PT89889B

PT89889B - Processo para a preparacao de testes imunologicos contendo derivados de igg polimericos para a compensacao de factores perturbantes

Info

Publication number: PT89889B
Application number: PT89889A
Authority: PT
Inventors: Werner Stock; Helmut Lenz; Ellen Mossner; Norbert Franken; Robert Crance Mccarthy; Albert Roder; Haral Haug
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1988-03-03
Filing date: 1989-03-02
Publication date: 1994-05-31
Also published as: FI891012A0; DD280396A5; ATE82072T1; HU212322B; FI891012A; GR3006991T3; LV10538A; ZA891568B; LV10538B; EP0331068A1; AU616484B2; US4914040A; FI92879C; AU3090889A; JPH01254869A; PT89889A; JPH0823560B2; DK96689D0; DK175429B1; DK96689A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 89 889

REQUERENTE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, alemã, com sede em 6800 Mannheim 31, República Federal Ale mã.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TESTES IMUNO

LÓGICOS CONTENDO DERIVADOS DE IgG POLIMÈRI COS PARA A COMPENSAÇÃO DE FACTORES PERTURBANTES .

INVENTORES: Dr.rer. nat. Helmut LENZ, Dr. rer. nat. Ellen MOSSNER, Dr. rer. nat. Werner STOCK e Dr. rer. nat. Norbert FRANKEN, Dr. Robert Crance McCARTHY, Dr. rer. nat. Albert RODER e Dr. rer. nat. Haral HAUG.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. Estados Unidos da América, em 3 de Março de 1988, sobonL 164,054.

INRI. MOQ 113 RF 10732

Descrição referente à patente de invenção de BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, i ,! alemã, industrial e comercial, com | sede em 6800 Mannheim 31, República Federal Alemã, (inventores: Dr.

ji rer.nat. Helmut LENZ , Dr, rer.nat.

Ellen MOSSNERj Dr» rer.nat. Werner STOCK e Dr. rer.nat. Norbert FRANKEN, í residentes na Alemanha Ocidental, ι

Ί Dr. Robert Crance McCARTHY, residente nos E.U.A. e Dr. rer.nat, Albert RODER e Dr. rer,nat, Haral HAUG, re-l / sidentes na Alemanha), para PROCESSO j PARA A PREPARAÇÃO DE TESTES IMUNOLÕI) GICOS CONTENDO DERIVADOS DE IgG POLI'' MERICOS PARA A COMPENSAÇÃO DE FA CTORES PERTURBANTES ί

I

Descrição

A invenção refere-se a um processo I melhorado para a determinação de uma substância polivalente ^: com capacidade de ligação imunolúgica em presença de pelo menos ί dois reagentes específicos para a substância com capacidade de ligação imunolúgica e em presença de um inibidor para a compensação de factores perturbantes em amostras de soro humano assim como a um reagente apropriado para esse efeito.

A determinação sensível de substâncias corp capacidade de ligação imunológica, como por exemplo de antigenes polivalentes (péptidos, proteínas, polissacáridos, vírus, bactérias, células específicas) com utilização de dois ou even tualraente mais anticorpos que se ajustam contra diversos determinantes de antigenes especialmente diferentes é conhecida como ensaio em sanduíche (two-site-immunoassay- ensaio imunológico em dois sítios) imunorradiométrico ou imunoenzimométricoo Mais vulgarmente, a realização deste processo de determinação conhecido consiste em ligar o antigene a determinar (amos tra) com um primeiro anticorpo que ou está ligado a um matéria^ de suporte apropriado como Sefarose, agarose, tubos de ensaio de plástico e semelhantes ou homogeneamente, como por exemplo biotinilado em solução e incubar uma determinada quantidade de um segundo ou mais anticorpos outros anticorpos marcados em fase líquida o A especificidade do segundo e eventualmente outros anticorpos é preferivelmente escolhida de tal forma que eles normalmente se ajustam contra outros determinantes do antigene a determinar diferentes do primeiro anticorpo para se excluir uma concorrência entre os anticorpos nesses mesmos pontos de ligação no antigene a determinar porque, desta forma, a sensibilidade do ensaio serie influenciada. Tanto o primeiro anticorpo marcado ligado à fase sólida ou biotinilado como também o segundo ou outros anticorpos marcados são adicionados em excesso» O respectivo antigene pode ser determinado por meio da actividade não imunologicamente ligada fixada ao primeiro anticorpo ou existente em solução» Neste óltimo caso, é necessário adicionar uma quantidade definida do segundo anticorpo ligado

Por causa da necessária especificidade, para os ensaios imunológicos em sanduíche são utilizadas IgG completas derivadas especialmente de anticorpos monoclonais (MAK) ou os seus fragmentos reactivos (Fab, F(ab’) ). á, no entanto, além disso possível empregar componentes imuno-rectivos nestes ensaios, os quais derivam de anticorpos pociclonais (PAK).

Muito embora nos ensaios de imunidade de dois sítios se utilizam anticorpos específicos para os analitoè i

a determinar, aparecem com uma frequência significativa amostràs i

de soro humano e que provocam reacções nao específicas. Estas originam resultados dos ensaios faleos com consequências gravosas para as medidas terapêuticas, 0 aparecimento de reacções não específicas deve atribuir-se a substâncias existentes na

I amostra que igualmente ao analito a determinar (antigene polivalente) ligam os reagentes específicos da imunoglubulina (fac! tores perturbantes), embora noutros pontos de ataque.

Correntemente, por consequência, nesses : ensaios de imunidade adicionasse preventiva men te imunoglobulil

I ;nas ou fragmentos de imunoglobulinas não específicas em excesso ι (como regra geral, trata-se de imunoglobulina G, IgG) da mesma ί espécie de animal de que derivam os anticorpos específicos (G.M. Adison em Radioinmunoassay and Related Procedures in Medicine, Volume 1, 131 - 147 (1974); Pa tente de Invenção Europeia EP-A 0174 026)« A partir da utilização de anticorpos !

’ monoclonais, que como regra geral derivam do rato, nos ensaios de imunidade, a mencionada prevenção de perturbações necessita a utilização de grandes quantidades de IgG do rato não específica sob a forma de soro de rato, ascites de rato ou de imunoglobulina isolada de rato (cerca de 3θθ - 50θ yug/ml; Clin. Cheni j 32, 1491 - 1495 (1986))_& Por exempl o, de acordo com a Patentq de Invenção Europeia EP-A 0 174 026, por adição de cerca de 3θ ^ug/ml de IgG de rato ou de ratazana não específica relevante nos ensaios de imunidade do tipo descrito sé com determinados soros e em casos especiais (amostras negativas) consegue realizar uma compensação completa das perturbações. A preparação de IgG de rato â escala de produção industrial necessária não e, no entanto possível em condições economicamente interessantes com os métodos actualmente a disposição e também do ponto de vistaíti ético .

Uma medida essencial para evitar perturbações nos ensaios de imunidade do tipo mencionado consiste na utilização de fragmentos Fab ou Ffab’)^ para pelo menos um dos anticorpos especificos usados no ensaio de imunidade. Desta I forma, s3o eliminados todos os factores de perturbação existen tes na amostra que são dirigidos à parte Fc de IgG (factores reumáticos, imunoglobulinas anti-Fc, como por exemplo IgM) do seu ponto de ataque num dos reagentes da imunidade específicos e, por esse motivo, não precisam de ser compensados.

No entanto, em muitos soros humanos, em ensaios de imunidade aparecem ainda perturbaçSes não obstante os reagentes de anticorpos específicos isentos de Fc utilizados. Estas são atribuídas a substâncias no soro que são endereçadas a Fab e FÍab*)^ De acordo com a Patente de Invenção Europeia EP-B 0 O83 869 esses domínios de Fab dos factores perturbantes só reconhecem se foram separados da parte Fc,

Nos correspondentes ensaios de imunidade, estes só podem ser eliminados por adição de fragmentos Fab ou F(ab’) específicos para o antigene a determinar naturais ou reticulados (Patente de Invenção Europeia EP—B 0 O83 869)» Neste caso, os fragmentos Fab e FÍab')^ agregados em comparação com os componentes nativos possuem uma actividade de desaparecimento das perturbaçães 2-3 vezes maior. IgG completamente não específicas, pelo contrário, actuam de acordo com a Patente de Invenção Europeia EP—B 0 O83 869 pelo contrario tanto sob a forma natural como também sob a forma agregada de maneira a não provocarem nenhoma perturbação ne· mencionados ensaios de imunidade.

processo tem, alóm disso, o inconveniente essencial de serem necessárias quantidades consideráveis de reagentes de imunoglo bulinas não específicos de elevado valor - alóm dos reagentes de imunoglubulina específicos para o anigene a determinar, o que origina problemas económicos assim como óticos consideráveis, De acordo com esse facto, para o desaparecimento de perturbações, por exemplo, demonstraram dar bons resultados pelo menos, 100 ^ug/ml dos gragmentos de imunoglobulina isentos de Fc não específicos agregados com boae actividade.

- u -

A presente invenção tem por consequência como objectivo proporcionar novas possibilidades para a compensação de reacções não específicas em ensaios de imunidade com reagentes de anticorpos específicos isentos de Fc e que contem Fc como reagentes específicos, por meio do qual é possível eliminar de maneira segura os factores de perturbação em soros humanos sobre IgG completas e sobre fragmentos Fab ou F(ab’)^ e permitem uma utilização económica dos sistemas de ensaio aper feicoados tendo em atenção pontos de vista éticos.

Este objectivo é atingido, de acordo com a presente invenção, por meio de um processo para a determinação de uma substância com capacidade de ligação imunológica num líquido biológico de um primeiro tipo de animal ou de sere^ humanos em presença de pelo menos dois reagentes específicos para a substância com capacidade de ligação imunoldgica de um segundo animal e em presença de um inibidor para a compensação de factores perturbantes, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional ser posta em contacto com 0,1 - 5θ yum/ml para a substância com capacidade de ligação imunológica não específica de agregados de um segundo e/ou um terceiro tipo de animais derivados de anticorpos monoclonais ou policlonais para a compensação de factores perturbantes»

Como substâncias susceptíveis de ligação imunológica interessam de maneira especial antigenes polivalen tes como póptidos, proteínas, polissacóridos,vírus, bactérias e outras células específicas ou componentes destas» Como reagentes específicos para a respectiva substância susceptível ! de ligação imunológica que se pretende determinar é possível empregar-se anticorpos tanto policlonais como também monoclonais; neste caso, preferivelmente empregam-se IgG e os seus componentes imuno-reactivos tais como fragmentos Fab e FÇab*^ ji combinados. É especialmente preferida a utilização de dois ou ji :l eventualmente mais reagentes específicos dos quais pelo menos um é um fragmento Fab ou FÍab’^ e os restantes reagentes cor- 5 -

Como agregados de anticorpos nao específicos para a substância capaz de ligação imunológica para a compensação de perturbaçSes empregam-se preferivelmente agre- , gados de IgG não específicos para a substância capaz de liga— ' ção imunológica, sendo especialmente preferido um agregado de ! IgG que consiste em IgG não específica e uma outra macromolá- i cuia. Neste caso, preferêm-se IgG não específicas que derivam da mesma espécie de animal como pelo menos um dos reagentes específicos. Como macromolecuias são apropriadas por exemplo fragmentos de Fab ou de FÍab*)^ isto e, fragmentos de IgG isentos de Fc que podem derivar de MAK ou de PAK provenientes do rato ou de uma outra espécie, assim como proteínas (por exemplo, albumina), polissacaridos (por exemplo, dextrano) e outros poímeros solúveis em agua. Alám disso, podem-se usar heteropolímeros que, por exemplo, se formam a partir de IgG de rato por meio de IgG de vitelo em ponto, para a compensação de perturbações. De maneira especialmente preferida usam-se agregados que consistem em uma molécula de IgG e um fragmento de IgG isento de Fc, em que tanto as IgG como também os fragmentos de IgG isentos de Fc derivam da mesma espécie de animal como um reagente específico. Na realidade, esses polímeros de IgG/ Fab ou F(ab’)2 possuem uma actividade de eliminação das perturbações três vezes melhor do que os agregados de IgG puras. Dependendo da amostra de soro individual, são suficiantes 0,1 - 50 yug/ml de um polímero misto de IgG para se conseguir com êxito evitar as perturbações? prefere-se no entanto trabalhar com concentração de 5 3 25 >ug/ml e, de maneira muito especialmente preferida, de 5 até ao máximo de 10/rg/ml, porque na maior parte dos casos e já completamente activa uma muito menor adição de agregados de IgG não específicos.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, para a compensação de factores perturbantes em soros humanos, usam-se agregados de IgG ou

agregados de IgG/Fab ou F(ab')„ homopoliméricos ou heteropoli-| ~ ί méricos não específicos com pesos moleculares de 320 000 Daltoíis e mais. Nesse caso, os agregados de IgG contêm IgG da espécie! a partir da qual pelo menos um dos reagentes específicos deriva! e pertencem de preferência à mesma subclasse que pelo menos umί dos reagentes específicos. De preferência, utilizam-se composições poliméricas de IgG com pesos moleculares de 320 000 ate! 10 milhões Dalton em que a acção de compensação contra factores perturbantes do soro aumenta com o aumento do peso molecular,,

As formas de realização da presente invenção especialmente preferidas são os ensaios de imunidade em dois sítios com dois ou mais reagentes MAK de rato ou de ratazana específicos, dos quais pelo menos um reagente é um fragmento Fab ou FÍab*)^ θ pelo menos um dos outros reagentes é uma IgG que contém Fc, aos quais se adicionam agregados de IgG ou agregados de IgG/Fab ou FÍab·)^ não específicos homopoliméricos ou heteropoliméricos com pesos moleculares maiores do que 320 000 Dalton para a compensação de factores perturbantes, em que as IgG e os fragmentos Fab ou F(ab*)2 contidos nos agregados não específicos são monoclonais e da subclasse como pelo menos um dos reagentes específicos. Neste caso, é indiferente que a IgG ou o fragmento de Fab seja preparado intermédio de por ascites, fermentação ou de engenharia genética por expressão em microrganismos .

As moléculas de IgG não específicas polimerizadas ou os agregados de IgG/Fab ou F^b’)^ não específicos apropriados para a compensação de perturbações de acordo com o processo da presente invenção devem derivar de uma outra espécie diferente da amostra a analisar. Em geral, utilizam-se pre cessos de determinação imunolégicos para a análise de soros hujj manos com o auxílio de anticorpos monoclonais específicos que ! derivam do rato ou os seus fragmentos imunorreactivos« No ení .

tanto, os reagentes de anticorpos específicos podem derivar de um outro animal, Os agregados não específicos adicionados eliminação das perturbações podem derivar corresponden- 7 para a

temente do rato ou em combinação com IgG de rato ou com os seus fragmentos derivar de uma outra espécie animal diferente da pr meira. Por exemplo, é possível empregar-se heteropolímeros (s. μ o.) de IgG de rato/lgG de vitelo para a eliminação de perturbaIí ções no ensaio de imunidade que utilizam como reagente de anti-j ^: corpo específico MAK de rato ou IgG de rato.

-rl|

Mediante a adição dos agregados de IgG íou dos agregados de IgG/Fab ou F(ab*)₂ não específicos de acordo com a presente invenção, consegue-se, em comparação com IgG naturais um aumento de 20 a 1000 vezes e, em comparação com 'fragmentos de IgG isentos de Fc naturais ou agregados, um aumer to de 20 a 1500 vezes da actividade triplicada para a compensação de reacções não específicas nos ensaios da imunidade com

I pelo menos dois reagentes específicos para o imunogénio a deι terminar, um dos quais pelo menos deriva de um fragmento Fab ou de um fragmento F(ab*) . Este facto é surpreendente porque não i 2 era de prever que reagentes não específicos contendo IgG no enj: saio de imunidade nos quais participam reagentes da imunoglobuplina específicos isentos de Fc de anticorpos monoclonais ou poj liclonais realizem principalmente uma compensação de perturbaições dirigidas a fragmentos Fab ou F(ab’)₂« A Patente de Invenção Europeia EP—B 0 O83 869 como estado da técnica mais próximo conduz o técnico no assunto mais a uma suposição contrária.

, De facto, na memória descritiva desta patente, acentua-se ex'pressamente que tanto as IgG naturais como também as IgG agregadas não demonstram quaisquer efeitos de eliminação das per!| turbações no ensaio de aglutinação itnunolégico aí mencionado e que os agentes adicionados para a eliminação das perturbações como também para a aglutinação específica devem ser isentos de IgG o

A IgG não específica pode ser reticulada

Hconsigo prépria ou com fragmentos de anticorpos assim como com íl jjproteína s, polissa céridos ou outras moléculas solúveis em agua por acção do calor, quimicamente ou não covalentemente por acçã

de permuta bioafira de acordo com métodos conhecidos da litera-j tura» Em todos os casos se obtêm, em soluçoes de tampões aquosas, agregados solúveis» A reticulação química pode, por exempio, realizar-se por ramificações de ligação química homobifunL cionais e heterobifuncionais (ligantes) por meio de proteínas j ou dextrano activado ou por auto-reticulação da molécula de IgG e/ou outros fragmentos isentos de Fc com carbodiimida» Além disso, é possível reticular os monómeros de anticorpos mediante redução dos dissulfuretos e reoxidação ou mediante oxidação da sua parte de hidretos de carbono consigo próprios ou uma ma cr omolécula apropriada» Como ligantes químicos, interessam por exemplo éster de metilo de bis-(maleinimida), suberimidato de dimetilo, suberato de dissiccinimidilo, dialdeído glutarico N-succinimidi1-3-(2-piridilditio)-propionato, N-5-azido-2-n itrobenz oil-succinimida, N-succinimidil-(4-iodoa cetil)-aminoben zoato ou a combinação de succinimidato de maleinilido-hexanoílo e anidrido do ácido S—acetil—mercapto—succínico ou de compostos análogos. A preparação de dextrano activado, por exemplo realizar-se a partir de aminodextrano de um peso molecular definido com succinimidato de maleinimido-hexanoílo que, em seguida, se reticula com moléculas de IgG não específicas deriva t izada s coiii mercapto-acetilo. Como ligações com actividade de troca biofim significam-se em geral as ligações que existem por exemplo nos pares biotina/avidina (ou estreptavidina), hapteno/anticorpos anti-hapteno, antigene/anticorpos antigene, ligando/proteína de ligação (por exemplo, tiroxina/proteína de ligação da tiroxina), hormona/receptor» Uma forma de realização apropriada é obtida por pelo menos biotinilação dupla da IgG não específica e adição de estreptavidina ou por derivatização da IgG com pelo menos duas moléculas de digoxigenina e reticulação com um anticorpo anti-digoxina monoclonal ou policlonal. São igualmente apropriados agregados que se obtêm por reacção de polialbu— mina humana com um anticorpo anti-albumina humana monoclonalo

As misturas brutas de agregado respectivamente obtidas podem ser utilizadas directamente depois de dialise ou, por exemplo, leculares crescentes por usadas directamente para em ensaios de imunidade.

filtração em gel e, em seguida, ser a compensação de factores perturbantes

Um dos reagentes específicos adicionados ã mistura a ensaiar, de preferência, o IgG-anticorpo que contém Fc. á preferivelmente ligado de maneira conhecida pelos peritos no assunto em fase sólida a um material de suporte como por exemplo agarose ou tubo de ensaio de plástico e semelhantes ou existe - por exemplo, ligado com biotina - em fase líquida. Se se utiliza um primeiro anticorpo biotinilizado, forma-se em primeiro lugar o complexo do antigene e de um segundo reagente específico marcada que, em seguida, é ligado in situ a um materiel de suporte recorberto com uma proteína que liga biotina, como por exemplo avidina ou estreptavidina„ ! Além disso, são no entanto também possíveis li outras realizações de ensaios com o primeiro anticorpo biotiniii lizado. O antigene reage com o MAK biotinilizado e é ligado a

I uma fase sólida que liga a biotina in situ ou depois de decor rido um determinado período de semi incubação e só depois é imposto em contacto conjuntamente com o segundo reagente específico. Ou então é possível que se faça reagir em primeiro luigar o antigene com o segundo reagente específico e em seguida í com o anticorpo biotinilizado. A marcação de segundo e eventu— lalmente dos outros reagentes específicos, nos quais se trata : i de preferência de fragmentos de IgG isentos de Fc, realiza-se por acoplamento com uma enzima, uma substância fluorescente, lquimooluminoscente ou radioactiva. Os processos para a marcai ção de derivados de anticorpos deste tipo são conhecidos pelos ^: peritos no assunto, por exemplo, a partir de E. Ischikawa et al J. of Immunoassay, (1983) 209 — 327 e não necessitam de posterior esclarecimento na presente memória descritiva.

H

II í São igualmente um outro objecto da presente invenção os meios de diagnóstico para a determinação de subs

tancias polivalentes com capacidade de ligação imunolágica em ensaio de imunidade em dois sítios que contêm os agregados de ; anticorpos não específicos descritos.

íl

A composição de diagnóstico contem, além j, de dois ou eventualmente de mais anticorpos específicos, dos ! quais um 4 uma molécula de IgG e, pelo menos, um fragmento de

IgG isento de Fc, um sistema de tampão apropriado e o agregado anticorpo—agregado não específico descrito assim como eventual* mente outras substâncias auxiliares eventualmente correntemente usadas como, por exemplo, aceleradores da reacção, detergentes ou agentes estabilizadores. Como sistemas de tampSes apropriados é possível por exemplo usar tampões de fosfato 20 - 60

ImM (pH 7,θ) ou um sistema de tampão HEPE3 5θ mM/NaCl mM. Como ιacelaradores da reacção interessam por exemplo sulfato de dex— trano ou polietilenoglicol 6 000 até 40 000, por exemplo, Triton X - 100, Tween 20 ou Pluronic F 68 e, como agentes estabijlizadores apropriados, fenol, oxioirion, cloracetamida, mertioíj lato, etc o j A composição de diagnóstico contém os l^! agregados de anticorpos não específicos com pesos moleculares jde 320 000 Dalton e mais, de preferencia, 10 milhões de Dalton, !l numa concentração de 0,1 a 5θ /Ug/ml, de preferência, numa conj centração de 5 a 25 /Ug/ml e, de maneira muito especialmente pre ferida, numa concentração de 5 ^a té 10 /íg/r.il.

A composição de diagnóstico pode encontrar-se sob a forma de uma solução ou de um reagente para a qul mica em fase seca aplicado sobre um suporte absorvente ou numa película aberta.

meio de diagnóstico de acordo com a pre sente invenção sob a forma de uma solução, eventualmente tamponada até ao valor de pH pretendido, contém de preferência todos os reagentes necessários para o ensaio. Por razões de conserva11

ção durante a armazenagem, pode ser vantojoso distribuir os reagentes necessários para o ensaio por duas ou mais soluções que só se misturam ao realizar o ensaio. Neste caso não ó importante separar os agregados de anticorpos não específicos num : sistema de tampão apropriado ou/e guardá-los com um ou/e com jj ί i| dois ou vários anticorpos específicos,

i. Para a preparação do meio de diagnóstico com a forma de uma tira de papel de ensaio, impregna-se um su-!

,porte absorvente, de preferência, papel de filtro, celulose ou velo de fibras sintéticas com soluções dos reagentes necessáric correntemente utilizados para a preparação de tiras de ensaio etn dissolventes facilmente voláteis, como por exemplo água, metanol, etanol ou acetona. Isso pode realizar—se numa operação de impregnação. Muitas vezes, ó no entanto conveniente realizar a impregnação em várias operações, empregando-se então soluções que contêm respectivamente uma parte dos componentes do meio de diagnóstico»

Para a preparação do meio de diagnóstico com a forma de uma tira de ensaio pode ainda servir uma película aberta em que, alóm do formador de película e pigmentos, estão contidos os anticorpos ou os agregados de fragmentos específ icos, os anticorpos (fragmentos) nao específicos descritos,

I um sistema de tampão apropriado e os outros aditivos usuaimente utilizados para o meio de diagnóstico.

Os papeis de ensaio e as películas de ensaio prontos podem ser usados tal e qual ou ser colados em fo!

jlhas de suporte de acordo com a maneira conhecida ou encerrados do preferência entre materiais plásticos e redes de malha fina jde acordo com a Patente de Invenção DE-PS 2 118 455 θ postos em contacto com o líquido corporal a ensaiar (por exemplo, sangue, plasma, soro)»

A invenção ó apropriada para a determina12

ção de todos os antigenes com pelo menos dois determinantes de antigenes. Por exemplo, são apropriadas a tireotropina (TóH), i antigene carcino-embrionário (CEA), vírus de hepatite (antigene superficial da hepatite B, HBs), 1-fetoproteína (AFP), coric nogonadotropina humana (HCG), hormona luteinizante (LH), hormona foliculo-estimulante (FSH) , ^-microglobulina , prostatafosfatase acida, prolacfcina, ferritina e insulina.

Os seguintes exemplos esclarecem mais a presente invenção.

Exemplo 1

Preparação de agregado de IgG de rato monoclonal por roticulação com um reagente homobifuncional !

I

Isola-se MAK33—lgG monoclonal (grau de pureza 95 composição da subclasse K, 1; especificidade anti-crea· tinaquinase) a partir de líquido de ascites por precipitação com sulfato de aménio e cromatografia num permutador de iães de DEAE (veja-se A. Johnstone e R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications 1982, páginas 44 - 45).

! Dissolvem-se 5θ mg de IgG era 3 mililitros de tampão de bicarbonato/carbonato 0,025 molar de pH 9»5· Para es(ta solução pipetam-se 17 microlitos de solução de dialdeído glutárico a 12,5 β incuba-se a 25°C durante duas horas. Em

I seguida, arrefece-se a solução num banho de gelo e regula-se a pH 8,2 com tampão de trietanolamina 5θ “Μ. A esta solução adiciona-se 0,6 mililitro de solução de boro-hidreto de sédio re· ₍centemente preparada (8 mg de boro-hidreto de sédio/l ml de água bidestilada) e incuba-se a 0°C durante mais 2,5 horas. Por idiálise durante 16 horas a 0 — 4°C com tampão de fosfato 10 mM jde pH 7,5 contendo NaCl 0,2 M, eliminam-se os reagentes em excesso. Concentra-se o produto da dialise por ultrafiltração até

um volume de 1,25 mililitros. Uma parte deste concentrado (mis-ijí tura bruta) ó directamente empregada para a eliminação das períl turbações; croma tograf a - se 1,0 mililitro com uma coluna de fil-t tração em gel com enchimento de AsA22. A dimensão da coluna β x 40 cm; tampão de funcionamento fosfato 10 mM/NaCl 100 mM d jj ρΗ 7,5· θ eluido da coluna e ensaiado com um monitor de ultra— violetas a 280 nm relativamente ao seu teor de proteína e f ra c-I i !

cionado. As fracções da gama de eluição contendo toda a proteína são reunidas em 4 partes com o mesmo volume» Por aferição ;

i da coluna de cromatografia em gel com proteínas de peso molecular conhecido, é possível ordenar os volumes parcelares segundo as gamas de pesos moleculares l60 000 - 400 000, 400 000— 1 000 000, 1—2 milhões e 2 - 10 milhões. Depois de se concentrar os volumes parciais de maneira a obter-se uma concentração de prote ínas igual a cerca de 2 mg/ml, as soluções de agregados de IgG das diversas gamas de pesos moleculares podem ser empregadas para a eliminação das perturbações.

' Exemplo 2

Preparação de agregado de IgG de rato monoclonal por reticulaIção com um reagente heteroblfuncional

a) Preparação de MAK33-IgG-MH (maleinimido-hexanoil-MAK33-IgG)

Dissolvem-se 100 mg de MAK33~IgG em 4 mililitros de tampão de fosfato de pH 7»1· Para esta solução pipetam-se jj 20 microlitros (4 micromoles) de uma solução 0,2 M de succinijímidato de ma leinimido-hexanoílo em sulfóxido de dimetilo. Incuba-se a mistura reaccional a 25°C durante 1 hora e, em seguida, dialisa-se durante 16 horas com tampão de fosfato 10 mM a pH

6,1 contendo NaCl 5θ mM, a O — 4°C» Obtem-se 4,45 ^ml de solução com 22 mg de MAK33-IgG~MH/mililitro, jjb) Preparação de MAK33~YgG~SAM3 ( 3-a cetil-mercapto-succinil-MAK33-IgG)

I jj Dissolvem-se 100 mg de MAK33-IgG em 4,0 mili>' litros de tampão de fosfato 0,1 M de pH igual a 8,0. Para esta ; solução pipetam-se 40 microlitos de uma solução 0,25 M de ani, drido do ácido S-acetil-mercapto-succínico em sulfóxido de dimetilo. Incuba-se a mistura reaccional a 25°C durante 1 hora e, em seguida, dialisa-se durante 16 horas contra tampão de fosJfato 10 mM de pH 6,1 contendo NaCl 50 mM, a 0 - 4°C. Obtêm-se 4,45 mililitros com 21,8 mg de MAK33-IgG-SAMA3/ml.

i jc) Reticulação de MAK33—fgG—MH com MAK33~IgG-MS (mercaptossuc— i j cinil-MAK33-IgG) ι

Diluem-se 5θ mg de MAK33~ãgG-SAMAS até se obter juma concentração de 15 mg/ml com tampão de fosfato 25 mM de pH p6,5, contendo tetracetato de etilenodiamina 2 mM (tampão A). Pa. ra esta solução pipetam-se 75 microlitros de uma solução 1 M de hidroxilamina e incuba-se a 25°θ durante 20 minutos.

Diluem-se 3 mililitros desta solução contendo mg de MAK33-IgG-M5 com tampão A até perfazer 6,0 mililitros.

A esta solução adicionam-se 4 mililitros de solução com 88 mg jde MAK33-IgG-MH. Incuba-se a mistura a 25°C durante 40 minutos N , e depois mistura-se com cisteína ate a solução ficar 2 mM para interromper a reacção de reticulação. Depois de nova incubação

I O , .ja 25 C durante 30 minutos, adiciona-se N-metil-maleinimida ate Jjficar 5 mM e mantem-se a 25°C durante. 1 hora. Dialisa-se a sojlução reaccional contra tampão de fosfato 10 mM de pH 7,5 contendo NaCl 0,2 M. 0 líquido resultante da diálise é concentrado por ultrafiltração até se obter uma concentração de proteína igual a 35 mg/ml e isenta-se de uma ligeira turvação por cen iitrif ugação. A Figura 1 mostra uma distribuição de pesos molejjculares de um tal líquido dialisado (mistura bruta) de um agreI gado MAK33-IgG. A mistura de agregado pode ser empregada directamente ou depois da separação em fracções de pesos moleculares (cromatografia em AcA22 como no Exemplo l) para a eliminação de pert urba ç ões.

Exemplo 3

Preparação de agregado de MAK33-IgG por reticulação por meio de aminodextrano ll . ---a) Preparação de S-acetil-tioacetil-aminodextrano ' l· j! Dissolvem-se 100 mg de aminodextrano (Dextran

40, Pharmacia; 28 grupos de aminoácidos/peso molecular 40 000) j! em 4 mililitros de tampão de fosfato 3θ mM de pH igual a 7,1« |iSobre esta solução pipetam-se 0,25 mililitros de uma solução |0,2 M de 3-acetil-tioacetil-succinimidato em sulfóxido de dijmetilo. Incuba-se a mistura reaccional a 25°C durante 1 hora e, ;em seguida, dialisa-se contra tampão de fosfato 10 mM de pH 'igual a 6,1 contendo NaCl 5θ mM. 0 rendimento obtido e igual a j9θ miligramas de S-acetil-tiacetilamino-dextrano em 4,5 mililitros de solução.

b) Reticulação de MAK33—IgG—MH com tioacetilamino-dextrano í

j

Regulam-se a pH 6,5 2 mililitros contendo 20 |mg/ml de S-acetil-tioacetilamino-dextrano adicionando cuidado(samente NaOH 0,1 molar e adicina-se tetracetato de etilenodiamina atá se obter a concentração de 2 mM. Sobre esta solução pipetam-se 40 microlitros de uma solução 1 M de hidroxilamina e jíincuba-se a 25°C durante 20 minutos. Em seguida, dilui-se a sojlução com tampão de fosfato 25 mM de pH igual a 6,5 θ mistura-se com 7,2 mililitros de uma solução com 158,4 mg de MAK33-lgG -MH (preparação como se descreveu no Exemplo 2a). Depois de 3θ pminutos de incubação, adiciona-se â mistura reaccional cisteina j.atá perfazer a concentração igual a 2 mM e depois de decorridos '30 minutos, adiciona-se N-metil-maleinimida ate à concentração |de 5 mM. Depois de mais uma hora de incubação a 25°C, dialisa-se o polímero com tampão de fosfato 10 mM de pH igual a 7»5/ /NaCl 5θ mM. Depois de se separar por centrifugação uma ligeira turvação obtêm-se 19,5 mililitros de uma solução de agregado de

|MAK33-IgG-dextrano com um teor de proteína igual a 7,1 mg/ml» i

Exemplo 4 :Preparação de agregado de MAK33~IgG por reticulação por intermédio de IgG de vitelo J ! I

I I

a) Preparação de IgG de vitelo-MH

II

I Procedendo de maneira análoga à que se descre- j veu no Exemplo 2a), fazem-se reagir 100 mg de IgG de vitelo policlonal com 4 micromoles de maleinimido-hexanoil-succinimidato. Obteve-se o rendimento de 4,45 mililitros de solução contendo 22 mg de IgG de vitelo-MH/ml.

í í

b) Preparação de MAK33-SATA (S-acetil-tioacetil-MAK33-IgG)

Dissolvem»se 100 mg de MAK33-IgG em 4 mililitro de tampão de fosfato 30 mM de pH 7,1· Sobre esta solução pipejtam-se 20 /ilitros (2 micromoles) de uma solução 0,1 M de S-acejtiltioacetilssuccinimida em sulfóxido de dimetilo. Incuba-se a

I ilmistura reaccional a 25 C durante 1 hora e, em seguida, dialil· sa-se com tampão de fosfato 10 mM de pH 6,l/NaCl 50 milimolar, Obtem-se 4,45 mililitros de solução com 22 mg de MAK33-IgG-SATA y/mi o í

c) Reticulação de tioacetil-MAK33“IgG com IgG de vitelo-MH í Diluem-se 5θ mg de MAK33^-IgG-SATA com tampão de fosfato 25 mM de pH 6,5 contendo tetracetato de etilenodiamina 2 mM (Tampão a) ate se obter uma concentração de 15 mg/ml» A es 'ta solução pipetam-se 75 microlitros de uma solução 1 M de hi|jdr oxilamina e incuba-se a 25°C durante 20 minutos» i Misturam-se 3 mililitros desta solução contendo |44 mg de tioacetil-MAK33-IgG com 4 ml de solução contendo 88

I

]!miligrama s de IgG de vitelo-MH e incuba-se a 25 C durante 25 minutos. Para interromper a reticulação, adiciona-se em seguijda cisteina até se obter uma concentração 2 mM e, depois de 30

I O y jminutos de incubaçao a 25 C, iodoacetamida ate se obter a concentração de 5 mM. Depois de mais uma hora de incubação a 25°C, idialisa-se durante 16 horas com tampão de fosfato 10 mM de pH Í7»5/NaCl 50 mM a 0 - 4°C. Depois de se centrifugar o líquido jdialisado, obtêm-se 8,9 mililitros de solução de agregado de |ÍMAK33-IgG com IgG de vitelo com uma concentração de proteína igual a 13 mg/ml.

Exemplo 5

Preparação de agregado de MAK33-IgG reticulado por intermédio jde MAK33-Fab

200 mg de MAK33—IgG são tratados com papai— na para se obter Fab/Fc e isola-se MAK33-Fab a partir da mistu·· | ra por cromatografia em celulose DE52 (Whatman) (método veja-se ij A. Johnstone R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell

Scientific Publications, 1982, páginas 52 - 53)· 0 rendimento é igual a 95 mg de MAK33—Fab sob a forma de liofilizado isento ί de sa1„ ; Dissolvem-se 5θ mg de MAK33-Fab em 2 milllij tros de tampão de fosfato 3θ mM de pH 7»1° A esta solução pipetam-se 30 /il (3 /imoles) de uma solução 0,1 M de 8-acetil-tioa cetil-succinimidato em sulfóxido de dimetilo. Incuba-se a mistura reaccional a 25°C durante 1 hora e depois dialisa-se a 0 - ί- 4°C durante 16 horas contra tampão de fosfato 10 mM de pH ij 6,1/NaCl 5θ mM/tetra cetato de etilenodiamina 2 mM.

l·

I , i A. ~

I Obtêm-se 2,6 ml de solução com 18,5 mg de ίMAK33-Fab-SATA/ml.

b) Reticulação de MAK33-IgG-MH com tioacetil-MAK33-Fab

Diluem—se 30 mg de MAK-Fab-3ATA com tampão ί de fosfato 25 mM de pH 6,5 até uma concentração de 15 mg/ml» ' ; ~ í !| A esta solução pepitara-se 50 /ul de uma solução 1 M de hidroxi-;

lamina e incuba-se a 25°C durante 20 minutos»

Misturam—se 1,5 mililitros desta solução contendo 22 mg de t ioa cetil-MAK33-Fab com 55 mg de MAK33-IgG- ! -MH (preparado como se descreveu em 2a) e dilui-se com água bidestilada até um volume total de 10 mililitros» Incuba-se a ¹ p mistura reaccional a 25°C durante 35 minutos e, depois, para ρ interromper a reticulação adiciona-se cisteína até â concentração de 2 mM. Depois de 30 minutos a 25°C, adiciona-se N-metilI -maleiniinida até perfazer a concentração de 5 mM e incuba-se í de novo a 25°C durante 1 hora. Em seguida, dialisa-se a mistura reaccional a 0 - 4°C durante 16 horas com tampão de fosfato _mM de pH 7,5/NaCl 0,1 M. Depois de centrifugação obtem-se ; 12,88mililitros de solução límpida com 5,3 mg de agregado de í

' MAK33-IgG-Pab/ml.

I

Exemplo 6 i

ι , Preparação de agregado MAK33-IgO por reticulação por meio de b iot ina/e streptavidina

a) Preparação de MAK33-IgO biotinizda

Misturaram-se 5θ miligramas de MAK33-IgO em

2.5 mililitros de tampão de fosfato de potássio 0,1 M de pH

8.5 com 1,13 mg de ácido biotinil- £-aminocaproico-N-hidroxi-succinimida (Boehringer Mannheim GmbH) em 5θ /ulitros de sulfáxido de dimetiio (proporção molar de IgG : biotina =1 : 7»θ) e, depois de se misturar, incubou-se a 25°C durante 90 minutosl , o |

Dialisou-se a IgG biotinizada durante a noite a 4 C contra tamf pão de fosfato de potássio 2 mM de pH 7,0.

Rendimento: 45 ®6 de MAK33-lgO-biotina em

6,4 ml ί b) Reticulação com estreptavidina ;; Misturaram-se 4 mililitros de solução de || MAK33-IgG-biotina em intervalos de 5 minutos com três porções cada uma com 1,5 mg de estreptavidina (Boehringer Mannheim Gmbh) em tampão de fosfato de potássio 50 mM/cloreto de sódio 0,1 Μ ί e incuba-se a 25°C durante 20 minutos. Proporção molar IgG : estreptovidina = 2,5 “· 1· Concentrou-se a mistura reaccional ató perfazer 2 ml por ultrafiltração e cromatografou-se numa coluna contendo AcA22 como se descreveu no Exemplo l_o Reuniram-se todas as fracções com pesos moleculares >> 320 000.

Rendimento: 21 mg de agregado de MAK33-IgG-estreptavidina em 12 ml de solução com 17 mg de teor de IgG.

' Exemplo 7 i Reticulação de ΜΑΚ-anti—humana/albumina com albumina humana !l ! Agregaram-se 40 mg de albumina humana (Behringwerke, Marburgo) eni 1 ml de tampão de fosfato de potássio ί 50 mM de pH 7>0 por aquecimento a 70°C durante 3 horas. Depois ¹ de se arrefecer a 25°C diluí—se uma parte com 25 mg de agrega'! do de albumina humana com tampão de fosfato de potássio 50 mM/ j‘ /NaCl 0,1 M, 0,1, pH 7,0 ató perfazer 2,5 mg/ml e misturou-se j! em intervalos de 5 minutos com 4 porções de 2,5 mg de MAK MIί -anti-humano-albumina (gama 1, capa) cada uma em 0,2 ml de tam| pão de fosfato de potássio 5θ mM, pH 7,0. Depois de 20 minutos de incubação a 25°C, concentrou-se por ui trafiitração ató perfazer o volume de 2 ml e cromatografou-se numa coluna de gel de AcA como se descreveu anteriormente. Reuniram-se as fracçõe^ contendo proteína com o peso molecular >-320 000.

Rendimento: 12,4 mg de agregado de MAK MI20

IgG-albumina em 7,8 ml contendo 8,86 mg de IgG

I Exemplo 8 í Comparação da eliminação de perturbações por MAK33-IgG natural ie diferentes agregados de MAK33-IgG num ensaio de imunidade de !enzima CEA com dois reagentes MAK específicos

Utilizaram-se os reagentes de uma embalagem de ensaio Enzymun(Jy CEA (Boehringer Mannheim GmbH). Os tubos ide ensaio contidos na referida embalagem são revestidos com IgG de rato específica de CEA monoclonal (IgG 1, K). 0 reagen!te marcado com enzima e um conjugado de Fab-peroxidase de rato

I 'específico de CEA monoclonal; composição da subclasse do Fab é

1.

/ Os diferentes preparados de MAH33-IgG foram ^! adicionados em concentração crescente respectivamente ao tampão de incubação e realizou-se o ensaio com um soro humano (P43), no qual apareceram factores perturbantes efectivos para origi; nar precipitação. A Tabela 1 indica a concentração do preparado ! de MAK33-IgG (em/ug de proteína/ml) em tampão de incubação que se verificou diminuir a perturbação de maneira tal que o teor il ido analito se encontrava dentro do intervalo normal (l - 3,5 ng/ml).

- 21 Tabela 1 ll Função de eliminação das perturbações relativa de diversos pre hparadoa MAK33-IgG

jAdição ao tampão de ;incubação 1 1 i i	ug/ml	Factor de eliminação da perturbação	Extinção	Teor de CEA de- te ctável¹ em soro P43
1 1 í Sem	0	-	1,636	58*
Monómero de MAK33—IgG í	9600	0,0026	0,132	3,4
1 'Agregado de MAH33-IgG/ /GDA (mistura bruta l)	34	0,74	0,126	3,1
Agregado de MAK33-IgG (mistura bruta 2c)	25	1	0,125	3,1
MAK33-IgG-Dextrano (3)	43	0,58	0,129	3,3
Agregado de MAK33-IgG de vitelo (4)	82	0,3	0,130	3,3
Agregado de MAK33-IgG-Fab (5)	3	8,33	0,122	2,9

i * Valor fora da gama definida dos pontos de calibração da curva de calibração *

Íí (Exemplo 9

Actividade de agregados de ΜΑΚ-IgG que foram ligados por meio

Ijde ligações fioafins não covalentes num ensaio de imunidade da (enzima CEA

Para os reagentes empregados e relização do ensaio, veja-se o Exemplo 8.

- 22 1!

teor real de CEA das amostras de soro hu—j mano utilizadas, determinado com um método de referência, estaf va compreendido entre 2,8 e 4,2 ng/ml.

A Tabela 2 indica as concentrações de CEA ! detectaveis lidas numa curva de caiibração para uma amostra de soro humano (Número 108) que contém factores perturbantes com diversas adições de agregado de IgG ao tampão de incubação.

Tabela 2

Actividade de eliminação de perturbações de agregados de IgG com reticuiação bioafim

Adição ao tampão de incubação í	yug de IgG/ml	Soro Humano N* 108 ng de CEA/ml
1 Sem	-	40
! 'Monómero de MAK33“IgG	200	33,4
Agregado de MAK33-IgG-	5OO	31,4
ί-Atreptavidina	1	28,5
ido Exemplo 6 !	10	00 «· CD
j Agregado MAK MI-IgG-
1 —Hum» Albumina	2,5	36,7
do Exemplo 7 ! 1	7,5	25,1

Da tabela conclui-se que ambos os agregados de IgG reticulados por bioafinidade têm uma actividade de eliminação de perturbações em relação a IgG não reticulada com um factor > 500 ou >60. As quantidades empregadas foram escolhidas de tal maneira que apenas se verificou uma eliminação parcial das perturbações} nessas condições pode nomeadamente ava— 23 —

liar-se da melhor maneira a actividade de eliminação de perturbações relativa de diversos preparados.

j Exemplo 10 ij

I Dependencia da função de eliminação de perturbações do peso mo-r lecular agregados de MAK33-IgG

I i

j Os reagentes empregados e a realização deste ; ensaio são como se descreveu no Exemplo 8. Os preparados de l! MAK33-IgG são preparados de acordo com o Exemplo 2, í‘

I Tabela 3 !i Acção de eliminação das perturbações de agregados de MAK33~IgG ^: em dependência do peso molecular

Adição ao tampão de incubação	Soro do Paciente N°18^	Soro do Paciente
Extinção	2 ng de CEA/ml	n° L; Ext inç ã o	r ng de CEA /ml
Sem adição	1,567	>58³	ι, 636	>58³
125 Alg/ml de monómeros de MAK33-IgG	0,148	3,9	1,703	>58
10 /ug/ml MAK33-IgG- —agregado mistura bruta	0,115	2,7	0,179	6,2
30 /ug/ml de agregado de MAK33-IgG mistura bruta		··	0,125	3,1
5 /Ug/ml de agregado de MAK33-IgG Peso molucular 2-10 milhões	0,105	2,1	0,137	3,9

- 24 Η / ΐ! 2 /ug/ml de agregax do de MAK33-IgG i Peso molecular

1-2 milhões /ug/ml de egregado de MAK33-IgG ; Peso molecular 400.000-1 milhão ί 5 /Ug/ml de agregado de MAK33-IgG

Peso molecular 160.000-400.000

0,109	2,4	0,285	11,0
0,155	4,8	1,051	53,7
0,364	16,3	1,239	>58

! 1. O teor real de CEA determinado com um método de referencia esté compreendido dentro do intervalo de 1 - 3,5 ng/ml.

2o 0 teor de CEA detectável é determinado por extinção e utilização da curva de calibração com amostras padrão de CEA de acordo com maneira de proceder descrita para as enzimas CEA.

j3· Fora do domínio da curva de calibração definida pelos pontos í· de calibração.

,Exemplo 11 tí ' Comparação da acção de eliminação de perturbações de agregados

I de ΜΑΚ-IgG, preparados a partir de diversos anticorpos monoclona i s

Empregaram-se tubos de ensaio de uma embala(β) gem Enzymun TSH (Boehringer Mannheim GmbH) que são revestidos com um anti-TSH IgG de rato (IgGl, K). Os outros reagentes foram retirados da embalagem Enzymun CEA como se descreveu no Exemplo 8. A realização do ensaio efectuou-se procedendo de acordo com as indicações de trabalho indicadas nesta embalagem. Nesta realização do ensaio, qualquer amostra de soro não pode

fornecer um sinal provocado por um teor de analito porque os dois reagentes específicos têm especificidades diferentes. Trata-se de um ensaio modelo que com as amostras do soro origina |j apenas o sinal sobre o valor em vazio. Os agregados de MAK-IgG ij j; usados para comparação foram preparados a partir de MAK33 de maneira análoga à que descreveu no Exemplo 2 c.

l· li

Tabela 4

Comparação de agregados de IgG de diversos anticorpos monoclo-

nais na actividade de eliminação de perturbações num ensaio
modelo
Adiçao ao tampão de	Hg/ml	Extinção do Soro P43
incubação
Agregado de MAK33-IgO (2c)	0	0» 900
Mistura bruta	1,25	0,506
	2,5	0,366
	5	0,238
	10	0,195
	20	0,152
Agregado de MAK MS43«1O—	0	0,900
-IgG	1,25	0, 554
Mistura bruta	2,5	0,406
	5	0,286
	10	0,202
	20	0,180

Extinção para uma amostra de soro sem CEA e sem factor de per de perturbação! 0,l62.

Resultado! A actividade de eliminação das perturbações de diversos agregados monoclonais ΜΑΚ-IgG é igual

Exemplo 12

Acção de eliminação de perturbações de agregado de MAK33-IgG e

I de monómero de ΜΑΚ-IgG num ensaio com reagentes de ΜΑΚ-IgG bioí , . . , ; timzados

Neste ensaio empregam-se dois ΜΑΚ-IgG específicos de antigenes superficiais (HBsAg) da hepatite monoclonais sob a forma biotinilada (biotinilação realizada de acordo com Τ, V. Updyke e G. L. Nicolson em Methods in Enzymology, 121 ;(1986), 717 “ 725· Uma delas θ MAK5A10-IgG e e do subtipo ^;IgGl/K e a outra e MAK5A10-IgG e é do subtipo IgG2a, K. Como í

jreagente marcador da enzima utilizou-se o conjugado MAK5A10i-Fab-POD.

Composição do tampão de incubação é a seguir te:

tampão de fosfato 4 O mM de pH 7,θ, tartarato de sódio 0,2 M,

0,5% (peso/volume) de albumina de soro de vitelo, 0,1% (peso/volume) de IgG de vitela, θ,5% (peso/volume) de Pluronic F68,

0,01% (peso/volume) de fenol,

200 ng/ml de MAK6E7-IgG (biotinilada), ng/ml de MAK5A10-IgG (biotinilada),

200 mU/ml de conjugado de MAK5A10-Fab-P0D.

Na tabela 5 estão indicadas as condições de proteínas para eliminação das perturbações.

As misturas brutas de agregado de MAK33-IgG

foram preparadas de acordo com o Exemplo 2c).

Para cada ensaio pipetou-se 0,2 ml de amostra de soro e 1 ml de tampão de incubação para um tubo de ensaio pequeno de poliestireno que estava revestido com estrepta ¹ vidina. Em seguida, incubou-se à temperatura ambiente durante . 4 horas. Em seguida, lavou-se cada tubo de ensaio 3x1,5 ml : de água da rede de distribuição e adicionou-se a cada um 1 mij lilitro de solução de substrato (ABTS/peróxido) da embalagem ίde ensaio Enzymun CEA. Depois de mais uma hora de incubação à

I temperatura ambiente, mediu-se a extinção da solução de substrato resultante da reacção a 405 nm»

Tabela 5

Comparação da acção de eliminação de perturbações de composições de MAK33-IgG com a de reagentes de ΜΑΚ-IgG biotiniladas num ensaio de imunidade de enzimas tipo sanduíche

Adição ao tampão de in cubaç ão /ug/ml

Extinção para a amostra de soro

		N? 100¹	Ns 489¹	NS²
Sem	0	1,390	0,262	0,042
Monómero de MAK-IgG	1	-	-	0,042
	5	1,070	0,102	0,045
	10	0,884	0,068	0,048
	200	0,125	0,042	0,046
	400	0,080	0,048	0,049
Mistura bruta de	0	1,044	0,378	0,047
agregado de MAK33-IgG	1	0,125	0,034	0,043
(2c)	5	0,043	0,045	0,048
	10	0,048	0,035	0,054

ί 1. As amostras de soro N 2 100 e 489 foram recebidas de um ban- I co de sangue e foram declaradas como isentas de HBsAg.

1’ 2. Soro de um doador saudável que não continha nem HBsAg nem í factores perturbantes.

' i ;i A partir do resultado de que, para o soro

Ií N? 100, se atinge a mesma perturbação de 0,25 com 200 yug/ml de j

MAK33-IgG que com 1 /Ug/ml dô agregado de MAK33-IgG, conclui-se| que o agregado de IgG e 200 vezes mais activo na eliminação dai ll perturbações neste ensaio.

|i i

Exemplo 13 . Actividade de eliminação de perturbações de agregado de MAK-IgG i

! num ensaio com suporte de reagente para ensaio quico por via ί

^! seca ii j A determinação realiza-se com um suporte de j reagente para ensaio químico por via seca num ensaio em fase l única de acordo com o principio da sanduíche em fase sálida de i anticorpo duplo em elementos de introdução em rútores com um !i analisador centrífugo descrito no pedido de Patente de Invenção í '

Alemã publicado para inspecfão pública DE-9S 34 25 008.5.

1. Preparação das soluções reagentes

a) Tampão

Prepara-se tampão de fosfato de potássio contendo 5θ milimoles/litro de pH igual a 6,0 por mistura de solução de K^HPO^ contendo 5θ milimoles/litro com solução de

KH PO. contendo 5θ milimoles/litro até se atingir o valor de 2 4 pH igual a 6,0.

b) Tampão II tampão II prepara-se como o tampão I com a diferença de, como valor de pH, se obter o valor 7,5 θ o tam- 29 -

¹ conter adicionalmente 10 gramas/litro de albumina de soro de vitelo e I/Q milimoles/litro de NaCl.

!! (tireotropina )

c) Solução reagente R , capaz de ligar TSH

Como reagente R^ emprega-se um anticorpo anti-TSH de rato monoclonal. 0 líquido de ascites que contêm ; estes anticorpos é misturado com sulfato de amónio até se atin[gir a concentração igual a 1,8 M. Retoma-se o precipitado num ίtampão de fosfato de sódio 15 milimolar de pH 7,0 β contendo |cloreto de sódio 5θ milimolar. A solução assim obtida é submeI tida a uma passagem através de celuloee-DEAE. 0 anticorpo capaz de ligar TSH assim obtido é biotinilado (5 de biotina/lgG) í e diluído com tampão 11 até se atingir uma concentração de proI jteína igual a 1 mg/ml.

d) Solução reagente R^ marcada com enzima

Como reagente emprega-se igualmente um anticorpo anti-TSH de rato monoclonal que, no entanto, reconhe ce um outro determinantes antigenerico diferente de R^» 0 líqui do de ascites que contém estes anticorpos é purificado como se indica em 1·3· θ anticorpo completo é cindido com obtenção do fragmento Fab procedendo de acordo com a maneira de proceder conhecida segundo o método descrito por R. R. Porter, Biochem. Jo, 73« (1959) pagina 119· Os fragmentos Fab assim obtidos são acopolados com «galactosidase de acordo com Ishikawa et al., J. of Immunoa ssay , 4_, (1983), péginas 209 - 327· A solução reagente R? é diluida com tampão II de maneira a obter-se uma concentração de 5OO mU/ml (medida com o-nitrofenil--galactési_;do a 37°C).

e) Proteína para eliminação das perturbações i

Dissolve-se polímero de MAK33-IgO, preparadoj como se descreveu no Exemplo 2, com tampão II até se obter uma concentração de 1 mg/ml»

f) Solução de Avidina

Dilui-se Avidina com tampão I de maneira a obter-se uma concentração de proteína igual a 50/Ug/ml.

mmole/l (3,05 g/l)

g) Solução de substrato iVernielho de clorofenol-^-galactósido [(preparado de acordo com o pedido de Patente de Invenção Alemã publicado

para inspecção pública DE-OS 3345748)
HEPES	70 mmole/l	(16,7 g/l)
NaCl	154 mmole/l	(9 g/l)
Albumina de soro de vitelo	0,3 % (3	g/l)
Tween 20	0,2 % (2	g/l)
pH (com NaOH)	7,25

'2. Preparação de suportes com reagente

I a) Suporte com reagente 1 (sem proteína ae eliminação das perturbações) ! Deixa—se cair gota a gota 40/ulitros de uma solução que contém por litros 100 milimoles de fosfato de sédio de pH igual a 7,3 (37°C), 2 milimoles de cloreto de magnésio, gramas de cloreto de sédio, 5 gramas de albumina de soro de vitelo, 0,5 mg de anticorpo monoclonal anti-TSH biotinilado de rato (reagente R^), 1 000 U de conjugado de anticorpo de anti— -TSH) -f ragmento-Fab (de rato)-/^ —ga la ct o sida se (solução reagen 'te R^) (actividade determinada com orto-^^⁷-D-galactosidase a 137°C) sobre um velo que consiste em papel de poliéster comercial, Em seguida, seca-se ã temperatura ambiente. Guardam-se estes velos até ã sua utilização a 4°C e a uma humidade relativa do ar igual a 20

b) Suporte com reagente 1' (com proteína que ijalimina as perturbações) íí

A preparação realiza-se como se descreveu para o suporte com reagente 1 com a diferença de, adicionalmen31

te, por litro de solução de impregnação, estar contido 0,01 grama de agregado MAK33-IgG do Exemplo 2 c) (mistura bruta).

c) Suporte com reagente 2

Sobre um velo de celulose fixa-se Avidina (solução de Avidina) de acordo com o processo de activação com ί bromociano (pedido de Patente de Invenção Alemã publicado para inspecção pública DE-OS 1768512), empregando-se 10 ^ug de Avivina por grama de material de fibras. Por lavagem, elimina-se o anticorpo não acoplado e seca-se o velo com cuidado. A armazenagem do velo assim obtido realiza-se de maneira análoga ao su!porte com reagente 1.

3. Realização da determinação

A determinação realiza-se com o auxílio de dois suportes com reagentes 1 e 2 ou 1' e 2, procedendo de acoí do com a maneira de proceder descrita no pedido de Patente de Invenção Alemã DE-OS 3425θθθ·5 para a realização de determinações analíticas.

Esta prescreve um elemento de inserção num rútor pa ra máquinas centrifugadoras analíticas automáticas, o qual consiste num corpo que possui uma câmara para colocação da amostra que está em ligação com uma multiplicidade de reservas de reagentes e que contêm material de suporte absorvente com um determinado reagente, pelo menos unia câmara de válvula de mistura e uma câmara de medições que conjuntamente formam uma via de transporte de líquido de amostra que conduz radialmente de dentro para fora se o elemento de inserção á fixado no rotor e conduz ainda pelo menos a uma outra câmara para a realização da medição e á pelo menos parcialmente idêntica ã via de transporte do líquido da amostra.

A via de transporte de líquido da amostra conduz de uma câmara de recepção da amostra (Ρ), passando atra·

vés de uma câmara (a) que contém tampão cheia com material ^absorvente, uma câmara (b) e uma primeira câmara de válvula ; )(VKl) colocada entre as câmaras (a) e ( c) a uma segunda câmara ! Pde válvula (VK2) e desta, passando pela câmara (d) e por uma l j ji câmara de amortecimento (AK) , até à câmara de medição (k)„ Para a admissão de um outro líquido, prevê-se uma câmara de substrato (PK) com a forma de câmara de bombagem que se encontra ligada por intermédio de um dispositivo de doseamento que con- j

i.siste numa câmara de doseamento (DK) e um capilar (Kap) e de ' l !

Numa câmara de transbordamento (UK) com a segunda câmara de válJ vula (VK2) (veja-se Figura 2) í

Para a determinação da extinção a_ (sinal de nisdida incluindo sinal da perturbação), utilizam-se o suporte jcom reagente 1 e o suporte com reagente 2; para a determinação da extinção b (sinal específico sem sinal perturbado), utilizaml -se o suporte com reagente 1’ e o suporte com reagente 2.

O suporte com o reagente 1 ou 1* é colocado no campo jç do elemento de inserção no rotor e o suporte com ί reagente 1* no campo c[. Para isso, pipetam-se 40 /ilitros de amostra concentrada directamente para o campo através de uma abertura no .rebordo superior. Pipetam-se 2?θ /ilitros dessolução jde substrato para dentro da câmara PK. Por intermédio de um pro 'grama de centrifugação apropriado, no qual um grande número de rotaçães alterna com o estado de repouso, transporta-se a amostra e a solução de substrato na direcção da matriz de separação ί

ie da cuvete.

Nessas circunstâncias, no decurso do progre !ma, os reagente R^ e R^ sem ou com proteína para eliminação das perturbações sàô eluídos do campo £ e a mistura homogénea é seguidamente feita reagir. No campo ti, ligam-se os complexos formados sobre R^ com Avidina. A transferencia da amostra do campo j; para o campo çj realiza-se dentro de um intervalo de tem po muito curto.

A solução de substrato é dividida eni porçSes na câmara de doseamento DK, as primeiras das quais servem para j

Ί lavar o excesso de conjugado não complexado. Os factores pertur· j, bantes que podiam reticular R^ são neutralizados por introduçãtj» j de 10 /ug de proteína de eliminação de pert urbações/tnl de solução de ensaio e igualmente lavados (introdução de suporte de reagente 1’).

A actividade de^? -ga la ct o s ida se ligada a d por formação de complexo é proporcional à quantidade de TSR contida na amostra ou ao valor em vazio da amostra. Ésta acti-¹vidade é determinada com uma outraiporção do substrato, em que o substrato é feito reagir com formação de produtos corados numa reacção durante 5 minutos. A cor formada e o outro desenvolvimento de cor/minuto na fase líquida são medidos na cuvete a 576 nm.

Nestas condições, obtiveram-se os resultados indicados na seguinte Tabela.

Tabela 6

1 Amostra	a	b
Ext 0	Cone. _7 /7uU/ml__7
Ext . /“mE_7	Con c · //uU/ml _7
Calibrador de T5H 0 /uU/ml^C)	451	0	457	0
Calibrador de TSH 19,6 /uU/ml '	3331	19,6	3311	19,5
Soro humano	669	1,5	72 5	1,8
Soro humano 43	6790	38	662	1,5
com factores
perturbantes

Todas as medições se realizaram aÀ= 576 nm ; com uma espessura da camada igual a 0,3 cm e calculadas para a espessura da camada d = 1 cm.

a) Determinação de TSH com utilização do suporte com reagente 1

b) Determinação de TSH com utilização do suporte com reagente 1’ com polímero MAK33-IgG para a neutralização de factores perturbantes específicos de M-Fab.

c) Padrões de TSH calibrados no segundo IRP

80/588.

teor de TSH no soro humano 43 foi confirmado com um Ensaio 1SH Enzymun da Firma Boehringer Mannheim como sendo igual a 1,4 xiU/ml. Este ensaio emprega como reagentes específicos um ΜΑΚ-anti-TSH revestido num tubo de ensaio e um conjugado anti-TSH—Fab—POD de ovelha. Este último é inerte I contra perturbações em HS 43»

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1» _

Processo para a determinação de uma substância com capacidade de ligação imunoiógica num líquido biológico de uma primeira espécie animal ou de seres humanos, na preÍsença de pelo menos dois reagentes específicos para a substânI jcia com capacidade de ligação imunoiógica de uma segunda espécie animal, e na presença de um inibidor para compensação de factores perturbantes, caracterizado por se pôr a mistura reaccional em contacto com 0,1-50 /tig/ml de agregados não específicos para a substância com capacidade de ligação imunoiógica, derivados de anticorpos monoclonais ou policlonais, de uma segunda e/ou terceira espécie animal, para compensação de factore

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a substância com capacidade de ligaçao imunolégica ser um antigene polivalente, os reagentes específicos serem anticorpos dos quais pelo menos um é um fragmento Fab ou ; F(ab»)₂, e os agregados não específicos gerem agregados de IgG,

- 3* Processo de acordo com as reivindicações 1 jou 2, caracterizado por se pôr a mistura reaccional em contacto ! com 5~25 ug/ml de agregados de IgG não específicos.

- 4* i

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se pôr a mistura reaccional em contacto t

jcom 5-10 ug/ml de agregados de IgG não específicos.

- 55 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 4, caracterizado por os agregados de IgG não específicos serem constituídos por IgG e por uma segunda macromolép cuia.

- 6* Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a segunda macromolécula se tratar de IgGs nao específicos de uma terceira espécie animal, de fragmentos de Ig não específicos isentos de Fc, de proteínas, de polissacáridos ou de um outro polímero solúvel em égua»

36 7^e

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por os agregados nao específicos possuírem um peso molecular de 320,000 Dalton ou superior.

- 8* Processo de acordo com qualquer das reivinidicações 1 a 6, caracterizado por os agregados não específicos possuírem um peso molecular de 320,000 a 10 milhões Dalton.

' - 9^a í

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se prepararem os agregados i

não específicos por meio de acção térmica, ligação química ou ! ligação não covalente.

I - 10* l· Processo de acordo com qualquer das reiviníjdicações 1 a 9, em que pelo menos um dos reagentes específicos se encontra ligado a uma substância marcadora e um outro se enJ contra fixo numa matriz ou biotinilado, e em que se determina a actividade imunológica ligada ou não ligada associada à proteína fixa ou biotinilada, caracterizado por os agregados de IgG não específicos se encontrarem presentes na mistura reaccio nal em solução durante o teste.

- 11* • Frocesso para a preparação de um meio de |diagnóstico, para a determinação de uma substância com capacidade de ligação imunológica num líquido biológico de uma primei !ra e spé cie animal ou de seres humanos, contendo pelo menos dois reagentes específicos para a substância com capacidade de liga-jção imunológica de uma segunda espécie animal, um inibidor paI ra a compensação de factores perturbantes, uma substância tamí; pão adequada, bem como eventualmente outros aditivos de uso cor~ I rente, caracterizado por se utilizarem para a compensação de ^!factores perturbantes 0,1-50 ug/ml de agregados não específicos 'para a substância com capacidade de ligação imunológica, derivados de anticorpos monoclonais ou policlonais, de uma segunda j í

e/ou terceira espécie animal, com pesos moleculares superiores j a 320,000 Dalton»

- 12« Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a substância com a capacidade de ligação imunológica ser um antigene polivalente, os reagentes específicos serem anticorpos, dos quais peio menos um é um fragmento Fab oc F(ab’) , e os agregados não específicos serem agregados de IgG»

- 135 1

I Processo de acordo com as reivindicações 11

Jou 12, caracterizado por se utilizarem como agregados de IgG não específicos agregados de IgG constituídos por IgG e por uma I segunda macromolécula.

- 14« Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a segunda macromolécula se tratar de IgGs não específicos de uma terceira espécie animal, de fragmentos de IgG não específicos isentos de Fc, de proteínas, de polissacaridos ou de um outro polímero solúvel em agua.

15*

Processo de acordo com qualquer das reivin- | dicaçSes 11 a 14, caracterizado por se utilizarem dois ou mais ! reagentes específicos de rato ou de ratazana MAK, dos quais pelo menos um reagente e um fragmento Fab ou F(ab·) e pelo menos ,um dos outros reagentes é um IgG contendo Fc, e agregados de IgG ou agregados de IgG/fab ou de IgG/F(ab’)₉ não específicos, Íhomopoliméricos ou heteropoliméricos, com pesos moleculares suJperiores a 32O_çOOO Dalton, sendo os fragmentos Fab ou F(ab·) ie os IgGs, contidos nos agregados não específicos, monoclonais e da mesma espécie e subclasse de pelo menos um dos reagentes í e specificos.

ι !

- 16» ! Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 15, caracterizado por os agregados de IgG não espe cif icos possuírem um peso molecular de 320.000 a 10 milhões 1 Dalton.

- 17* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 16, caracterizado por se utilizarem como aditivos ίί , ~ , (suplementares aceleradores da reacçao, detergentes e/ou estabijí íí lizadores.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América, em e de Março de 1988, sob o número de série 164,054.