DK165860B - PROCEDURE FOR DETERMINING A POLYVALENT ANTIGEN AND A REAGENT THEREOF - Google Patents
PROCEDURE FOR DETERMINING A POLYVALENT ANTIGEN AND A REAGENT THEREOF Download PDFInfo
- Publication number
- DK165860B DK165860B DK002085A DK2085A DK165860B DK 165860 B DK165860 B DK 165860B DK 002085 A DK002085 A DK 002085A DK 2085 A DK2085 A DK 2085A DK 165860 B DK165860 B DK 165860B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- receptor
- antigen
- antibody
- receptors
- animal species
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/6857—Antibody fragments
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
. i. in
DK 165860BDK 165860B
Opfindelsen angår en immunokemisk fremgangsmåde til bestemmelse af en polyvalent, dvs. mindst bifunktionel ligand (antigen) i en flydende prøve og et reagens til brug ved denne fremgangsmåde. !The invention relates to an immunochemical method for determining a polyvalent, i.e. at least bifunctional ligand (antigen) in a liquid sample and a reagent for use in this method. !
Den følsomme bestemmelse af polyvalente antigener (peptider 5 og proteiner) under anvendelse af to antistoffer, der er rettet mod forskellige antigendeterminanter, kendes som immuno-radiometisk eller immunoenzymometrisk 2-site assay, f.eks. fra J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18 (1980), 197-208. Sædvan- e ' ligvis gennemføres denne kendte bestemmelsesfremgangsmade ! 10 ved, at det antigen, der skal bestemmes, først inkuberes med et første antistof, der foreligger i fast fase ved binding til et egnet bærermateriale, såsom sepharose, agarose, små plastrør eller lignende. Under denne første inkubation binder det første antistof, der sædvanligvis skal foreligge i stort 15 overskud, med en antigendeterminant på det antigen, der skal . bestemmes. Derpå adskilles prøvevæsken sædvanligvis fra den faste fase for at udelukke forstyrrelser forårsaget af ikke-specifikke stoffer, såsom humanserumprotein, eller af krydsreagerende antigener i den efterfølgende anden inkubation. | 20 Derefter inkuberes en bestemt mængde af et andet, markeret antistof i flydende fase med den faste fase. Specificiteten af det andet antistof vælges her fortrinsvis således, at det er rettet mod en anden determinant på det antigen, der skal bestemmes, end det første antistof for at udelukke en kon-25 kurrence mellem antistofferne om de samme bindingssteder for det antigen, der skal bestemmes, da forsøgsfølsomheden derved ville blive påvirket.The sensitive determination of polyvalent antigens (peptides 5 and proteins) using two antibodies directed against different antigenic determinants is known as immuno-radiometric or immunoenzymometric 2-site assay, e.g. from J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18 (1980), 197-208. Usually this known method of determination is carried out! 10, in that the antigen to be determined is first incubated with a first antibody present in solid phase upon binding to a suitable carrier material such as sepharose, agarose, small plastic tubes or the like. During this first incubation, the first antibody, usually present in excess of 15, binds with an antigenic determinant on the antigen to be. is determined. Then, the test liquid is usually separated from the solid phase to exclude disturbances caused by non-specific substances such as human serum protein, or by cross-reacting antigens in the subsequent second incubation. | Thereafter, a certain amount of another labeled antibody in liquid phase is incubated with the solid phase. Here, the specificity of the second antibody is preferably selected such that it is directed to a different determinant of the antigen to be determined than the first antibody to exclude competition between the antibodies for the same binding sites for the antigen to be is determined as the test sensitivity would thereby be affected.
Under denne anden inkubation reagerer det markerede andet antistof, der ligeledes sædvanligvis foreligger i overskud, 30 med samtlige bindingssteder på molekylerne af det antigen, der skal bestemmes. Efter den anden inkubation kan markeringsstoffets aktivitet enten måles i den faste fase eller i su-pernatanten. Sædvanligvis foregår målingen i den faste fase efter udvaskning af den flydende fase. I det gunstigste til- 2During this second incubation, the labeled second antibody, which is also usually present in excess, reacts with all the binding sites on the molecules of the antigen to be determined. After the second incubation, the activity of the marker substance can be measured either in the solid phase or in the supernatant. Usually, the measurement takes place in the solid phase after leaching of the liquid phase. In the most favorable way
DK 165860 BDK 165860 B
fælde forholder den bestemte aktivitet sig herved næsten proportionalt med mængden af det antigen, der skal bestemmes.In this case, the particular activity is almost proportional to the amount of antigen to be determined.
Denne 2-trins-sandwich-fremgangsmåde har den fordel, at eventuelt krydsreagerende antigener allerede fjernes ved den før-5 ste faseadskillelse. Dette er af særlig betydning i testsystemer, hvori begge antistoffer på grund af følsomhedskravene må besidde virkeligt forskellig specificitet. I dette tilfælde er der kun det strenge krav til specificiteten for ét af de to antistoffer, idet det andet så ikke behøver at være 10 absolut specifikt overfor krydsreagerende antigener.This 2-step sandwich method has the advantage that any cross-reacting antigens are already removed by the first phase separation. This is of particular importance in test systems in which both antibodies, due to the sensitivity requirements, must possess truly different specificity. In this case, there is only the strict requirement for the specificity of one of the two antibodies, the other then need not be absolutely specific to cross-reacting antigens.
Denne fremgangsmåde har imidlertid tre væsentlige ulemper.However, this approach has three major drawbacks.
1. I det første inkubationstrin foreligger den ene reaktant i fast fase og den anden i opløsning. Hastighedskonstanten for reaktionen er dermed mindre, end hvis reaktionsdelta-15 gerne (antigen og første antistof) befandt sig i opløsning.1. In the first incubation step, one solid phase reactant and the other in solution are present. Thus, the rate constant of the reaction is less than if the reaction particles (antigen and first antibody) were in solution.
Der må imidlertid inkuberes i så lang tid, at alle antigenmolekyler foreligger bundet til den faste fase, eftersom ikke bundet antigen ville blive fjernet ved faseadskillelsen og dermed ville få en forfalskning af resultaterne 20 til følge.However, it must be incubated for such a long time that all antigen molecules are bound to the solid phase, since no bound antigen would be removed by the phase separation and thus result in falsification of the results 20.
2. Bindingen af et antistof, der kan binde specifikt til antigenet, til en fast fase kræver på grund af de ringe bindingsudbytter relativt store mængder af det første antistof, der for det meste er et meget kostbart stof, især 25 når antiserumet af specificitetsgrunde må udvindes fra smådyr, såsom kaniner, marsvin og lignende. Derudover kan der ved bindingsreaktionen til den faste fase opstå affinitetsforringelser for antistoffet, hvilket påvirker følsomheden uheldigt.2. Binding of an antibody capable of binding specifically to the antigen to a solid phase requires, due to the low binding yields, relatively large amounts of the first antibody, which is usually a very expensive substance, especially when the antibody for specificity needs to are recovered from small animals such as rabbits, guinea pigs and the like. In addition, affinity degradation of the antibody may occur during the binding reaction to the solid phase, which adversely affects the sensitivity.
30 3. Udvindingen af to antistoffer med forskellig specifici tet over for det samme antigen er i reglen kostbart og i mange tilfælde kun i begrænset omfang muligt, f.eks. ved at man immuniserer to forskellige dyrearter, eller ved 33. The recovery of two antibodies with different specificity to the same antigen is usually expensive and in many cases only to a limited extent possible, e.g. by immunizing two different animal species, or by 3
DK 165860BDK 165860B
at man forsøger at skille antistofpopulationen fra et dyr ved immunoadsorption af det antigen, der skal bestemmes, i egnede fragmenter.trying to separate the antibody population from an animal by immunoadsorption of the antigen to be determined into suitable fragments.
Der kendes allerede forskellige forsøg, der afhjælper de oven-5 stående mangler. Således gennemføres ifølge US-PS nr. 4.098.876 den første inkubation af antigenet med isotopmarkeret,opløst antistof. Først derefter tilføres de til den faste fase bundne antistoffer, hvorpå den anden inkubation foretages. Her er det kun nødvendigt med én faseadskillelse, hvilket resul-10 terer i en vis forøgelse af følsomheden og gennemførligheden. Specificitetsproblemet forbliver imidlertid uløst, eftersom begge antistofferne skal være stærkt specifikt rettet mod antigenet, da den tilsyneladende koncentration af det antigen, der skal bestemmes, ellers i nærværelse af større mæng-15 der krydsreagerende antigener forøges ved en eventuel uspecificitet af det andet antistof,og reduceres ved uspecifi- | citet af det første antistof.Various attempts are already known to remedy the above-mentioned shortcomings. Thus, according to U.S. Patent No. 4,098,876, the first incubation of the antigen is carried out with isotope-labeled, dissolved antibody. Only then are the antibodies bound to the solid phase added and the second incubation is performed. Here, only one phase separation is necessary, which results in a certain increase in sensitivity and feasibility. However, the specificity problem remains unsolved, as both antibodies must be highly specific to the antigen, as the apparent concentration of the antigen to be determined is otherwise increased in the presence of a greater amount of cross-reacting antigens by any unspecificity of the second antibody, and reduced by unspecific | site of the first antibody.
I DE-OS 29 25 565 beskrives en fremgangsmåde, ved hvilken det i fast fase foreliggende første antistof og det marke-20 rede opløste andet antistof inkuberes samtidig med antige net. Her er de samme problemer som i den førnævnte fremgangsmåde. Desuden forbliver også de ovenfor for basisfremgangsmåden beskrevne ulemper 2 og 3 uløste.DE-OS 29 25 565 discloses a method in which the first antibody present in the solid phase and the marked dissolved second antibody are incubated simultaneously with antigenic networks. Here are the same problems as in the aforementioned process. In addition, the disadvantages 2 and 3 described above for the basic procedure also remain unresolved.
Fra den offentliggjorte japanske patentansøgning nr. 123.802 25 kendes endelig en fremgangsmåde, ved hvilken der anvendes et fastfase-antistof, der er rettet specifikt mod det andet antistof, hvilket andet antistof kan binde til det antigen, der skal måles. Her undgås bindingen af et mod antigenet rettet antistof til den faste fase. Følsomheden reduceres imid-30 lertid, da der kun anvendes et enkelt antistof, der kan binde specifikt til antigenet. Koncentrationspåvisningen af det antigen, der skal bestemmes, foregår via den kompetitive reak- 4Lastly, Japanese Patent Application No. 123,802 discloses a method utilizing a solid phase antibody directed specifically to the second antibody, which other antibody may bind to the antigen to be measured. Here, the binding of an antibody directed against the antigen to the solid phase is avoided. However, the sensitivity is reduced as only a single antibody that can bind specifically to the antigen is used. The concentration detection of the antigen to be determined takes place via the competitive reaction
DK 165860 BDK 165860 B
tion mellem antigenet og en bestemt mængde isotopmarkeret antigen med det specifikke antistof.between the antigen and a specific amount of isotope-labeled antigen with the specific antibody.
Fra EU-A 105 714 kendes en fremgangsmåde, ved hvilken et fast-fase-antistof sammen med to yderligere antistoffer, hvoraf 5 mindst det ene skal være et monoklont antistof, anvendes til antigen-bestemmelse efter sandwich-princippet. Derved inkuberes antigenet først med begge de i flydende fase foreliggende antistoffer, og derefter med fastfase-antistoffet. Fremgangsmåden har den ulempe, at den kræver to inkubationstrin, 10 hvilket hindrer automatisering, fører til lange inkubationstider og ikke tillader anvendelsen af ufortyndede prøver.From EU-A 105 714 a method is known in which a solid phase antibody together with two additional antibodies, of which at least one must be a monoclonal antibody, is used for antigen determination according to the sandwich principle. Thereby the antigen is first incubated with both the liquid phase antibodies and then with the solid phase antibody. The method has the disadvantage of requiring two incubation steps, which prevents automation, leads to long incubation times and does not allow the use of undiluted samples.
En lignende fremgangsmåde kendes fra Clin. Chem. 27/6 (1981) 823-827. Dér beskrives en radiometrisk bestemmelsesmetode for kreatinkinase MB-isoenzym, ved hvilken antigenet i et 15 første inkubationstrin samtidigt omsættes med et umarkeret og med et markeret antistof med forskellig specificitet og fra forskellige dyrearter. I det andet trin tilsættes derefter et i fast fase foreliggende antistof med specificitet mod det umarkerede antistof fra det første inkubationstrin.A similar approach is known from Clin. Chem. 27/6 (1981) 823-827. There is disclosed a radiometric assay method for creatine kinase MB isoenzyme in which the antigen in a first incubation step is reacted simultaneously with an unlabeled and with a labeled antibody of different specificity and from different animal species. In the second step, then, a solid phase antibody with specificity is added to the unlabeled antibody from the first incubation step.
20 Ulempen ved denne fremgangsmåde består igen i, at det er nødvendigt med to forskellige for antigenet specifikke antistoffer og med tre forskellige dyrearter.The disadvantage of this method is again that two different antigen-specific antibodies and three different animal species are needed.
Formålet med opfindelsen er derfor bedre at undgå en eller flere af de ovenfor skildrede ulemper ved basisfremgangsmå-25 den end de hidtil kendte fremgangsmåder. Især skal der tilvejebringes en sådan fremgangsmåde, som kun kræver én inkubation, hvor der ikke skal anvendes antistoffer i flydende fase, som egner sig til automatisering, og som udviser en stor følsomhed og nøjagtighed. Yderligere skal det ved fremgangsmå-30 den være muligt eventuelt at klare sig med en enkelt dyreart til udvindingen af de nødvendige antistoffer eller til antiserumudvindingen at kunne anvende store dyr.The object of the invention is therefore better to avoid one or more of the disadvantages described above in the basic method than the previously known methods. In particular, such a method should be provided which requires only one incubation where no liquid phase antibodies suitable for automation are used and which exhibit a high sensitivity and accuracy. In addition, it should be possible in the process to deal with a single animal species for the extraction of the necessary antibodies or for the use of large animals for the antiserum extraction.
55
DK 165860BDK 165860B
Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er en fremgangsmåde til bestemmelse af et polyvalent antigen ved inkubation med tre forskellige receptorer, hvoraf den første og den tredje foreligger opløst i flydende fase og kan binde til antigenet, den anden receptor ^ foreligger i fast fase og kun kan binde til den del af den første receptor, der ikke kan binde til antigenet, og den tredje receptor bærer en markering og ikke krydsreagerer med den første og den anden receptor, adskillelse af den faste fra den flydende fase og måling af markeringen i en af faserne, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer en opløsning indeholdende antigenet sammen med et første fast bærermateriale, der er imprægneret med den første og den tredje receptor i opløselig form, og efter løsnelse af receptorerne straks bringer den opnåede opløsning i kon-^ takt med et andet fast bærermateriale, der indeholder den anden receptor i uopløselig form, derpå skiller væsken fra det andet faste bærermateriale og måler markeringen.This object is achieved by the method of the invention, which is a method for determining a polyvalent antigen by incubation with three different receptors, the first and third of which are dissolved in liquid phase and can bind to the antigen, the second receptor and can bind only to that portion of the first receptor that cannot bind to the antigen, and the third receptor carries a marker and does not cross-react with the first and second receptors, separating the solid from the liquid phase, and measuring the marker in one of the phases, characterized by bringing a solution containing the antigen together with a first solid support material impregnated with the first and third receptors in soluble form and after dissolving the receptors immediately bringing the obtained solution into a - with another solid support material containing the second insoluble receptor, then so-called the liquid from the other solid support material and measures the mark.
Som receptorer anvendes inden for opfindelsens rammer enten komplette antistoffer (polyklone eller monoklone), der kan 20 binde specifikt, antistoffragmenter deraf eller konjugater af antistoffer eller antistoffragmenter med haptener eller antigener. Fortrinsvis anvendes som første receptor et komplet antistof eller et med en hapten eller et antigen forbundet eller markeret antistof eller antistoffragment, idet 25 et monoklont antistof særligt foretrækkes.As receptors within the scope of the invention, either complete antibodies (polyclone or monoclonal) capable of binding, antibody fragments thereof, or conjugates of antibodies or antibody fragments with haptenes or antigens are used. Preferably, as a first receptor, a complete antibody or one associated with a hapten or an antigen or labeled antibody or antibody fragment is used, with a monoclonal antibody being particularly preferred.
Som anden receptor anvendes et antistof, der kun kan binde til en del af den første receptor, og særligt foretrukket er et antistof, der kun kan binde til den første receptors Fc-del. Alternativt kan der også som anden receptor anven-30 des et antistof, der kun kan binde specifikt med haptendelen eller antigendelen af den første receptor. Den anden receptor kan også være rettet generelt mod Fc-delen af immunoglobulin.As the second receptor is used an antibody which can only bind to a portion of the first receptor, and particularly preferred is an antibody which can only bind to the Fc portion of the first receptor. Alternatively, an antibody may also be used as a second receptor which can bind specifically only with the haptend moiety or antigen moiety of the first receptor. The second receptor may also be directed generally to the Fc portion of immunoglobulin.
66
DK 165860 BDK 165860 B
Den tredje receptor, der ikke må krydsreagere med den anden receptor, kan være et markeret antistof, der kan binde til antigenet, og som udvindes af en anden dyreart end den første receptor.The third receptor, which must not cross-react with the second receptor, may be a labeled antibody capable of binding to the antigen, which is recovered by a different animal species than the first receptor.
5 Fortrinsvis anvendes imidlertid en tredje receptor, der er et markeret Fab-fragment. Ved Fab-fragment forstås inden for opfindelsens rammer også (Fab)2~ og Fab'-fragmenter. I dette tilfælde kan receptor 3 udvindes af den samme dyreart som den første receptors antistof-bestanddel. Dette gælder også, 10 når den første receptor består af et antistof, der bærer en hapten eller et antigen, og den anden receptor kun kan binde til denne hapten eller dette antigen. Særligt foretrukket er den tredje receptor en del, især et Fab-fragment, af den første receptor. Alternativt kan der også som tredje receptor 15 anvendes et antistof, der stammer fra den samme dyreart som den anden receptor. Begge alternativer har den fordel, at der kun behøves to dyrearter til de tre receptorer. Når den anden receptor kun kan binde til den første receptors hapten eller antigen, er det endda kun nødvendigt med én dyreart 20 til alle tre receptorer. Særligt foretrukket indeholder den tredje og den første receptor monoklone antistoffer eller fragmenter deraf, der er rettet mod forskellige og/eller repetitive determinanter på antigenet.However, a third receptor, which is a labeled Fab fragment, is preferably used. By Fab fragment within the scope of the invention is also meant (Fab) 2 ~ and Fab 'fragments. In this case, receptor 3 can be recovered from the same animal species as the antibody component of the first receptor. This is also true when the first receptor consists of an antibody carrying a hapten or an antigen and the second receptor can bind only to that hapten or antigen. Particularly preferred is the third receptor, a portion, in particular a Fab fragment, of the first receptor. Alternatively, as third receptor 15, an antibody derived from the same animal species as the second receptor may also be used. Both alternatives have the advantage that only two animal species are needed for the three receptors. When the second receptor can only bind to the first receptor's hapten or antigen, only one animal species 20 is required for all three receptors. Particularly preferred, the third and first receptors contain monoclonal antibodies or fragments thereof directed to various and / or repetitive determinants of the antigen.
Den tredje receptor anvendes fortrinsvis i en mængde, der 25 er større end mængden af det antigen, der skal påvises. X dette tilfælde, altså ved overskud, er det ikke nødvendigt med en eksakt dosering eller en nøjagtig kendt mængde. Den tredje receptor er markeret på en for fagfolk kendt måde. Fortrinsvis foregår markeringen ved kobling med et enzym eller 30 med et fluorescerende, kemiluminiscerende eller radioaktivt stof. Fremgangsmåder til markering af den slags receptorer er kendte for fagfolk, f.eks. fra "Clin. Chim. Acta" 81 (1977) 1-40, og behøver her ingen yderligere belysning.The third receptor is preferably used in an amount greater than the amount of the antigen to be detected. In this case, that is, in excess, no exact dosage or exact quantity is required. The third receptor is marked in a manner known to those skilled in the art. Preferably, the labeling is by coupling with an enzyme or with a fluorescent, chemiluminescent or radioactive substance. Methods for labeling such receptors are known to those of skill in the art, e.g. of "Clin. Chim. Acta" 81 (1977) 1-40, and need no further elucidation here.
77
DK 165860BDK 165860B
Den første og den tredje receptor anbringes i opløst form på et egnet bærermateriale, f.eks. på sugedygtigt papir, og overføres ved tørring eller lyofilisering i en let derfra løsnelig form.The first and third receptors are placed in a dissolved form on a suitable carrier material, e.g. on absorbent paper, and transferred by drying or lyophilization in a readily soluble form.
5 Bindingen af den i fast fase foreliggende anden receptor til et uopløseligt bærermateriale kan foretages efter sædvanlige, for fagfolk, kendte metoder til fiksering af biologisk aktive proteiner til faste bærerstoffer. Såvel en covalent som en adsorptiv binding er egnet. Fortrinsvis anvendes imidlertid 10 på grund af det herved opnåelige højere udbytte og den for- ; enklede arbejdsmetode en udelukkende adsorptiv binding, f.eks. til et plastmateriale eller et andet underlag, f.eks. papir.The binding of the second solid-state receptor to an insoluble carrier material can be made by conventional methods known in the art to fix biologically active proteins to solid carriers. Both a covalent and an adsorptive bond are suitable. Preferably, however, 10 is used because of the higher yields obtained and the advantages obtained; simplified working method is an exclusively adsorptive bond, e.g. for a plastic material or other substrate, e.g. paper.
Som egnede viste sig f.eks. små reagensglas af polystyren og lignende plastarter, der er coatede adsorptivt på indersiden 15 med den anden receptor. Inkubationen gennemføres derefter i disse rør eller i på anden måde udformede beholdere, og til faseadskillelsen er det tilstrækkeligt at fjerne den flydende fase fra rørene, f.eks. ved udsugning, udrystning eller lignende. Efter vask af rørene kan målingen af markeringen 20 så foretages direkte deri, især når markeringen er foregået med et enzym. Det er så tilstrækkeligt ganske enkelt at måle aktiviteten af markeringsenzymet, f.eks. peroxidase eller Bgalactosidase, på den hertil almindeligt kendte måde, idet man tilsætter et kendt påvisningsreagens for dette markerings-25 enzym, f.eks. et farvereagens, og enten måler i nærvær af den faste fase eller efter adskillelse. Den målte enzymaktivitet er så et mål for mængden af det polyfunktionelle antigen, der skal bestemmes. Som fastfase-bærer for den anden receptor kommer imidlertid også partikelformede stoffer, f.eks.As appropriate, e.g. small polystyrene test tubes and similar plastic species coated adsorptively on the inside 15 with the second receptor. The incubation is then carried out in these tubes or in other shaped containers, and for the phase separation it is sufficient to remove the liquid phase from the tubes, e.g. by extraction, shaking or the like. After washing the tubes, the measurement of the marker 20 can then be made directly therein, especially when the marker has been carried out with an enzyme. It is then sufficiently simple to measure the activity of the marker enzyme, e.g. peroxidase or Bgalactosidase, in the manner well known in the art, adding a known detection reagent to this marker enzyme, e.g. a color reagent, and either measure in the presence of the solid phase or after separation. The measured enzyme activity is then a measure of the amount of the polyfunctional antigen to be determined. However, as solid phase carrier for the second receptor also come particulate matter, e.g.
30 ionbyttere, molekylarsigtematerialer, glaslegemer, plastslanger og lignende i betragtning. Som bærer for den anden receptor foretrækkes især en porøs, lagdelt bærer, såsom papir.30 ion exchangers, molecular sieve materials, glass bodies, plastic hoses and the like. As a carrier for the second receptor, a porous, layered carrier such as paper is particularly preferred.
Såfremt markeringen ikke foregår med et enzym, men med et radioaktivt' stof, en isotop, et fluorescerende eller et kemi- 8If the labeling does not take place with an enzyme but with a radioactive substance, an isotope, a fluorescent or a chemical 8
DK 165860BDK 165860B
luminiscerende stof, så foretages også her bestemmelsen efter for fagfolk velkendte metoder. En beskrivelse af disse målemetoder er derfor overflødig her.luminescent substance, then again the determination is made according to methods well known to those skilled in the art. A description of these measurement methods is therefore superfluous here.
Til gennemførelse af fremgangsmåden sættes prøveopløsningen, 5 der ifølge et særligt fordelagtigt træk ved opfindelsen endda kan anvendes i ufortyndet form, f.eks. som blod, plasma eller serum, sammen med det første bærermateriale i tilstrækkelig lang tid til at løsne begge receptorer, fraskilles derefter og inkuberes med det andet bærermateriale. Kontaktti-10 den med det første bærermateriale ligger sædvanligvis mellem ca. 10 sek. og 10 min. Fordelagtigt gennemføres fremgangsmåden herved på en anordning, der er beskrevet i DE-A 34 25 008.For carrying out the process, the sample solution is added, which according to a particularly advantageous feature of the invention can even be used in undiluted form, e.g. as blood, plasma, or serum, together with the first carrier for a sufficient period of time to release both receptors, is then separated and incubated with the second carrier. The contact time with the first carrier material is usually between 10 sec. and 10 min. Advantageously, the method is carried out on a device described in DE-A 34 25 008.
Det har nu overraskende vist sig, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås en betydeligt større følsomhed end 15 ved den sædvanlige 2-trins-sandwich-metode og 1-trins-sand-wich-metode.It has now surprisingly been found that the method according to the invention provides a considerably greater sensitivity than 15 by the usual 2-step sandwich method and 1-step sand-wich method.
Anvendes der ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen en mod den første receptors Fc-del eller mod haptenen eller antigenet, der er koblet til den første receptor, 20 rettet anden receptor, så kan der herved opnås en yderligere stigning i følsomheden, da en eventuel sterisk hindring af bindingsreaktionen mellem antigenet og den første receptors bindingssted undgås. Dette er en særlig fordel, når der skal bestemmes antigener med særligt ringe koncentration, som det 25 f.eks. er tilfældet ved bestemmelsen af thyreotropin i serum.If, according to a preferred embodiment of the invention, a second receptor is used against the Fc portion of the first receptor or against the hapten or antigen coupled to the first receptor, then a further increase in sensitivity can be obtained, obstruction of the binding reaction between the antigen and the binding site of the first receptor is avoided. This is a particular advantage when determining antigens of particularly low concentration, such as the is the case in the determination of serum thyreotropin.
Opfindelsen angår yderligere et tørreagens til bestemmelse af et polyvalent antigen, hvilket reagens er ejendommeligt ved a) et første fast bærermateriale, der er imprægneret eller 30 lyofiliseret med to forskellige opløselige receptorer 1 9The invention further relates to a dry reagent for the determination of a polyvalent antigen, which reagent is characterized by a) a first solid support material impregnated or lyophilized with two different soluble receptors 19
DK 165860 BDK 165860 B
og 3, der kan binde til antigenet, hvor receptor 3 bærer en markering, og b) et andet fast baerermateriale, der indeholder en uopløselig anden receptor, som kun kan binde til en del af den 5 ikke-markerede, opløselige første receptor og foreligger fysisk adskilt fra det første bærermateriale, med det forbehold, at den markerede, tredje receptor er et Fab-fragment.and 3 capable of binding to the antigen, wherein receptor 3 bears a label, and b) another solid support material containing an insoluble second receptor capable of binding only to a portion of the unlabeled soluble first receptor and present physically separated from the first carrier material, with the proviso that the marked third receptor is a Fab fragment.
Den fysiske adskillelse kan f.eks. foregå ved, at den uop-10 løselige anden receptor og de opløselige første og tredje receptorer anbringes på adskilte bærermaterialer. Dette kan opnås ved, at receptor 1 og receptor 3 samtidig eller efter hinanden bindes i eller på en egnet bærer (f.eks. plastrør eller sugedygtige bærere, såsom papir eller lignende) ved 15 lyofilisering eller imprægnering, og receptor 2 bindes ad- sorptivt eller covalent til en egnet bærer (f.eks. plastrør, papir eller partikler). Prøven med det polyvalente antigen, der skal bestemmes, bringes først i kontakt med bærer 1, der indeholder den opløselige første og tredje receptor og der-20 efter med bærer 2, hvortil den uopløselige receptor 2 er fik-seret. Alternativt kan den første og den tredje receptor på den ene side og den anden receptor på den anden side foreligge på med hinanden forbundne bærere, der f.eks. består af en papirstrimmel, der indeholder receptorerne på forskellige, 25 fra hinanden adskilte steder.The physical separation can e.g. This is done by placing the insoluble second receptor and the soluble first and third receptors on separate support materials. This can be achieved by binding receptor 1 and receptor 3 simultaneously or sequentially in or on a suitable carrier (e.g., plastic tubes or sugary supports, such as paper or the like) by lyophilization or impregnation, and receptor 2 is adsorbed binding or covalently to a suitable carrier (e.g., plastic tubes, paper or particles). The sample of the polyvalent antigen to be determined is first contacted with carrier 1 containing the soluble first and third receptors and then with carrier 2 to which the insoluble receptor 2 is fixed. Alternatively, the first and third receptors on the one hand and the second receptor on the other hand may be present on interconnected carriers, e.g. consists of a paper strip containing the receptors at different, 25 spaced apart locations.
Ifølge en første foretrukken udførelsesform er et reagens ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det indeholder en første receptor, der er et antistof, og en tredje receptor, der er et enzymmarkeret Fab-fragment af et antistof. Fortrins-30 vis indeholder det også puffer og et system til bestemmelse af enzymmarkeringen.According to a first preferred embodiment, a reagent according to the invention is characterized in that it contains a first receptor which is an antibody and a third receptor which is an enzyme labeled Fab fragment of an antibody. Preferably, it also contains buffer and a system for determining the enzyme label.
1010
DK 165860 BDK 165860 B
Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at receptorerne 1 og 2 er monoklone og er rettet mod forskellige af antigenets determinanter og stammer fra samme dyreart.According to a further preferred embodiment of the reagent of the invention, this is characterized in that receptors 1 and 2 are monoclonal and are directed to different of the determinants of the antigen and originate from the same animal species.
5 Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at den anden receptor er et antistof mod den første receptors Fc-del, og at den tredje receptor stammer fra den samme dyreart som den anden receptor, hvorimod den første receptor stammer fra en 10 anden dyreart.According to a further preferred embodiment of the reagent of the invention, this is characterized in that the second receptor is an antibody to the Fc portion of the first receptor and that the third receptor originates from the same animal species as the second receptor, whereas the first receptor originates. from another 10 animal species.
Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for reagenset ifølge opfindelsen udmærker dette sig ved, at alle tre receptorer indeholder antistoffer fra den samme dyreart, at den første receptor er et haptenmarkeret, monoklont antistof, 15 og at den anden receptor er rettet mod den første receptors hapten.According to a further preferred embodiment of the reagent according to the invention, this is characterized in that all three receptors contain antibodies from the same animal species, that the first receptor is a hapten-labeled monoclonal antibody and that the second receptor is directed to the hapten of the first receptor.
Receptorerne 1 og 3 fra reagenset ifølge opfindelsen foreligger imprægneret eller lyofiliseret på et fast bærermateriale.The receptors 1 and 3 of the reagent of the invention are impregnated or lyophilized on a solid support material.
20 Opfindelsen egner sig til bestemmelse af alle slags antigener med mindst to antigen-determinanter. Eksempler herpå er thyreotropin (TSH), α-1-fetoprotein (AFT), hCG, carbinoembryo-nalt antigen, luteiniserende hormon (LH), follikelstimulerende hormon (FSH), ^“roi^roglobulin, sur prostataphospha-25 tase, prolactin, ferritin og insulin.The invention is suitable for the determination of all types of antigens with at least two antigenic determinants. Examples of these are thyroidotropin (TSH), α-1-fetoprotein (AFT), hCG, carbinoembryonic antigen, luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), ³royroglobulin, acidic prostate phosphatase, prolactin, ferritin and insulin.
Ved opfindelsen kan receptor 1 reagere homogent med antigenet. Denne reaktion har som følge deraf en højere hastighedskonstant end ved anvendelse af en fastfase-bundet, uopløselig første receptor. Eftersom antistoftabene ved fikseringen 30 (uopløselighedsgøreisen) til den faste fase undgås, kan mængden af den første receptor formindskes yderligere.In the invention, receptor 1 can react homogeneously with the antigen. As a result, this reaction has a higher rate constant than using a solid phase-bound, insoluble first receptor. Since the antibody losses in fixation 30 (the insolubility assay) to the solid phase are avoided, the amount of the first receptor can be further reduced.
DK 165860 B i 11DK 165860 B in 11
Det er heller ikke, i modsætning til den i Clin. Chem. 27/6 (1981) beskrevne fremgangsmåde, nødvendigt at udvinde den første og den tredje receptor fra to forskellige dyrearter, der desuden skal vælges således, at receptor 2 kun reagerer 5 med receptor 1, men ikke med receptor 3.Nor is it, unlike the one in Clin. Chem. 27/6 (1981), it is necessary to recover the first and third receptors from two different animal species, which must additionally be selected such that receptor 2 reacts only 5 with receptor 1, but not with receptor 3.
Udvindingen af antistoffet til receptor 1 og til receptor 3 fra samme dyreart muliggør endelig også anvendelse af store dyr til antiserum-udvindingen.Finally, the recovery of the antibody to receptor 1 and to receptor 3 from the same animal species also allows the use of large animals for antiserum recovery.
Endelig forøges ifølge opfindelsen også følsomheden. Såle-10 des blev der for TSH fundet en følsomhed på mindre end 40 pg/ml (1 μϋ - 170 pg/ml), mens den ved 2 site-assay (sandwich-fremgangsmåden) ligger over 100 pg/ml.Finally, according to the invention, the sensitivity is also increased. Thus, for TSH, a sensitivity of less than 40 pg / ml (1 μϋ - 170 pg / ml) was found, while in the 2 site assay (sandwich method) it is above 100 pg / ml.
De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere i forbindelse med tegningen. Her forestiller: 15 fig. 1 en kalibreringskurve ifølge eksempel 2, fig. 2 en kalibreringskurve ifølge eksempel 3, fig. 3 en kalibreringskurve ifølge eksempel 4, og fig. 4 et anvendelseselement til en centrifugalanalyseautomat, der anvendes ifølge eksempel 2.The following examples illustrate the invention in more detail in connection with the drawing. Here depicts: 15 fig. 1 shows a calibration curve according to Example 2; FIG. 2 shows a calibration curve according to Example 3; FIG. 3 shows a calibration curve according to Example 4, and FIG. 4 shows a use element for a centrifugal analyzer used in Example 2.
20 Eksempel 1Example 1
Bestemmelse af thyreotropin (TSH)Determination of Thyrotropin (TSH)
Receptor 1 og 3 stammer fra samme dyreart (mus), og receptor 3 er et markeret Fab-fragment. Receptor 1 er et monoklont antistof, og Fab-fragmentet i receptor 3 stammer ligeledes 25 fra et monoklont antistof, der er rettet mod en anden determinant på TSH end det monoklone antistof fra receptor 1. Re- 12Receptor 1 and 3 originate from the same animal species (mouse), and receptor 3 is a marked Fab fragment. Receptor 1 is a monoclonal antibody, and the Fab fragment in receptor 3 is also derived from a monoclonal antibody directed to a different determinant of TSH than the monoclonal antibody from receptor 1.
DK 165860 BDK 165860 B
ceptor 2 stammer fra får og er rettet mod det monoklone museantistofs Fc-del.ceptor 2 is derived from sheep and is directed to the Fc portion of the monoclonal mouse antibody.
Udviklingen af monoklone antistoffer foregår efter Kohier og Milsteins metode, Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976).The development of monoclonal antibodies takes place according to Kohier and Milstein's method, Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976).
5 a) Forsøqsgennemførelse ifølge opfindelsen Reagenser: 1. Inkubationspuffer (IP): 15 mM natriumphosphatpuffer, pH-værdi 7,4, 154 mM NaCl, 10 5 mM EDTA, 0,2% RSA (okseserumalbumin), pH-værdi 7,4.5 a) Experimental In accordance with the Invention Reagents: 1. Incubation buffer (IP): 15 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 154 mM NaCl, 10 5 mM EDTA, 0.2% RSA (bovine serum albumin), pH 7.4 .
2. Receptor 1:2. Receptor 1:
Muse-anti-TSH-antiserum (receptor 1):Mouse anti-TSH antiserum (receptor 1):
Museascitesvæsken indeholdende monoklone anti-TSH-antistof-fer blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet opta-15 ges i en puffer omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose.The mouse ascites fluid containing monoclonal anti-TSH antibodies is mixed up to 1.8 M with NH 2 SO 2. The precipitate is taken up in a buffer comprising 15 mM sodium phosphate, pH 7.0 and 50 mM NaCl, and the solution thus obtained is subjected to a passage over DEAE cellulose.
3. Receptor 3:3. Receptor 3:
Anti-TSH-antistoffer (monoklone), dér genkender en anden 20 antigen-determinant end receptor 1, - peroxidasekonjugat (receptor 3): muse-anti-TSH-antiserum oprenses som receptor 1. Den efterfølgende udvinding af (Fab^ fra det komplette antistofmolekyle foregår efter den i eksempel 2 angivne metode. Koblingen med 25 peberrodsperoxidase foregår efter Nakanes metode (M.B.Anti-TSH antibodies (monoclonal), recognizing a different antigenic determinant than receptor 1, - peroxidase conjugate (receptor 3): mouse anti-TSH antiserum is purified as receptor 1. The subsequent recovery of (Fab The antibody molecule is carried out according to the method of Example 2. The coupling with 25 horseradish peroxidase takes place according to Nakane's method (MB
Wilson, P.K. Nakane "Recent Developments in the Periodate Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Elsevier, North Holland Biomedical Press, side 215-224 i "Immunofluorescence and Related 30 Staining Techniques").Wilson, P.K. Nakane "Recent Developments in the Periodate Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Elsevier, North Holland Biomedical Press, pages 215-224 in "Immunofluorescence and Related 30 Staining Techniques").
DK 165860BDK 165860B
13 4. Receptor 2:4. Receptor 2:
Adsorbermateriale med fikseret fåre-anti-muse-Fcv- antistof (receptor 2-adsorber): Fåre-anti-museFcY-antiserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer 5 omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mMFixed sheep anti-mouse Fcv antibody adsorber (receptor 2 adsorber): Sheep anti-mouse Fcγ antibody serum is mixed up to 1.8 M with NH 2 SO 2. The precipitate is taken up in a buffer 5 comprising 15 mM sodium phosphate, pH 7.0 and 50 mM
NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose. Den IgGholdige fraktion (receptor 2) kobles med "affinitetsadsorptionsmidlet, aktiveret med glutardialdehyd" fra Boehringer Mannheim (Best. nr. 665.525) 10 efter fabrikantens arbejdsforskrift.NaCl, and the solution thus obtained is subjected to a passage over DEAE cellulose. The IgG-containing fraction (receptor 2) is coupled with the "affinity adsorbent activated with glutardialdehyde" from Boehringer Mannheim (Order No. 665,525) 10 according to the manufacturer's working instructions.
5. Indikatorreagens: 1,8 mM "ABTS"® (2,2'-azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfo-nat(6)]), 3,3 mM natriumperborat i 100 mM phosphatcitrat-puffer, pH-værdi 4,!4.Indicator reagent: 1.8 mM "ABTS" ® (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)]), 3.3 mM sodium perborate in 100 mM phosphate citrate buffer, pH 4, ! 4th
15 Gennemførelse: 50 ng receptor 1 og 170 mU receptor 3 opløses sammen i inkubationspufferen og pådryppes et underlag bestående af kommercielt polyesterpapir med størrelse 6x6 mm, tykkelse 1,0 mm og tørres ved stuetemperatur. Dette reagensholdige 20 papirunderlag benævnes reagensbærer 1.Execution: 50 ng of receptor 1 and 170 mU of receptor 3 are dissolved together in the incubation buffer and applied onto a substrate consisting of commercial polyester paper of size 6x6 mm, thickness 1.0 mm and dried at room temperature. This reagent-containing 20 paper substrate is called reagent carrier 1.
På reagensbærer 1 pipetteres henholdsvis 40 μΐ af den prøve, der skal bestemmes, eller en standardopløsning indeholdende kendte mængder antigen, hvorpå underlaget straks fracentrifugeres i en Eppendorf-centrifuge, hvorved reagens-25 bærer 1 placeres på en Eppendorf-hætte, og den eluerede væske i hætten under centrifugeringen rammer receptor 2, der er koblet til adsorberen og reagerer med denne. Der anvendes 2,5 mg adsorbermateriale pr. forsøg af receptor 2.On reagent carrier 1, respectively, 40 μΐ of the sample to be pipetted or a standard solution containing known amounts of antigen are pipetted and immediately centrifuged in an Eppendorf centrifuge, whereby reagent carrier 1 is placed on an Eppendorf cap and the eluted liquid in the cap during centrifugation, receptor 2, which is coupled to the adsorber, strikes and reacts with it. 2.5 mg of adsorber material is used per day. experiment of receptor 2.
30 Reaktionsblandingen inkuberes i 15 min. ved 37°C på et rysteapparatur.The reaction mixture is incubated for 15 min. at 37 ° C on a shaker.
1414
DK 165860 BDK 165860 B
Efter præcis 15 min. udtages reaktionsbeholderne fra apparaturet og centrifugeres.·After exactly 15 min. the reaction vessels are removed from the apparatus and centrifuged.
En prøve af supérnatanten udtages med en pipette, og det dannede farvestof bestemmes ved en ekstinktion ved 405 5 nm.A sample of the supernatant is taken out with a pipette and the dye formed is determined by an extinction at 405 5 nm.
Med to forskellige TSH-prøver fastlagdes følgende ekstinktionsværdier : TSH E405 nm/cm* (μϋ/ml) 10 0 0,74 I_50_ 7,54 * Ekstinktionsværdierne fastlagdes ved 0,2 cm lagtykkelse og omregnedes til 1 cm lagtykkelse.With two different TSH samples, the following extinction values were determined: TSH E405 nm / cm * (μϋ / ml) 10 0 0.74 I_50_ 7.54 * The extinction values were determined at 0.2 cm layer thickness and converted to 1 cm layer thickness.
b) Enkelt sandwich (sammenligning): 15 Gennemførelsen foregår med de samme reagenser og på sam- måde som beskrevet under a), men med følgende ændringer: 1. 2,5 mg adsorber-receptor 2 forinkuberes i 1 time med 20 μς receptor 1 i 0,2 ml under omrystning. Derefter fra-suges supernatanten, og resten vaskes tre gange med hver 20 gang 1 ml IP.b) Single sandwich (comparison): The procedure is carried out with the same reagents and in the same manner as described under a), but with the following changes: 1. 2.5 mg of adsorber receptor 2 is preincubated for 1 hour with 20 μς receptor 1 in 0.2 ml with shaking. Then the supernatant is aspirated and the residue is washed three times with 20 ml of IP each 20 times.
2. Den på denne måde med receptor 1 forbehandlede adsorber-receptor 2 inkuberes i 4 timer med prøve og receptor 3 på et rysteapparat ved 37°C, idet tilsætningen af opløselig receptor 1 bortfalder i denne variant.2. The adsorber receptor 2 thus pretreated with receptor 1 is incubated for 4 hours with sample and receptor 3 on a shaker at 37 ° C, with the addition of soluble receptor 1 lapsing into this variant.
25 Derefter frasuges supernatanten som sædvanlig, resten va skes med vand, og den fikserede enzymaktivitet eftervises med indikatorreagens.Subsequently, the supernatant is aspirated as usual, the residue washed with water and the fixed enzyme activity is demonstrated by indicator reagent.
1515
DK 165860BDK 165860B
Med to forskellige TSH-prøver fastlagdes følgende ekstinktionsværdier: TSH E405 nm/cm* (μϋ/ml) 5 0 0,20 50 2,87 * Ekstinktionsværdien fastlagdes ved 0,2 cm lagtykkelse og blev omregnet til 1 cm lagtykkelse.With two different TSH samples, the following extinction values were determined: TSH E405 nm / cm * (μϋ / ml) 5 0 0.20 50 2.87 * The extinction value was determined at 0.2 cm layer thickness and converted to 1 cm layer thickness.
Følsomheden er betydeligt lavere end i a), selvom der i 10 b) anvendes betydeligt mere receptor 1 end i a) (forhold 1:400).The sensitivity is significantly lower than in a), although in receptor b) significantly more receptor 1 is used than in a) (ratio 1: 400).
Eksempel 2Example 2
Bestemmelse af human choriogonadotropin (HCG)Determination of human choriogonadotropin (HCG)
Reagenser: 15 Puffer A: 100 mmol natriumphosphat, pH-værdi 7,3 (37°C) 2 mmol magnesiumchlorid 0,9% NaCl 0,5% RSA (okseserumalbumin) 120 Mg/ml anti-HCG-monoklone antistoffer fra mus 20 (som ascites) (receptor 1) 100 mU/ml anti-HCG-antistof-(f åre)-Fab-f ragment-j3-galactosidase-konjugat.Reagents: Buffer A: 100 mmol sodium phosphate, pH 7.3 (37 ° C) 2 mmol magnesium chloride 0.9% NaCl 0.5% RSA (bovine serum albumin) 120 Mg / ml anti-HCG monoclonal antibodies from mice 20 (as ascites) (receptor 1) 100 mU / ml anti-HCG antibody (four) Fab Fab fragment β-galactosidase conjugate.
(Receptor 3)(Receptor 3)
Fremstillingen af Fab-fragmentet foregår efter 25 T. Kitagawa i "Enzyme Immunoassay E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai eds. Igaku-Shoin, Tokyo/New York 1981, side 81-89". Den covalente kobling af /3-galac-tpsidase til antistoffer eller AK-fragmenter foregår efter metoden fra: R.R. Porter, Biochem. J.The Fab fragment is prepared following 25 T. Kitagawa in "Enzyme Immunoassay E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, eds. Igaku-Shoin, Tokyo / New York 1981, pages 81-89". The covalent coupling of β-galac tpsidase to antibodies or AK fragments is performed according to the method of: R.R. Porter, Biochem. J.
30 73 (1959), 119.30, 73 (1959), 119.
1616
DK 165860 BDK 165860 B
Substratopløsning: som puffer A og desuden 5 mmol (ONPG) ortho-nitrophenyl-galactosid.Substrate solution: as buffer A and in addition 5 mmol (ONPG) ortho-nitrophenyl galactoside.
1. Fremstillingen af reagensbærer 1 foregår analogt med 5 eksempel 1 på den måde, at der fra opløsning A pådryp- pes 40 μΐ på et underlag bestående af kommercielt polyesterpapir, der efterfølgende tørres ved stuetemperatur. Lagringen af underlagene indtil anvendelsen foregår ved 4°C og en relativ luftfugtighed på < 20%.1. The preparation of reagent carrier 1 is analogous to Example 1 in that from solution A, 40 µΐ is applied onto a substrate consisting of commercial polyester paper which is subsequently dried at room temperature. The substrates are stored until use at 4 ° C and a relative humidity of <20%.
10 2. Fremstilling af reagensbærer 2: På et arkformet cel luloseunderlag fikseres <M-FcY>-antistoffer fra får (IgG-fraktion) efter bromcyan-aktiveringsfremgangsmåden (DE-OS 17 68 512) hvorved der pr. g fibermateriale anvendes 10 mg antistoffer til fiksering. Ved vaskning 15 fjernes ukoblede antistoffer, og underlaget tørres skån somt ved stuetemperatur. -Lagringen af underlagene foregår analogt med reagensbærer 1.2. Preparation of Reagent Carrier 2: On a sheet-shaped cellulose substrate, <M-FcY> antibodies from sheep (IgG fraction) are fixed by the bromocyan activation method (DE-OS 17 68512), thereby g fiber material 10 mg antibodies are used for fixation. On washing 15, uncoupled antibodies are removed and the substrate is dried slightly at room temperature. -The storage of the substrates takes place analogously to reagent carrier 1.
Bestemmelsen af HCG ved hjælp af disse to reagensbærere 1 og 2 foregår ved hjælp af den i tysk patentansøgning 20 nr. 2425008.5 beskrevne anordning til gennemførelse af analytiske bestemmelser. Heri beskrives et rotorindsætningselement til centrifugalanalyseautomater bestående af et formlegeme, som har et prøvepåfyldningskammer, der står i forbindelse med flere reagensfelter, hvilke felter 25 indeholder et med et bestemt reagens imprægneret sugedygtigt bærermateriale, mindst ét blandeventilkammer og ét målekammer, der sammen danner en prøvevæsketransportvej, som fører radialt indefra længere radialt udad, når indsætningselementet er fastgjort på rotoren, og desuden har mindst 30 ét yderligere kammer til optagelse af en væske, og en trans portvej, der fra dette kammer fører til målestedet, og som mindst delvis er identisk med prøvevæsketransportvejen. Derved fører prøvevæsketransportvejen fra et prøvepåfyldningskammer (P) over et med sugedygtigt materiale fyldt, 17The determination of HCG by means of these two reagent carriers 1 and 2 is carried out by means of the device described in German patent application No. 2025008.5 for carrying out analytical assays. Herein discloses a rotor insertion element for centrifugal analyzers consisting of a mold body having a sample loading chamber communicating with multiple reagent fields, which fields 25 includes a suction-proof suction-resistant carrier material, at least one mixing valve chamber and one measuring chamber, together with one sample chamber, together with one test chamber. which leads radially from the inside farther radially outwardly when the insertion member is secured to the rotor, and further has at least one additional chamber for receiving a fluid and a transport path leading from that chamber to the measurement site which is at least partially identical to the sample fluid transport path . Thereby, the sample liquid transport path from a sample loading chamber (P) passes over a suction-filled material 17
DK 165860 BDK 165860 B
pufferholdigt kaminer (a), et kammer (c) og et mellem kamrene (a) og (c) anbragt første ventilkammer (VKl) til et andet ventilkammer (VK2) og fra dette via kammeret (d) og via et opfangningskammer (AK) til målekammeret (K).buffer-containing fireplaces (a), a chamber (c) and a first valve chamber (VK1) arranged between the chambers (a) and (c) to a second valve chamber (VK2) and from this via the chamber (d) and via a capture chamber (AK) to the measuring chamber (K).
5 Til optagelse af en yderligere væske tilvejebringes et som pumpekammer udviklet substratkammer (PK), der over en af et doseringskammer (DK) og kapillarer (Kap) bestående doseringsanordning og et overløbskammer (UK) er forbundet med det andet ventilkammer (VK2). Fig. 4 viser skematisk 10 det anvendte rotorindsætningselement. Ved dette apparat placeres reagensbærer 1 på felt c i indsætningselementet og reagensbærer 2 på felt d. Reaktionsføringen svarer i det væsentlige til den fra eksempel 1 fra ovennævnte patentansøgning. 40 μΐ prøve pipetteres gennem en åbning 15 ved den øverste kant direkte på feltet a. Prøven er ufor- tyndet.To obtain an additional fluid, a substrate chamber (PK) developed as a pump chamber is provided, which is connected to the second valve chamber (VK2) via a dosing chamber (DK) and capillaries (Kap) and a flow chamber (UK). FIG. 4 shows schematically 10 the rotor insertion element used. In this apparatus, reagent carrier 1 is placed on field c of the insert element and reagent carrier 2 on field d. The reaction guide is substantially similar to that of Example 1 of the above-mentioned patent application. Pipette 40 μΐ sample through an opening 15 at the upper edge directly onto the field a. The sample is undiluted.
Ved hjælp af et egnet program, hvor der veksles mellem høje omdrejningstal og stilstand, føres prøve og substrat derefter i retning af adskillelsesmatrixen og kuvetten.By means of a suitable program which alternates between high rpm and standstill, the sample and substrate are then fed in the direction of the separation matrix and cuvette.
20 I det følgende angiver centrifugering høje omdrejningstal, mens de derimellem indskudte trin med lavere omdrejningstal tjener til den følsomme styring af væsketransporten. Sub-strat/væskeopløsningen opdeles ved hjælp af doseringskapillarerne (DK) i lige store dele (portioner).In the following, centrifugation indicates high rpm, while the interspersed steps with lower rpm serve for the sensitive control of the liquid transport. The substrate / liquid solution is divided into equal parts (portions) by means of the dosing capillaries (DK).
25 1. Centrifugering Prøve og prøvepuffer centrifugeres i VKl, og den første portion er i doseringskammeret DK.25 1. Centrifugation Sample and sample buffer are centrifuged in VK1 and the first portion is in the dosing chamber DK.
1. Stilstand Prøve løber til felt c og løsner recep torerne 1 og 3. Den første portion sub-30 stratopløsning går ind i overløbskammeret UK. .1. Stagnation Sample runs to field c and loosens receptors 1 and 3. The first batch of substrate solution enters the overflow chamber UK. .
2. Centrifugering HCG og receptorerne 1 og 3 når til VK2, og der centrifugeres for at opnå en homogen blanding af reagenserne. Den 182. Centrifugation HCG and receptors 1 and 3 reach VK2 and centrifuge to obtain a homogeneous mixture of the reagents. On the 18th
DK 165860 BDK 165860 B
første portion substratopløsning tilbage· holdes i U K, og den anden portion substratopløsning går til doseringskammeret DK.the first portion of substrate solution is retained in U K, and the second portion of substrate solution goes to the dosing chamber DK.
5 2. Stilstand Hvad angår prøven transporteres væsken til felt d, og der følger en stilstand på 5 min., i hvilket tidsrum komplekset binder til bæreren. Den binder også ikke 'i kompleks indeholdt anti-HCG.5 2. Standstill As for the sample, the liquid is transported to field d and a standstill of 5 minutes follows, during which time the complex binds to the carrier. It also does not bind to the complex containing anti-HCG.
10 Ved reaktionens afslutning befinder der sig stadig ikke i et kompleks indeholdt Fab-konjugat ubundet i opløsningen. Den anden portion substratopløsning går i UK.At the end of the reaction, a complex of Fab conjugate still unbound in the solution was not present. The second batch of substrate solution goes in the UK.
15 3. Centrifugering Den fra prøvekanalen kommende væske centrifugeres i opfangningskammeret (AK) og med denne væske overskuddet af Fab-konjugat.15 3. Centrifugation The liquid coming from the sample channel is centrifuged in the capture chamber (AK) and with this liquid the excess of Fab conjugate.
Den anden substratportion holdes i UK.The second substrate portion is kept in the UK.
20 Den tredje substratportion befinder sig i doseringskammeret DK.The third substrate portion is in the dosing chamber DK.
3. Stilstand Den tredje substratportion føres til UK.3. Stagnation The third substrate portion is brought to the UK.
4. Centrifugering Portion 4 til DK4. Centrifugation Portion 4 for DK
Portion 3 til VK2.Portion 3 to VK2.
25 4. Stilstand Portion 4 til UK.25 4. Stationary Portion 4 for UK.
Portion 3 til felt d.Portion 3 to field d.
Den første vaskeportion befinder sig på reagensbærer 2.The first wash portion is on reagent carrier 2.
1919
DK 165860 BDK 165860 B
5. Centrifugering Portion 5 til DK.5. Centrifugation Portion 5 to DK.
Portion 4 til VK2Portion 4 to VK2
Portion 3 til AK.Portion 3 to AK.
5. Stilstand Portion 5 til UK.5. Standstill Portion 5 to the UK.
5 Portion 4 til d5 Portion 4 to d
Anden vaskeportion på reagensbærer 2.Second wash portion on reagent carrier 2.
6. Centrifugering Portion 6 til DK6. Centrifugation Portion 6 to DK
Portion 5 til VK2.Portion 5 to VK2.
Portion 4 til AK.Portion 4 to AK.
XO 6. Stilstand Portion 6 til UK.XO 6. Standstill Portion 6 to UK.
Portion 5 til d.Serving 5 to d.
Tredje vaskeportion på reagensbærer 2.Third wash portion on reagent carrier 2.
7. Centrifugering Portion 7 til DK.7. Centrifugation Portion 7 to DK.
Portion 6 til VK2.Portion 6 to VK2.
15 Portion 5 til AK.Portion 5 to AK.
7. Stilstand Portion 7 til UK..7. Standstill Portion 7 to UK ..
Portion 6 til d.Portion 6 to d.
Fjerde vaskeportion på reagensbærer 2.Fourth wash portion on reagent carrier 2.
8. Centrifugering Portion 8 til DK.8. Centrifugation Portion 8 to DK.
20 Portion 7 til VK2.Portion 7 to VK2.
Portion 6 til AK.Portion 6 to AK.
8. Stilstand Portion 8 til UK.8. Stand still Portion 8 to UK.
Portion 7 til d.Portion 7 to d.
25 Påvisningsportion på reagensbærer 2.25 Detection portion on reagent carrier 2.
I løbet af 5 min. spaltes substratet af det på reagensbærer 2 bundne enzym, dvs. en enzymmængde, der ved kompleksdannelsen er proportional med den tilsatte mængde 30 HCG, og der danner sig en farve, der kan måles.In 5 min. the substrate is cleaved by the enzyme bound to the reagent carrier 2, i. an amount of enzyme which in the complexation is proportional to the added amount of 30 HCG, forming a measurable color.
DK 165860BDK 165860B
20 9. Centrifugering Den fra reagensbærer 2 kommende væske fylder med en første aliquot AK fuldstændigt, og resten føres til kuvetten. I kuvetten foregår målingen af den dannede farve ved 5 578 nm.20 9. Centrifugation The reagent carrier 2 liquid is filled with a first aliquot AK completely and the remainder is fed to the cuvette. In the cuvette, the measurement of the color formed takes place at 5 578 nm.
Overførslen af prøven fra felt c til d foregår i løbet af meget kort tid 60 sek.). Det substratvolumen, der til sidst foreligger til påvisning, er ligeledes på 40 μΐ, således at lo der ikke på nogen måde foregår en prøvefortynding før signalmålingen.The sample is transferred from fields c to d within 60 seconds. The substrate volume eventually available for detection is also 40 μΐ, so that no sample dilution occurs before the signal measurement.
Under anvendelse af serum til kalibrering opnås kalibreringskurven på fig. 1, der omfatter intervallet fra 0-100 mU HCG/ml (standardiseret efter første IRP-standard for HCG) og mulig-15 gør en tilstrækkelig følsom måling af HCG i serum og plasma.Using serum for calibration, the calibration curve of FIG. 1, comprising the range from 0-100 mU HCG / ml (standardized according to the first IRP standard for HCG) and enabling a sufficiently sensitive measurement of HCG in serum and plasma.
Eksempel 3Example 3
Bestemmelse af α-1-fetoprotein (AFP).Determination of α-1 fetoprotein (AFP).
Anvendelse af en haptenmarkeret, første receptor, hvor samtlige tre antistoffer stammer fra samme dyreart.Use of a hapten-labeled, first receptor in which all three antibodies originate from the same animal species.
20 Gennemførelsen og de anvendte puffere svarer til de i eksempel 2 anvendte.The performance and the buffers used are similar to those used in Example 2.
Som receptor 1 anvendes anti-AFP-antistoffer fra får (100 ng/ml), der er markeret med digoxin (efter DE-patentskrift nr. 25 37 129), og som receptor 3 anvendes anti-AFP-antistof-25 fer fra får, markeret med /3-galactosidase ifølge den for HCG (eksempel 2) nævnte metode, og som fastfasekoblet receptor 2 anvendes små papirskiver af polyesterpapir, hvortil antistoffer mod digoxin fra får kobles adsorptivt. Coatningsmetoden svarer til den for plastrør kendte fremgangsmåde. Den opnåede 30 kalibreringskurve vises i tegningens fig. 2.As receptor 1, sheep anti-AFP antibodies (100 ng / ml) labeled with digoxin (according to DE patent no. 25 37 129) are used, and as receptor 3, sheep anti-AFP antibodies are used. , marked with β-galactosidase according to the method mentioned for HCG (Example 2), and as solid phase coupled receptor 2, small polyester paper wafers are used to which digoxin antibodies from sheep are adsorptively coupled. The coating method is similar to the method known for plastic pipes. The obtained calibration curve is shown in FIG. 2nd
2121
DK 165860 BDK 165860 B
Eksempel 4Example 4
Bestemmelse af thyreotropin (TSH).Determination of Thyrotropin (TSH).
Reagenser: 1. Inkubationspuffer (IP): 15 mM natriumphosphatpuffer, pH- 5 værdi 7,4, 154 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% RSA, pH-værdi 7,4.Reagents: 1. Incubation buffer (IP): 15 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 154 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% RSA, pH 7.4.
2. Receptor 1: Fåre-anti-TSH-antiserum: Råserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer omfattende 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage 10 over DEAE-cellulose. Den IgG-holdige fraktion befries derpå for de med TSH's α-kæde reagerende dele ved passage over en med HCG-påfyldt immunoadsorber. Eluatet føres til en med TSH påfyldt immunoadsorber. Efter vask af adsorberen foregår elueringen af de mod TSH immunoreaktive antistoffer 15 med 1 M propionsyre. Eluatet dialyseres derpå mod IP og opkoncentreres eventuelt ved ultrafiltrering.2. Receptor 1: Sheep anti-TSH antiserum: Raw serum is mixed up to 1.8 M with NH 2 SO 2. The precipitate is taken up in a buffer comprising 15 mM sodium phosphate, pH 7.0 and 50 mM NaCl, and the solution thus obtained is subjected to a passage 10 over DEAE cellulose. The IgG-containing fraction is then liberated from those parts reacting with the α-chain of TSH by passage over an HCG-loaded immunoadsorbent. The eluate is fed to an immunoadsorb filled with TSH. After washing the adsorber, the elution of the TSH immunoreactive antibodies 15 takes place with 1 M propionic acid. The eluate is then dialyzed against IP and optionally concentrated by ultrafiltration.
3. Receptor 3: Antistof-peroxidase-konjugat: Et yderligere fare-anti-TSH-antiserum oprenses som receptor 1, og derpå udvindes (Fab)ragmenter derfra. Fremstillingen af (Fab^” 20 fragmenterne foregår ifølge E. Lamoye et al. J. Immunol.3. Receptor 3: Antibody-Peroxidase Conjugate: A further danger anti-TSH antiserum is purified as receptor 1 and then (Fab) fragments are recovered therefrom. The preparation of the (Fab 1) 20 fragments is carried out according to E. Lamoye et al. J. Immunol.
Methods 56, 235-243 (1983). Koblingen med peberrodsper-oxidase foregår efter Nakanes metode (M.B. Wilson, P.K.Methods 56, 235-243 (1983). The coupling with horseradish peroxidase takes place according to Nakane's method (M.B. Wilson, P.K.
Nakane "Recent Developments in the Periodat Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Else-25 vier, North Holland Biomedical Press, side 215-224 i "Im munofluorescence and Related Staining Techniques").Nakane "Recent Developments in the Periodic Method of Conjugating Horseradish Peroxidase to Antibodies", 1978, Else-25 Four, North Holland Biomedical Press, pages 215-224 in "Im munofluorescence and Related Staining Techniques").
4. Receptor 2: Adsorbermateriale med fikseret æsel-antifåre-Fcy-antistof: Æsel-anti-fåre-Fcy-antiserum blandes indtil 1,8 M med NH^SO^. Præcipitatet optages i en puffer omfattende 30 15 mM natriumphosphat, pH-værdi 7,0 og 224. Receptor 2: Fixed donkey anti-Fcy antibody adsorber material: Donkey anti-sheep Fcy antibody serum is mixed up to 1.8 M with NH 2 SO 2. The precipitate is taken up in a buffer comprising 30 mM sodium phosphate, pH 7.0 and 22
DK 165860 BDK 165860 B
50 mM NaCl, og den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose. Den IgG-holdige fraktion (receptor 2) kobles med affinitetsadsorptionsmidlet, aktiveret med glutardialdehyd fra Boehringer Mannheim (Best.50 mM NaCl and the solution thus obtained is subjected to a passage over DEAE cellulose. The IgG-containing fraction (receptor 2) is coupled with the affinity adsorbent, activated with glutardialdehyde from Boehringer Mannheim (Best.
5 nr. 665 525) efter fabrikantens arbejdsforskrift.5 No. 665 525) according to the manufacturer's working regulations.
• 5. Indikatorreagens: 1,8 mM "ABTS1® (2,21-azino-di-3-ethyl- benzthiazolinsulfonat-(6), 3,3 mM natriumperborat i 100 mM phosphatcitratpuffer, pH-værdi 4,4.Indicator Reagent: 1.8 mM "ABTS1® (2,21-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate- (6), 3.3 mM sodium perborate in 100 mM phosphate citrate buffer, pH 4.4).
Gennemførelse: 10 Gennemførelsen svarer til den i eksempel 1 angivne fremgangsmåde, hvor der i dette tilfælde tildryppes 100 ng receptor 1 og 100 mU receptor 3, opløst i inkubationspuffer (40 μΐ) på et arkformet celluloseunderlag med størrelsen 6x6 mm. Efter tørring foregår lagringen af underlagene indtil deres 15 anvendelse igen ved 4°C.Execution: Execution is similar to the procedure described in Example 1, in which case 100 ng of receptor 1 and 100 mU of receptor 3 dissolved in incubation buffer (40 μΐ) are added onto a sheet-shaped cellulose substrate of size 6x6 mm. After drying, the substrates are stored until their use again at 4 ° C.
Den yderligere gennemførelse svarer til den i eksempel 1 viste arbejdsmetode. Som prøve anvendes 40 μΐ.The further implementation corresponds to the working method shown in Example 1. 40 μΐ is used as a sample.
Fig. 3 viser en således opnået kalibreringskurve.FIG. 3 shows a calibration curve thus obtained.
Claims (22)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843400027 DE3400027A1 (en) | 1984-01-02 | 1984-01-02 | Method for the determination of a polyvalent antigen and reagent therefor |
| DE3400027 | 1984-01-02 | ||
| DE19843425008 DE3425008A1 (en) | 1984-07-06 | 1984-07-06 | METHOD AND DEVICE FOR CARRYING OUT ANALYTICAL PROVISIONS |
| DE3425008 | 1984-07-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK2085D0 DK2085D0 (en) | 1985-01-02 |
| DK2085A DK2085A (en) | 1985-07-03 |
| DK165860B true DK165860B (en) | 1993-01-25 |
| DK165860C DK165860C (en) | 1993-06-21 |
Family
ID=25817348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK002085A DK165860C (en) | 1984-01-02 | 1985-01-02 | PROCEDURE FOR DETERMINING A POLYVALENT ANTIGEN AND A REAGENT THEREOF |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0147848B1 (en) |
| AU (1) | AU567998B2 (en) |
| CA (1) | CA1244761A (en) |
| DE (1) | DE3485265D1 (en) |
| DK (1) | DK165860C (en) |
| ES (1) | ES539297A0 (en) |
| IE (1) | IE58254B1 (en) |
| IL (1) | IL73938A (en) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3705686C2 (en) * | 1987-02-23 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methods for the determination of antibodies |
| US4825648A (en) * | 1987-03-02 | 1989-05-02 | General Electric Company | Turbofan engine having a split cowl |
| US4918025A (en) * | 1987-03-03 | 1990-04-17 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Self contained immunoassay element |
| DE3714147A1 (en) * | 1987-04-28 | 1988-11-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | IMMUNCHEMICAL METHOD AND REAGENT FOR DETERMINING A POLYVALENT ANTIGENT IN A LIQUID SAMPLE |
| DE3829245A1 (en) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR DETERMINING A SPECIFICALLY BINDABLE SUBSTANCE |
| EP0368674A3 (en) * | 1988-11-11 | 1991-10-09 | SANYO CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. | Immunoassay and test kits therefor |
| DE4120412C1 (en) * | 1991-06-20 | 1993-01-07 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
| DE4328070C1 (en) * | 1993-08-20 | 1994-11-24 | Henning Berlin Gmbh | Method for the determination of an analyte in a volume of a liquid sample, and its use for the determination of anti-TSH receptor autoantibodies in a patient's serum |
| US5695928A (en) * | 1993-12-10 | 1997-12-09 | Novartis Corporation | Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction |
| US5589344A (en) * | 1994-06-15 | 1996-12-31 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Test kit and method for competitive specific binding assay |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4292403A (en) * | 1978-08-24 | 1981-09-29 | Akzona Incorporated | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins |
| CA1160566A (en) * | 1980-04-25 | 1984-01-17 | Harald Gallati | Immunological determination method |
| DE3044385A1 (en) * | 1980-11-25 | 1982-06-24 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | METHOD FOR CARRYING OUT ANALYTICAL PROVISIONS AND ROTOR INSERT ELEMENT SUITABLE FOR THIS |
| DE3225027A1 (en) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | IMMUNCHEMICAL MEASUREMENT METHOD |
| DE3377531D1 (en) * | 1982-09-29 | 1988-09-01 | Serono Diagnostics Ltd | Immunoassay of antigens |
-
1984
- 1984-12-25 IL IL73938A patent/IL73938A/en unknown
- 1984-12-27 DE DE8484116335T patent/DE3485265D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-27 EP EP84116335A patent/EP0147848B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-01-02 AU AU37247/85A patent/AU567998B2/en not_active Ceased
- 1985-01-02 ES ES539297A patent/ES539297A0/en active Granted
- 1985-01-02 DK DK002085A patent/DK165860C/en not_active IP Right Cessation
- 1985-01-02 CA CA000471361A patent/CA1244761A/en not_active Expired
- 1985-01-02 IE IE785A patent/IE58254B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3724785A (en) | 1985-07-18 |
| DK165860C (en) | 1993-06-21 |
| ES8601479A1 (en) | 1985-11-16 |
| EP0147848A2 (en) | 1985-07-10 |
| ES539297A0 (en) | 1985-11-16 |
| IL73938A0 (en) | 1985-03-31 |
| DK2085A (en) | 1985-07-03 |
| IE58254B1 (en) | 1993-08-25 |
| DK2085D0 (en) | 1985-01-02 |
| DE3485265D1 (en) | 1991-12-19 |
| IE850007L (en) | 1985-07-02 |
| IL73938A (en) | 1989-09-28 |
| EP0147848B1 (en) | 1991-11-13 |
| EP0147848A3 (en) | 1988-06-22 |
| CA1244761A (en) | 1988-11-15 |
| AU567998B2 (en) | 1987-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Clark et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): theoretical and practical aspects | |
| US4624930A (en) | Immunochemical process | |
| US7241628B2 (en) | Method for immobilizing conjugates in diagnostic tests | |
| US4434236A (en) | Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue | |
| US4945042A (en) | Process and reagent for the determination of an antibody | |
| US4690907A (en) | Capillary tube immunoassay | |
| FI92879B (en) | Method and instrument for compensating for interfering factors in immunoassays | |
| CA1261745A (en) | Methods of assay | |
| US4350760A (en) | Method for the separation of a protein substance from a solution containing the same by affinity filtration and application of said method to enzymatic assays | |
| JPH0467914B2 (en) | ||
| JP2000508075A (en) | Luminescence-specific binding assay | |
| DK165860B (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING A POLYVALENT ANTIGEN AND A REAGENT THEREOF | |
| JP2001505999A (en) | Receptor binding assay for detecting TSH receptor autoantibodies | |
| JPH0670629B2 (en) | Method and reagent for measuring reaction components of immune reaction | |
| JPH0664060B2 (en) | Analyte detection method and detection agent | |
| EP0095089B1 (en) | Improved homogeneous binding assay method and reagent system, test kit and test device therefor | |
| EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
| SU1475492A3 (en) | Method of determining polyvalent antigen | |
| CA2008100A1 (en) | Method for the determination of immunologically detectable substance | |
| EP0396801A1 (en) | Simple method for immunological assay | |
| AU628298B2 (en) | Method for measuring human insulin | |
| US4885255A (en) | Immunochemical process and reagent for the determination of a polyvalent antigen in a liquid sample | |
| US4816390A (en) | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor | |
| US4820633A (en) | Process for production of an immune reactive, porous carrier material for heterogeneous immunological analysis | |
| DK163022B (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING AN IMMUNOLOGICAL BINDING ANALYST BY SANDWICH ANALYSIS AND MEASURING REVERSE DISSOLUTION RATE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |