FI92879B - Menetelmä ja väline immuunikokeissa esiintyvien häiriötekijöiden kompensoimiseksi - Google Patents

Description

92879

Menetelmä ja väline immuunikokeissa esiintyvien häiriötekijöiden kompensoimiseksi 5 Keksintö kohdistuu parannettuun menetelmään immunologisesti sitoutumiskykyisen polyvalentin substanssin määrittämiseksi vähintään kahden immunologisesti sitoutumiskykyiselle substanssille spesifisen reagoivan aineen läsnäollessa ja inhibiittorin läsnäollessa häiriötekijöiden kompensoimiseksi ihmi-10 sen seeruminäytteissä sekä siihen sopivaan reagenssiin.

Immunologisesti sitoutumiskykyisten substanssien, kuten esimerkiksi polyvalenttien antigeenien (peptidit, proteiinit, polysakkaridit, virukset, bakteerit, spesifiset solut), herkkä 15 määrittäminen käyttämällä kahta tai mahdollisesti useampaa vasta-ainetta, jotka on suunnattu ulottuvuudeltaan erilaisia antigeenideterminantteja vastaan, on tunnettua immuuniradio-metrisena, vast, immuunientsymometrisenä kerroskokeena (two-site- immunoassay) . Tämän tunnetun määrittelymenetelmän suorit-20 taminen on käyttökelpoisina silloin, kun määritettävä antigeeni (näyte), jossa on toinen vasta-aine, joka on joko kiin-tofaasissa sidottuna sopivaan kantoaineeseen, kuten sefaroo-siin, agaroosiin, muoviputkiin tai niiden kaltaisiin, tai homogeenisena, kuten esimerkiksi biotinoituna liuoksessa, ja 25 määrätty määrä toista tai muita merkittyjä vasta-aineita in-·, kuboidaan nestefaasissa. Toisen ja mahdollisesti muiden vasta- aineiden spesifisyys valitaan edullisesti siten, että ne on suunnattu muita määritettävän antigeenin determinantteja vastaan kuin ensimmäisen vasta-aineen, jotta suljetaan pois vas-30 ta-aineiden välinen kilpailu samoista sitoutumispaikoista määritettävään antigeeniin, koska tällöin testiherkkyys pienenisi. Sekä toinen kiintofaasiin sidottu, vast, biotinoitu, että toinen, vastaavasti muu liuoksessa oleva, merkitty vasta-aine lisätään ylimääränä. Kulloinenkin antigeeni voidaan määrittää 35 joko ensimmäiseen vasta-aineeseen kiinnittyneenä tai liuokseen jääneenä, ei-immunologisesti sitoutuneena toimintana. Jälkimmäisessä tapauksessa on välttämätöntä lisätä määrätty määrä merkittyä toista vasta-ainetta.

2 92879

Vaadittujen spesifisyyksien takia käytetään immunologisiin kerroskokeisiin erityisesti monoklonaalisistä vasta-aineista (MAK) johdettuja täydellisiä IgG:itä, vast, niiden immunolo-gisesti reaktiivisia fragmentteja (Fab, F(ab')2). On kuitenkin 5 mahdollista liittää näihin testeihin immunoreaktiivisia aineosia, jotka voidaan johtaa polyklonaalisista vasta-aineista (PAK).

Vaikka kuvatuissa two-site-immuunitesteissä käytetään määri-10 tettäviä analyyttejä varten spesifisiä vasta-aineita, tavataan merkittävän usein ihmisen seeruminäytteitä, jotka saavat aikaan ei-spesifisiä reaktioita. Nämä johtavat vääriin testituloksiin, jotka johtavat vakaviin seurauksiin terapeuttisten toimenpiteiden osalta. Ei-spesifisten reaktioiden esiintyminen 15 kytkeytyy näytteessä esiintyviin substansseihin, jotka sitovat spesifisiä immunoglobuliinireagensseja (häiriötekijät), samoin kuten määritettävä analyytti (polyvalentti antigeeni) kuitenkin eri tartuntapisteisiin.

20 Tavallisesti lisätään sen tähden tällaisiin immuunikokeisiin ehkäisevästi ylimäärä samasta eläinlajista, kuin mistä spesifiset vasta-aineet ovat peräisin, olevia ei-spesifisiä immu-noglobuliineja tai immunoglobuliinifragmentteja (yleensä on tällöin kysymyksessä immunoglobuliini G, IgG) (G. M. Addison, 25 Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine, Voi 1, ·· 131-147 (1974), EP-A 0174 026). Siitä lähtien kun on käytetty spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat tavallisesti peräisin hiirestä, on immuunikokeissa tarvittu mainituissa häiriönpoistotoimenpiteissä suuria määriä ei-spesifistä 30 hiiren IgGrtä hiiren seerumina, hiiren vesivatsana tai eristettynä hiiren immunoglobuliinina (noin 300-500 ^g/ml; Clin. Chem. 32, 1491-1495 (1986)). Esimerkiksi EP-A 0174 026:n mukaan häiriöiden täydellinen kompensaatio saavutetaan lisäämällä noin 30 μΐ/ml relevanttia, ei-spesifistä hiiren, vast, ro-35 tan IgG:tä erilaisiin immuunikokeisiin pelkästään tiettyjen seerumien ja tiettyjen tapauksien (negatiiviset näytteet) yhteydessä. Hiiren IgG:n valmistaminen tarvittavana kilomääränä ei ole kuitenkaan mahdollista parhaillaan käytettävissä ole- il 3 92879 villa menetelmillä taloudellisesti mielenkiintoisilla edellytyksillä ja lisäksi se on eettisistä syistä kriittistä.

Oleellinen toimenpide häiriöiden välttämiseksi mainitunlaisis-5 sa immuunikokeissa on Fab-, vast. F (ab' )2-fragmenttien käyttö vähintään yhtä immuunikokeessa käytettyä spesifistä vasta-ainetta kohti. Tällöin poistetaan kaikki näytteessä olevat häiriötekijät, jotka kohdistuvat IgG:n Fc-osiin (reumatekijät, anti-Fc-immunoglobuliini, kuten esim. IgM), riistetään niiden 10 tartuntapisteet spesifisiltä immunoreagensseilta, ja täten niitä ei tarvitse kompensoida.

Kuitenkin monissa ihmisen seerumeissa esiintyy immuunikokeissa edelleen häiriöitä huolimatta käytetyistä Fc-vapaista spesifi-15 sistä vasta-ainereagensseista. Nämä ovat palautettavissa seerumissa oleviin substansseihin, jotka kohdistuvat Fab:iin, vast. F(ab')2:een. EP-B 0083 869:n mukaan tunnistavat tällaiset häiriötekijät kuitenkin vain Fab-alueet, kun ne on erotettu Fc-osasta. Nämä voidaan jättää pois vastaavissa immuunikokeis-20 sa lisäämällä luontaisia tai verkkoutettuja määritettävälle antigeenille ei-spesifisiä Fab-, vast. F(ab' )2-fragmentteja. Tällöin on aggregoituneilla Fab-, vast. F (ab') 2-fragmenteilla verrattuna luontaisiin aineosiin 2-3-kertainen häiriönpoisto-kyky. Täydelliset ei-spesifiset IgG:t eivät aiheuta EP-B 0083 25 869:n mukaan eivät luontaisessa eivätkä myöskään aggregoitu- neessa muodossa mainituissa immuunikokeissa mitään häiriön-poistoa. Lisäksi menetelmällä on oleellisena haittana, että tällöin tarvitaan määritettävälle antigeenille spesifisten immunoglobuliinireagenssien ohella melkoisia määriä arvokkaam-30 pia, ei-spesifisiä immunoglobuliinireagensseja, mikä tuo mukanaan huomattavia taloudellisia sekä eettisiä ongelmia. Lisäksi häiriönpoistoon tarvitsee lisätä esimerkiksi vähintään 100 μg/ml vaikuttavaksi osoittautuneita aggregoituneita ei-spesifisiä Fc-vapaita immunoglobuliinifragmentteja.

35

Keksinnön tehtävänä on sen tähden antaa käyttöön uusia mahdollisuuksia ei-spesifisten reaktioiden kompensoimiseksi immuuni-♦ kokeissa, joissa on Fc-pitoisia ja Fc-vapaita spesifisiä vasta -ainereagenssejä spesifisinä reagoivina aineina, jolloin 4 92879 poistetaan luotettavasti täydellisiin IgG:ihin ja Fab-, vast.

F (ab') 2-fragmentteihin kohdistuvat ihmisen seerumissa olevat häiriötekijät sekä eettisistä näkökohdista katsoen parannettujen testijärjestelmien taloudellinen hyväksikäyttö.

5 Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmällä ensimmäisen eläinlajin tai ihmisen biologisessa nesteessä olevan immunologisesti sitoutumiskykyisen substanssin määrittämiseksi toisen eläinlajin vähintään kahden immunologisesti si-10 toutumiskykyiselle substanssille spesifisen vasta-aineen läsnäollessa, jotka ovat vasta-aineita, joista vähintään yksi on Fab-, vast. F (ab' )2-fragmentti, ja inhibiittorin läsnäollessa häiriötekijöiden kompensoimiseksi, jolloin on tunnusomaista, että reaktiosekoitus saatetaan kosketuksiin 0,1-50 ^g/ml:n 15 immunologisesti sitoutumiskykyiselle substanssille ei-spesi-fisten, toisen tai kolmannen eläinlajin monoklonaalisistä tai polyklonaalisista vasta-aineista johdetun aggregaatin, jonka molekyylipaino on 320 000 daltonia tai enemmän, kanssa häiriötekijöiden kompensoimiseksi.

20

Immunologisesti sitoutumiskykyisillä substansseilla tarkoitetaan erityisesti polyvalentteja antigeenejä, kuten peptidit, proteiinit, polysakkaridit, virukset, bakteerit ja muut spesifiset solut, vast, niiden aineosat. Spesifisinä reagoivina 25 aineina kulloinkin määritettävää immunologisesti sitoutumis-kykyistä substanssia varten voidaan käyttää sekä polyklonaa-lisia että myös monoklonaalisia vasta-aineita, edullisesti käytetään tällöin IgGritä ja niiden immunoreaktiivisia aineosia kuten Fab-, vast. F (ab') 2- fragment te j a kombinoituina. Eri-30 tyisen edullista on kahden tai mahdollisesti useamman spesifisen reagoivan aineen käyttö, joista aineista vähintään yksi Fab-, vast. F (ab') 2-fragmentti ja muut spesifiset reagoivat aineet ovat täydellisiä IgGritä.

35 Immunologisesti sitoutumiskykyiselle substanssille ei-spesi-fisinä vasta-aineaggregaatteina häiriöiden kompensoimiseksi käytetään edullisesti immunologisesti sitoumiskykyiselle substanssille ei-spesifisten IgG:iden aggregaatteja, erityisen edullisesti IgG-aggregaattia, joka koostuu ei-spesifisestä li 5 92879

IgGrstä ja toisesta makromolekyylistä. Tällöin ovat edullisia ei-spesifiset IgG:t, jotka ovat peräisin samasta eläinlajista kuin vähintään yksi spesifisistä reagoivista aineista. Makromolekyyleiksi sopivat tällöin esimerkiksi Fab-, vast.

5 F(ab'^-fragmentit, so. Fc-vapaat IgG-fragmentit, jotka voivat olla peräisin hiirestä tai muusta lajista johdettavissa olevista MAK:ista tai PAK:ista, kuten proteiinit (esim. albumiini), polysakkaridit (esim. dekstraani) tai muut veteen liukenevat polymeerit. Lisäksi häiriöiden kompensointiin voi-10 daan käyttää heteropolymeerejä, jotka muodostetaan esimerkiksi hiiren IgG:stä silloittavan naudan IgG:n avulla. Erityisen edullisesti käytetään aggregaatteja, jotka koostuvat IgG-mo-lekyylistä ja Fc-vapaasta IgG-fragmentista, jolloin sekä IgG:t että Fc-vapaat IgG-fragmentit ovat peräisin samasta 15 eläinlajista kuin yksi spesifisistä reagoivista aineista. Tällaisilla IgG/Fab-, vast. F(ab' ^-polymeereillä on jopa noin 3 kertaa parempi häiriönpoistovaikutus kuin puhtailla IgG-aggregaateilla. Yksittäisistä seeruminäytteistä riippuen riittää 0,1-50 yg/ml IgG-sekapolymeeriä menestyksekkääseen 20 häiriönpoistoon, edullisesti työskennellään kuitenkin 5-25 pg/ml:n pitoisuuksilla, erityisen edullisesti 5 - enintään 10 pg/ml:n pitoisuuksilla, koska useimmissa tapauksissa jo paljon vähäisempi ei-spesifisen IgG-aggregaattien lisäys on täysin tehokas.

25 Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti käytetään ih-“ misen seerumeissa olevien häiriötekijöiden kompensointiin ei- spesifisiä homopolymeerisiä tai heteropolymeerisiä IgG-aggre-gaatteja tai IgG/Fab-, vast. F(ab'^-äggregäatteja, joiden molekyylipaino on 320000 daltonia ei enemmän. Tällöin IgG-30 aggregaatit sisältävät sen lajin IgG:tä, josta lajista vähintään yksi spesifisistä reagoivista aineista on peräisin ja * ne kuuluvat edullisesti samaan alaluokkaan kuin vähintään yksi spesifisistä reagoivista aineista. Tällöin käytetään edullisesti polymeerisiä IgG-preparaatteja, joiden molekyyli-35 paino on 320000 - 10 miljoonaa daltonia, jolloin seerumihäi-riöiden kompensointivaikutus kasvaa molekyylipainon kasvaessa. Erityisen edullisia keksinnön suoritusmuotoja ovat two-si te-immuunikokeet, joissa on kahta tai useampaa spesifistä 6 92879 hiiren, vast, rotan MAK-reagoivaa ainetta, joista vähintään yksi reagoiva aine on Fab- tai F{ab'^-fragmentti ja vähintään yksi toisista reagoivista aineista on Fc-pitoinen IgG, joissa häiriötekijöiden kompensointiin käytetään homopolymee-5 risiä tai heteropolymeerisiä ei-spesifisiä IgG-aggregaatteja tai IgG/Fab-, vast. F(ab1>2-aggregaatteja, joiden molekyyli-paino on suurempi kuin 320000 daltonia, jolloin ei-spesifis-ten aggregaattien sisältämät IgG:t ja Fab-, vast. F(ab')2-fragmentit ovat monoklonaalisia ja ne ovat samasta lajista 10 ja alaluokasta kuin vähintään yksi spesifisistä reagoivista aineista. Tällöin on samantekevää, onko ei-spesifinen IgG, vast. Fab-fragmentti valmistettu vesivatsasta, fermentoimalla vaiko geenitekniikalla mikro-organismeissa ilmentämällä.

Keksinnön menetelmän mukaiset häiriöiden kompensointiin sopi-15 vat polymeroidut ei-spesifiset IgG-molekyylit, vast, ei-spe-sifiset IgG/Fab-, vast. F(ab'^-aggregaatit täytyy johtaa toisesta lajista kuin analysoitava näyte. Yleensä käytetään immunologisia määritysmenetelmiä ihmisen seerumin analysointiin spesifisten, hiirestä johdettavissa olevien monoklonaa-20 listen vasta-aineiden, vast, niiden immunorektiivisten fragmenttien avulla. Spesifiset vasta-ainereagenssit voivat olla kuitenkin toisesta eläinlajista. Häiriönpoistoon käytetyt ei-spesifiset vasta-aineaggregaatit voivat olla peräisin vastaavasti hiirestä tai toisen, ensimmäisestä eroavan eläinlajin 25 aggregaattien kombinaatio hiiren IgG:n, vast, sen Fab-frag-menttien kanssa. Esimerkiksi voidaan käyttää hiiren IgG / naudan IgG -heteropolymeeriä (s.o.) häiriöiden poistoon im-muunikokeissa, joissa käytetään spesifisenä vasta-ainerea-genssina hiiren MAKiitä, vast, hiiren IgG:itä.

30 Käyttämällä keksinnön mukaisesti ei-spesifisiä IgG-aggregaat-teja, vast IgG/Fab-, vast F(ab' ^-aggregaatteja saavutetaan verrattaessa luontaisiin IgG:ihin noin 20-100 kertaa ja verrattaessa luontaisiin tai aggregoituihin Fc-vapaisiin IgG-fragmentteihin noin 20-1500 kertaa, vast, noin kolminkertai-35 sesti parantunut vaikutus ei-spesifisten reaktioiden kompensoimiseksi immuunikokeissa, joissa on vähintään kaksi määritettävälle immunogeenille spesifistä reagoivaa ainetta, jois- li 7 92879 ta vähintään yksi johdetaan Fab-, vast F(ab'^-fragmentista. Tämä on yllättävää, koska ennalta ei ollut odotettavissa, että IgG-pitoiset ei-spesifiset reagoivat aineet toimivat ylipäätään Fab-, vast. F(ab')2-fragmentteihin kohdistuneiden 5 häiriöiden kompensoimiseksi immuunitesteissä, joissa Fc-va-paat spesifiset immunoglubuliinireagenssit ovat monoklonaa-listen tai polyklonaalisten vasta-aineiden osana. Lisäksi EP-B 0083869 ohjaa asiantuntijaa tekniikan lähimpään tasoon pikemminkin kuin päinvastaiseen otaksumaan. Sillä tässä patent-10 tiselostuksessa painotetaan ilmeisesti, että sekä luontaisilla että aggregoiduilla IgG:illä ei ilmene mitään häiriöitä poistavaa vaikutusta siinä mainitussa immunologisessa agglu-tinaatiotestissä ja että häiriöiden poistamiseksi pitää myös spesifistä agglutinaatiota varten lisättyjen aineiden olla 15 IgG-vapaita.

Ei-spesifinen IgG voidaan verkkouttaa itsensä tai vasta-aine-fragmenttien, kuten proteiinien, polysakkaridien tai muiden veteen liukenevien makromolekyylien kanssa kuumentamalla, kemiallisesti tai ei-kovalenttisesti bioaffiinisen vuorovai-20 kutuksen avulla kirjallisuudesta tunnettujen menetelmien mukaisesti. Jokaisessa tapauksessa suntyy vesipitoisiin puskuriliuoksiin liukenevia aggregaatteja. Kemiallinen verkkout-taminen voi tapahtua esimerkiksi homo- tai heterobifunktio-naalisilla kemiallisilla liitoshaaroilla (liittäjä), prote-25 iinin tai aktivoidun dekstraanin avulla tai IgG-molekyylin • · ’ ’ vast, sen ja/tai muiden Fc-vapaiden fragmenttien itseverkkou- tuksella karbodi-imidin kanssa. Sen lisäksi on mahdollista verkkouttaa vasta-ainemonomeerit disulfidireduktiolla ja re-oksidaatiolla tai sen hiilihydraattiosan oksidaatiolla itsen-30 sä kanssa tai sopivan makromolekyylin kanssa. Kemiallisena liittäjänä tulee kyseeseen esimerkiksi bis(maleinimido)metyy-liesteri, dimetyyli-suberimidaatti, disukkinimidyyli-sube-raatti, glutaaridialdehydi, N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyli-ditio)propionaatti, N-5-atsido-2-nitrobentsoyylisukkinimidi, 35 N-sukkinimidyyli(4-jodiasetyyli)-aminobentsoaatti tai malein-imidoheksanoyylisukkinimidaatin ja S-asetyyli-merkaptomeri-, pihkahappoanhydridin, vast, analogisten yhdisteiden kombinaa- a tio. Aktivoidun dekstraanin valmistus voi tapahtua esimerkik- 92879 8 si määrätyn molekyylipainon aminodekstraanista maleinimido-heksanoyylisukkinimidaatin kanssa, joka verkkoutetaan seuraa-vaksi merkaptoasetyylillä johdetuilla ei-spesifisillä IgG-molekyyleiliä. BioaffUnisella vuorovaikutuksella tarkoite-5 taan yleisesti sellaisia sidoksia, kuten pareissa biotiini/-avidiini (streptavidiini), hapteeni/anti-hapteeni-vasta-aine, antigeeni/anti-antigeeni-vasta-aine, ligandi/sitojapro-teiini (esim. tyroksiini / tyroksiiniä sitova proteiini), hormoni/reseptori esiintyy. Sopiva suoritusmuoto saadaan bio-10 tinoimalla vähintään kaksi kertaa ei-spesifinen IgG ja lisäämällä streptavidiinia tai johtamalla IgG vähintään kahdella digoksigeniinimolekyylillä ja verkkouttamalla monoklonaali-sella tai polyklonaalisella anti-digoksiini-vasta-aineella. Samaten ovat sopivia aggregaatit, jotka syntyvät muuttamalla 15 poly-humaani-albumiini monoklonaalisella anti-humaani-albu-miinivasta-aineella.

Kulloinkin saadut aggregaattiraakaseokset voidaan käyttää suoraan dialyysin jälkeen tai esimerkiksi ne voidaan erottaa geelisuodatuksella fraktioiksi, joiden molekyylipaino on kas-20 vava ja käyttää seuraavaksi suoraan häiriötekijöiden kompensoimiseen immuunikokeissa.

Eräs testiseokseen lisätyistä spesifisistä reagoivista aineista, edullisesti Fc-pitoinen IgG-vasta-aine, sidotaan sitten ammattimiehen tuntemalla tavalla kiinteässä faasissa kan-25 toaineeseen, kuten esimerkiksi agaroosiin tai muoviputkeen tai niiden kaltaiseen tai se on esimerkiksi biotiiniin sidottuna nestefaasissa. Jos käytetään biotinoitua vasta-ainetta, muodostetaan seuraavaksi kompleksi antigeenistä ja toisesta merkitystä spesifisestä reagoivasta aineesta, joka sidotaan 30 sitten in situ biotiinia sitovalla proteiinilla, kuten esimerkiksi avidiinilla tai streptavidiinilla, päällystettyyn kantoaineeseen. Tällöin ovat kuitenkin myös muut testaukset mahdollisia ensimmäisellä biotinoidulla vasta-aineella; antigeeni reagoi biotinoidun MAK:n kanssa ja sidotaan in situ tai 35 määrätyn esi-inkubointiajanjakson jälkeen biotiinia sitovaan kiintofaasiin ja saatetaan vasta sitten kosketuksiin toisen : spesifisen reagoivan aineen kanssa. Tai on mahdollista, että il 9 92879 reagoitetaan ensiksi antigeeni toisen spesifisen reagoivan aineen kanssa ja sitten biotinoidun vasta-aineen kanssa. Toisen ja mahdollisesti muiden spesifisten reagoivien aineiden, jotka ovat edullisesti Fc-vapaita IgG-fragmentteja, merkit-5 seminen tapahtuu kytkemällä entsyymillä fluoresoiva, kemilu-minoiva tai radioaktiivinen substanssi. Ammattimies tuntee tällaiset vasta-ainejohdannaisten merkitsemismenetelmät, esimerkiksi E. Ischikawa et ai., J. of Immunoassay 4_:stä (1 983) 209-327, ja niitä ei tarvitse selostaa tässä tarkemmin.

10 Keksinnön toisena kohteena ovat diagnostiset välineet immuno-logisesti sitoutumiskykyisten polyvalenttien substanssien määrittämiseksi two-site-immuunikokeissa, jotka sisältävät kuvattuja ei-spesifisiä vasta-aineaggregaatteja. Diagnostinen väline sisältää kahden tai mahdollisesti useamman spesifisen 15 vasta-aineen, joista yksi on IgG-molekyyli ja vähintään yksi on Fc-vapaa IgG-fragmentti, ohella sopivan puskurijärjestelmän ja kuvatut ei-spesifiset vasta-aineaggregaatit sekä mahdollisesti muita tavanomaisella tavalla käytettyjä apuaineita, kuten esimerkiksi reaktionkiihdyttimiä, pinta-aktiivisia 20 aineita ja stabilisaattoreita. Sopivana puskurijärjestelmänä voidaan käyttää esimerkiksi 20-60 mM fosfaattipuskuria (pH 7,0) tai 50 mM HEPES / 1 00 mM NaCl-puskurijärjestelmää. Reak-tionkiihdyttimenä tulee tällöin kyseeseen esimerkiksi deks-traanisulfaatti tai polyetyleeniglykoli 6000-4000, pinta-ak-25 tiivisena aineena esim. Triton x-100, Tween 20 tai Pluronic : F 68 ja sopivana stabilisaattorina fenoli, oksipyrioni, klor- asetamidi, mertiolaatti jne.

Diagnostinen väline sisältää ei-spesifisiä vasta-aineaggregaatteja, joiden molekyylipaino on 320000 daltonia ja sen .. 30 yli, edullisesti 10 miljoonaan daltoniin saakka, 0,1-50 μg/ml:n, edullisesti 5-25 μΐ/mlln ja erityisen edullisesti 5-10 μg/ml:n pitoisuiidessä.

Diagnostinen väline voi olla liuoksen tai kuivan kemiallisen reagenssin, joka on imeytetty imukyiseen kantoaineeseen, tai 35 avoimen kalvon muodossa.

10 92879

Keksinnön mukainen liuoksen muodossa oleva diagnostinen väline, joka on kyseisessä tapauksessa puskuroitu haluttuun pH-arvoon, sisältää edullisesti kaikki kokeessa tarvittavat rea-genssit. Säilyvyysyistä voi olla edullista jakaa tarvittavat 5 reagenssit kahteen tai useampaan liuokseen, jotka sekoitetaan vasta varsinaisessa tutkimuksessa. Tällöin on merkityksetöntä, ovatko spesifiset vasta-aineaggregaatit erillään sopivassa puskurijärjestelmässä tai/ja ovatko ne toisen tai/ja molempien, vast, muiden spesifisten vasta-aineiden kanssa.

10 Testiliuskan muodossa olevan diagnostisen välineen valmistamiseksi impregnoidaan imukykyinen kantoaine, edullisesti suodatinpaperi, selluloosa tai tekokuitumatto tarvittavien, tavanomaisesti testiliuskojen valmistamiseen käytettyjen rea-genssien liuoksella helposti haihtuvissa liuottimissa, kuten 15 esim. vesi, metanoli, etanoli tai asetoni. Tämä voi tapahtua yhdessä impregnointivaiheessa. Usein on kuitenkin tarkoituksenmukaista toteuttaa impregnointi useammissa vaiheissa, jolloin käytetään liuoksia, jotka sisältävät kulloinkin osan diagnostisen välineen aineosista.

20 Testiliuskan muodossa olevan diagnostisen välineen valmistamiseksi voidaan käyttää avointa kalvoa, joka sisältää kalvon-muodostajan ja pigmenttien ohella spesifisiä vasta-aineita, vast, -fragmentteja, kuvattuja ei-spesifisiä vasta-aine(fragmentti ) aggregaatteja, sopivan puskurijärjestelmän ja muita 25 diagnostisiin välineisiin tavallisesti käytettyjä lisäaineita.

Valmiit testipaperit tai testikalvot voidaan käyttää sellaisenaan tai ne kiinnitetään sinänsä tunnetulla tavalla kanta-jakalvoihin tai ne sinetöidään edullisesti muovien ja hieno-30 silmäisten verkkojen väliin DE-patenttijulkaisun 2118455 mukaisesti ja ne saatetaan yhteyteen tutkittavan ruumiinnesteen (esim. veri, plasma, seerumi) kanssa.

Keksintö sopii kaikkien antigeenien, joissa on vähintään kaksi antigeenideterminanttia, määrittämiseen. Esimerkkejä tästä 35 ovat tyreotropiini (TSH), karsinoembryonaalinen antigeeni

II

„ 92879 (CEA), hepatiittivirukset (hepatiitti B -pinta-antigeeni, HBs), 1-fetoproteiini (AFP), ihmisen koriongonatropiini (HCG), luteinoiva hormoni (LH), follikkelia stimuloiva hormoni (FSH), fi2-mikroglobuliini, hapan prostatafosfataasi, 5 prolaktiini, ferritiini ja insuliini.

Seuraavat esimerkit selostavat keksintöä edelleen:

Esimerkki 1

Monoklonaalisen hiiren IgG-aggregaatin valmistaminen verk-kouttamalla homobifunktionaalisella reagenssilla 10 Monoklonaalinen MAK33-IgG (>95 % puhdas; alaluokkakoostumus K, ^1 ; spesifisyys anti-kreatiinikinaasi) eristetään vesivat-sanesteestä ammoniumsulfaattisaostuksella ja kromatografiällä DEAE-ioninvaihtimessa (katso A. Johnstone ja R Thorpe, Immu-nochemistry in practice, Blackwell Scientific Publications 15 1982, sivu 44-45).

50 mg IgG:tä liuotetaan 3 mljaan 0,025 M bikarbonaatti/kar-bonaattipuskuria, pH 9,5. Tähään liuokseen pipetoidaan 17 μΐ 12,5-%:ista glutaaridialdehydiliuosta ja sitä inkuboidaan 2 h 25 °C:ssa. Seuraavaksi liuos jäähdytetään jääkylvyssä ja 20 säädetään 50 mM trietanoliamiinipuskurilla pHrhon 8,2. Tähän liuokseen lisätään 0,6 ml juuri valmistettua natriumboorihyd-ridiliuosta (8 mg natriumboorihydridiä / 1 ml kahdesti tis-’’ lattua vettä) ja inkuboidaan edelleen 2,5 h 0 °C:ssa. 16 h:n dialyysillä 0-4 °C:ssa 10 mM fosfaattipuskuria vasten, pH 25 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl, poistetaan ylimääräiset rea- genssit. Dialysaatti konsentroidaan ultrasuodattamalla 1,25 ml:n tilavuuteen. Tämän konsentraatin osa (raakaseos) käytetään suoraan häiriöiden poistoon; 1,0 ml siitä kromatografoi-daan geelisuodatuspylväässä, jossa on AcA22-täyte (LKB). Pyl-30 vään mitta 2 x 40 cm; käyttöpuskuri 10 mM fosfaatti / 100 mM NaCl, pH 7,5. Pylväseluaatin proteiinipitoisuus tutkitaan UV-monitorilla 280 nm:ssä ja fraktonoidaan. Koko proteiinipitoi-sen eluaatioalueen fraktiot yhdistetään 4 yhteenliittymäksi, joiden tilavuus on sama. Tarkistamalla geelikromatografiapyl-35 väät tunnetun molekyylipainoisilla proteiineilla voidaan jär- 12 92879 jestää yhteenliittymät, joiden molekyylipainoalueet ovat 160000-400000, 400000-1000000, 1-2 miljoonaa ja 2-10 miljoonaa. Yhteenliittymien konsentroinnin noin 2 mg/ml:aan jälkeen voidaan eri molekyylipainoiset IgG-aggregaattiliuokset käyt-5 tää häiriöiden poistoon.

Esimerkki 2

Monoklonaalisen hiiren IgG-aggregaatin valmistaminen verkout-tamalla hetobifunktionaalisella reagenssilla a) MAK33-IgG-MH:n (maleinimidoheksanoyyli-MAK33-IgG) valmis-10 taminen

100 mg MAK33-IgG:tä liuotetaan 4 ml jaan 30 mM fosfaattipuskuria, pH 7,1. Tähän liuokseen pipetoidaan 20 μΐ (4 μπιοο1χ3) 0,2 M maleinimidoheksanoyylisukkinimidaatin dimetyylisulfok-sidiliuosta. Reaktioseosta inkuboidaan 1 h 25 °C:ssa, sitten 15 sitä dialysoidaan 16 h vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH

6,1, joka sisältää 50 ml NaCl, 0-4 °Cjssa. Saadaan 4,45 ml liuosta, jossa on 22 mg MAK33-IgG-MH/ml.

b) MAK33-IgG-SAMS:n (S-asetyylimerkaptosukkinyyli-MAK33-IgG) valmistaminen 20 100 mg MAK33-IgG:tä liuotetaan 4 mljaan 0,1 M fosfaattipus

kuria, pH 8,0. Tähän liuokseen pipetoidaan 40 μΐ 0,25 M S-asetyyli-merkaptomeripihkahappoanhydridin dimetyylisulfok-sidiliuosta. Reaktioseosta inkuboidaan 1 h 25 °C:ssa, sitten sitä dialysoidaan 16 h vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH

25 6,1, joka sisältää 50 mM NaCl, 0-4 °C:ssa. Saadaan 4,45 ml, jossa on 21,8 g MAK33-IgG-SAMS/ml.

c) MAK33-IgG-MH:n verkkouttaminen MAK33-IgG-MS:llä (merkap-to sukkinyy1i-MAK33-IgG) 50 mg MAK33-IgG-SAMS:ä laimennetaan 15 mg/ml:n pitoisuuteen 30 25 mM fosfaattipuskurissa, pH 6,5, joka sisältää 2 mM etylee- nitetra-asetaattia (puskuri A). Tähän liuokseen pipetoidaan 75 μΐ 1 M hydroksyyliamiiniliuosta ja sitä inkuboidaan 20 min

II

92879 1 3 25 °C:ssa.

3 ml tätä liuosta, jossa on 44 mg MAK33-IgG-MS, laimennetaan puskurilla A 6,0 mlraan. Tähän liuokseen lisätään 88 mg MAK33-IgG-MH:ä. Seosta inkuboidaan 40 min 25 °C:ssa, sitten 5 sekoitetaan kysteiiniä 2 M:een. 30 minuutin 25 °C:ssa lisä-inkuboinnin jälkeen lisätään 5 mM:een N-metyylimaleinimidiä ja pidetään edelleen 1 h 25 °C:ssa. Reaktioliuos dialysoidaan vasten 10 mH fosfaattipuskuria, pH 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl. Dialysaatti konsentroidaan ultrasuodattamalla 35 mg/-10 ml:n proteiinipitoisuuteen ja siitä poistetaan sentrifugoi-malla vähäinen sameus. Kuvio 1 esittää MAK33-IgG-aggregaatin tällaisen dialysaatin tavanomaista molekyylipainojakaumaa. Aggregaattiseos voidaan käyttää suoraan tai molekyylipaino-fraktioihin erottamisen (AcA22-kromatografia kuten esimerkis-15 sä 1) jälkeen häiriöiden poistoon.

Esimerkki 3 MAK33-IqG-agqregaatin valmistaminen verkkouttamalla amino-dekstraanin avulla a) S-asetyylitioasetyyli-aminodekstraanin valmistaminen 20 100 mg aminodekstraania (Dekstran T40, Pharmacia; 28 amino-

ryhmää / molekyylipaino 40000) liuotetaan 4 ml:aan fosfaatti-puskuria, pH 7,1. Tähän liuokseen pipetoidaan 0,25 ml 0,2 M

>»· ' S-asetyylitioasetyylisukkinimidaatin dimetyylisulfoksidiliu- osta. Reaktioseosta inkuboidaan 1 h 25 °C:ssa, sitten se dia-25 lysoidaan vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH 6,1, joka sisältää 50 mM NaCl. Saanto 90 mg S-asetyylitioasetyyli-aminodeks-traania 4,5 ml liuoksessa.

b) MAK33-IgG-MH;n verkkouttaminen tioasetyyli-aminodekstraa-nilla 30 2 ml;n liuos, jossa on 20 mg/ml S-asetyylitioasetyyli-amino- dekstraania, säädetään varovasti 0,1 Milla NaOHia pHihon 6,5 ja lisätään etyleenidiamiinitetra-asetaattia 2 mMieen. Tähän liuokseen pipetoidaan 40 μΐ 1 M hydroksyyliamiiniliuosta ja ,4 92879 sitS inkuboidaan 20 min 25 °C:ssa. Lopuksi liuos laimennetaan 25 mM fosfaattipuskurilla, pH 6,5, 6,8 ml:ksi ja lisätään 7,2 ml liuosta, jossa on 158,4 mg MAK33-IgG-MH:ta (valmistus kuten esimerkissä 2a). 30 min 25 °C:ssa inkuboinnin jälkeen 5 lisätään reaktioseokseen kysteiiniä 2 mM:een ja 30 min kuluttua lisäksi N-metyylimaleinimidiä 5 mMseen. Edelleen tunnin 25 °C:ssa inkuboinnin jälkeen polymerisaatti dialysoidaan vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH 7,5 / 50 mM NaCl. Heikon sameuden poissentrifugoinnin jälkeen saadaan 19,5 ml MAK33-10 IgG-dekstraani-aggreg.aatin liuosta, jonka proteiinipitoisuus on 7,1 mg/ml.

Esimerkki 4 MAK3 3-IqG-agqreqaatin valmistaminen verkkouttamalla naudan IgG:n avulla 15 a) Naudan IgG-MH:n valmistaminen 100 mg polyklonaalista naudan IgG:tä muutetaan esimerkin 2a) mukaisesti 4 pmoolilla maleinimidoheksanoyylisukkinimidaat-tia. Saanto 4,45 ml liuosta, jossa on 22 mg naudan IgG-MH/ml.

b) MAK33-SATA:n (S-asetyylitioasetyyli-MAK33-IgG) valmistami-20 nen 100 mg MAK33-IgG:tä liuotetaan 4 ml:aan 30 mM fosfaattipusku- * ria, pH 7,1. Tähän liuokseen pipetoidaan 20 μΐ (2 μιηοΐ) 0,1 M S-asetyylitioasetyylisukkinimidaatin dimetyylisulfoksidi-liuosta. Reaktioseosta inkuboidaan 1 h 25 °C:ssa, sitten sitä 25 dialysoidaan 16 h 0-4 °C:ssa vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH 6,1/50 mM NaCl. Saadaan 4,45 ml liuosta, jossa on 22 mg MAK33-IgG-SATA/ml.

* c) Tioasetyyli-MAK33-IgG:n verkkouttaminen naudan IgG-MH:11a 50 mg MAK33-IgG-SATA:a laimennetaan 25 mM fosfaattipuskuril-30 la, pH 6,5, joka sisältää 2 mM etyleenidiamiinitetra-ase-. taattia (puskuri A), 15 mg/ml:n pitoisuuteen. Tähän liuokseen pipetoidaan 75 μΐ 1 M hydroksyyliamiiniliuosta ja sitä inku- tl boidaan 20 min 25 °C:ssa.

is 92879 3 mitään tätä liuosta, jossa on 44 mg tioasetyyli-MAK33-IgGt-tä, lisätään 4 ml liuosta, jossa on 88 mg naudan IgG-MH:ta ja sitä inkuboidaan 25 min 25 °C:ssa. Verkkouttamisen lopet-5 tamiseksi lisätään sitten kysteiiniä 2 mMteen ja 30 min 25 °C:ssa inkuboinnin jälkeen jodiasetamidia 5 mMteen. Edelleen tunnin 25 °C;ssa inkuboinnin jälkeen sitä dialysoidaan 16 h 0-4 °Ctssa vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH 7,5 / 5 0 mM NaCl. Dialysaatin sentrifugoinnin jälkeen saadaan 8,9 ml 10 MAK33-IgG-nauta-IgG-aggregaattia, jonka proteiinipitoisuus on 13 mg/ml.

Esimerkki 5 MAK33-IqG-aggreqaatin, joka on verkkoutettu MAK33-Fabtn avulla, valmistaminen 15 a) MAK33-Fab-SATAtn valmistaminen 200 mg MAK33-IgGttä pilkotaan papaiinilla Fab/Fctksi ja MAK33-Fab eristetään seoksesta kromatografoimalla DE52-sel-luloosassa (Whatman) (menetelmä, katso A. Johnstone ja R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 20 Publications 1982, 52-53). Saanto 95 mg MAK33-Fabta suolattomana lyofilisaattina.

' 50 mg MAK33-Fab:a liuotetaan 2 mitään 30 mM fosfaattipusku

ria, pH 7,1. Tähän liuokseen pipetoidaan 30 μΐ (3 pmoolia) 0,1 M S-asetyylisukkinimidaatin dimetyylisulfoksidiliuosta. 25 Reaktioseosta inkuboidaan 1 h 25 °C:ssa, sitten sitä dialysoidaan 16 h 0-4 °Ctssa vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH

6,1 / 50 mM NaCl / 2 mM etyleenidiamiinitetra-asetaatti. Saadaan 2,6 ml liuosta, jossa on 18,5 mg MAK33-Fab-SATA/ml.

b) MAK33-IgG-MH t n verkkouttaminen tioasetyyli-MAK33-Fabt11a 30 30 mg MAK33-Fab-SATAta laimennetaan 25 mM fosfaattipuskuril la, pH, 6,5 15 mg/ml pitoisuuteen. Tähän liuokseen pipetoi- *! daan 50 μΐ 1 M hydroksyyliamiiniliuosta ja sitä inkuboidaan ie 92879 20 rain 25 °C:ssa.

1 ,5 ml:aan tätä liuosta, jossa on 22 mg tioasetyyli-MAK33-Fab:a, sekoitetaan 55 mg:aa MAK33-IgG-MH:ta (valmistettu kuten 2a) ja laimennetaan kahdesti tislatulla vedellä 10 ml:n 5 kokonaistilavuuteen. Seosta inkuboidaan 35 min 25 °C:ssa ja siihen viedään verkkouttamisen lopettamiseksi kysteiiniä 2 mM:een. 30 min 25 °C:ssa pitämisen jälkeen lisätään N-metyy-limaleinimidiä 5 mM:een ja sitä inkuboidaan uudelleen 1 h 25 °C:ssa. Lopuksi reaktioseosta dialysoidaan 16 h 0-4 °C:ssa 10 vasten 10 mM fosfaattipuskuria, pH 7,5 / 0,1 M NaCl. Sentri-fugoinnin jälkeen saadaan 12,8 ml kirkasta liuosta, jossa on 5,3 mg MAK33-IgG-aggregaattia/ml.

Esimerkki 6 MAK33-IgG-aggregaatin valmistaminen verkkouttamalla biotii-1 5 nin/streptavidiinin avulla.

a) Biotinoidun MAK33-IgG:n valmistaminen 50 mg:aan MAK33-IgG:tä 2,5 ml:ssa 0,1 M kaliumfosfaattipus-kuria, pH, 8,5, sekoitettiin 1,13 mg biotinyyli-e-aminokapro-nihappo-N-hydroksisukkinimidiä (Boehringer Mannheim GmbH) 50 20 pl:ssa dimetyylisulfoksidia (moolisuhde IgGjbiotiini - 1:7,5) ja sekoittamisen jälkeen sitä inkuboitiin 25 °C:ssa 90 min. Biotinoitua IgG:tä dialysoitiin yön yli 4 °C:ssa vasten 2 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0. Saanto: 45 mg MAK33-lgG-bio-tiiniä 6,4 ml:ssa.

25 b) Streptavidiinilla verkkouttaminen 4 ml:aan MAK33-IgG-biotiiniliuosta sekoitettiin 5 minuutin välein 3 osana kulloinkin 1,5 mg streptavidiinia (Boehringer Mannheim GmbH) 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa / 0,1 M natri-umkloridissa ja sitä inkuboitiin 25 °C:ssa. Moolisuhde 30 IgG:streptavidiini - 2,5:1. Seos konsentroitiin ultrasuodat-tamalla 2 ml:ksi ja se kromatografoitiin kuten esimerkissä 1 AcA22-pylväässä. Kaikki fraktiot, joiden molekyylipaino oli >320000, yhdistettiin. Saanto: 21 mg MAK33-IgG-strepavidiini-

II

17 92879 aggregaattia 12 ml:n liuoksessa, jonka IgG-pitoisuus on 17 mg.

Esimerkki 7 MAK-anti-ihmisen albumiinin verkkouttaminen ihmisen albumii-5 nilla 40 mg ihmisen albumiinia (Behringwerke, Marburg) 1 ml:ssa 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0, aggregoitiin 3 h lämmittämällä 70 °C:een. 25 °C:een jäähdyttämisen jälkeen laimennettiin osa, jossa on 25 mg ihmisen albumiini-aggregaattia, 10 50 mM kaliumfosfaattipuskurilla / 0,1 M NaCl, pH 7,0, 2,5 mg:ksi/ml ja 5 minuutin välein sekoitettiin 4;nä 2,5 mg:n osana MAK-MI-anti-ihmisen albumiinia (Gamma 1, Kappa) 0,2 ml:aan 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0. 20 minuutin 25 °C:ssa inkuboinnin jälkeen se konsentroitiin ultrasuodatta-15 maila 2 ml:ksi ja kromatografoitiin kuten aiemmin AcA-geeli-pylväässä. Proteiinipitoiset fraktiot, joiden molekyylipaino on >320000, yhdistettiin. Saanto 12,4 mg MAK-MI-IgG-albumii-niaggregaattia 7,8 ml:ssa 8,86 mg:n IgG-pitoisuutena.

Esimerkki 8 20 Luontaisen MAK33-IgG:n ja erilaisten MAK33-IqG-aggreqaattien häiriöiden poiston vertailu CEA-entsyymi-immuunikokeessa, jossa on kaksi spesifistä MAK-reagoivaa ainetta : Käytettiin reagensseja, jotka olivat peräisin koepakkauksesta

EnzymuriB^ CEA (Boehringer Mannheim GmbH). Tämän testin sisäl-25 tämät reagenssiputket on päällystetty monoklonaalisella CEA-spesifisellä hiiren IgG:llä (IgG 1, K). Entsyymillä merkitty reagoiva aine on monoklonaalinen CEA-spesifinen hiiren Fab-peroksidaasikonjugaatti; Fab:n alaluokkakoostumus on K, p-1.

Erilaiset MAK33-IgG-preparaatit vietiin inkubointipuskuriin 30 kulloinkin kasvavina määrinä ja suoritettiin testi ihmisen seerumilla (P43), jossa esiintyi huomattavan vaikuttavia häiriötekijöitä. Taulukko 1 esittää MAK33-IgG-preparaattikonsen-traation (yg proteiinia/ml) inkubointipuskurissa, joka tukahdutti häiriön niin laajalti, että havaittiin oikea analyyt- 18 92879 tipitoisuus normaalialueella (1-3,5 ng/ml).

Taulukko 1

Erilaisten MAK33-IgG-preparaattien suhteellinen häiriönpois-tofunktio 5 Inkubointipuskuriin mg/μΐ häiriö- heiken- näkyvä see- lisätty aine tekijä tyminen rumin P43 CEA-pitoi-suus, ng/ml ei mitään 0 1,636 >58* 10 MAK33-IgG-monomeeri 9600 0,0026 0,132 3,4 MAK33-IgG-aggregaat- ti/GDA (raakaseos 1) 34 0,74 0,126 3,1 MAK33-IgG-aggregaat- ti (raakaseos 2c) 25 1 0,125 3,1 15 MAK33-IgG-dekstraa- ni (3) 43 0,58 0,129 3,3 MAK33-IgG-naudan

IgG-aggregaatti (4) 82 0,3 0,130 3,3 MAK33-IgG-Fab-aggre- 20 gaatti (5) 3 8,33 0,122 2,9 * Arvo sijaitsee säätökäyrän säätöpisteiden avulla määritellyn alueen ulkopuolella.

• Esimerkki 9

IgG-aggregaattien, jotka verkkoutettiin ei-kovalenttisten, 25 bioaffiinisten sidosten avulla, häiriönpoistovaikutus CEA-Enzymun-testissä

Reagenssien ja testin suorittamisen suhteen katso esimerkki 8. Käytetyn ihmisen seeruminäytteen todellinen CEA-pitoisuus määritettynä viitemenetelmällä oli 2,8-4,2 ng/ml. Taulukko 2 30 esittää säätökäyrältä luetut näkyvät ihmisen seeruminäytteen (no 108) CEA-pitoisuudet, joka näyte sisältää häiriötekijöitä, kun inkubointipuskuriin on lisätty erilaisia IgG-aggre-gaatteja.

ti

Taulukko 2 19 92879

IqG-aggreqaattien häiriönpoistovaikutus bioaffiinlsella verkkouttamisella

Inkubaatiopuskuriin pg IgG/ml ihmisen seerumi no 108 5 lisätty aine ng CEA/ml ei mitään - 40 MAK33-IgG-monomeeri 200 33,4 500 31,4 MAK33-IgG-streptavi- 10 diini 1 28,5 aggregaatti esim. 6 10 8,8 MAK-MI-IgG-ihmisen albumiini 2,5 36,7 aggregaatti esim. 7 7,5 25,1 15 Taulukosta on nähtävissä, että molemmat bioaffiiniverkkoute-tut IgG-aggregaatit laskettuna IgG-määrästa poistavat häiriöitä oleellisesti tehokkaammin kuin verkkouttamaton IgG: kerroin >500 vast. >60. Lisäysmäärät valittiin siten, että ilmeni vain osittainen häiriöiden poisto; tällaisissa olosuh-20 teissä voidaan arvioida nimittäin parhaiten erilaisten preparaattien suhteellinen häiriöiden poisto.

Esimerkki 10 : ; Häiriönpoistofuktion riippuvaisuus MAK33-IqG-agqregaatin mo lekyylipa inos ta 25 Reagenssit ja tämän kokeen suorittaminen ovat kuten esimerkissä 8 kuvattiin. MAK33-IgG-preparaatit on valmistettu esimerkin 2 mukaisesti.

i 1 20 92879

Taulukko 3 MAK33-IgG-aggregaattien häiriönpoiston riippuvuus molekyylipainosta

Inkubointipuskuriin potilasseerumi no 18^ potilasseerumino 43^ lisätty aine heikenty- ng CEA/ml·^ heikenty- ng CEA/ml2 5 iäinen minen ei mitään 1,567 >583 1,636 >583 125 pg/ml moncmee- rinen IgG 0,148 3,9 1,703 >58 10 ug/ml MAK33-10 IgG-aggregaatti raakaseos 0,115 2,7 0,179 6,2 30 μg/ml MAK3 3-IgG- aggregaatti raakaseos - - 0,125 3,1 15 5 pg/ml MAK33-IgG- aggregaatti molek.p. 2-10 milj. 0,105 2,1 0,137 3,9 5 pg/ml MAK33-IgG- aggregaatti 20 molek.p. 1-2 milj. 0,109 2,4 0,285 11,0 5 pg/ml MAK3 3-IgG-aggregaatti molek.p. 400000- 1 milj. 0,155 4,8 1,051 53,7 25 5 pg/ml MAK33-IgG- aggregaatti molek.p. 160000- 400000 0,364 16,3 1,239 >58 1 Viitemenetelmällä havaittu todellinen CEA-pitoisuus on alueella 1-3,5 30 ng/ml.

2 Näkyvä CEA-pitoisuus havaittiin CEA-standardinäytteiden heikentymisen ja säätokäyrän avulla entsyymin CEA työohjeen mukaisesti.

3 Säätckäyrällä määritellyn säätökäyraalueen ulkopuolella.

Esimerkki 11 35 Erilaisista monoklonaalisista vasta-aineista valmistettujen MAK-lgG-aggregaattien häirionpoistovaikutus Käytettiin Enzymun® TSH-pakkauksesta (Boehringer Mannheim GmbH) peräisin olevia koeputkia, jotka on päällystetty mono-klonaalisella anti-TSH-hiiren IgG:llä (IgG1 , K). Muut reagens-40 sit otettiin kuten esimerkissä 8 Enzymun CEA-pakkauksesta. Testi suoritettiin tämän pakkauksen työohjeen mukaisesti. Tämän testin suorituksessa ei voi olla mitään merkkiä seerumi-näytteen analyyttipitoisuudesta, koska molemmilla reagoivilla : aineilla on erilainen spesifisyys. Täten on kysymyksessa vain

II

21 92879 mallitesti, joka antaa vain tyhjän arvon avulla signaalin, jos häiriötekijöitä on mukana. Vertailuun otetut MAK-IgG-aggregaatit valmistetaan esimerkin 2 mukaisesti ΜΆΚ33:sta.

Taulukko 4 5 Erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden IgG-aggregaattien häiriönpoiston vertailu mallitestissä.

Inkubointipuskuriin pg/ml heikentyminen seerumissa P43 lisätty aine MAK33-IgG-aggre- 10 gaatti (2c) 0 0,900 raakaseos 1,25 0,506 2.5 0,366 5 0,238 10 0,195 15 20 0,152 MAK-MS43.1 0-IgG- aggregaatti 0 0,900 raakaseos 1,25 0,554 2.5 0,406 20 5 0,286 10 0,202 20 0,180

Heikentyminen seeruminäytteessä, jossa ei ole CEA:ta ja häiriötekijöitä; 0,162 25 Tulos: Erilaisten monoklonaalisten ΜΑΚ-IgG-aggregaattien häi-riönpoistovaikutus on virherajojen puitteissa sama.

Esimerkki 12 MAK33-IgG-aqqregaatin ja monomeerisen MAK33-lgG;n häiriönpols-tovaikutus testissä, jossa on biotlnoituja MAK-IgG-reagoivia 30 aineita . Tässä testissä käytetään kahta monoklonaalista hepatiitti-pin- ta-antigeeni-(HBsAg)-spesifistä MAK-IgG:tä biotinoidussa muo- 22 92679 dossa (biotinointi on suoritettu T.V. Updyken ja G.L. Nicol-sonin mukaisesti, Methods in Enzymology, 121 , (1986) 717-725). Toinen niistä, MAK6E7-IgG on alatyyppiä IgG1/K, toinen, MAK-5A10-IgG, on alatyyppiä IgG2a, K. Entsyymillä merkittynä rea-5 goivana aineena käytettiin MAK5A1O-Fab-POD-konjugaattia.

Inkubaatiopuskurin koostumus: 40 mM fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,2 M natriumtartraattia 0,5 % (paino/til.) naudan seerumialbumiinia 10 0,1 % (paino/til.) naudan IgG:tä 0,5 % (paino/til.) Pluronic F68;aa 0,01 % (paino/til.) fenolia 200 ng/ml MAK6E7-IgG:tä (biotinoitu) 25 ng MAK5A10-IgG:ta (biotinoitu) 15 200 mU/ml MAK5A10-Fab-POD-konjugaattia Häiriönpoistoproteiini, katso taulukko 5.

MAK33-IgG-aggregaattiraakaseokset valmistettiin esimerkin 2c mukaisesti.

Testiä varten pipetoitiin 0,2 ml seeruminäytettä ja 1 ml in-20 kubaatiopuskuria polystyroliputkeen, joka oli päällystetty streptavidiinilla. Sitten sitä inkuboitiin 4 h huoneenlämpötilassa. Lopuksi jokainen putki pestiin 3 x 1,5 ml:lla vesijoh-: tovettä ja niihin lisättiin kuhunkin 1 ml substraattiliuosta (ABTS/peroksidi) Enzymun CEA-testipakkauksesta. Edelleen tun-25 nin huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen mitattiin muunnetun substraattiliuoksen heikentyminen 405 nm:ssä.

il 23 92879

Taulukko 5 MAK33-IgG-preparaattien häirionpoistovaikutus kerros-entsyy-mi-immuunitestissä, jossa on biotinoituja MAK-IgG-reagoivia aineita 5 Inkubaatiopuskuriin pg/ml heikentyminen seeruminäytteessä lisätty aine no 100^ no 489"* NS2 ei mitään 0 1,390 0,262 0,042 MAK33-IgG-monomeeri 1 - - 0,042 5 1,070 0,102 0,045 10 10 0,884 0,068 0,048 200 0,125 0,042 0,046 400 0,080 0,048 0,049 MAK33-IgG-aggre- gaatti (2c) 0 1,044 0,378 0,047 15 raakaseos 1 0,125 0,034 0,043 5 0,043 0,045 0,048 10 0,048 0,035 0,054 1: Seeruminäytteet no 100 ja 489 otettiin eräästä veripan kista ja ne oli ilmoitettu HBsAg vapaiksi.

20 2: Terveen luovuttajan seerumia, joka ei sisältänyt HBsAg:tä eikä häiriötekijöitä.

Tutkimustuloksesta, että seerumille no 100 saavutetaan sama ' häiriöiden poisto 0,125:n signaalilla 200 ug:lla/ml monomee- rista MAK33-IgG:tä tai 1 μg:lla/ml MAK33-IgG-aggregaattia, 25 seuraa, että IgG-aggregaatti on tähän testiin 200-kertaa häi-rionpoistoaktiivisempaa.

:· Esimerkki 1 3 MAK33-agqragaatin häirionpoistovaikutus testissä, jossa on kuivakemia-reagenssikantoainetta 30 Määrittely suoritetaan kuivakemiareagenssikantoaineella yksi-vaihetestissä kaksois-vasta-aine-kiintofaasikerrosperiaatteen mukaisesti roottorikäyttoelementissä, jossa on sentifugiana-lysaattori DE-OS 3425 008.5:ssa kuvatulla analyysilaitteistol- 24 92879 la.

1. Reagenssiliuosten valmistaminen 5 a) Puskuri I

50 mmoolia/1 kaliumfosfaattipuskuria, pH 5,0, joka on valmistettu sekoittamalla 50 mmoolia/1 K2HP04-liuosta ja 50 mmoolia KH2P04-liuosta, kunnes saavutetaan pH-arvo 6,0.

10 b) Puskuri II

Puskuri II valmistetaan kuten puskuri I erolla, että pH-arvoksi säädetään 7,5 ja että puskuri sisältää lisäksi 10 g/1 naudan seerumialbumiinia ja 150 mmoolia/1 NaCl.

15 c) Reagoiva aine R,-liuos, joka on TSH:ään sitoutumiskykyinen

Reagoivana aineena käytetään monoklonaalista hiiren anti-TSH-vasta-ainetta. Tätä vasta-ainetta sisältävään vatsaontelones-teeseen sekoitetaan 1,8 M:een ammoniumsulfaattia. Presipitaat-ti otetaan puskuriin, joka koostuu 15 mM:sta natriumfosfaat-20 tia, pH 7,0; ja 50 mM:sta natriumkloridia. Täten saatu liuos viedään DEAE-selluloosan läpi. Täten saadut TSHrhon sitoutu-miskykyiset vasta-aineet biotinoidaan (5 biotiinia/IgG) ja ne laimennetaan puskurilla II 1 mg/ml:n proteiinipitoisuuteen.

25 d) Entsyymillä merkitty reagoiva aine R2-liuos

Reagoivana aineena R2 käytetään samaten monoklonaalista hiiren anti-TSH-vasta-ainetta, joka tunnistaa kuitenkin toisen anti-geenideterminantin kuin reagoiva aine Rj. Näitä vasta-aineita sisältävä vesivatsaneste puhdistetaan kuten 3.l:ssä. Täydel-30 linen vasta-aine pilkotaan tunnetulla tavalla R.R Porterin,

Biochem. J. 22 (1959) s. 119, menetelmän mukaisesti Fab-frag-mentiksi. Saadut Fab-fragmentit kytketään Ischikawa et ai.:n mukaisesti, J. of Immunoassay 4 (1983), s. 209-327 β-galakto-sidaasilla. Reagoiva aine R2-liuos laimennetaan puskurissa II 35 500 mU/ml:n pitoisuuteen.

e) Häiriönpoistoproteiini • « ’ MAK33-IgG-polymeeri, joka on valmistettu kuten esimerkissä 2, liuotetaan puskuriin II 1 mg/ml:n pitoisuuteen.

Il 25 92879 f) Avidiiniliuos

Avidiini laimennetaan 50 pg/ml:n proteiinipitoisuuteen.

g) Substraattiliuos kloorifenolin punainen B-ga- 5 mmoolia/1 (3,05 g/1) 5 tosidi (valmistettu DE-OS 3345748:n mukaisesti) HEPES 70 mmoolia/1 (16,7 g/1)

NaCl 154 mmoolia/1 (9 g/1) naudan seerumialbumiini 0,3 % (3 g/1) 10 Tween 20 0,2 % (2 g/1) pH (NaOH:n kanssa) 7,25 2. Reagenssikantoaineiden valmistus a) Reagenssikantoaine 1 (ei häiriönpoistoproteiinia) 40 pl:aa liuosta, joka sisältää litraa kohti 100 mmoolia nat-15 riumfosfaattia, pH 7,3, 2 mmoolia magnesiumkloridia, 9 g nat-riumkloridia, 5 g naudan seerumialbumiinia, 0,5 mg biotinoitua anti-TSH-monoklonaalista vasta-ainetta, joka on peräisin hiirestä (reagoiva aine 1), 1000 U anti-TSH-vastaine-(hiiri)-Fab-fragmentti-B-galaktosidaasi-konjugaattia (reagoiva aine R2-20 liuos) (aktiivisuus määritetty orto-nitrofenyyli-B-D-galakto-sidilla 37 °C:ssa), tiputetaan tippoina kuitumatolle, joka koostuu kaupallisesta polyesteripaperista. Lopuksi se kuiva- • * : taan huoneenlämpötilassa. Kuitumattoja säilytetään käyttöön saakka 4 °C:ssa ja 20 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa.

25 b) Reagenssikantoaine 11 (sisältää häiriönpoistoproteiinia) , Valmistaminen tapahtuu kuten reagenssikantoaineen 1 , mutta e erolla, että se sisältää imeytysliuoslitraa kohti 0,01 g esimerkin 2c (raakaseos) MAK33-lgG-aggregaattia.

c) Reagenssikantoaine 2 30 Selluloosakuitumatolle kiinnitetään bromisyaaniaktivointimene- * telmän (DE-hakemusjulkaisu 1768512) mukaisesti avidiinia (avi- 92879 26 diiniliuos), jolloin kiinnittämiseen käytetään kuitumateriaa-ligrammaa kohti 10 μg avidiinia. Sitoutumaton vasta-aine poistetaan pesemällä ja kuitumatto kuivataan huolellisesti huoneenlämpötilassa. Täten saadut kuitumatot säilytetään samoin 5 kuin reagenssikantoaine 1.

3. Määrittelyn suorittaminen Määrittely näiden kahden reagenssikantoaineen 1 ja 2, vast. 1' ja 2, tapahtuu DE-hakemusjulkaisussa 3425008.5 kuvatulla laitteistolla analyyttisten määrittelyjen suorittamiseksi.

10 Se opettaa roottorikäyttöelementin sentrifugianalyysiautomaat-teja varten, joka koostuu muotoelimestä, jossa on näytteen-täyttökammio, joka on yhteydessä useaan reagenssikenttään, jotka sisältävät määrätyllä reagenssilla impregnoitua imuky-kyistä kantoainemateriaalia, vähintään yhden sekoitusventtii-15 likammion ja mittauskammion, jotka muodostavat yhdessä näyte-nesteensiirtotien, joka kulkee säteittäisesti sisältä säteit-täisesti ulos, kun käyttöelementti on kiinnitetty roottoriin, ja siinä on lisäksi vähintään yksi toinen kammio mittauksen suorittamista varten ja se on vähintään osittain identtinen 20 näytenesteensiirtotien kanssa.

Tällöin näytenesteensiirtotie johtaa toisesta näytteentäyttö-kammiosta (P) imukyisellä materiaalilla täytetyn, puskuria sisältävän kammion (a), kammmion (b) ja kammioiden (a) ja (c) väliin järjestetyn ensimmäisen venttiilikammion (VK1) kautta 25 toiseen venttiilikammioon (VK2) ja näistä kammion (d) kautta ja kokoomakammion (ΆΚ) kautta mittauskammioon (K). Muun nesteen sisäänottamiseksi on varustettu pumppukammioksi muodostettu substraattikammio (PK), joka on yhdistetty annostuskam-miosta (DK) ja kapillaarista (Kap) koostuvan annostuslaitteis-30 ton kautta ja ylijuoksukammion (U) kautta toiseen venttiili-kammioon (VK2).

Heikentymisen a (mittaussignaali, joka sisältää häiriösignaa-lin) määrittämiseksi käytetään reagenssikantoainetta 1 ja rea-genssikantoainetta 2, heikentymisen b (spesifinen mittaussig- 11 27 92879 naali ilman häiriösignaalia) määrittämiseksi käytetään rea-genssikantoainetta 1' ja 2.

Reagenssikantoaine 1 vast. 1 1 sijoitetaan roottorikäyttöele-mentin aluelle c ja reagenssikantoaine 2 alueelle d. Tällöin 5 pipetoidaan 40 μΐ konsentroitua näytettä yläreunasssa olevan aukon kautta suoraan alueelle a. 270 μΐ substraattiliuosta pipetoidaan kammioon PK. Sitten viedään näyte ja substraat-tiliuos erotusmatriksin ja pesualtaiden suuntaan sopivalla sentrifugointiohjelmalla, jossa suuret kierrosluvut vaihtele-10 vat pysäyttämisten kanssa.

Tällöin reagoivat aineet Ri ja R2, joissa ei ole tai on häi-riönpoistoproteiinia, eluoituvat alueelta c peräisin olevan näytenesteen avulla ohjelman kuluessa ja reaktioon viedään seuraavaksi homogeeninen seos. Muodostuneet kompleksit sitou-15 tuvat kentässä d R-j :n avulla avidiiniin. Näytteen siirto alueelta c tapahtuu hyvin lyhyen ajan sisällä.

Substraattiliuos jaetaan osiin annostuskammion DK avulla, joista ensimmäistä käytetään ylimääräisen, ei-kompleksoituneen konjugaatin poispesemiseen. Häiriötekijät, jotka voivat verk-20 kouttaa R2:n, neutraloidaan lisäämällä 1 0 pg häiriönpoistopro-teiinia / ml testiliuosta ja pestään samaten pois (reagenssi-kantoaineen 1' lisääminen).

' Kompleksinmuodostuksella d:hen sitoutunut 8-galaktosidaasiak- tiivisuus on verrannollinen näytteen sisältämään TSH-määrään, 25 vast, näytteen tyhjäarvoon. Tämä aktiivisuus määritetään toisella substraattiannoksella, jolloin substraatti muutetaan 5-minuuttisessa reaktiossa värillisiksi tuotteiksi. Muodostunut väri ja muu nestefaasissa tapahtuva värinkehitys/min mita-* taan 576 nm:ssä pesualtaissa. Näissä olosuhteissa saatiin seu- 30 raavat tulokset: 28 92879

Taulukko 6 Näyte a b heikent. kons. heikent. kons.

[mE] [μυ/ml] [mE] [pU/ml] 5 TSH-kalibroija 0 μϋ/mic) 451 0 457 0 TSH-kalibroij a 19,6 μυ/mic) 3331 19,6 3311 19,5 ihmisen seerumi 1 669 1,5 725 1,8 10 ihmisen seerumi 43, jossa on häiriötekijöitä 6790 38 662 1,5

Kaikki mittaukset suoritettiin x-576 nmsssM 0,3 emin kerrospaksuudella ja laskettiin kerrospaksuudessa d - 1 15 a) TSH-määritys käytettäessä reagenssikantoainetta 1 b) TSH-määritys käytettäesssä reagenssikantoainetta 1 * MAK33-IgG-polymeerin kanssa M-Fab-spesifisten häiriötekijöiden neutralointiin c) TSH-standardit kalibroitu 2. IRP 80/588:ssa.

20 TSH:n pitoisuus ihmisen seerumissa 43 vahvistettiin Boehringer ’ Mannheim -yhtiön Enzymun TSH -testillä 1,4 μυ/mliksi. Tämä testi sisältää spesifisinä reagoivina aineina putkeen päällystetyn MAK-anti-TSH:n ja polyklonaalisen lampaan anti-TSH-Fab-POD-konjugaatin. Jälkimmäinen on inertti häiriötekijöille ih-25 misen seerumissa 43.

II

Claims (16)

92879

1. Menetelmä immunologisesti sitoutumiskykyisen substanssin määrittämiseksi ensimmäisen eläinlajin tai ihmisen biologisesta nesteestä toisen eläinlajin vähintään kahden immunologises- 5 ti sitoutumiskykyiselle substanssille spesifisen vasta-aineen läsnäollessa, jotka ovat vasta-aineita, joista vähintään yksi on Fab-, vast. F (ab' )2-fragmentti, ja inhibiittorin läsnäollessa häiriötekijöiden kompensoimiseksi, tunnettu siitä, että että reaktioseos saatetaan kosketuksiin 0,1-50 μg/ml:n immuno-10 logisesti sitoumiskykyiselle substanssille ei-spesifisen, toisen ja/tai kolmannen eläinlajin monoklonaalisista tai poly-klonaalisista vasta-aineista johdetun aggregaatin, jonka mole-kyylipaino on 320 000 daltonia tai enemmän, kanssa häiriötekijöiden kompensoimiseksi. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunologisesti sitoutumiskykyinen substanssi on polyva-lenttinen antigeeni, ja ei-spesifiset aggregaatit ovat aggre-goituja IgG:itä. 20

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiosekoitus saatetaan kosketuksiin 5-25 μg/-ml:n ei-spesifistä IgG-aggregaattia kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiosekoitus saatetaan kosketuksiin 5-10 μg/-ml:n ei-spesifistä IgG-aggregaattia kanssa.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tun-30 nettu siitä, että ei-spesifiset IgG-aggregaatit koostuvat IgGrstä ja toisesta makromolekyylistä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen makromolekyyli on kolmannen eläinlajin IgG:t, ei- 35 spesifiset Fc-vapaat IgG-fragmentit, proteiinit, polysakkaridit tai muu veteen liukeneva polymeeri. 92879

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-spesifisten IgG-aggregaattien molekyyli -paino on 320000 daltonia - 10 miljoonaa daltonia.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että ei-spesifiset aggregaatit muodostetaan kuumentamalla, kemiallisella tai ei-kovalenttisella verkkouttami-sella.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, jol loin vähintään yksi spesifisistä reagoivista aineista on sidottu merkitsemissubstanssiin ja toinen on kiinnitetty matrik-siin tai biotinoitu, ja joko kiinnitetty, vast, biotiinia sitovaan proteiiniin yhdistetty immunologisesti sidottu tai im-15 munologisesti ei-sidottu aktiivisuus määritetään, tunnettu siitä, että että ei-spesifiset IgG-aggregaatit ovat liuoksena reaktioseoksessa kokeen aikana.

10. Diagnostinen väline immunologisesti sitoutumiskykyisen 20 substanssin määrittämiseksi ensimmäisen eläinlajin tai ihmisen biologisesta nesteestä, joka väline sisältää vähintään kaksi toisen eläinlajin immunologisesti sitoutumiskykyiselle substanssille spesifistä vasta-ainetta, joista vähintään yksi on Fab-, vast. F (ab') 2-fragmentti, inhibiittorin häiriötekijöiden 25 kompensoimiseksi, sopivan puskurisubstanssin sekä mahdollises-. ti muita tavanomaisella tavalla käytettyjä apuaineita, tunnet tu siitä, että häiriötekijöiden kompensointiin käytetään 0,1-50 Mg/ml immunologisesti sitoutumiskykyiselle substanssille ei-spesifistä, toisen ja/tai kolmannen eläinlajin monoklonaa-30 lisistä tai polyklonaalisista vasta-aineista johdettua aggregaattia, jonka molekyylipaino on 320 000 daltonia tai enemmän.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen diagnostinen väline, tunnettu siitä, että immunologisesti sitoutumiskykyinen substans- 35 si on polyvalentti antigeeni, ja ei-spesifiset aggregaatit ovat aggregoituja IgG:itä.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen diagnostinen väline, tunnettu siitä, että ei-spesifisinä IgG-aggregaatteina it V2ö7 9 käytetään IgG:stä ja toisesta makromolekyylistä koostuvia IgG-aggregaatteja.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen diagnostinen väline, tun-5 nettu siitä, toinen makromolekyyli on kolmannen eläinlajin ei- spesifiset IgG:t, ei-spesifiset Fc-vapaat IgG-fragmentit, proteiinit, polysakkaridit tai muu veteen liukeneva polymeeri.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 10-13 mukainen diagnostinen 10 väline, tunnettu siitä, että käytetään kahta tai useampaa spesifistä hiiren tai rotan MAK-reagoivaa ainetta, joista vähintään yksi reagoiva aine on Fab- tai F (ab') 2- fragmentti ja vähintään yksi toinen reagoiva aine on Fc-pitoinen IgG, ja homo-polymeerisiä tai heteropolymeerisiä ei-spesifisiä IgG-aggre- 15 gaatteja tai IgG/Fab-, vast. F (ab') 2-aggregaatteja, joiden mo-lekyylipaino on suurempi kuin 320 000 daltonia, jolloin ei-spesifisten aggregaattien sisältämät IgG:t ja Fab-, vast. F (ab') 2-fragmentit ovat monoklonaalisia ja ovat peräisin siitä lajista ja alaluokasta kuin vähintään yksi spesifisistä rea-20 goivista aineista.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 11-14 mukainen diagnostinen väline, tunnettu siitä, että ei-spesifisten IgG-aggregaattien molekyylipaino on 320 000 - 10 miljoonaa daltonia. 25

16. Jonkin patenttivaatimuksista 11-15 mukainen diagnostinen väline, tunnettu siitä, että apuaineena käytetään lisäksi reaktionko ihdyttimiä, pinta-aktiivisia aineita ja/tai stabili-saattoreita. 30