SU1475492A3

SU1475492A3 - Способ определени поливалентного антигена

Info

Publication number: SU1475492A3
Application number: SU843830911A
Authority: SU
Inventors: Байер Манфред; Клозе Зигмар; Шлумбергер Хельмут; Клееманн Вольфганг; Паш Манфред; Фит Фридхельм
Original assignee: Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Priority date: 1984-01-02
Filing date: 1984-12-28
Publication date: 1989-04-23
Also published as: JPH0521428B2; JPS60177264A; DE3400027A1; ZA854B

Abstract

Изобретение относитс к иммунохимическому способу определени антигена в жидкой пробе. Целью изобретени вл етс повышение точности и упрощение способа. 50 нг антител первого пор дка и 170 MU МЕЧЕНОГО (FAB)₂-фрагмента этого антитела помещают на слой волокнистой массы, состо щей из полиэфирной бумаги размером 6х6 мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температуре. Далее на этот носитель помещают определ емый антиген, центрифугируют и надосадочную жидкость соедин ют с антителами второго пор дка, св занными с твердой фазой и специфичными к FC-фрагменту антител первого пор дка. После инкубировани реакционной смеси ведут определение антигена по индикаторному реактиву в иммуноферментном анализе. Точность способа возрастает за счет повышени чувствительности иммуноферментного анализа до 40 рд/мл. Упрощение достигаетс тем, что первое антитело и меченое антитело могут быть получены от одного животного.

Description

1

Изобретение относитс к иммунохи- мическому способу определени поливалентного , т0ес по меньшей мере бифункционального , лиганда (антигена) в жидкой пробе0

Цель изобретени - повышение точности и упрощение способа.

Пример 1. Определение тирео- тропина (TSH).

Рецептор 1 антитела первого пор дка и рецептор 3 (меченые Fab-фрагмен- ты антител первого пор дка) происход т из одного и того же вида животных (мыши); рецептор представл ет

собой маркированный Fab-фрагменте Рецептор 1 представл ет собой моно- клональное антитело, Fab-фрагмент в рецепторе 3 также происходит из моноклонального антитела, которое (направлено против другого детерминанта TSH, , чем моноклональное антитело рецептора 1. Рецептор 2 происходит из овцы и направлен против Fc-части моноклонального антитела

МЫШИ о

4

СЛ 4ь

СО

1C

см

Реактивы дл осуществлени способа

3147

Инкубационный буфер (IP): 15ммолъ натрийфосфатного буфера, рН 7,14, 154 ммоль NaCl, 5 ммоль EDTA, 0,2% TSA, рН 7,4.

Рецептор 1 (антитела первого пор дка ) ; анти-TSH - антисыворотка мыши (рецептор 1)„ Содержаща моно- клональные анти-Т8Н-антитела асцитна жидкость из мышей смешиваетс с коли- чеством до 1,8 М с ( Осадок раствор етс в буфере из 15 ммоль фосфата натри , рН 7,0, и 50 ммоль №аС1 и таким образом полученный раствор подвергаетс пропусканию через DEАЕ-целл кшо з у.

Рецептор 3 (меченые антитела): Анти-ТЗН-антитело (моноклональное), которое распознает другой антигенньрй детерминат, чем рецептор 1. Конъюгат пероксидазы (рецептор 3): мышина анти-ТЗН-ант сьшоротка очищаетс как рецептор 1„ Последующее получение (Fab)2 из комплектной молекулы

антитела осуществл етс аналогично. Св зывание с пероксидазой хрена0

Рецептор 2 (антитела второго пор дка ) : адсорбирующий материал с фиксированным овца-анти-мышь FcJ - антителом (рецептор 2-адсорбер). Овечь антимьшина Fc jf -антисьшоротка смешиваетс с количеством до 1,8 М с Осадок раствор ют в буфере 1 ил 15 ммоль фосфата натри , рН 7,0 и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор пропускают через DEAE-целлюлозу. Содержащую IgC-фрак- цию (рецептор 2) св зывают с адсорбентом , средства, активированным глу- таровым альдегидом Bochringer Mann- helm

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль ABTS ,2 -азино-ди(3-этилбензтиазо- линсульфонат-бУ, 3,3 ммоль пербора- та натри в 100 ммоль фосфатно-ци- тратного буфера, рН 4,4

Способ осуществл ют следующим образом

А. 50 нгс рецептора 1 и 170 пг/мл рецептора 3, растворенные в инкуба- ционном буфере, накапывают вместе на прочес (слой волокнистой массы), состо щий из полиэфирной бумаги размером 6x6 мм, толщиной 1,0 мм, и

высушивают при комнатной температу ре о Содержащее этот реактив бумажное полотно называетс реактивным носителем 1 „

L На реактивный носитель 1 нанос т пипеткой 40 мкл определ емой пробы, содержащей известное количество антигена стандартного раствора, затем прочес (слой волокнистой массы) тотчас отдел ют центрифугированием в центрифуге Eppendorf, причем реактивный носитель 1 размещаетс на Eppendorf колпачке, а элюированна жидкость в колпачке (Hiitchen) во врем центрифугировани попадает на рецептор 2, который св зан с адсорбером, и реагирует с ним. Из рецептора 2 используетс 2,5 мг адсорбированного материала на тест.

На аппаратуре со встр хиванием инкубируетс реакционна смесь в течение 15 мин при 37°С.

Спуст 15 мин реакционные сосуды вынимают из аппаратуры и центрифугируют .

Отбирают аликвотную часть надоса- дочной жидкости с помощью пипетки и определ ют образовавшийс краситель по его экстинкции при 405 нм.

С помощью двух различных TSH-проб определ ютс следующие значени экстинкции, приведенные в табл01 Таблица 1

TSH, pMn |

J405

НМ/СМ

зо , „

.,.

50 55

Значени экстинкции определ лись при толщине сло 0,2 см и пересчитывались на толщину сло 1 см„

Б0 Простой Сэндвич (сравнение).

Осуществл ют по А, но 2,5 мг адсорбера - рецептора 2 предварительно инкубируетс в течение 1 ч с 20 мкг рецептора 1 в 0,2 мл при встр хивании Затем надосадочна жидкость отсасываетс и остаток промываетс трижды по 1 мл IP.

Таким образом предварительно обработанный рецептором 1 адсорбер-рецептор 2 инкубируетс 4 ч с пробой и рецептором 3 в аппаратуре со встр хиванием при 37 С, причем в этом варианте отпадает добавка растворимого рецептора 1„

Затем надосадочна жидкость отсасываетс , остаток промываетс и фиксированна активность фермента определ етс с помощью индикаторного реактива

С помощью двух различных TSH-проб определ ютс следующие величины экс- тинкции, приведенные в табл„2.

Таблица 2

Чувствительность значительно меньше , чем согласно п.А, хот в п.Б используетс значительно больше рецептора 1, чем в По А (соотношение 1:400).

Пример 2. Определение чело- ве 1еского хориогонадотропина (HCG) .

Реактивы.

Буфер А: 100 ммоль фосфата натри рН 7,3 (37°С), 2 ммоль хлорида магни , 0,9% NaCl, 0,5% RSA (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота).

120 мкг/мп анти-HCG моноклональ- ного антитела из мыши в виде асцита (рецептор 1)„

.100 пг/мл (мл анти-НСС-антитело - (овца) - РаЪтфрагмент-р -галактозида за - конъюгат) рецептора 3.

Приготовление Fab-фрагмента осуществл етс согласно T.Kitagawa

Ковалетное св зывание |5 -галакто- зидазы с антителом, соответственно с АК-фрагментом, осуществл етс по методу R.PoPoster.

Субстратный раствор: как и буфер дополнительно содержит 5 ммоль (ONPG) орто-нитрофенилгалактозида.

Приготовление реактивного носител 1 осуществл етс аналогично приме меру 1. 40 мкл раствора А накапывают на слой волокнистой массы (прочес), состо щий из полиэфирной бумаги, и затем высушивают при комнатной температуре . Хранение сло волокнистой массы (прочеса) вплоть до его использовани осуществл етс при 4° С и относительной влажности воздуха Ј20%.

Приготовление реактивного носител 2 на целлюлозном прочесе (слое волокнистой массы) по способу активировани бромцианом фиксируетс :М - Fc У -антитело овцы (lgG-фракци ), причем на 1 г волокнистого материала дл фиксации беретс 10 мг антитела. Путем промывки удал етс несв занное антитело, и прочес (слой волокнистого материала) осторожно высушивают

15

25

30

20

при комнатной температуре. Хранение волокнистого материала (прочес) осуществл етс аналогично реактивному носителю -1 о

Определение НСС осуществл ют с помощью реактивных носителей 1 и 2 описанным в немецкой патентной за вке № 24250085 устройством,, УстройЮ ство дл осуществлени аналитических определений включает роторный вставной элемент .дл центробежных (центрифужных ) аналитических автоматов, состо щий из формованного корпуса, который имеет камеру дл ввода пробы , св занную с множеством реактив областей, содержащих пропитанный определенным реактивом всасывающий носитель, по крайней мере одну- камеру со смесительным клапаном и измерительную камеру, которые вместе образуют транспортировочный путь испытуемой жидкости (жидкости пробы), который идет радиально изнутри до, далее радиально наружу, когда вставной элемент укреплен на роторе, и далее, по крайней мере одну-две камеры дл приема жидкости, и транспортировочный путь, который ведет из этой камеры к осуществлению измерени и идентичен по меньшей мере частично транспортировочному пути испытуемой жидкости. При этом транспортировочный путь испытуемой жидкости идет от камеры дл ввода пробы (Р) через заполненную поглощающим материалом содержащую буфер камеру q. , камеру с и расположенную между камерами Q и с первую клапанную коробку

0 VKY, к второй клапанной коробке VK2 и из нее через камеру J и через приемную камеру АК в измерительную камеру К. Дл прин ти дальнейшей жидкости предусмотрена камера, вы5 полненна в виде насосной камеры, дл субстрата РК, котора через состо щее из дозировочной камеры ДК и капилл ра Кар дозировочное устройство и переливную камеру UK св зана с второй клапанной коробкой VK2,

При этом реактивный носитель 1 помещаетс в поле с вставного эле35

0

мента, а реактивный носитель 2 - в поле d о Осуществление реакции со- ответствует примеру 1„ При этом пипеткой внос т 40 мкл пробы через отверстие в верхней части кра непосредственно в поле 6 . Проба неразбавленна . Высока скорость вращени

чередуетс с состо нием поко , затем проба и субстрат движутс ъ направлении разделительной матрицы и кюветы.

Перенос пробы из пол с в с) осуществл етс в течение очень короткого времени ( 60 с)„ Ведущий в конечном счете к индикации объем субстрата составл ет также 40 мкл, так что никакого разбавлени пробы до измерени сигнала не происходит.

При применении калибровочной сыворотки получаетс калибровочна крива , котора охватывает область 0- 100 пг/мл HCG (мл) стандартизование по 1-му IRP-стандарту дл HCG, и становитс возможным достаточно чувствительное измерение HCG в сыворотке и плазме.

Пример Зо Определение альфа- 1-фетопротеина (AFP)0

Примен ют маркированный гаптеном рецептор 1, причем все три антитела происход т из одного и того же виДа животных.

Осуществление и используемый буфер соответствует примеру 2.

В качестве рецептора 1 используютс анти-АРР-антитело овцы (100 нг/мл), которые маркированы дигоксином (согласно патенту ФРГ № 2537129), в ка- честве рецептора 3 используютс анти-AFP - антитела овцы, маркированные р -галактозидазой согласно примеру 2, и в качестве твердофазно св занного рецептора 2 примен ютс бумажные диски из полиэфирной бумаги , с которыми адсорбционно св зы- i вают антитела против дигоксина овцы„ Способ нанесени покрыти соответствует известному дл пластиковых трубочек способу0

Пример 4о Определение тире- отропина (TSH)0 Реактивы.

Инкубационный буфер (IP): 15 ммоль натрийфосфатного буфера, рН 7,4, 154 ммоль NaCl, 5 ммоль ЕДТА, 0,2% PSA, рН 7,4о

Рецептор 1: овечь анти-TSH - ан- тисыворотка0 Неочищенна .сыворотка смешиваетс с количеством до 1,8 М с NH4S04о Осадок раствор етс в буфере из 15 ммоль фосфата натри , рН 7,0, и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор подвергаетс пропусканию через ДЕАЕ-целлюлозу. Содержаща IgG-фракци затем освобождаетс от реагирующих с альфа-цепью TSH0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

частей путем пропускани через нагруженный HCG иммуноадсорбер. Элюат подаетс на нагруженный TSH иммуноад- сорбер. После промывки адсорбера происходит элюирование иммунореактивных против TSH антител с помощью 1 М про- пионовой кислоты,, Элюат затем диализу- етс по отношению к IP, при известных услови х концентрируютс путем ультрафильтрации0

Рецептор 3: конъюгат антитела - пероксидаза0 Дальнейша овечь анти- TSH - антисьюоротка очищаетс как рецептор 1 и затем из нее получают (Fab)2-фрагменты„ Приготовление (Fab)2-фрагментов осуществл етс согласно EoZamoye0

Рецептор 2. Материал адсорбера с фиксированным ослиным-антиовечьим FcJ - антителом,, Ослина -антиовечь Fcjf -антисыворотка смешиваетс в ко- личестве до 1,8 М с Осадок раствор ют в буфере из 15 ммоль фосфата натри , рН 7,0, и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор пропускают через ДЕАЕ-цедлюлозу0 Содержащую IgG-фракцию (рецептор 2) соедин ют с адсорбентом средства, активированным глутаровым альдегидом Boeqringer Мдцпйехга (определение jp 665525) по рабочей инструкции изготовител .

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль ABTS Ј2,2 азино ди(3-этилбензтиазо- линсульфонат-бУ, 3,3 ммоль пербора- та натри в 100 ммоль фосфат-цитрат- ного буфера, рН 4,4.

Способ осуществл ют аналогично примеру 1, причем в этом случае ЮОнг рецептора 1 и 100 пг/мл рецептора 3, растворенные в инкубационном буфере (40 мкл), накапывают на целлюлозный прочес (слой волокнистой массы) размером 6x6 мм. После высушивани хранение прочеса вплоть до применени его снова осуществл ют при 4°С„

Дальнейшее осуществление соответствует примеру 1 о В качестве пробы используетс 40 мкл.

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет точнее определ ть антигены , содержащиес в малых количествах (40 пг/мл). Кроме того, достигаетс упрощение способа, так как не требуетс получать первый и третий рецепторы из двух различных видов животных

9147549210

Claims

Формула изобретени конкурентным методом по активности

Способ определени поливалентногометки, отличающийс тем,

антигена, включающий добавление егочто, с целью повышени точности и

к специфическим моноклональным анти-упрощени способа, перед добавлением

телам или фрагментам антител первогоантигена специфические антитела пер-

пор дка, антителам второго пор дка,вого пор дка и меченые Fab-фрагменты

св занных с твердой фазой и специфич-этих антител нанос т на твердую фазу,

ных к FC-фрагментам антител первоговысушивают, далее после добавлени

пор дка, к Fab-фрагментам антителюантигена смесь центрифугируют и надпервого пор дка, маркированных меткой,осадочную жидкость соедин ют с анти-

с последующим определением антигенателами второго пор дка.