DK175429B1

DK175429B1 - Fremgangsmåde til immunbestemmelse med reduceret uspecifikke forstyrrelser og diagnostisk middel til anvendelse ved fremgangsmåden

Info

Publication number: DK175429B1
Application number: DK198900966A
Authority: DK
Inventors: Helmut Lenz; Ellen Moessner; Werner Stock; Norbert Franken; Albert Roeder; Harald Haug; Robert Crance Mccarthy
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1988-03-03
Filing date: 1989-02-28
Publication date: 2004-10-18
Also published as: FI891012A0; DD280396A5; ATE82072T1; HU212322B; FI891012A; GR3006991T3; LV10538A; ZA891568B; LV10538B; EP0331068A1; AU616484B2; US4914040A; FI92879C; AU3090889A; JPH01254869A; PT89889A; JPH0823560B2; DK96689D0; DK96689A; DE3905505A1

Description

"""" ...... · ^^-ηττ^·.··^.Β·^||;ι> - -ίΆ-ÆWi't:·.': -'g'».....igBtt^l DK 175429 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en immunologisk bindingsdygtig substans i en biologisk væske fra en første dyreart eller fra mennesket i nærværelse af mindst to for den immunologisk bindingsdygtige substans specifikke reaktanter fra en anden dyreart, af hvilke specifikke reaktanter mindst én er Fc-5 holdig og i nærværelse af en inhibitor til kompensation for forstyrrende faktorer samt et hertil velegnet diagnostisk middel.

Oen' følsomme bestemmelse af immunologisk bindingsdygtige substanser, såsom f.eks. af polyvalente antigener (peptider, proteiner, polysaccharider, viruser, bakterier, specifikke celler), under anvendélse af to eller eventuelt flere antistoffer, som er rettet mod rumligt forskellige antigendeterminanter, er kendt som immunradiometrisk eller immunenzymome-trisk "sandwichbestemmelse" (to-sidet-iramunbestemmelse). Hest almindeligt sker gennemførelsen af denne kendte bestemmelsesfremgangsmåde ved, at antigenet (prøven) til bestemmelse in-15 kuberes med et første antistof, som enten i fast fase er bundet til et egnet bæremateriale, såsom sepharose, agarose, kunststofrør og lignende, eller foreligger homogent, såsom f.eks. biotinyleret i opløsning, og en bestemt mængde af et andet eller yderligere markerede antistoffer i flydende fase. Specificiteten hos det andet og eventuelt yderligere anti-^0 stoffer vælges fortrinsvis således, at de er rettet mod andre determinanter hos antigenet til bestemmelse end det første antistof for at udelukke en konkurrence mellem antistofferne om de samme bindingssteder på antigenet til bestemmelse, da prø-vefølsomheden herved ville forringes. Såvel det første, fast-fasebundne eller biotinylerede antistof som det andet eller ^5 yderligere i opløsning værende markerede antistoffer tilsættes i overskud. Det pågældende antigen kan enten bestemmes via den på det første antistof fikserede eller den i opløsning tilbageblevne ikke-immunologisk bundne aktivitet. I det sidste tilfælde er det påkrævet at tilsætte en defineret mængde af markeret, andet antistof.

På grund af de nødvendige specificiteter anvendes til de immunologiske sandwichbesteramelser især af monoklonale antistoffer (MAKs) afledte fuldstændige IgGs eller deres immunolo- I DK 175429 B1

gisk reaktive fragmenter (Fab, F(ab'>2) - Det er do9 tilmed mu- I

H ligt at anvende immunreaktive bestanddele i disse undersøgel- I

I ser, hvilke bestanddele er afledt af polyklonale antistoffer I

I (PAKs). I

I I

H Skønt der i de beskrevne to-sidet-immunbestemmelser til ana- I

lytterne til bestemmelse anvendes specifikke antistoffer, fo- I

rekommer med signifikant hyppighed humanserumprøver, som frem- I

kalder uspecifikke reaktioner. Dette fører til falske testre- I

10 sultater med tilsvarende graverende konsekvenser for de tera- I

I peutiske foranstaltninger. Forekomsten af uspecifikke reak- I

tioner tibageføres til i prøven værende substanser (forstyr- I

rende faktorer), som ligesom analytten til bestemmelse (poly- I

H valent antigen) binder de specifikke immunglobul i nreagenser, I

15 dog på andre angrebspunkter. I

Ved sådanne immunbestemmelser tilsættes derfor sædvanligvis I

I præventivt i overskud uspecifikke immunglobuliner eller im- I

munglobuli nfragmenter (i reglen drejer det sig herved om im- I

I 20 munglobulin G, IgG) fra de samme dyrearter, som de, hvorfra de I

I specifikke antistoffer hidrører, (G.M. Addison i Radioimmuno- I

I assay and Related Procedures in Medicine, bind 1, side 131-147 I

I (1974); EP-A 0174 026). Lige så længe man har anvendt speci- I

I fikke monoklonale antistoffer, hvilke i reglen hidrører fra I

H 25 mus, i immunbestemmelser, kræver den omtalte foranstaltning I

I mod forstyrrelse store mængder af ikke-specifik muse-IgG i I

I form af muse-serum, muse-bugvattersot eller isoleret muse- I

I immunglobul in (ca. 300-500 μς/πιΊ; Clin. Chem. 32, 1491-1495 I

I (1986)}. Ifølge EP-A 0174 026 ved tilsætning af ca. 30 pg/ml I

I 30 relevant, ikke-specifik muse- eller rotte-IgG til immunbestem- I

I melser af den omtalte art opnås f.eks, kun ved bestemte sera I

I og i særlige tilfælde (negative prøver) en fuldstændig kompen- I

I sation for forstyrrelser. Forsyningen med muse-IgG i den nød- I

I vendige kilomålestok er dog ved de for tiden værende metoder I

I 35 ikke mulig med hensyn til de økonomisk betingelser og er til- I

med kritisk ud fra etiske synspunkter. I 1

En væsentlig foranstaltning til undgåelse af forstyrrelser i I

I immunbesterame1 ser af den omtalte art er anvendelsen af Fab- I

3 DK 175429 B1 eller F(ab')2~fragmenter til mindst et af de i immunbestem-melsen anvendte specifikke antistoffer. Hermed berøves alle forstyrrende faktorer i prøven, hvilke faktorer er rettet mod Fc-dele af IgG (rheuraafaktorer, anti-Fc-imraunglobuliner, såsom S f.eks. IgM), deres angrebspunkt på en af de specifikke immun-reagenser, og der behøver dermed ikke at blive kompenseret for dem.

Dog optræder ved mange humansera i immunbestemmelser trods 10 anvendelsen af Fc-frie specifikke antistof reagenser fortsat forstyrrelser. Disse kan tilbageføres til substanser i serummet, hvilke substanser er rettet mod Fab eller F(ab')2* Efter EP-B 0083 869 genkender sådanne forstyrrende faktorer kun Fab-områder, når disse er udskilt fra Fc-delen. Ved tilsvarende 15 immunbestemmelser kan disse fjernes ved tilsætningen af native eller tværbundne, for antigenet til bestemmelse ikke-specifikke Fab- eller F(ab')2-fragmenter (EP-B 0083 869). Dermed udviser aggregerede Fab- eller F(ab'^-fragmenter i sammenligning med de native bestanddele en 2-3 gange højere virkning 20 til fjernelse af forstyrrelse. Fuldstændige ikke-specifikke IgGs bevirker ifølge EP-B 0083 869 derimod såvel på nativ form som på aggregeret form ingen fjernelse af forstyrrelse i de nævnte immunbestemmelser. Fremgangsmåden har tilmed den væsentlige ulempe, at der herved påkræves - ud over de speci-25 fikke immunglobulinreagenser for antigenet til bestemmelse -anselige mængder værdifulde, ikke-specifikke immunglobulinreagenser, hvilket bringer betydelige økonomiske såvel som etiske problemer med sig. Dertil anvendes f.eks. til fjernelsen af forstyrrelse mindst 100 pg/ml aggregerede ikke-30 specifikke Fc-frie immunglobulinfragmenter, som har vist sig virkningsfulde.

Det er således formålet med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte muligheder til kompensationen for uspecifikke re-35 aktioner ved immunbestemmelser med Fc-holdige og Fc-frie specifikke antistofreagenser som specifikke reaktanter, hvorved forstyrrende faktorer rettet mod fuldstændige IgGs og Fab- og F(ab1)2~fragmenter i humansera på pålidelig måde fjernes, og

I DK 175429 B1 I

I I

I hvor der under hensyntagen til etiske synspunkter gives mulighed for en økonomisk I

udnyttelse af de forbedrede testsystemer. I

I Dette opnås ved en fremgangsmåde til bestemmelse af en immunologisk bindingsdyg- I

5 tig substans i en biologisk væske fra en første dyreart eller fra mennesket i nærværelse I

af mindst to for den immunologisk bindingsdygtige substans specifikke reaktanter fra I

en anden dyreart, af hvilke specifikke reaktanter mindst en er Fc-holdig og i nærværel- I

I se af en inhibitor til kompensation for forstyrrende faktorer, hvilken fremgangsmåde er I

I ejendommelig ved, at man til kompensation for forstyrrende faktorer bringer reaktions- I

I 10 blandingen i kontakt med 0,1-50 ptg/ml aggregater fra en anden og/eller tredje dyreart, I

I hvilke aggregater ikke er specifikke over for den immunologisk bindingsdygtige sub- I

I stans, og hvilke aggregater er afledt af monoklonale eller polyklonale antistoffer med I

I en molekylvægt på mindst 320.000 Dalton. I

I Som immunologisk bindingsdygtige substanser kommer især poly- I

I ^ valente antigener, såsom peptider, proteiner, polysaccharider, I

I virusser, bakterier og andre specifikke celler eller bestand- I

I dele af disse i betragtning. Som specifikke reaktanter for den I

I pågældende immunologisk bindingsdygtige substans til bestem- I

melse kan polyklonale såvel som monoklonale antistoffer an- I

vendes, fortrinsvis anvendes her IgGs og deres immunreaktive I

I 20 I

bestanddele, såsom Fab- eller F(ab')2“fragmenter, i kombina- I

I tion. Særligt foretrukket er anvendelsen af to eller eventuelt I

I flere specifikke reaktanter, hvoraf mindst den ene er et Fab- I

eller F(ab')ragment, og de øvrige specifikke reaktanter er I

fuldstændige IgGs. I 1

“ Som for den immunologisk bindingsdygtige substans ikke-speci- I

fikt antistof-aggregat til kompensationen for forstyrrelser I

anvendes fortrinsvis aggregater af for den immunologisk bin- I

dingsdygtige substans ikke-specifikke IgGs, særligt foretruk- I

ket anvendes et IgG-aggregat bestående af uspecifikt IgG og et I

yderligere makromolekyle. Herved foretrækkes ikke-specifikke I

IgGs, som hidrører fra den samme dyrerace som mindst en af de I

specifikke reaktanter. Velegnede makromolekyler er her f.eks. I

Fab- eller F (ab')2~fragmenter, dvs. Fc-frie IgG-fragmenter, I

som kan stamme fra af mus eller en anden art afledte MAKs el- I

.............1 """* ,ρη Γ" ·- ‘-fif11-1-^-1^1 TTOK^gOT---; g,-----r- ’^^gBBWJt.ji'iwuiiii1.11._y..,"»^-".y ^ i«"Hig DK 175429 B1 5 ler PAKs, såvel som proteiner (f.eks. albumin), polysacchari-der (f.eks. Dextran) eller andre vandopløselige polymerer. Endvidere kan der til kompensationen for forstyrrelser anvendes heteropolymerer, hvilke f.eks. dannes ud fra muse-IgG over 5 brodannende okse-IgG. Særligt foretrukket anvendes aggregater bestående af et IgG-molekyle og et Fc-frit IgG-fragment, hvorved såvel IgGs som de Fc-frie IgG-fragmenter hidrører fra den samme dyreart som en af de specifikke reaktanter. Sådanne IgG/Fab-eller F(ab')2_polymerer viser endog en faktor ca. 3 10 gange bedre virkning til fjernelse af forstyrrelse end rene

IgG-aggregater. Afhængig af de individuelle serumprøver er 0,1-50 pg/ml af en IgG-blandingspolytner tilstrækkelig til en vellykket fjernelse af forstyrrelse, fortrinsvis arbejdes dog med koncentrationer fra 5 til 25 pg/ml og særligt foretrukket 15 med koncentrationer fra 5 til højst 10 pg/ml, da en langt ringere tilsætning af uspecifikke IgG-aggregater i de fleste tilfælde allerede er fuldt ud effektiv.

Ifølge en foretrukket udførelsesform af opfindelsen anvendes 20 til kompensationen for forstyrrende faktorer i humansera uspecifikke homopolymere eller heteropolymere IgG-aggregater eller IgG/Fab- eller F(ab')2_a99re9ater roed molekylvægte på 320.000 Dalton og derover. Dermed indeholder IgG-aggregaterne IgG fra den art, hvorfra mindst en af de specifikke reaktanter hidrører, og 25 hører fortrinsvis til den samme underklasse, som mindst en af de specifikke reaktanter. Fortrinsvis anvendes herved polymere IgG-præparater med molekylvægte fra 320.000 til 10 millioner Dalton, hvorved kompensationsvirkningen over for f oristyr rende faktorer i serum vokser med stigende molekylvægt. Særligt fo-30 retrukne udførelsesformer for opfindelsen er to-si det-immun-bestemmelser med to eller flere specifikke muse- eller rotte-MAK-reaktanter, hvoraf mindst en reaktant er et Fab- eller F(ab')j-fragment og mindst en af de andre reaktanter er et Fc-holdigt IgG, til hvilke der til kompensationen for forstyr-35 rende faktorer tilsættes homopolymere eller heteropolymere ikke-specifikke IgG-aggregater eller IgG/Fab- eller F(ab')2_a99regater med molekylvægte større end 320.000 Dalton, hvorved de i de uspecifikke aggreagater indeholdte IgGs og

I DK 175429 B1 I

I I

I Fab- eller F(ab')2"fragmenter er monoklonale og er fra den I

samme art og underklasse som mindst en af de specifikke reak- I

I tanter. Dermed er det ligegyldigt, om det ikke-specifikke IgG I

eller Fab-fragment fremstilles over bugvattersot, fermentation I

I 5 eller over gensplejsning ved ekspression i mikroorganismer. I

I Polymeriserede, uspecifikke IgG-molekyler eller uspecifikke I

IgG-/Fab- eller F(ab1)2~aggregater, som efter fremgangsmåden I

ifølge opfindelsen er velegnede til kompensation for forstyr- I

10 reiser, må afledes fra en anden art end den, hvorfra prøven I

I til analyse hidrører. I reglen anvendes immunologiske bestem- I

I melsesfremgangsmåder til analyser af humansera ved hjælp af I

H specifikke, af mus afledte monoklonale antistoffer eller deres I

immunreaktive fragmenter. De specifikke antistofreagenser kan I

15 dog også stamme fra en anden dyreart. De tilsatte uspec if ikke I

antistofaggregater til fjernelse af forstyrrelse kan tilsva- I

rende hidrøre fra mus eller i kombination med muse-IgG eller I

deres Fab-fragmenter fra en anden dyreart, soro er forskellig I

I fra den første. F.eks. kan der anvendes muse-IgG/okse-IgG- I

20 heteropolymerer (s.o.) til fjernelse af forstyrrelse ved im- I

H munbestemmelser, hvor der som specifikt anti stofreagens an- I

vendes muse-MAKs eller muse-IgGs. I

Ved tilsætningen af uspecifikke IgG-aggregater eller igG/Fab- I

25 eller F(ab1)2-aggregater ifølge opfindelsen opnås i sammenlig- I

I ning med native IgGs en faktor 20-1000 og i sammenligning med I

native eller aggregerede Fc-frie IgG-fragmenter en faktor 20 - I

H 1500 eller en 3-gange forhøjet virkning til kompensationen for I

uspecifikke reaktioner ved immunbestemmelser med mindst to I

30 specifikke reaktanter for immungenet til bestemmelse, hvoraf I

I mindst en af reaktanterne afledes af et Fab- eller et I

F(ab')2~fragment. Dette er overraskende, da det ikke kunne fo- I

I rudses, at IgG-holdige uspecifikke reaktanter ved immunbestem- I

I melser, ved hvilke Fc-frie specifikke immunglobulinreagenser I

35 af monoklonale eller polyklonale antistoffer medvirker, over- I

I hovedet bevirker en kompensation for forstyrrelser rettet mod I

I Fab- eller F(ab’)2-fragmenter. Desuden føres EP-B 00838G9 som I

teknikkens nærmestliggende stade snarere fagmanden til en mod- I

--- f. «· I. II Ί -11111 -Γ—- ---—-----?. -———τ· ' I'·» H- - " . · -.™ . —· *-- -rw DK 175429 B1 7 sat antagelse. I dette patentskrift fremhæves udtrykkeligt, at hverken native eller aggregerede IgGs viser nogen effekt til fjernelse af forstyrrelse ved den deri omtalte immunologiske agglutinationstest, og at de tilsatte midler til fjernelsen af 5 forstyrrelse samt til den specifikke agglutination må være IgG-frie.

Uspecifikt IgG kan tværbindes med sig selv eller med antistof-fragmenter såvel som med proteiner, polysaccharider eller an-10 dre vandopløselige makromolekyler under varmeindvirkning, kemisk eller ikke-kovalent over bioaffin vekselvirkning efter fra litteraturen kendte metoder. I hvert tilfælde fremkommer opløselige aggregater i vandige pufferopløsninger. Den kemiske tværbinding kan f.eks. gennemføres ved homo- og heterobifunk-15 tionelle kemiske forbindingsarme (forbindelsesled) over proteiner eller aktiveret Dextran eller ved selvtværbinding af IgG-molekylerne eller deres og/eller andre Fc-frie fragmenter med carbodiimid. Desuden er det muligt at tværbinde antistofmonomererne med sig selv eller et andet velegnet makromolekyle via 20 disulfidreduktion og reoxidation eller via oxidation af deres kulhydratandel. I betragtning som kemiske forbindelsesled kommer f.eks. bis(maleinimido)-methylester, dimethylsuberi-midat, disuccinimidyl-suberat, giutardialdehyd, N-succinimi-dyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, N-5-azido-2-nitrobenzoyl-25 succinimid, N-succinimidyl(4-jod-acetyl)-aminobenzoat eller kombinationen af ma1eini midohexanoy1succini midat og S-acetyl-mercaptoravsyreanhydrid eller analoge forbindelser. Fremstillingen af aktiveret dextran kan f.eks. gennemføres ud fra ami-nodextran med en defineret molekylvægt og maleinimidohexanoy 1-30 succinimidat, som derefter tværbindes med mercaptoacety 1 -derivatiserede uspecifikke IgG-molekyler. Med bioaffin vekselvirkning menes almindeligvis sådanne bindinger, såsom de der f.eks. foreligger ved parrene biotin/avidin (eller streptavi-din), hapten/anti-hapten-anti stof, antigen/ anti-antigen- 35 antistof, ligand/bindingsprotein (f.eks. thyroxi n/thyroxi n-bindende protein), hormon/receptor. En velegnet udførelsesform fremkommer ved mindst dobbelt biotinylering af uspecifikt IgG og tilsætning af streptavidin eller gennem derivatisering af

I DK 175429 B1 I

I i

I IgG med mindst to digoxi geni nmolekylep og tværbinding med et I

I monoklonalt eller polyklonalt anti-digoxin-antistof. Aggregat- I

er, som fremkommer ved omsætning af polyhumanalbumin med et I

monoklonalt antihumanal'buminantistof, er eventuelt velegnede. I

I 5 I

I De resulterende aggregat-råblandinger kan anvendes direkte ef- I

I ter dialyse eller f.eks. adskilles i fraktioner med stigende I

molekylvægt ved gelfi 1 trer ing og derefter direkte anvendes til I

I kompensationen for forstyrrende faktorer i immunbestemmelser. I

I 10 I

I En af de specifikke reaktanter, fortrinsvis det Fc-holdige I

I IgG-anti stof, som er tilsat testblandingen, bindes på for fag- I

I manden kendt måde i fast fase på et bæremateriale, såsom I

I f.eks. agarose eller plastrør og lignende, eller foreligger i I

15 flydende fase - f.eks. forbundet med biotin. Anvendes et bio- I

tinyleret første antistof, dannes derefter komplekset ud fra I

I antigenet og en markeret anden specifik reaktant, som derpå på I

I stedet bindes på et bæremateriale, som er belagt med et I

biotin-bindende protein, som f.eks. avidin eller streptavidin. I

I 20 Desuden er også andre testveje med første biotinyleret anti- I

stof mulige: antigenet reagerer med det bi ot i ny 1erede MAK og I

I bindes på stedet eller efter en bestemt forinkubationsperiode I

I på en bioti n-bindende fastfase og bringes derpå først sammen I

I med den anden specifikke reaktant. Eller det er muligt først I

25 at omsætte antigenet med den anden specifikke reaktant og der- I

I efter med det biotinylerede antistof. Markeringen af det andet I

I og eventuelt yderligere specifikke reaktanter, hvor det for- I

trinsvis drejer sig om Fc-frie IgG-fragmenter, udføres ved I

I kobling roed et enzym, en fluorescerende, en kemoluminiscerende I

I 30 eller en radioaktiv substans. Fremgangsmåder til markeringen I

I af sådanne åntistofderivater er kendt af fagmanden, f.eks. fra I

I E. Ischikawa et al., J. of Immunoassay 4 (1983) 209-327, og I

I behøver ingen yderligere belysning her. I

35 Et yderligere formål med opfindelsen er diagnostiske midler I

I til bestemmelse af immunologisk bindingsdygtige polyvalente I

I substanser i en biologisk væske fra en første dyreart eller fra mennesket i to-sidet-immun- I

I bestemmelser, hvilke indeholder de beskrevne uspecifikke antistof-aggregater. Det diagnostiske I

DK 175429 B1 9 middel indeholder du over mindst to for den immunologisk bindingsdygtige substans specifikke reaktanter fra en anden dyreart, af hvilke specifikke reaktanter mindst en er Fc-holdig, en inhibitor til kompensation for forstyrrende faktorer, et velegnet puffersystem og de beskrevne uspecifikke antistof-aggregater samt eventuelt yderligere sæd-5 vanligt anvendte hjælpestoffer, som f.eks. reaktionsffemskyndende midler, detergenter eller stabilisatorer. Som velegnede puffersystemer kan f.eks. anvendes 20-60 mM phosphatpuffer (pH 7,0) eller et 50 mM HEPES/100 mM NaCl-puffersystem (pH 7,4).

I betragtning som reaktionsfremskyndende midler kommer her f.eks. dextransulfat eller polyethylenglycol 6000 til 40.000, som detergenter kommer f.eks. Triton x-100, Tween 10 20 eller Pluronic F 68 i betragtning, og som velegnede stabilisatorer kommer bl.a. phe nol, oxypyrion, chloracetamid og merthiolat i betragtning.

Det diagnostiske middel indeholder de uspecifikke antistofaggregater med molekylvægte fra 320.000 Dalton og mere, for-15 trinsvis til 10 millioner Dalton, i en koncentration fra 0,1 til SO pg/ml, fortrinsvis i en koncentration fra 5 til 25 pg/ml og særligt foretrukket i en koncentation fra 5 til 10 Mg/ml.

Det diagnostiske middel kan foreligge i form af en opløsning 20 eller et tørstofreagens, som er påført på en absorberende bærer, eller i form af en åben film.

Det omhandlede diagnostiske middel i form af en opløsning, som eventuelt er pufret til den ønskede pH-værdi, indeholder fortrinsvis samtlige reagenser, der er nødvendige for testen. Af 25 holdbarhedsgrunde kan det være fordelagtigt at fordele de påkrævede reagenser til testen i to eller flere opløsninger, som først blandes ved den egentlige undersøgelse. Dermed er det uden betydning, om de uspecifikke anti stof-aggregater separeres i et velegnet puffersystem eller/og foreligger sammen med et eller/og begge eller yderligere specifikke antistoffer.

i

Til fremstilling af det diagnostiske middel i form af en test-strimmel imprægneres en absorberende bærer, fortrinsvis filter- I DK 175429 B1

I 10 I

I papir, cellulose eller kunstfibertæppe, med opløsninger af de I

H nødvendige, til fremstilling af teststrimler sædvanligt an- I

vendte reagenser i letflygtige opløsningsmidler, som f.eks. I

vand, methanol, ethanol eller acetone. Dette ken gennemføres i I

5 et imprægneringstrin. Ofte er det dog hensigtsmæssigt at gen- I

nemføre imprægneringen i flere trin, hvorved der anvendes I

opløsninger, som hver indeholder en del af bestanddelene i det I

diagnostiske middel.

10 Til fremstilling af det diagnostiske middel i form af en test- strimmel kan endvidere benyttes en åben film, i hvilken der ud H over filmdannende midler og pigmenter er indeholdt de speci- fikke antistoffer eller anti stoffragmenter, de beskrevne uspecifikke anti stof{fragment)-aggregater, et velegnet puf- 15 fersystem og øvrige almindeligt anvendte tilsætningsstoffer til diagnostiske midler.

De færdige testpapirer og testfilm kan anvendes som sådan el- ler på kendt måde fastklæbes på bærefolier eller fortrinsvis 20 indkapsles mellem kunststoffer og finmaskede netværk ifølge DE-patentskrift nr. 2118455 og bringes i forbindelse med lefl gemsvæsken til undersøgelse (f.eks. blod, plasma, serum).

H Opfindelsen er velegnet til bestemmelse af alle antigener med I 25 mindst to antigendeterminanter. Eksempler herpå er thyreotro- fl pin (TSH), carcinoembryona1t antigen (CEA), hepatitis-virusser I (hepatitis B overfladeantigen, HBs), 1-føtoprotein (AFP), hu- H mant choriongonadotropin (HCG), 1 ute ini serende hormon (LH), foilikelstimulerende hormon (FSH), krogi obul in, surt pro- 30 stataphosphatase, prolactin, ferritin og insulin.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere: 35

—-: - . , ..., . - 'T "'"l.!!11 . )1^,1 »lillLg J . " »' t I

DK 175429 B1 11

Eksempel 1

Fremstilling af monoklonalt muse-IqG-aqqreqat ved tværbinding med et homobifunkt ionelt reagens.

5

Monoklonalt MAK33-IgG (>95% rent; underklassesammensætning K, yl; specificitet antikreatinkinase) isoleres ud fra bugvatter-sotvæske ved ammoniumsulfatfældning og kromatografi på DEAE-ionbytter (se A. Johnstone og R. Thorpe, Immunochemistry in 10 practice, Blackwell Scientific Publications 1982, side 44-45).

50 mg IgG opløses i 3 ml 0,025 M bicarbonat/carbonatpuffer med en pH-værdi på 9,5. Til denne opløsning pipetteres 17 μΐ 12,5% glutardialdehydopløsning, og der inkuberes 2 timer ved 25°C. Der-15 efter afkøles opløsningen på et isbad og indstilles til en pH-værdi på 8,2 med 50 mM triethanolaminpuffer. Til denne opløsning sættes 0,6 ml frisk fremstillet natriumborhydridopløsning (8 mg natriumborhydrid/1 ml bidesti 1 leret vand), og der inkuberes yderligere 2,5 time ved 0°C. Efter 16 timers dialyse 20 ved 0-4°C over for 10 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,5, der indeholder 0,2 M NaCl, fjernes overskydende reagenser. Oialysatet koncentreres ved ultrafiltrering til et volumen på 1,25 ml. En del af dette koncentrat (råblanding) anvendes direkte til fjernelse af forstyrrelse; 1,0 ml deraf kroma-25 tograferes over en gelfi 1 trer ingssøjle med AcA22-fyldning (LKB). Søjledimension 2 x 40 cm; drivpuffer 10 mM phosphat/100 mM NaCl, pH 7,5. Søjleeluatet undersøges med en (JV-detektor ved 280 nm for proteinindhold og fraktioneres. Fraktionerne fra hele det proteinholdige elueringsområde forenes i 4 puljer 30 med samme volumen. Ved justering af gelkromatografi søj1 en med proteiner med kendte molekylvægte kunne puljerne indordnes i molekylvægtsområderne 160.000 - 400.000, 400.000 - 1.000.000, 1-2 millioner og 2 - 10 millioner. Efter koncentrering af puljerne til en proteinkoncentration på ca. 2 mg/ml kunne IgG-35 aggregatopløsningerne med de forskellige molekylvægtsområder anvendes til fjernelse af forsyrrelse.

I DK 175429 B1 I

I I

Eksempel 2 I

Fremstilling af monoklonalt muse-IqG-aqqreqat ved tværbinding I

B~ med et heterobifunkt ionelt reagens. I

I 5 I

B a) Fremstilling af MAK33-IgG-MH (maleinimidohexanoyl-MAK33- I

I ig6) * I

100 mg MAK33-IgG opløses i 4 ml 30 mM phosphatpuffer med en I

10 pH-værdi på 7,1. Til denne opløsning pipetteres 20 μΐ (4 umol) I

af en 0,2 M opløsning af maleinimidohexanoylsuccinimidat i I

dimethylsulfoxid. Reaktionsblandingen inkuberes 1 time ved I

I 25eC og dialyseres derpå ved 0-4eC i 16 timer over for 10 mM I

B phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,1 indeholdende 50 mM NaCI. I

B 15 Der opnås 4,45 ml opløsning med 22 mg MAK33-Ig6-MH/ml. I

B b) Fremstilling af MAK33-IgG-SAMS (S-acetylmercaptosucciny1 - I

B MAK33-IgG). I

B 20 100 mg MAK33- IgG opløses i 4 ml 0,1 M phosphatpuf fer med en I

B pH-værdi på 8,0. Til denne opløsning pipetteres 40 μΐ af en I

B 0,25 M opløsning af S-acetyl-mercaptoravsyreanhydrid i I

B dimethylsulfoxid. Reaktionsblandingen inkuberes 1 time ved I

B 25°C og dialyseres derpå i 16 timer ved O - 4*C over for 10 mM I

B 25 phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,1 indeholdende 50 mM NaCI. I

B Der opnås 4,45 ml opløsning med 21,8 mg MAK33-IgG-SAMS/ml. I

B c) Tværbinding af MAK33-IgG-MH med MAK33-IgG-MS (mercapto- I

B succinyl-MAK33-IgG). I

30 I

B 50 mg MAK33-IgG-SAMS fortyndes til en koncentration på 15 ' I

B mg/ml i 25 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5 indehol- I

B dende 2 mM ethylendiamintetraacetat (puffer A). Til denne I

B opløsning pipetteres 75 μΐ af en 1 M hydroxylaminopløsning, og I

B 35 der inkuberes i 20 min. ved 25eC. I

B 3 ml af denne opløsning med 44 mg MAK33-IgG-MS fortyndes med I

puffer A til 6,0 ml. Til denne opløsning tilsættes 4 ml opløs- I

1 ^..... jTOA!· zr^r-^m DK 175429 B1 13 ning med 88 mg MAK33-IgG-MH. Blandingen inkuberes i 40 min. ved 25eC, hvorefter der til afbrydelse af tværbindingsreaktionen tilsættes cystein til 2 mM. Efter yderligere 30 min. inkubation ved 25eC tilsættes N-methylmaleinimid til 5 mM, og 5 opløsningen holdes yderligere 1 time ved 25°C. Reaktionsopløsningen dialyseres over for 10 mM phosphatpuf f er med en pH-værdi på 7,5, indeholdende 0,2 M NaCl. Dialysatet koncentreres ved ultrafiltrering til en proteinkoncentration på 35 mg/ml og befris for mindre uklarheder ved centrifugering. En typisk mo-10 lekylvægtfordel ing for et sådant dialysat (råblanding) af et MAK33-IgG-aggregat er vist på fig. 1. Aggregatblandingen kan anvendes direkte eller efter opdeling i molekylvægtfraktioner (AcA22-kromatografi som i eksempel 1) til fjernelse af forstyrrelse.

15

Eksempel 3

Fremstilling af MAK33-Iq6-aqqreqat ved tværbinding over 2 0 ami nodextran.

a) Fremstilling af S-acetylthioacety1-aminodextran.

100 mg aminodextran (Dextran T40, Pharmacia; 28 amninogrup-25 per/moleky1 vægt 40.000) opløses i 4 ml 30 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,1. Til denne opløsning pipetteres 0,25 ml af en 0,2 M S-acetylthioacetylsuccinimidatopløsning i dimethyl-sulfoxid. Reaktionsblandingen inkuberes 1 time ved 25eC og dialyseres derpå over for 10 mM phosphatpuffer med en pH-værdi 30 på 6,1, som indeholder 50 mM NaCl. Udbyttet 90 mg S-acetyl-thioacetylaminodextran i 4,5 ml opløsning.

b) Tværbinding af MAK 33-Ig6-MH med thioacetylaminodextran 35 2 ml opløsning med 20 mg/ml S-acetylthioacetylaminodextran indstilles forsigtigt med 0,1 M NaOH til en pH-værdi på 6,5, og der tilsættes ethylendiamintetraacetat til 2 mM. Til denne opløsning pipetteres 40 μΊ af en 1 M hydroxylaminopløsning, og I DK 175429 B1

I I

I der inkuberes 20 min. ved 25*C. Derefter fortyndes opløsningen I

I til 6,8 ml med 25 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5, og I

I der tilsættes 7,2 ml af en opløsning med 158,4 mg MAK33-Ig6-MH I

I (fremstilling som eksempel 2a). Efter 30 min. inkubation ved I

I 5 25®C sættes til reaktionsblandingen cystein til 2 mM og efter I

30 min. yderligere N-methylmaleinimid til 5 mM. Efter yderli- I

gere en times inkubation ved 25°C dialyseres polymerisatet I

over for 10 mM phosphatpuf fer ved en pH-værdi på 7,5/50 mM I

I NaCl. Efter fracentr i fugering af en mindre uklarhed opnås 19,5 I

10 ml af en opløsning af MAK33-IgG-dextran-aggregat med et pro- I

I teinindhold på 7,1 mg/ml. I

Eksempel 4 I

15 Fremstilling af MAK33-IgG-aqqreqat ved tværbinding over I

okse-IqG. I

a) Fremstilling af okse-IgG-MH I

H 20 100 mg polyklonalt okse-IgG omsættes analogt med eksempel 2a) I

med 4 pmol maleinimidohexanoylsuccinimidat. Udbytte 4,45 ml

opløsning med 22 mg okse-IgG-MH/ml. I

I b) Fremstilling af MAK33-SATA (S-acetylthioacetyl-MAK33-IgG) I 25 100 mg MAK33-IgG opløses i 4 ml 30 mM phosphatpuffer med en I pH-værdi på 7,1. Til denne opløsning pipetteres 20 μΐ (2 μιηοΐ) af en 0,1 M opløsning af S-acetylthioacetylsuccinimidat i I dimethy1 sulfoxid. Reaktionsblandingen inkuberes 1 time ved

I 30 25°C og dialyseres derpå i 16 timer ved 0-4 eC over for 10 mM

I phosphatpuffer pH 6,1/50 mM NaCl. Der opnås 4,45 ml opløsning med 22 mg MAK33-IgG-SATA/ml.

c) Tværbinding af thioacetyl-MAK33-IgG med okse-IgG-MH

I 35 I 50 mg MAK33-IgG-SATA fortyndes til en koncentration på 15 I mg/ml med 25 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5, som in- I deholder 2 mM ethylendiamintetraacetat (puffer A). Til denne | 15 DK 175429 B1 opløsning pipetteres 75 μΐ af 1 M hydroxy 1 aminopløsning, og der inkuberes 20 min. ved 25eC.

Til 3 ml af denne opløsning med 44 mg thioacetyl-MAK33-IgG 5 sættes 4 ml opløsning indeholdende 88 mg okse-IgG-MH, og der inkuberes 25 min. ved 25®C. Til afbrydning af tværbindingen tilsættes derpå cystein til 2 mM, og efter 30 min. inkubation ved 25°C tilsættes jodacetamid til 5 mM. Efter endnu en times inkubation ved 25eC dialyseres i 16 timer ved 0-4 eC over for 10 10 mM phosphatpuffer pH 7,5/50 mM NaCl. Efter centrifugering af dialysatet opnås 8,9 ml MAK33-IgG-okse-IgG-aggregat med en proteinkoncentration på 13 mg/ml.

Eksempel 5 15

Fremstilling af MAK33-IqG-aqareciat tværbundet over MAK33-Fab

a) Fremstilling af MAK33-Fab-SATA

20 200 mg MAK33-IgG spaltes med papain til Fab/Fc, og MAK33-Fab isoleres ud fra blandingen ved kromatografi på DE52 Cellulose (Whatman) (metode, se A. Johnstone og R. Thorpe, Immunochemi-stry in Practice, Blackwell Scientific Publications 1982, 52-53). Udbytte 95 mg MAK33-Fab i form af et saltfrit lyofi-25 lisat. 1

mg MAK33-Fab opløses i 2 ml 30 mM phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,1. Til denne opløsning pipetteres 30 μΊ (3 μιηοΐ) af en 0,1 M opløsning af S-acetylthioacetylsuccinimidat i dime-30 thyl sulfoxid. Reaktionsblandingen inkuberes i 1 time ved 25®C

og dialyseres derpå i 16 timer ved 0-4eC over for 10 mM pho-sphatpuffer pH 6,1/50 mM NaCl/2 mM ethy1 end iamintetraacetat.

Der opnås 2,6 ml opløsning med 18,5 mg MAK33-Fab-SATA/ml.

35 b) Tværbinding af MAK33-IgG-MH med thioacetyl-MAK33-Fab.

309 mg MAK33-Fab-SATA fortyndes til en koncentration på 15 mg/ml med 25 mM phosphatpuf fer med en pH-værdi på 6,5. Til I DK 175429 B1

I denne opløsning pipetteres 50 μΐ af en 1M hydroxylaminopløs- I

H ning, og der inkuberes i 20 min. ved 25°C. I

Til 1,5 ml af denne opløsning med 22 mg thioacety 1 -MAK33-Fab H 5 tilsættes 55 mg MAK33-IgG-MH (fremstillet som 2a), og der for- tyndes med bidesti 1 leret vand til et samlet volumen på 10 ml.

Blandingen inkuberes i 35 min. ved 25°C og bringes derpå til afbrydelse af tværbindingen ved hjælp af cystein til 2 mM.

Efter 30 min. ved 25°C tilsættes N-methylmaleinimid til 5 mM, 10 og der inkuberes påny i en time ved 25°C. Herefter dialyseres H reaktionsopløsningen i 16 timer ved 0-4eC over for 10 mM phos- phatpuffer pH 7,5/0,1 M NaCl. Efter centrifugering opnås 12,6 ml klar opløsning med 5,3 mg MAK33-IgG-Fab-aggregat/ml.

15 Eksempel 6

Fremstilling af MAK33-IgG-aqgregat ved tværbinding over biotin/streptavidin 20 a) Fremstilling af biotinyleret MAK33-IgG.

Til 50 mg MAK33-IgG i 2,5 ml 0,1 M kal i umphosphatpuf- fer med en pH-værdi på 8,5 sættes 1,13 mg biotinyl-e- H aminocapronsyre-N-hydroxysuccinimid (Boehringer Mannheim 25 GmbH) i 50 μΐ dimethylsulfoxid (molforhold IgG ; biotin - 1:7,5), og efter blanding inkuberes der i 90 min. ved 25°C.

Det biotinylerede IgG dialyseredes natten over ved 4*C over for 2 mM ka1 iumphosphatpuffere, pH 7,0.

I Udbytte: 45 mg MAK33-IgG-biotin i 6,4 ml.

I b) Tværbinding med streptavidin.

H Til 4 ml af MAK33-IgG-biot i n-opløsningen sattes med 5 min.

mellemrum 3 portioner af hver 1,5 mg streptavidin I 35 (Boehringer Mannheim GmbH) i 50 mM kaliumphosphatpuffer/0,1 I M natriumchlorid, og der inkuberedes i 20 min. ved 25'C.

I Molforhold IgG Streptavidin = 2,5:1. Blandingen koncen- I treredes til 2 ml ved ultrafiltrering og kromatograferedes __^_______________ ·_Ύ .τ;. ;.. -,;Γ ·*:=·:·- ·_ .....'."'..'t.· '""*»?:. ..'„nyjape.iB·'»« . 'agpaiiLÆ Γ'.'^ΐί sr - . :»?^:r^:Tvri^aBi DK 175429 B1 17 som i eksempel 1 på en AcA22-søjle. Alle fraktioner med molekylvagt >320.000 forenedes.

Udbytte: 21 mg NAK33-IgG-streptavidin-aggregat i 12 ml opløsning med et indhold på 17 mg IgG.

5

Eksempel 7

Tvarbindinq af MAK-anti-human-albumin med human-albumin.

10 40 mg human-albumin (Behringwerke, Marburg) i 1 ml 50 mM kali-

umphosphatpuffer, pH 7,0, aggregeredes ved 3 timers opvarmning til 70*C. Efter afkøling til 25eC fortyndedes en portion indeholdende 25 mg human-albumin-aggregat til 2,5 mg/ml med 50 mM ka 1 iumphosphatpuffer/0,1 M NaCl, pH 7,0,og med 5 min. mellem-15 rum tilsattes 4 portioner på hver 2,5 mg MAK MI-anti-humanalbumin (gamma 1, kappa) i 0,2 ml 50 mM ka1 iumphosphatpuffer, pH

7,0. Efter 20 min. inkubation ved 25°C koncentreredes blandingen til 2 ml og kromatograferedes som ovenfor på en AcA-gel-søjle. De protei nhol dige fraktioner med molekylvægte > 20 320.000 forenedes.

Udbytte: 12,4 mg MAK MI-IgG-albumin-aggregat i 7,8 ml med et indhold på 8,86 mg IgG.

Eksempel 8 25

Sammenligning af fjernelse af forstyrrelse mellem native MAK33-IqG og forskellige MAK33-IqG-aqqreqater i en CEA-enzvmimmunbestemmel se med to specifikke MAK-reaktanter.

30 Der blev anvendt reagenser fra en testpakke Enzymun® CEA (Boehringer Mannehim GmbH). De i denne test indeholdte reagensrør er belagt med et monoklonalt, CEA-specifikt muse-IgG (IgG 1, K). Den enzymmarkerede reaktant er et monoklonalt, CEA-specifikt muse-Fab-peroxidasekonjugat; underklassesammen-35 sætning for Fab er K, yl.

De forskellige MAK33-IgG-præparater tilsattes i stigende koncentration til inkubationspufferen, og undersøgelsen gennem- I DK 175429 B1

førtes med et humanserum (P43), hvori det var påvist, at der I

var forstyrrende faktorer til stede. Tabel 1 viser koncentra- I

I tionen af MAK33-IgG-prsparatet (i pg protein/ml) i inkubation- I

spufferen, hvilken undertrykte forstyrrelsen så vidt, at det I

5 rigtige analytindhold blev fundet i normalområdet (1-3,5 I

ng/ml). I

I 20 i 25

I 30 I

35 I

19 DK 175429 B1

Tabel 1

Relativ funktion til fjernelse af forstyrrelse hos forskellige MAK33-IqG-præparater.

5 ______.

Ti lsyne- I

Tilsætning til pg/ Faktor Ekstink- ladende ί

Inkubationspufferen ml til tion CEA-ind- fjer- hold i nelse serum P43 af for- ng/ml io sty ___relse___ uden 0 - 1,636 >58* MAK33-IgG monomer 9600 0,0026 0,132 3,4 MAK33-IgG-aggregat/GDA 34 0,74 0,126 3.1 15 (råblanding 1) MAK33-IgG-aggregat 25 1 0,125 3,1 (råblanding 2c) MAK33-IgG-dextran (3) 43 0,58 0,129 3,3 MAK33-IgG-okse-IgG- 82 0,3 0,130 3,3 20 aggregat (4) MAK33-IgG-Fab-aggregat (5) 3 8,33 0,122 2,9 * Værdi ligger uden for kalibreringskurvens område, som er de-25 fineret af kalibreringspunkterne.

Eksempel 9

Virkning til fjernelse af forstyrrelse hos MAK-IqG-agqreqater, som er tværbundet over ikke-kovalente. bioaffine bindinqer, i 3 0 ---1— en CEA-enzvmun»-test.

Reagenser og forsøgsgennemførelse se eksempel 8. Ved bestemmelse efter en referencemetode androg de anvendte humanse-rumprøvers faktiske CEA-indhold 2,8-4,2 ng/ml. Tabel 2 viser 3 9 de på en kalibreringskurve aflæste tilsyneladende CEA-koncen-trationer hos en humanserumprøve (nr. 108), som indeholder forstyrrende faktorer, ved forskellige IgG-aggregat-tiIsætninger til inkubationspufferen.

I DK 175429 B1

I 20 I

I Tabel 2

I Virkning til fjernelse af forstyrrelse hos IgG-aqqregater med . I

I bioaffin tværbinding. I

I 5 __________1____ I Tilsætning til Humanserum nr. 108 inkubationspufferen pg IgG/ral ng CEA/ml uden 40 I MAK33-IgG monomer 200 33,4 500 31,4 I HAK33-IgG-streptavidin 1 28,5 aggregat, eksempel 6 10 8,8 HAK MI-lgG-hum.albumin 2,5 36,7 15 aggregat, eksempel 7 7.5 25,1

Ud fra tabellen kan det ses, at begge bioaffin-tværbundne IgG- aggregater i henhold til IgG-vægtmængder viser væsentligt mere effektiv fjernelse af forstyrrelse end ikke-tværbundet IgG: H 20 faktor >500 eller > 60. Den anvendte mængde udvalgtes således, at de kun resulterede i delvis fjernelse af forstyrrelse; un- der sådanne betingelser kan den relative virkning til fjer- nelse af forstyrrelse hos forskelleige præparater nemlig bedst vurderes.

I 25 I Eksempel 10

Den forstyrrelsesfiernende funktions afhængighed af MAK33- | 30 IgG-aggreoatets molekylvægt.

Reagenser og gennemførelse af disse forsøg er som beskrevet i I eksempel 8. MAK-33-IgG-præparaterne fremstilles ifølge eksem- I Pel 2.

I 35 21

Tabel 3 DK 175429 B1

Virkning til fjernelse af forstyrrelse hos MAK33-IqG-agqreqa- ter i afhængighed af molekylvagten.

5 Tilsætning til Patientserum nr. 18* Patientserum nr. 43* i nkubations- pufferen Ekstinktion ngCEA/ml^ Ekstinktion ngCEA/ml2 uden tilsætning 1,567 >583 1,636 >581 10 125 pg/ml mono- 0,148 3,9 1,703 >58

mert MAK33-IgG

10 pg/ml MAK33- 0,115 2,7 0,179 6,2

IgG-aggregat råblanding 15 30 pg/ml MAK33- - - 0,125 3,1

IgG-aggregat råbianding 5 Mg/ml MAK33- 0,105 2,1 0,137 3,9

IgG-aggregat MG 2-10 Mio 20 5 pg/ml MAK33- 0,109 2,4 0,285 11,0

IgG-aggregat MG 1-2 Mio 5 pg/ml MAK33- 0,155 4,8 1,051 53,7

IgG-aggregat MG 400.000-1 25 M i o 5 pg/ml MAK33- 0,364 16,3 1,239 >58

IgG-aggregat MG 160.000- 400.000 30 *MG = molekylvægt.

1 Det ved en referencemetode målte sande indhold af CEA ligger i området fra 1-3,5 ng/ml.

2 Tilsyneladende CEA-indhold målt ved hjælp af ekstinktion og 35 kalibreringskurve med CEA-standardprøver efter arbejdsan visning til Enzymun® CEA.

Udenfor kalibreringskurveområdet, som er defineret af kalibreringspunkter.

I DK 175429 B1 I

I 2 2 I

Eksempel 11 I

Sammenligning af virkningen til fjernelse af forstyrrelse hos I

MAK-IgG-aggregater, som er fremstillet ud fra forskellige mo- I

5 noklonale antistoffer. I

Der anvendtes testrør fra en Enzymun® TSH-pakning (Boehringer I

Mannheim GmbH), som er belagt med et monoklonalt anti-TSH I

muse-IgG(IgGl, K). De øvrige reagenser blev som i eksempel 8 I

10 udtaget fra Enzymun® CEA-pakningen. Gennemførelse af testen I

skete efter denne paknings arbejdsanvisning. Ved denne gennem- I

førelse af testen kan der ikke gives noget signal ved en se- I

rumprøves analytindhold, idet begge de specifikke reaktanter I

I har helt forskellig specificitet. Det drejer sig dermed kun om I

15 en modeltest, som med serumprøver kun giver signal over nul- I

punktet, når der er indeholdt forstyrrende faktorer. Det ud- I

valgte MAK-IgG-aggregat til sammenligningen fremstilledes ana- I

logt med eksempel 2c ud fra MAK33. I

20 I 25 I 30 35 23

Tabel 4 DK 175429 B1

Sammenligning af virkningen til fjernelse af forstyrrelse hos IgG-aggregater af forskellige monoklonale antistoffer ved 5 en model-test.

Tilsætning til Ekstinktion ved inkubationspufferen pg/ml Serum P43 10 MAK33-IgG-aggregat (2c) 0 0,900 råblanding 1,25 0,506 2.5 0,366 5 0,238 10 0,195 20 0,152 l5 MAK MS43.10-IgG-aggre- 0 0,900 gatråblanding 1,25 0,554 2.5 0,406 5 0,286 10 0,202 20 0,180 20

Ekstinktion på en serumprøve udea CEA og uden forstyrrende faktor: 0,162.

Resultat: Virkningen til fjernelse af forstyrrelse hos de forskellige monoklonale MAK-IgG-aggregater er inden for fejl-25 grænsernes ramme ens.

Eksempel 12 ^ Virkning til fjernelse af forstyrrelse hos MAK-33-IgG-aggregat og monomert MAK33-IgG i et forsøg med biotinvlerede MAK-IgG-reaktanter.

I denne undersøgelse anvendes to monoklonale heptati tis-overfladeantigen (HBsAg)-spec i f ikke MAK-IgGs på biotinyleret form 3 5 (biotinylering gennemført efter T.V. Updyke og G.L. Nicolson i Methods in Enzymology, 121 (1986) 717-725). Det ene derfra, MAK6E7-IgG er fra undertypen IgGl/K, det andet, MAK5A10-IgG, I DK 175429 B1 B er fra undertypen IgG2a,K. Som enzymmarkeret reaktant anvend- B tes MAK5A10-Fab-P0D-konjugat.

B Sammensætning af inkubationspufferen:

B

B 40 mM phosphatpuffer pH 7,0 B 0,2 M natriumtartrat B 0,5% vægt/rumfang% okseserumalbumin

B 0,1% vægt/rumfang% okse-IgG

B 10 0,5% vægt/rumfang% "Pluronic" F68 B 0,01% vægt/rumfang% phenol I 200 ng/ml MAK6E7-IgG (biotyni1eret) B 25 ng/ml MAK5A10-IgG (biotynileret) B 200 mll/ml MAK5A10-Fab-P0D-konjugat I 15 B Proteintilsætning til fjernelse af forstyrrelse, se tabel 5.

B MAK33-IgG-aggregat-råblandinger fremstilledes ifølge eksempel

B

B Til undersøgelsen pipetteredes henholdsvis 0,2 ml serumprøve B og 1 ml inkubationspuffer i et polystyrenrør, som var belagt B med streptavidin. Derefter inkuberedes i 4 timer ved stuetem- B peratur. Efterfølgende vaskedes hvert rør med 3 x 1,5 ml led- B 25 ningsvand, og der tilsattes henholdsvis 1 ml substratopløsning B (ABTS/peroxid) fra Enzymun® CEA-testpakning. Efter yderligere B en times inkubation ved stuetemperatur måltes ekstinktionen i B den omsatte substratopløsning ved 405 nm.

B

Tabel 5 25 DK 175429 B1

Sammenligning af virkningen til fjernelse af forstyrrelse hos MAK33-IaG-præparater i en sandwich-enzymimmuntest med biotinv-5 lerede MAK-IgG-reaktanter.

Tilsætning til Ekstinktion for serumprøve inkubationspufferen pg/ml nr. 100* nr. 4891 I NS2 10----- uden 0 1.390 0,262 0,042 MAK33-IgG-monomer 1 - 0,042 5 1,070 0,102 0,045 10 0,884 0,068 0,048 200 0,125 0,042 0,046 15 400 0,080 0,048 0,049 MAK33-IgG-aggregat (2c) 0 1,044 0,378 0,047 råblanding 1 0,125 0,034 0,043 5 0,043 0,045 0,048 10 0,048 0,035 0,054 20 ----- ad 1: Serumprøverne nr. 100 og nr. 489 leveredes fra en blodbank og var deklarerede som HBSAg-frie.

ad 2: Serum fra en sund donor, hvilken serum hverken indeholdt 25 HBsAg eller forstyrrende faktor.

Ud fra det undersøgelsesresultat, at der for serum nr. 100 opnåedes den samme fjernelse af forstyrrelse på et signal på 0,125 med 200 pg/ml monomert MAK33-IgG som med 1 pg/ml MAK33-3 0

IgG-aggregat, følger, at IgG-aggregat i denne undersøgelse er 200-gange mere aktivt til fjernelse af forstyrrelse.

35

I DK 175429 B1 I

I 26 I

I Eksempel 13 I

I Virkninq til fjernelse af forstyrrelse hos MAK33-IqG-aqoreqat I

i en undersøgelse med~ tør kemisk reaqensbærer. I

I 5 I

Bestemmelsen gennemføres med tør kemisk reagensbærer (tysk: I

Trockenchemiereagenztrager) i en enkelttrinsundersøgelse ef- I

ter dobbelt-antistoffastfase-sandwich-princippet i rotorind- I

I satselementer ved hjælp af en centrifugalanalysator med det i I

I 20 DE-offentliggørelsesskrift nr. 3425 008.5 beskrevne analyseap- I

paratur. I

1. Fremstilling af reagensopløsninger. I

I 15 a) Puffer I

50 mmol/1 kaliumphosphat-puffer, pH 6,0, fremstilles ved blanding af 50 mmol/1 K2HP04“opløsning og 50 mmol KH2P04~opløsning indtil opnåelse af en pH-værdi på 6,0.

I 20

I b) Puffer II

Puffer II fremstilles som puffer I med den undtagelse, at I pH-værdien indstilles på 7,5, og at pufferen yderligere in- 25 deholder 10 g/1 okseserumalbumin og 150 mmol/1 NaCl.

I c) Reaktant R^-opløsning, bindingsdygtig med TSH

Som reaktant Rj anvendes et monoklonalt muse-anti-TSH- I 30 antistof. Til bugvattersotvæsken, som indeholder dette I antistof, sættes ammoniumsulfat til 1,8 M. Bundfaldet op- I tages i en puffer af 15 mM natriumphosphat, pH 7,0, og 50 mM natriumchlorid. Den således opnåede opløsning underka- I stes en passage over OEAE-cellulose. Det således resulte- I 35 rende TSH-bindingsdygtige antistof biotinyleres (5 biotin/IgG) og fortyndes med puffer II til en proteinkon- centration på l mg/ml.

27 DK 175429 B1 d) Enzymmarkeret reaktant R2-opløsning

Som reaktant R2 anvendes- eventuelt et monoklonalt muse-anti-TSH-antistof, som dog genkender en anden antigendeter-5 minant end reaktant Rj. Bugvattersotvæsken, som inde holder dette antistof, oprenses som angivet under 1.3. Det fuldstændige antistof spaltes på kendt måde til Fab-fragmentet ifølge R.R. Porters metode, Biochem. J. 73, (1959), side 119. De resulterende Fab-fragmenter kobles med 1° Ø-galactosidase ifølge Ishikawa et al., J. of Immunoassay 4 (1983), side 209-327. Reaktant R2~op1øsni ngen fortyndes i puffer II til en koncentration på 500 mU/ml (målt med o-nitrophenyl-Ø-galactosid ved 37°C).

I5 e) Protein til fjernelse af forstyrrelse MAK33-IgG-po1ymer, som er fremstillet som i eksempel 2, opløses i puffer II til en koncentration på 1 mg/ml.

20 f) Avidinopløsning

Avidin fortyndes med puffer I til en proteinkoncentration på 50 pg/ml.

25 g) Substratopløsning

Chlorphenolrødt-Ø-ga1actosid 5 mmol/1 (3,05 g/1) 30 (fremstillet ifølge DE-offentiiggørel- sesskrift nr. 3345748) HEPES 70 mmol/1 (16,7 g/l)

NaCl 154 mmol/1 (9 g/l)

Okseseruma1 bumin 0,3% (3 g/l) 35 Tween 20 0,2% (2 g/l) pH (med NaOH) 7,25 2. Fremstilling af reagensbærere I DK 175429 B1

I 28 I

a) Reagensbærer 1 (uden protein til fjernelse af forstyr- I

relse) I

40 μΐ af en opløsning, som pr. liter indeholder 100 mmol I

I 5 natriumphosphat, pH 7,3 (37°C), 2 mmol magnesiumchlorid, 9 I

g natriumchlorid, 5 g okseserumalbumin, 0,5 mg biotinyleret anti-TSH-monoklonalt antistof fra mus (reaktant R}), H 1.000 U anti-TSH-anti stof-{mus)-Fab-fragment-Ø-galactosi - dase-konjugat (reaktant R2~opløsning) (aktivitet bestemt 10 ned ortho-nitrophenyl-p-D-galactosid ved 37eC), pådryppes H på et vlies, som består af kommercielt polyesterpapir. Oer tørres efterfølgende ved stuetemperatur. Disse tæpper opbe- vares indtil deres anvendelse ved 4eC og en relativ luft- fugtighed på 20%.

I 15 b) Reagensbærer 1’ (med protein til fjernelse af forstyr- relse)

Fremstillingen gennemføres som for reagensbærer 1 bortset 20 fra, at der yderligere pr. liter imprægneringsopløsning er H indeholdt 0,01 g MAK 33-IgG-aggregat fra eksempel 2 c (råblanding).

c) Reagensbærer 2 I Til et cellulosetæppe fikseres ifølge Bromcyan-aktivise- ringsfremgangsmåden (DE-offentiiggørelsesskrift nr.

1768512) avidin (avidinopløsning), hvorved der pr. gram fa- semateriale tilbydes 10 pg avidin til fikseringen. Efter 30 vask fjernes ukoblet antistof, og tæppet tørres skånsomt I ved stuetemperatur. Lagringen af de således resulterende tæpper sker analogt med reagensbærer 1.

I 3. Gennemførelse af bestemmelsen

Bestemmelsen ved hjælp af begge disse reagensbærere 1 og 2 I eller 1' og 2 sker med det i DE-offentiiggørelsesskriftet I nr. 3425008.5 beskrevne apparatur til gennemføres 1 sen af I analytiske bestemmelser.

pt-*· _;_;_"ν' " ~.T' - · " · -gp' .'"IfT^gr· '.»ar..-gr: ^..

DK 175429 B1 29

Dette offentliggørelsesskrift anviser et rotor indsatselement til centrifugalanalyseautomater bestående af et form-legeme, som har et prøvetilførselskammer, der står i forbindelse med et flertal af reagensfelter, som hver især 5 indeholder absorberende bærermateriale imprægneret med et bestemt reagens, som har et blandingsventilkammer og som har et målekammer, der tilsammen danner en prøvevæsketrans-portvej, som fører fra den indre radialvej til den ydre radialvej, når indsatselementet er fastgjort til rotoren, 10 og endvidere fører til mindst et yderligere kammer til må legennemførelse og i det mindste delvis er identisk med prøvevæsketransportvejen.

Derved fører prøvevæsketransportvejen fra et prøvetilfør-15 selskammer (P) over et med absorberende materiale fyldt, puffer-holdigt kammer (a), et kammer (b) og et mellem kamrene (a) og (c) anbragt første ventilkammer (VK1) til et andet ventilkammer (VK2) og fra dette over kammeret (d) og over et opf angningskammer (AK) til målekammeret (K). Til 20 optagelse af en yderligere væske er anbragt et som pumpe kammer afbildet substratkammer (PK), hvilket over et doseringskammer (OK) og en doser ingsindretning bestående af kapillarrør (Kap) og et overløbskammer (YK) er forbundet med det andet ventilkammer (VK2) (se fig. 2).

25

Til bestemmelse af ekstinktion a (målesignal indbefattet forstyrrende signal) anvendes reagensbærer 1 og reagensbærer 2, og til bestemmelse af ekstinktionen b (spec i fikt målesignal uden forstyrrende signal) anvendes reagensbærer 1' 30 og 2.

Reagensbærer 1 eller 1’ placeres i rotorindsatselementets rum c, og reagensbærer 2 placeres i rum d. Herved pipetteres 40 μΐ koncentreret prøve direkte til rummet a gennem en åbning i den øvre kant. 270 μΐ substratopløsning pipetteres i kammer PK. Ved hjælp af et velegnet centrifugeringsprogram med vekslen mellem høje omdrejningstal og stilstand tvinges derpå prøve og substratopløsning i retning mod separat ionsmatri ks og kuvette.

I DK 175429 B1 I

I 30 I

I I programmets forløb elueres hermed reaktanterne Rj og R2 I

I uden eller med protein til fjernelse af forstyrrelse gennem I

I prøvevæsken fra rummet c, og den homogene blanding bringes I

I derefter til reaktion. I rummet d bindes de dannede kom- I

I 5 plekser over Rj til avidin. Overførselen af prøven fra rum

I c til d sker i løbet af meget kort tid. I

I Substratopløsningen inddeles ved hjælp af doseringskammeret

I DK i portioner, hvoraf de første tjener til udvaskning af I

I 1° overskydende, ikke-komplekst konjugat. Forstyrrende fakto- I

I rer, som kunne tværbinde R2, neutraliseres ved anvendelse I

I af 10 pg protein til fjernelse af forstyrre 1se/m 1 testop- I

I løsning og udvaskes eventuelt (anvendelse af reagensbærer I

I I

I 15 I

I Den over kompleksdannelse i d bundne β-galactosidaseakti - I

I vitet er proportional med den i prøven indeholdte TSH- I

I mængde eller med prøvenulværdien. Denne aktivitet bestemmes I

I med en yderligere substratportion, hvorved substratet om- I

I 20 sættes i en 5 min. reaktion til farvede produkter. Den dan- I

I nede farve og den videre farveudvikling/min. i den flydende I

I fase måles i kuvetten ved 576 nm. I

I Under disse betingelser opnåedes følgende resultater:

I 25 I

I 30 I

I 35 I

DK 175429 B1

Mg-’· ·Τ. .'r-, - - T--T·^ fy :: .·...... --: ----rr-- -......

31

Tabel 6

Prøve a b

Ekst. Kone. Ekst. Kone.

5 [mE] [uU/rol ] [mE] [μϋ/ml] TSH-kalibrator 0 pU/mlc) 451 0 457 0 TSH-ka1 i brator 10 19,6 μυ/mlC) 3331 19,6 3311 19,5

Humanserum 1 669 1,5 725 1,8

Humanserum 43 med forstyrrende faktorer 6790 38 662 1,5 15 _____

Alle målinger gennemførtes ved λ=576 nm ved en lagtykkelse på 0,3 cm og omregnes til en lagtykkelse d=l.

2o a) TSH-bestemmelse ved anvendelse af reagensbærer 1 b) TSH-bestemmelse ved anvendelse af reagensbærer 1' med MAK33-IgG-po1ymer til neutralisation af M-Fab-specifikke forstyrrende faktorer 25 c) TSH-standarder kalibreret ved 2. IRP 80/588.

Indholdet af TSH i humanserum 43 fastlægges til 1,4 pU/ml ved hjælp af en Enzymun® TSH-test fra Fa. Boehringer Mannheim.

30 Denne test indeholder som specifikke reaktanter et MAK-anti-TSH belagt på et rør og et polyklonalt fåre-anti-TSH-Fab-POD-konjugat. Det sidste er inert over for forstyrrende faktorer i HS 43.

35

Claims

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den immunologisk bindingsdyg- I I 15 tige substans er et polyvalent antigen, at de specifikke reaktanter er antistoffer, hvoraf I I mindst et er et Fab- eller F(ab’)2-fragment, og de ikke-specifikke aggregater er aggregerede I I IgGs. , I
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man bringer reaktions- I I 20 blandingen i kontakt med 5-25 pg/ml ikke-specifikke IgG-aggregater. I
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at de ikke-specifikke IgG- I I aggregater består af IgG og et andet makromolekyle. I I 25 5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at de I I ikke-specifikke aggregater har en molekylvægt på 320.000 til 10 millioner Dalton. I
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor mindst en I I af de specifikke reaktanter er forbundet med en markeringssubstans og et andet I I 30 er fikseret på en matriks eller er biotinyleret, og hvor enten den fikserede eller I · · _;__· · _- '-'·· -« r -.- - π .Λ DK 175429 B1 33 den på et biotin-bindende protein associerede immunologisk bundne eller immunologisk ikke-bundne aktivitet bestemmes, kendetegnet ved, at de ikke-specifikke IgG-aggre-gater er i opløsning i reaktionsblandingen under bestemmelsen. 5
7. Diagnostisk middel til bestemmelse af en immunologisk bin-' dingsdygtig substans i en biologisk væske fra en første dyre art eller fra mennesket, indeholdende mindst to for den immunologisk bindingsdygtige substans specifikke reaktanter fra en 10 anden dyreart, af hvilke specifikke reaktanter mindst en er Fc-holdig, en inhibitor til kom- ’ pensation for forstyrrende faktorer, en velegnet puffersubstans såvel som eventuelt yder-ligere sædvanligt anvendte hjælpestoffer, kendetegnet ved, at det til kompensation for forstyrrende faktorer omfatter 0,1-50 pg/ml aggregater fra en anden og/eller tredje 15 dyreart, hvilke aggregater ikke er specifikke over for den im munologisk bindingsdygtige substans, er afledt af monoklonale eller polyklonale antistoffer, og har en molekylvægt på over 320.000 Dalton.
8. Diagnostisk middel ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den immunologisk bindingsdygtige substans er et polyvalent antigen, at de specifikke reaktanter er antistoffer, hvoraf mindst et er et Fab- eller F(ab’)2~fragment, og at de ikke-specifikke aggregater er aggregerede IgGs. 25
9. Diagnostisk middel ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at det som ikke-specifikke IgG-aggregater omfatter IgG-aggregater bestående af IgG og et andet makromolekyle. 1 2 3 4 5 6
10. Diagnostisk middel ifølge et hvilket som helst af kravene 2 7 til 9, kendetegnet ved, at det omfatter to eller 3 flere specifikke muse- eller rotte-MAK-reaktanter, hvoraf 4 mindst en reaktant er et Fab- eller F(ab’)2~fragment og mindst 5 en af de andre reaktanter er et Fc-holdigt IgG, og homopolyme- 6 re eller heteropolymere ikke-specifikke IgG-aggregater eller IgG/Fab- eller IgG/F(ab')2-aggregater med molekylvægte større end 320.000 Dalton, idet de i de uspecifikke aggregater indeholdte IgGs og Fab- eller F{ab*)2~fragmenter er monoklonale og I DK 175429 B1 I I 34 I I fra den samme art og underklasse som mindst en af de speci- I I fikke reaktanter. I
11. Diagnostisk middel ifølge krav 8 til 10, kendeteg- I I 5 net ved, at det som yderligere hjælpestoffer omfatter reak- I I tionsfremmende midler, detergenter og/eller stabilisatorer. I 10 I I 15 I I 20 I 25 I I 30 I I 35 I