和微孔载体的单克隆抗体多为羊抗人IgG抗体，在测定多发性骨髓瘤患者时，血清中免疫球蛋白IgG、IgA异常升高，或者单克隆轻链明显的升高，或在肾衰患者时，由于血液中异常蛋白的升高，造成非特异反应增强，结果干扰大，甚至与临床不符。
发明内容
本发明目的是提供一种消除血清中内源性免疫球蛋白干扰，灵敏度高，特异性强的乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法。
采用的技术方案是：在乙肝表面抗原酶联免疫吸附法试剂中，偶联酶和微孔载体的单克隆抗体采用鸡抗人单克隆IgG抗体，稀释液为生理盐水中加入葡萄球菌A蛋白，葡萄球菌A蛋白结合人免疫球蛋白IgG分子中Fc段，而不与鸡抗体球蛋白结合，葡萄球菌A蛋白不干扰检测试剂中的抗体，能消除血清异常球蛋白的干扰，采用双抗体夹心法进行检测。
具体实施方式
实施例1
试剂的制备：
一、乙肝病毒表面抗原试剂盒酶标板的制备
将鸡抗人单克隆IgG抗体用包被液稀释成1∶200倍，加入100μL包被微孔反应板的微孔，加入含1％小牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液350μL/每孔，室温封闭2小时，4℃过夜，甩尽孔内液体后，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
二、酶标抗-HBs抗体的制备
1.取10mg HRP溶于0.2 mL 25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PBS将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温(20℃左右)反应结合18h。
2.用0.15mol/L NaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
3.将5mg鸡抗人单克隆IgG抗体溶于1mL 0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。
4.加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0~9.6)，4℃，电磁搅拌下结合24h。
5.加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
6.装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
三、血清稀释液的制备
在1L 0.9%生理盐水中加入葡萄球菌A蛋白0.1mg、Proclin 300防腐剂200μL。
四、洗液的制备 磷酸盐缓冲液(0.15M pH7.4PBS)配置：0.15M KH2PO4 0.2克，Na2HPO4·12H2O 2.9克，NaC l8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL。
五、底物液的配置：终止液为2mol/L硫酸，底物液A为10%的四甲基联苯胺(TMB)、底物液B为30%的H2O2。
实施例2
检测步骤：
1.在100μL血清稀释液中加入待测标本10μL放置试管中静置10分钟。
2.取稀释后的血清标本50μL加入到酶联免疫微孔板孔中37℃孵育30分钟。
3.每孔加入酶结合物1滴，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟。
4.手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。
5.每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37℃ 孵育15分钟。
6.每孔加入终止液1滴，混匀。
7.用酶标仪读数，数值取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
在本发明中，葡萄球菌A蛋白可以结合人血清中的非特异性的免疫球蛋白，而不与检测试剂中鸡抗人单克隆IgG抗体，去除了非特异性干扰，利于乙肝表面抗原的检测，减少了干扰反应，特别是机体异常球蛋白增多的情况下，本发明在检测中具有明显优势。
Claims (4)
1.一种乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法，属于免疫分析技术领域，本发明的技术特征为：偶联酶和微孔载体的单克隆抗体采用鸡抗人单克隆IgG抗体，生理盐水中加入葡萄球菌A蛋白作为血清稀释液，葡萄球菌A蛋白结合血清中免疫球蛋白IgG分子中Fc段，而不与鸡抗体球蛋白结合，采用双抗体夹心法进行检测，葡萄球菌A蛋白不干扰检测试剂中的抗体，能消除血清异常球蛋白的干扰。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法，其特征在于试剂中偶联酶和微孔板的抗体为鸡抗人单克隆IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法，其特征在于血清稀释液为加入葡萄球菌A蛋白的生理盐水溶液，葡萄球菌A蛋白0.05～1.00mg/L，Proclin300防腐剂100～300μl，其中Proclin 300为高效防腐剂，葡萄球菌A蛋白可以结合血清中的非特异性的免疫球蛋白IgG，而不与检测试剂中鸡抗人单克隆IgG抗体，去除了非特异性免疫球蛋白干扰，利于乙肝表面抗原的检测，减少了干扰反应。
4.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原试剂盒及测定方法，其特征在于采用双抗体夹心法进行检测。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200512 |
|
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