DK165860B

DK165860B - Fremgangsmaade til bestemmelse af et polyvalent antigen samt et reagens dertil

Info

Publication number: DK165860B
Application number: DK002085A
Authority: DK
Inventors: Manfred Baier; Sigmar Klose; Helmut Schlumberger; Wolfgang Kleemann; Manfred Pasch; Friedhelm Vieth
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-01-02
Filing date: 1985-01-02
Publication date: 1993-01-25
Also published as: DK2085A; DK2085D0; AU3724785A; ES8601479A1; DK165860C; AU567998B2; IL73938A; DE3485265D1; EP0147848A2; IL73938A0; EP0147848A3; IE58254B1; IE850007L; ES539297A0; EP0147848B1; CA1244761A

Description

. i

DK 165860B

Opfindelsen angår en immunokemisk fremgangsmåde til bestemmelse af en polyvalent, dvs. mindst bifunktionel ligand (antigen) i en flydende prøve og et reagens til brug ved denne fremgangsmåde. !

Den følsomme bestemmelse af polyvalente antigener (peptider 5 og proteiner) under anvendelse af to antistoffer, der er rettet mod forskellige antigendeterminanter, kendes som immuno-radiometisk eller immunoenzymometrisk 2-site assay, f.eks. fra J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18 (1980), 197-208. Sædvan- e ' ligvis gennemføres denne kendte bestemmelsesfremgangsmade ! 10 ved, at det antigen, der skal bestemmes, først inkuberes med et første antistof, der foreligger i fast fase ved binding til et egnet bærermateriale, såsom sepharose, agarose, små plastrør eller lignende. Under denne første inkubation binder det første antistof, der sædvanligvis skal foreligge i stort 15 overskud, med en antigendeterminant på det antigen, der skal . bestemmes. Derpå adskilles prøvevæsken sædvanligvis fra den faste fase for at udelukke forstyrrelser forårsaget af ikke-specifikke stoffer, såsom humanserumprotein, eller af krydsreagerende antigener i den efterfølgende anden inkubation. | 20 Derefter inkuberes en bestemt mængde af et andet, markeret antistof i flydende fase med den faste fase. Specificiteten af det andet antistof vælges her fortrinsvis således, at det er rettet mod en anden determinant på det antigen, der skal bestemmes, end det første antistof for at udelukke en kon-25 kurrence mellem antistofferne om de samme bindingssteder for det antigen, der skal bestemmes, da forsøgsfølsomheden derved ville blive påvirket.

Under denne anden inkubation reagerer det markerede andet antistof, der ligeledes sædvanligvis foreligger i overskud, 30 med samtlige bindingssteder på molekylerne af det antigen, der skal bestemmes. Efter den anden inkubation kan markeringsstoffets aktivitet enten måles i den faste fase eller i su-pernatanten. Sædvanligvis foregår målingen i den faste fase efter udvaskning af den flydende fase. I det gunstigste til- 2

DK 165860 B

fælde forholder den bestemte aktivitet sig herved næsten proportionalt med mængden af det antigen, der skal bestemmes.

Denne 2-trins-sandwich-fremgangsmåde har den fordel, at eventuelt krydsreagerende antigener allerede fjernes ved den før-5 ste faseadskillelse. Dette er af særlig betydning i testsystemer, hvori begge antistoffer på grund af følsomhedskravene må besidde virkeligt forskellig specificitet. I dette tilfælde er der kun det strenge krav til specificiteten for ét af de to antistoffer, idet det andet så ikke behøver at være 10 absolut specifikt overfor krydsreagerende antigener.

Denne fremgangsmåde har imidlertid tre væsentlige ulemper.

1. I det første inkubationstrin foreligger den ene reaktant i fast fase og den anden i opløsning. Hastighedskonstanten for reaktionen er dermed mindre, end hvis reaktionsdelta-15 gerne (antigen og første antistof) befandt sig i opløsning.

Der må imidlertid inkuberes i så lang tid, at alle antigenmolekyler foreligger bundet til den faste fase, eftersom ikke bundet antigen ville blive fjernet ved faseadskillelsen og dermed ville få en forfalskning af resultaterne 20 til følge.

2. Bindingen af et antistof, der kan binde specifikt til antigenet, til en fast fase kræver på grund af de ringe bindingsudbytter relativt store mængder af det første antistof, der for det meste er et meget kostbart stof, især 25 når antiserumet af specificitetsgrunde må udvindes fra smådyr, såsom kaniner, marsvin og lignende. Derudover kan der ved bindingsreaktionen til den faste fase opstå affinitetsforringelser for antistoffet, hvilket påvirker følsomheden uheldigt.

30 3. Udvindingen af to antistoffer med forskellig specifici tet over for det samme antigen er i reglen kostbart og i mange tilfælde kun i begrænset omfang muligt, f.eks. ved at man immuniserer to forskellige dyrearter, eller ved 3

DK 165860B

at man forsøger at skille antistofpopulationen fra et dyr ved immunoadsorption af det antigen, der skal bestemmes, i egnede fragmenter.

Der kendes allerede forskellige forsøg, der afhjælper de oven-5 stående mangler. Således gennemføres ifølge US-PS nr. 4.098.876 den første inkubation af antigenet med isotopmarkeret,opløst antistof. Først derefter tilføres de til den faste fase bundne antistoffer, hvorpå den anden inkubation foretages. Her er det kun nødvendigt med én faseadskillelse, hvilket resul-10 terer i en vis forøgelse af følsomheden og gennemførligheden. Specificitetsproblemet forbliver imidlertid uløst, eftersom begge antistofferne skal være stærkt specifikt rettet mod antigenet, da den tilsyneladende koncentration af det antigen, der skal bestemmes, ellers i nærværelse af større mæng-15 der krydsreagerende antigener forøges ved en eventuel uspecificitet af det andet antistof,og reduceres ved uspecifi- | citet af det første antistof.

I DE-OS 29 25 565 beskrives en fremgangsmåde, ved hvilken det i fast fase foreliggende første antistof og det marke-20 rede opløste andet antistof inkuberes samtidig med antige net. Her er de samme problemer som i den førnævnte fremgangsmåde. Desuden forbliver også de ovenfor for basisfremgangsmåden beskrevne ulemper 2 og 3 uløste.

Fra den offentliggjorte japanske patentansøgning nr. 123.802 25 kendes endelig en fremgangsmåde, ved hvilken der anvendes et fastfase-antistof, der er rettet specifikt mod det andet antistof, hvilket andet antistof kan binde til det antigen, der skal måles. Her undgås bindingen af et mod antigenet rettet antistof til den faste fase. Følsomheden reduceres imid-30 lertid, da der kun anvendes et enkelt antistof, der kan binde specifikt til antigenet. Koncentrationspåvisningen af det antigen, der skal bestemmes, foregår via den kompetitive reak- 4

DK 165860 B

tion mellem antigenet og en bestemt mængde isotopmarkeret antigen med det specifikke antistof.

Fra EU-A 105 714 kendes en fremgangsmåde, ved hvilken et fast-fase-antistof sammen med to yderligere antistoffer, hvoraf 5 mindst det ene skal være et monoklont antistof, anvendes til antigen-bestemmelse efter sandwich-princippet. Derved inkuberes antigenet først med begge de i flydende fase foreliggende antistoffer, og derefter med fastfase-antistoffet. Fremgangsmåden har den ulempe, at den kræver to inkubationstrin, 10 hvilket hindrer automatisering, fører til lange inkubationstider og ikke tillader anvendelsen af ufortyndede prøver.

En lignende fremgangsmåde kendes fra Clin. Chem. 27/6 (1981) 823-827. Dér beskrives en radiometrisk bestemmelsesmetode for kreatinkinase MB-isoenzym, ved hvilken antigenet i et 15 første inkubationstrin samtidigt omsættes med et umarkeret og med et markeret antistof med forskellig specificitet og fra forskellige dyrearter. I det andet trin tilsættes derefter et i fast fase foreliggende antistof med specificitet mod det umarkerede antistof fra det første inkubationstrin.

20 Ulempen ved denne fremgangsmåde består igen i, at det er nødvendigt med to forskellige for antigenet specifikke antistoffer og med tre forskellige dyrearter.

Formålet med opfindelsen er derfor bedre at undgå en eller flere af de ovenfor skildrede ulemper ved basisfremgangsmå-25 den end de hidtil kendte fremgangsmåder. Især skal der tilvejebringes en sådan fremgangsmåde, som kun kræver én inkubation, hvor der ikke skal anvendes antistoffer i flydende fase, som egner sig til automatisering, og som udviser en stor følsomhed og nøjagtighed. Yderligere skal det ved fremgangsmå-30 den være muligt eventuelt at klare sig med en enkelt dyreart til udvindingen af de nødvendige antistoffer eller til antiserumudvindingen at kunne anvende store dyr.

5

DK 165860B

Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er en fremgangsmåde til bestemmelse af et polyvalent antigen ved inkubation med tre forskellige receptorer, hvoraf den første og den tredje foreligger opløst i flydende fase og kan binde til antigenet, den anden receptor ^ foreligger i fast fase og kun kan binde til den del af den første receptor, der ikke kan binde til antigenet, og den tredje receptor bærer en markering og ikke krydsreagerer med den første og den anden receptor, adskillelse af den faste fra den flydende fase og måling af markeringen i en af faserne, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer en opløsning indeholdende antigenet sammen med et første fast bærermateriale, der er imprægneret med den første og den tredje receptor i opløselig form, og efter løsnelse af receptorerne straks bringer den opnåede opløsning i kon-^ takt med et andet fast bærermateriale, der indeholder den anden receptor i uopløselig form, derpå skiller væsken fra det andet faste bærermateriale og måler markeringen.

Som receptorer anvendes inden for opfindelsens rammer enten komplette antistoffer (polyklone eller monoklone), der kan 20 binde specifikt, antistoffragmenter deraf eller konjugater af antistoffer eller antistoffragmenter med haptener eller antigener. Fortrinsvis anvendes som første receptor et komplet antistof eller et med en hapten eller et antigen forbundet eller markeret antistof eller antistoffragment, idet 25 et monoklont antistof særligt foretrækkes.

Som anden receptor anvendes et antistof, der kun kan binde til en del af den første receptor, og særligt foretrukket er et antistof, der kun kan binde til den første receptors Fc-del. Alternativt kan der også som anden receptor anven-30 des et antistof, der kun kan binde specifikt med haptendelen eller antigendelen af den første receptor. Den anden receptor kan også være rettet generelt mod Fc-delen af immunoglobulin.

6

DK 165860 B

Den tredje receptor, der ikke må krydsreagere med den anden receptor, kan være et markeret antistof, der kan binde til antigenet, og som udvindes af en anden dyreart end den første receptor.

5 Fortrinsvis anvendes imidlertid en tredje receptor, der er et markeret Fab-fragment. Ved Fab-fragment forstås inden for opfindelsens rammer også (Fab)2~ og Fab'-fragmenter. I dette tilfælde kan receptor 3 udvindes af den samme dyreart som den første receptors antistof-bestanddel. Dette gælder også, 10 når den første receptor består af et antistof, der bærer en hapten eller et antigen, og den anden receptor kun kan binde til denne hapten eller dette antigen. Særligt foretrukket er den tredje receptor en del, især et Fab-fragment, af den første receptor. Alternativt kan der også som tredje receptor 15 anvendes et antistof, der stammer fra den samme dyreart som den anden receptor. Begge alternativer har den fordel, at der kun behøves to dyrearter til de tre receptorer. Når den anden receptor kun kan binde til den første receptors hapten eller antigen, er det endda kun nødvendigt med én dyreart 20 til alle tre receptorer. Særligt foretrukket indeholder den tredje og den første receptor monoklone antistoffer eller fragmenter deraf, der er rettet mod forskellige og/eller repetitive determinanter på antigenet.

Den tredje receptor anvendes fortrinsvis i en mængde, der 25 er større end mængden af det antigen, der skal påvises. X dette tilfælde, altså ved overskud, er det ikke nødvendigt med en eksakt dosering eller en nøjagtig kendt mængde. Den tredje receptor er markeret på en for fagfolk kendt måde. Fortrinsvis foregår markeringen ved kobling med et enzym eller 30 med et fluorescerende, kemiluminiscerende eller radioaktivt stof. Fremgangsmåder til markering af den slags receptorer er kendte for fagfolk, f.eks. fra "Clin. Chim. Acta" 81 (1977) 1-40, og behøver her ingen yderligere belysning.

7

DK 165860B

Den første og den tredje receptor anbringes i opløst form på et egnet bærermateriale, f.eks. på sugedygtigt papir, og overføres ved tørring eller lyofilisering i en let derfra løsnelig form.

5 Bindingen af den i fast fase foreliggende anden receptor til et uopløseligt bærermateriale kan foretages efter sædvanlige, for fagfolk, kendte metoder til fiksering af biologisk aktive proteiner til faste bærerstoffer. Såvel en covalent som en adsorptiv binding er egnet. Fortrinsvis anvendes imidlertid 10 på grund af det herved opnåelige højere udbytte og den for- ; enklede arbejdsmetode en udelukkende adsorptiv binding, f.eks. til et plastmateriale eller et andet underlag, f.eks. papir.

Som egnede viste sig f.eks. små reagensglas af polystyren og lignende plastarter, der er coatede adsorptivt på indersiden 15 med den anden receptor. Inkubationen gennemføres derefter i disse rør eller i på anden måde udformede beholdere, og til faseadskillelsen er det tilstrækkeligt at fjerne den flydende fase fra rørene, f.eks. ved udsugning, udrystning eller lignende. Efter vask af rørene kan målingen af markeringen 20 så foretages direkte deri, især når markeringen er foregået med et enzym. Det er så tilstrækkeligt ganske enkelt at måle aktiviteten af markeringsenzymet, f.eks. peroxidase eller Bgalactosidase, på den hertil almindeligt kendte måde, idet man tilsætter et kendt påvisningsreagens for dette markerings-25 enzym, f.eks. et farvereagens, og enten måler i nærvær af den faste fase eller efter adskillelse. Den målte enzymaktivitet er så et mål for mængden af det polyfunktionelle antigen, der skal bestemmes. Som fastfase-bærer for den anden receptor kommer imidlertid også partikelformede stoffer, f.eks.

30 ionbyttere, molekylarsigtematerialer, glaslegemer, plastslanger og lignende i betragtning. Som bærer for den anden receptor foretrækkes især en porøs, lagdelt bærer, såsom papir.

Såfremt markeringen ikke foregår med et enzym, men med et radioaktivt' stof, en isotop, et fluorescerende eller et kemi- 8

DK 165860B

luminiscerende stof, så foretages også her bestemmelsen efter for fagfolk velkendte metoder. En beskrivelse af disse målemetoder er derfor overflødig her.

Til gennemførelse af fremgangsmåden sættes prøveopløsningen, 5 der ifølge et særligt fordelagtigt træk ved opfindelsen endda kan anvendes i ufortyndet form, f.eks. som blod, plasma eller serum, sammen med det første bærermateriale i tilstrækkelig lang tid til at løsne begge receptorer, fraskilles derefter og inkuberes med det andet bærermateriale. Kontaktti-10 den med det første bærermateriale ligger sædvanligvis mellem ca. 10 sek. og 10 min. Fordelagtigt gennemføres fremgangsmåden herved på en anordning, der er beskrevet i DE-A 34 25 008.

Det har nu overraskende vist sig, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås en betydeligt større følsomhed end 15 ved den sædvanlige 2-trins-sandwich-metode og 1-trins-sand-wich-metode.

Anvendes der ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen en mod den første receptors Fc-del eller mod haptenen eller antigenet, der er koblet til den første receptor, 20 rettet anden receptor, så kan der herved opnås en yderligere stigning i følsomheden, da en eventuel sterisk hindring af bindingsreaktionen mellem antigenet og den første receptors bindingssted undgås. Dette er en særlig fordel, når der skal bestemmes antigener med særligt ringe koncentration, som det 25 f.eks. er tilfældet ved bestemmelsen af thyreotropin i serum.

Opfindelsen angår yderligere et tørreagens til bestemmelse af et polyvalent antigen, hvilket reagens er ejendommeligt ved a) et første fast bærermateriale, der er imprægneret eller 30 lyofiliseret med to forskellige opløselige receptorer 1 9

DK 165860 B

og 3, der kan binde til antigenet, hvor receptor 3 bærer en markering, og b) et andet fast baerermateriale, der indeholder en uopløselig anden receptor, som kun kan binde til en del af den 5 ikke-markerede, opløselige første receptor og foreligger fysisk adskilt fra det første bærermateriale, med det forbehold, at den markerede, tredje receptor er et Fab-fragment.

Den fysiske adskillelse kan f.eks. foregå ved, at den uop-10 løselige anden receptor og de opløselige første og tredje receptorer anbringes på adskilte bærermaterialer. Dette kan opnås ved, at receptor 1 og receptor 3 samtidig eller efter hinanden bindes i eller på en egnet bærer (f.eks. plastrør eller sugedygtige bærere, såsom papir eller lignende) ved 15 lyofilisering eller imprægnering, og receptor 2 bindes ad- sorptivt eller covalent til en egnet bærer (f.eks. plastrør, papir eller partikler). Prøven med det polyvalente antigen, der skal bestemmes, bringes først i kontakt med bærer 1, der indeholder den opløselige første og tredje receptor og der-20 efter med bærer 2, hvortil den uopløselige receptor 2 er fik-seret. Alternativt kan den første og den tredje receptor på den ene side og den anden receptor på den anden side foreligge på med hinanden forbundne bærere, der f.eks. består af en papirstrimmel, der indeholder receptorerne på forskellige, 25 fra hinanden adskilte steder.

Ifølge en første foretrukken udførelsesform er et reagens ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det indeholder en første receptor, der er et antistof, og en tredje receptor, der er et enzymmarkeret Fab-fragment af et antistof. Fortrins-30 vis indeholder det også puffer og et system til bestemmelse af enzymmarkeringen.

10

DK 165860 B

Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at receptorerne 1 og 2 er monoklone og er rettet mod forskellige af antigenets determinanter og stammer fra samme dyreart.

5 Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at den anden receptor er et antistof mod den første receptors Fc-del, og at den tredje receptor stammer fra den samme dyreart som den anden receptor, hvorimod den første receptor stammer fra en 10 anden dyreart.

Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at alle tre receptorer indeholder antistoffer fra den samme dyreart, at den første receptor er et haptenmarkeret, monoklont antistof, 15 og at den anden receptor er rettet mod den første receptors hapten.

Receptorerne 1 og 3 fra reagenset ifølge opfindelsen foreligger imprægneret eller lyofiliseret på et fast bærermateriale.

20 Opfindelsen egner sig til bestemmelse af alle slags antigener med mindst to antigen-determinanter. Eksempler herpå er thyreotropin (TSH), α-1-fetoprotein (AFT), hCG, carbinoembryo-nalt antigen, luteiniserende hormon (LH), follikelstimulerende hormon (FSH), ^“roi^roglobulin, sur prostataphospha-25 tase, prolactin, ferritin og insulin.

Ved opfindelsen kan receptor 1 reagere homogent med antigenet. Denne reaktion har som følge deraf en højere hastighedskonstant end ved anvendelse af en fastfase-bundet, uopløselig første receptor. Eftersom antistoftabene ved fikseringen 30 (uopløselighedsgøreisen) til den faste fase undgås, kan mængden af den første receptor formindskes yderligere.

DK 165860 B i 11

Det er heller ikke, i modsætning til den i Clin. Chem. 27/6 (1981) beskrevne fremgangsmåde, nødvendigt at udvinde den første og den tredje receptor fra to forskellige dyrearter, der desuden skal vælges således, at receptor 2 kun reagerer 5 med receptor 1, men ikke med receptor 3.

Udvindingen af antistoffet til receptor 1 og til receptor 3 fra samme dyreart muliggør endelig også anvendelse af store dyr til antiserum-udvindingen.

Endelig forøges ifølge opfindelsen også følsomheden. Såle-10 des blev der for TSH fundet en følsomhed på mindre end 40 pg/ml (1 μϋ - 170 pg/ml), mens den ved 2 site-assay (sandwich-fremgangsmåden) ligger over 100 pg/ml.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere i forbindelse med tegningen. Her forestiller: 15 fig. 1 en kalibreringskurve ifølge eksempel 2, fig. 2 en kalibreringskurve ifølge eksempel 3, fig. 3 en kalibreringskurve ifølge eksempel 4, og fig. 4 et anvendelseselement til en centrifugalanalyseautomat, der anvendes ifølge eksempel 2.

20 Eksempel 1

Bestemmelse af thyreotropin (TSH)

Receptor 1 og 3 stammer fra samme dyreart (mus), og receptor 3 er et markeret Fab-fragment. Receptor 1 er et monoklont antistof, og Fab-fragmentet i receptor 3 stammer ligeledes 25 fra et monoklont antistof, der er rettet mod en anden determinant på TSH end det monoklone antistof fra receptor 1. Re- 12

DK 165860 B

ceptor 2 stammer fra får og er rettet mod det monoklone museantistofs Fc-del.

Udviklingen af monoklone antistoffer foregår efter Kohier og Milsteins metode, Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976).

5 a) Forsøqsgennemførelse ifølge opfindelsen Reagenser: 1. Inkubationspuffer (IP): 15 mM natriumphosphatpuffer, pH-værdi 7,4, 154 mM NaCl, 10 5 mM EDTA, 0,2% RSA (okseserumalbumin), pH-værdi 7,4.

2. Receptor 1:

Muse-anti-TSH-antiserum (receptor 1):

Museascitesvæsken indeholdende monoklone anti-TSH-antistof-fer blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet opta-15 ges i en puffer omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose.

3. Receptor 3:

Anti-TSH-antistoffer (monoklone), dér genkender en anden 20 antigen-determinant end receptor 1, - peroxidasekonjugat (receptor 3): muse-anti-TSH-antiserum oprenses som receptor 1. Den efterfølgende udvinding af (Fab^ fra det komplette antistofmolekyle foregår efter den i eksempel 2 angivne metode. Koblingen med 25 peberrodsperoxidase foregår efter Nakanes metode (M.B.

Wilson, P.K. Nakane "Recent Developments in the Periodate Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Elsevier, North Holland Biomedical Press, side 215-224 i "Immunofluorescence and Related 30 Staining Techniques").

DK 165860B

13 4. Receptor 2:

Adsorbermateriale med fikseret fåre-anti-muse-Fcv- antistof (receptor 2-adsorber): Fåre-anti-museFcY-antiserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer 5 omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mM

NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose. Den IgGholdige fraktion (receptor 2) kobles med "affinitetsadsorptionsmidlet, aktiveret med glutardialdehyd" fra Boehringer Mannheim (Best. nr. 665.525) 10 efter fabrikantens arbejdsforskrift.

5. Indikatorreagens: 1,8 mM "ABTS"® (2,2'-azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfo-nat(6)]), 3,3 mM natriumperborat i 100 mM phosphatcitrat-puffer, pH-værdi 4,!4.

15 Gennemførelse: 50 ng receptor 1 og 170 mU receptor 3 opløses sammen i inkubationspufferen og pådryppes et underlag bestående af kommercielt polyesterpapir med størrelse 6x6 mm, tykkelse 1,0 mm og tørres ved stuetemperatur. Dette reagensholdige 20 papirunderlag benævnes reagensbærer 1.

På reagensbærer 1 pipetteres henholdsvis 40 μΐ af den prøve, der skal bestemmes, eller en standardopløsning indeholdende kendte mængder antigen, hvorpå underlaget straks fracentrifugeres i en Eppendorf-centrifuge, hvorved reagens-25 bærer 1 placeres på en Eppendorf-hætte, og den eluerede væske i hætten under centrifugeringen rammer receptor 2, der er koblet til adsorberen og reagerer med denne. Der anvendes 2,5 mg adsorbermateriale pr. forsøg af receptor 2.

30 Reaktionsblandingen inkuberes i 15 min. ved 37°C på et rysteapparatur.

14

DK 165860 B

Efter præcis 15 min. udtages reaktionsbeholderne fra apparaturet og centrifugeres.·

En prøve af supérnatanten udtages med en pipette, og det dannede farvestof bestemmes ved en ekstinktion ved 405 5 nm.

Med to forskellige TSH-prøver fastlagdes følgende ekstinktionsværdier : TSH E405 nm/cm* (μϋ/ml) 10 0 0,74 I_50_ 7,54 * Ekstinktionsværdierne fastlagdes ved 0,2 cm lagtykkelse og omregnedes til 1 cm lagtykkelse.

b) Enkelt sandwich (sammenligning): 15 Gennemførelsen foregår med de samme reagenser og på sam- måde som beskrevet under a), men med følgende ændringer: 1. 2,5 mg adsorber-receptor 2 forinkuberes i 1 time med 20 μς receptor 1 i 0,2 ml under omrystning. Derefter fra-suges supernatanten, og resten vaskes tre gange med hver 20 gang 1 ml IP.

2. Den på denne måde med receptor 1 forbehandlede adsorber-receptor 2 inkuberes i 4 timer med prøve og receptor 3 på et rysteapparat ved 37°C, idet tilsætningen af opløselig receptor 1 bortfalder i denne variant.

25 Derefter frasuges supernatanten som sædvanlig, resten va skes med vand, og den fikserede enzymaktivitet eftervises med indikatorreagens.

15

DK 165860B

Med to forskellige TSH-prøver fastlagdes følgende ekstinktionsværdier: TSH E405 nm/cm* (μϋ/ml) 5 0 0,20 50 2,87 * Ekstinktionsværdien fastlagdes ved 0,2 cm lagtykkelse og blev omregnet til 1 cm lagtykkelse.

Følsomheden er betydeligt lavere end i a), selvom der i 10 b) anvendes betydeligt mere receptor 1 end i a) (forhold 1:400).

Eksempel 2

Bestemmelse af human choriogonadotropin (HCG)

Reagenser: 15 Puffer A: 100 mmol natriumphosphat, pH-værdi 7,3 (37°C) 2 mmol magnesiumchlorid 0,9% NaCl 0,5% RSA (okseserumalbumin) 120 Mg/ml anti-HCG-monoklone antistoffer fra mus 20 (som ascites) (receptor 1) 100 mU/ml anti-HCG-antistof-(f åre)-Fab-f ragment-j3-galactosidase-konjugat.

(Receptor 3)

Fremstillingen af Fab-fragmentet foregår efter 25 T. Kitagawa i "Enzyme Immunoassay E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai eds. Igaku-Shoin, Tokyo/New York 1981, side 81-89". Den covalente kobling af /3-galac-tpsidase til antistoffer eller AK-fragmenter foregår efter metoden fra: R.R. Porter, Biochem. J.

30 73 (1959), 119.

16

DK 165860 B

Substratopløsning: som puffer A og desuden 5 mmol (ONPG) ortho-nitrophenyl-galactosid.

1. Fremstillingen af reagensbærer 1 foregår analogt med 5 eksempel 1 på den måde, at der fra opløsning A pådryp- pes 40 μΐ på et underlag bestående af kommercielt polyesterpapir, der efterfølgende tørres ved stuetemperatur. Lagringen af underlagene indtil anvendelsen foregår ved 4°C og en relativ luftfugtighed på < 20%.

10 2. Fremstilling af reagensbærer 2: På et arkformet cel luloseunderlag fikseres <M-FcY>-antistoffer fra får (IgG-fraktion) efter bromcyan-aktiveringsfremgangsmåden (DE-OS 17 68 512) hvorved der pr. g fibermateriale anvendes 10 mg antistoffer til fiksering. Ved vaskning 15 fjernes ukoblede antistoffer, og underlaget tørres skån somt ved stuetemperatur. -Lagringen af underlagene foregår analogt med reagensbærer 1.

Bestemmelsen af HCG ved hjælp af disse to reagensbærere 1 og 2 foregår ved hjælp af den i tysk patentansøgning 20 nr. 2425008.5 beskrevne anordning til gennemførelse af analytiske bestemmelser. Heri beskrives et rotorindsætningselement til centrifugalanalyseautomater bestående af et formlegeme, som har et prøvepåfyldningskammer, der står i forbindelse med flere reagensfelter, hvilke felter 25 indeholder et med et bestemt reagens imprægneret sugedygtigt bærermateriale, mindst ét blandeventilkammer og ét målekammer, der sammen danner en prøvevæsketransportvej, som fører radialt indefra længere radialt udad, når indsætningselementet er fastgjort på rotoren, og desuden har mindst 30 ét yderligere kammer til optagelse af en væske, og en trans portvej, der fra dette kammer fører til målestedet, og som mindst delvis er identisk med prøvevæsketransportvejen. Derved fører prøvevæsketransportvejen fra et prøvepåfyldningskammer (P) over et med sugedygtigt materiale fyldt, 17

DK 165860 B

pufferholdigt kaminer (a), et kammer (c) og et mellem kamrene (a) og (c) anbragt første ventilkammer (VKl) til et andet ventilkammer (VK2) og fra dette via kammeret (d) og via et opfangningskammer (AK) til målekammeret (K).

5 Til optagelse af en yderligere væske tilvejebringes et som pumpekammer udviklet substratkammer (PK), der over en af et doseringskammer (DK) og kapillarer (Kap) bestående doseringsanordning og et overløbskammer (UK) er forbundet med det andet ventilkammer (VK2). Fig. 4 viser skematisk 10 det anvendte rotorindsætningselement. Ved dette apparat placeres reagensbærer 1 på felt c i indsætningselementet og reagensbærer 2 på felt d. Reaktionsføringen svarer i det væsentlige til den fra eksempel 1 fra ovennævnte patentansøgning. 40 μΐ prøve pipetteres gennem en åbning 15 ved den øverste kant direkte på feltet a. Prøven er ufor- tyndet.

Ved hjælp af et egnet program, hvor der veksles mellem høje omdrejningstal og stilstand, føres prøve og substrat derefter i retning af adskillelsesmatrixen og kuvetten.

20 I det følgende angiver centrifugering høje omdrejningstal, mens de derimellem indskudte trin med lavere omdrejningstal tjener til den følsomme styring af væsketransporten. Sub-strat/væskeopløsningen opdeles ved hjælp af doseringskapillarerne (DK) i lige store dele (portioner).

25 1. Centrifugering Prøve og prøvepuffer centrifugeres i VKl, og den første portion er i doseringskammeret DK.

1. Stilstand Prøve løber til felt c og løsner recep torerne 1 og 3. Den første portion sub-30 stratopløsning går ind i overløbskammeret UK. .

2. Centrifugering HCG og receptorerne 1 og 3 når til VK2, og der centrifugeres for at opnå en homogen blanding af reagenserne. Den 18

DK 165860 B

første portion substratopløsning tilbage· holdes i U K, og den anden portion substratopløsning går til doseringskammeret DK.

5 2. Stilstand Hvad angår prøven transporteres væsken til felt d, og der følger en stilstand på 5 min., i hvilket tidsrum komplekset binder til bæreren. Den binder også ikke 'i kompleks indeholdt anti-HCG.

10 Ved reaktionens afslutning befinder der sig stadig ikke i et kompleks indeholdt Fab-konjugat ubundet i opløsningen. Den anden portion substratopløsning går i UK.

15 3. Centrifugering Den fra prøvekanalen kommende væske centrifugeres i opfangningskammeret (AK) og med denne væske overskuddet af Fab-konjugat.

Den anden substratportion holdes i UK.

20 Den tredje substratportion befinder sig i doseringskammeret DK.

3. Stilstand Den tredje substratportion føres til UK.

4. Centrifugering Portion 4 til DK

Portion 3 til VK2.

25 4. Stilstand Portion 4 til UK.

Portion 3 til felt d.

Den første vaskeportion befinder sig på reagensbærer 2.

19

DK 165860 B

5. Centrifugering Portion 5 til DK.

Portion 4 til VK2

Portion 3 til AK.

5. Stilstand Portion 5 til UK.

5 Portion 4 til d

Anden vaskeportion på reagensbærer 2.

6. Centrifugering Portion 6 til DK

Portion 5 til VK2.

Portion 4 til AK.

XO 6. Stilstand Portion 6 til UK.

Portion 5 til d.

Tredje vaskeportion på reagensbærer 2.

7. Centrifugering Portion 7 til DK.

Portion 6 til VK2.

15 Portion 5 til AK.

7. Stilstand Portion 7 til UK..

Portion 6 til d.

Fjerde vaskeportion på reagensbærer 2.

8. Centrifugering Portion 8 til DK.

20 Portion 7 til VK2.

Portion 6 til AK.

8. Stilstand Portion 8 til UK.

Portion 7 til d.

25 Påvisningsportion på reagensbærer 2.

I løbet af 5 min. spaltes substratet af det på reagensbærer 2 bundne enzym, dvs. en enzymmængde, der ved kompleksdannelsen er proportional med den tilsatte mængde 30 HCG, og der danner sig en farve, der kan måles.

DK 165860B

20 9. Centrifugering Den fra reagensbærer 2 kommende væske fylder med en første aliquot AK fuldstændigt, og resten føres til kuvetten. I kuvetten foregår målingen af den dannede farve ved 5 578 nm.

Overførslen af prøven fra felt c til d foregår i løbet af meget kort tid 60 sek.). Det substratvolumen, der til sidst foreligger til påvisning, er ligeledes på 40 μΐ, således at lo der ikke på nogen måde foregår en prøvefortynding før signalmålingen.

Under anvendelse af serum til kalibrering opnås kalibreringskurven på fig. 1, der omfatter intervallet fra 0-100 mU HCG/ml (standardiseret efter første IRP-standard for HCG) og mulig-15 gør en tilstrækkelig følsom måling af HCG i serum og plasma.

Eksempel 3

Bestemmelse af α-1-fetoprotein (AFP).

Anvendelse af en haptenmarkeret, første receptor, hvor samtlige tre antistoffer stammer fra samme dyreart.

20 Gennemførelsen og de anvendte puffere svarer til de i eksempel 2 anvendte.

Som receptor 1 anvendes anti-AFP-antistoffer fra får (100 ng/ml), der er markeret med digoxin (efter DE-patentskrift nr. 25 37 129), og som receptor 3 anvendes anti-AFP-antistof-25 fer fra får, markeret med /3-galactosidase ifølge den for HCG (eksempel 2) nævnte metode, og som fastfasekoblet receptor 2 anvendes små papirskiver af polyesterpapir, hvortil antistoffer mod digoxin fra får kobles adsorptivt. Coatningsmetoden svarer til den for plastrør kendte fremgangsmåde. Den opnåede 30 kalibreringskurve vises i tegningens fig. 2.

21

DK 165860 B

Eksempel 4

Bestemmelse af thyreotropin (TSH).

Reagenser: 1. Inkubationspuffer (IP): 15 mM natriumphosphatpuffer, pH- 5 værdi 7,4, 154 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% RSA, pH-værdi 7,4.

2. Receptor 1: Fåre-anti-TSH-antiserum: Råserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage 10 over DEAE-cellulose. Den IgG-holdige fraktion befries derpå for de med TSH's α-kæde reagerende dele ved passage over en med HCG-påfyldt immunoadsorber. Eluatet føres til en med TSH påfyldt immunoadsorber. Efter vask af adsorberen foregår elueringen af de mod TSH immunoreaktive antistoffer 15 med 1 M propionsyre. Eluatet dialyseres derpå mod IP og opkoncentreres eventuelt ved ultrafiltrering.

3. Receptor 3: Antistof-peroxidase-konjugat: Et yderligere fare-anti-TSH-antiserum oprenses som receptor 1, og derpå udvindes (Fab)ragmenter derfra. Fremstillingen af (Fab^” 20 fragmenterne foregår ifølge E. Lamoye et al. J. Immunol.

Methods 56, 235-243 (1983). Koblingen med peberrodsper-oxidase foregår efter Nakanes metode (M.B. Wilson, P.K.

Nakane "Recent Developments in the Periodat Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Else-25 vier, North Holland Biomedical Press, side 215-224 i "Im munofluorescence and Related Staining Techniques").

4. Receptor 2: Adsorbermateriale med fikseret æsel-antifåre-Fcy-antistof: Æsel-anti-fåre-Fcy-antiserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer omfattende 30 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 22

DK 165860 B

50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose. Den IgG-holdige fraktion (receptor 2) kobles med affinitetsadsorptionsmidlet, aktiveret med glutardialdehyd fra Boehringer Mannheim (Best.

5 nr. 665 525) efter fabrikantens arbejdsforskrift.

• 5. Indikatorreagens: 1,8 mM "ABTS1® (2,21-azino-di-3-ethyl- benzthiazolinsulfonat-(6), 3,3 mM natriumperborat i 100 mM phosphatcitratpuffer, pH-værdi 4,4.

Gennemførelse: 10 Gennemførelsen svarer til den i eksempel 1 angivne fremgangsmåde, hvor der i dette tilfælde tildryppes 100 ng receptor 1 og 100 mU receptor 3, opløst i inkubationspuffer (40 μΐ) på et arkformet celluloseunderlag med størrelsen 6x6 mm. Efter tørring foregår lagringen af underlagene indtil deres 15 anvendelse igen ved 4°C.

Den yderligere gennemførelse svarer til den i eksempel 1 viste arbejdsmetode. Som prøve anvendes 40 μΐ.

Fig. 3 viser en således opnået kalibreringskurve.

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af et polyvalent antigen 5 ved inkubation med tre forskellige receptorer, hvoraf den første og den tredje foreligger opløst i flydende fase og kan binde til antigenet, den anden receptor foreligger i fast fase og kun kan binde til den del af den første receptor, der ikke kan binde til antigenet, og den tredje recep- io tor bærer en markering og ikke krydsreagerer med den første og den anden receptor, adskillelse af den faste fase fra den flydende fase og måling af markeringen i en af faserne, kendetegnet ved, at man bringer en opløsning indeholdende antigenet sammen med et første fast bærermate-15 riale, der er imprægneret med den første og den tredje receptor i opløselig form, og efter løsnelse af receptorerne straks bringer den opnåede opløsning i kontakt med et andet fast',bærermateriale, dér indeholder den anden receptor i uopløselig form, derpå skiller væsken fra det andet faste bærer- 20 materiale og måler markeringen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som første receptor anvender et antistof. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som første receptor anvender et med en hapten eller et antigen markeret antistof.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 30 at man som første receptor anvender et antistof-fragment, der er markeret med en hapten eller et antigen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man anvender en anden receptor, der kun kan binde til den 35 første receptors Fc-del. DK 165860B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at man anvender en anden receptor, der kun kan binde til den første receptors haptendel eller antigendel.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, 5 at man anvender en anden receptor, der er rettet mod antistoffets Fc-del.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man anvender en tredje receptor, der er et Fab-fragment og stammer fra samme dyreart som den første 10 receptors antistof-bestanddel.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at man som tredje receptor anvenderet Fab-fragment af den første receptor.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet 15 ved, at man anvender en tredje receptor, der består af et markeret,komplet antistof.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, > at man anvender en tredje receptor, der stammer fra samme dyreart som den anden receptor, og at den første receptor 20 stammer fra en anden dyreart og/eller er markeret med en hapten eller et antigen.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at alle tre receptorer indeholder antistoffer eller fragmenter deraf, der stammer fra samme dyreart.

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-12, kende tegnet ved, at man anvender en tredje receptor,, der er markeret med et enzym eller et fluorescerende, kemilumini-scerende eller radioaktivt stof. DK 165860 B 25.

14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-13, kendetegnet ved, at man anvender en ufortyndet prøveopløsning.

15. Reagens til brug ved fremgangsmåden ifølge et af de fore- ® gående krav, kendetegnet ved a) et første fast baerermateriale, der er imprægneret eller lyofiliseret med to forskellige opløselige receptorer 1 og 3, der kan binde til antigenet, hvoraf receptor 3 bærer en markering, og 15 b) et andet fast bærermateriale, der indeholder en uopløse lig anden receptor, som kun kan binde til den del af den ikke-markerede, opløselige, første receptor, der ikke kan binde til antigenet, og foreligger fysisk adskilt fra det første bærermateriale, 20 med det forbehold, at den markerede tredje receptor er et Fab-fragment.

16. Reagens ifølge krav 15, kendetegnet ved, at 25 den første receptor er et antistof, og den tredje receptor er et enzymmarkeret Fab-fragment af et antistof.

17. Reagens ifølge krav 16, kendetegnet ved, at receptorerne 1 og 3 er monoklone og er rettet mod forskel- 30 lige og/eller repetitive determinanter på antigenet og stam mer fra samme dyreart.

18. Reagens ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den anden receptor er et antistof mod den første receptors

35 Fc-del, og den tredje receptor stammer fra samme dyreart som den anden receptor, mens den første receptor derimod stammer fra en anden dyreart. DK 165860B

19. Reagens ifølge krav 17, kendetegnet ved, at alle tre receptorer indeholder antistoffer fra samme dyreart, og at den første receptor er et hapten-antigen-marke-ret, monoklont antistof, og den anden receptor er rettet mod 5 den første receptors hapten-antigen.

20. Reagens ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den første receptor er et komplet antistof, den tredje receptor stammer fra samme dyreart som den første receptor, og den anden receptor er et mod den første receptors Pc-del 10 rettet antistof.

21. Reagens ifølge ethvert af kravene 15-20, kendetegnet ved, at det indeholder puffer og et system til bestemmels af enzymmarkeringen.

22. Reagens ifølge ethvert af kravene 15-21, kendete g-15 net ved, at den tredje receptor er markeret med peroxidase eller a- eller /3-galactosidase.