JPS63290963A - 酵素標識抗体感作ラテックス及びそれを用いた酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微量分析分野において用いられる酵素と抗体
とを結合させた酵素標識抗体をさらにラテックス粒子に
結合させた酵素標識抗体感作ラテックス及びそれを用い
た酵素免疫測定法に関する。

〔従来の技術〕

近年、臨床検査の分野において微量生体成分の分析の重
要性が高まっている。一般に血清中の微量成分の分析は
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により行われている。この方
法は、微量抗原に対する抗体と検出信号を与える酵素と
を化学的に結合して作製された酵素標識抗体が抗原と反
応することにより、被検物の検出が可能となるものであ
る。

そうした免疫分析法の確立において、重要な問題となる
のは、感度である。通常、正常な検体には存在しないウ
ィルス抗原の測定にはｎｇ／ｍ１以下のオーダーの測定
を行う必要があると言われている。このような目的に対
し、従来からの酵素と抗体とを化学結合によって結びつ
ける方法（グルタルアルデヒド法や過ヨウ素酸酸化法）
あるいは抗体等を仲立ちとして酵素と抗体とを結ぶ方法
（ＰＡＰ法やへｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ法）による酵
素標識法によって作製された酵素標識抗体〔酵素標識抗
体法。

改訂版、学際企画側発行、　１９８５年、２１〜２３頁
参照〕は充分にその目的を果たしていない。

酵素免疫測定法における感度の向上には、一定量の酵素
標識抗体で高い吸光度となるような標識抗体の質的な向
上が必要である。このためには、被検物に対するアフィ
ニティーの高いものを用いる必要がある。しかしながら
、高アフィニティー抗体を得ることは一般的に難しく、
ポリクロナールな抗体では安定的に作ることは免疫動物
の個体差等のｒＪｉ題があり困難と言われ、更に高アフ
ィニティー抗体と低アフィニティー抗体の混合物として
得られるため、ｌｏｔ差がでやすい。一方、モノクロナ
ール抗体では、一度安定した融合細胞より得られる抗体
は安定的に供給できるが、高アフィニティーの抗体を産
するクローンを得ることは多大の費用と時間を要する。

また、ひとつの抗原抗体反応に関与する酵素の量を著し
く増大させること、すなわち、■抗体上に多数の酵素分
子を結合させることは不可能であり、感度を上昇させる
手段は殆ど行われていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来から行われている酵素標識法により作製
された酵素標識抗体に代わる新規な作製法によって作製
される高感度の酵素標識抗体及びそれを用いた酵素免疫
測定法を提供しようとするものである。

Ｃ問題点を解決するだめの手段〕 本発明者らは、上記目的を達成するために種々研究を重
ねた結果、意外にも、従来の酵素標識抗体をラテックス
粒子ｔこ結合させることにより、極めて高感度の酵素標
識抗体が得られることを見出し、この新知見に基づいて
本発明を完成するに到ったものである。

すなわち、上記の目的は、被検物に対応する抗体と定量
信号を与えるための酵素とを化学的に結合させた酵素標
識抗体を、さらに、ラテックス粒子上に結合させた酵素
標識抗体感作ラテックス及び前記酵素標識抗体感作ラテ
ックスを用いた酵素免疫測定法を提供することにより解
決される。

酵素標識抗体のラテックス粒子上への結合は、具体的に
は、例えばつぎのようにして行うことができる。すなわ
ち、適当な緩衝液に酵素標識抗体を約２５０　ｐ　ｇ／
ｍｌの濃度に溶解し、この液を０．２％ラテックス懸濁
液と等量混合して攪拌放置する。

一定時間後、適当な緩衝液で遠心洗浄し、その後適当な
ブロッキング液の０．０１〜１゜０％水溶液中に懸濁し
放置すれば、酵素標識抗体感作ラテックスが得られる。

緩衝液はリン酸又はトリス塩酸等を用い、ブロッキング
液はＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルク又はカゼイン等を
用いる。

ラテックス粒子は公知のものを使用すればよいが、例え
ば、ポリスチレン又はスチレン−ブタジェン共重合体、
スチレン−ジビニルベンゼンもしくはポリビニルトルエ
ン等、あるいはそれらにカルボキシル基、水酸基又はア
ミン基等を一部有するラテックスでもよく、その粒径は
１０μｍ以下が望ましい。

被検物に対する抗体は、被検物に対する抗血清より常法
に従って精製する。例えば、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツ
ジ、ブタ、マウス、モルモット又はその他の動物より得
られた被検物に対する抗血清を硫酸ナトリウムもしくは
硫安で分画したもの、またはＤＥＡＥ等のイオン交換カ
ラムで精製した抗体、もしくは抗原を固定化したカラム
を用いてアフィニティー精製した抗体を用いる。あるい
は、細胞融合法により作製されたマウスモノクローナル
抗体を用いてもよい。

一方、標識酵素は、パーオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、ヘキソキナーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ又はアミラーゼ等が
挙げられるが、これらに限らずその酵素活性測定が容易
で、一分子当たりの活性が高く、扱い易い酵素であれば
特に問題はない。

抗体と酵素を化学的に結合してなる酵素標識抗体は、常
法の酵素標識法で作成することができる。

例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸酸化法、Ｐ
ＡＰ法、へｖｉｄｉｎ−ｒｌｉｏｔｉｎ法、ピリジルジ
スルフィド法又はマレイミド化合物を用いる方法等公知
の方法によって酵素と抗体を結合させればよい。

このようにして得られた酵素標識抗体感作ラテックスは
、従来より行われている酵素免疫測定法における被検物
の微量分析の改良に役立つものである。

すなわち、上記酵素標識抗体感作ラテックスを用いた酵
素免疫測定法においては、例えばサンドイツチ法による
被検物の微量分析を極めて感度よく行うことができるも
のであって、具体的には、被検物のＨＢｓ、　　ＣＥＡ
、ＡＦＰ、ＣＲＰ、各種イムノグロブリン、β２−ミク
ログロブリン、アンチトリプシン、セルロプラスミン又
はトランスフェリン等に対する抗体を、マイクロタイタ
ープレート又はビーズの固定相に固定し、これを適当な
ブロッキング剤でブロッキング後、被検物を固定相と接
触反応させる。更に続けて、酵素標識抗体感作ラテック
スを加えるか、あるいは一定時間放置後、緩衝液で洗浄
し酵素標識抗体感作ラテックスを加える。その後、公知
の発色系の試薬を用いて酵素活性を比色定量することに
より目的の被検物の定量を感度よく測定することができ
る。

さらに、上記酵素標識抗体感作ラテックスを用いた酵素
免疫測定法は、競合法を利用した抗体価の測定に適用す
ることもできる。即ち、固定相に抗原を固定し適当にブ
ロッキング後、被検液と酵素標識抗体感作ラテックスを
同時に加え、被検液中の抗体と競合的に同相に結合した
酵素標識抗体感作ラテックスの酵素活性を前記の方法で
測定し、被検液中の抗体量を測定することができる。

また、例えばグルコースオキシダーゼとパーオキシダー
ゼのように、一つの酵素の反応生成物が他の酵素の基質
になるような二種類の酵素を用いるエンザイムチャンネ
リング法のような均一系の測定法においても、本発明に
よる酵素標識抗体感作ラテックスを使用することが可能
である。

〔作　用〕

本発明の酵素標識抗体感作ラテックスを酵素免疫測定法
による被検物の分析に用いれば、従来の酵素標識抗体に
比べて著しい高感度を示す。

以下、本発明を実施例により説明する。

実施例１ （１）パーオキシダーセ標識抗ＨＢｓ抗体感作ラテック
スの作製 パーオキシダーゼ５■を１ｍｌの０．３Ｍ炭酸水素ナト
リウムに溶解し、これに０．２　ｍｌの１％２−４ジニ
トロフロロベンゼンを加えて１時間攪拌した後、１−の
０．０６？Ｉ過ヨウ素酸ナトリウムを加え、３０分攪拌
、さらに１ｍｌの０．１６Ｍエチレングリコールを加え
て１時間攪拌する。これを炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で
−昼夜透析する。これを炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に溶
解した抗ＨＢｓモノクロナール抗体（５■／ｍり１−と
混合し、室温で３時間反応後、（ＰＢＳ透析）七フアク
リルＳ−２００でゲル濾過してパーオキシダーゼ標識抗
体を得る。このパーオキシダーゼ標識抗体（２５０μｇ
／ｍ／）を１−と粒径０．２２　ｐ　ｍの０．２％ラテ
ックス懸濁液１−を混合し、１．５時間シエイキングし
た後、１４０００ｒｐｍ　Ｘ　２０分遠心し、その後、
沈澱部分を０．５％カゼインを含む５０ＩＩＩＭトリス
緩衝液（ｐＨ８，０）にサスペンドし、１時間ブロッキ
ングした後、再び１４０００ｒｐｍ　Ｘ　２０分遠心し
、ラテックス濃度０．０４３％に希釈してパーオキシダ
ーゼ標識抗ＨＢｓ抗体感作ラテックスを得る。

（２）パーオキシダーゼ活性の確認 （１）で得た抗ＨＢｓパーオキシダーゼ標識抗体感作ラ
テックス懸濁液を２０μｌとり、これを過酸化水素０．
３ｍＭ、フェノール１０ｍＭ、及び４−アミノアンチピ
リン０．８２ｍＭを含む５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐ■４７．５）３−に加え、３７°ＣにおけるΔＡ３
００を測定したところ、７．３１１／ｍ／のパーオキシ
ダーゼ活性がラテックス上に存在することを認めた。

（３）抗ＨＢｓモノクロナール抗体活性の確認（１１で
得たパーオキシダーゼ標識抗体感作ラテックスを２０ｐ
βとり、これに被検物（抗原）であるＨＢｓを１０μｌ
加えたところ凝集が認められた。

以上の結果によりバーオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体感
作ラテックスが生成していることが確認できた。

実施例２ （１，１グルコースオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体感作
ラテックスの作製 グルコースオキシダーゼ１８０■をＰＢＳ４Ｔｔ１に溶
解し、これに４００μβの３０ｍＭ　ｎ−サクシンイミ
ジル３−　（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
下５ＰＤＰと記す）を加えて、２３℃で３０分放置して
セファデックスＧ−２５でゲル濾過後、グルコースオキ
シダーゼ活性画分を集める。これに１００ｍＭジチオス
レイトールを４００μｐ加え、２０分放置後再びゲル濾
過して５ＰＤＰグルコースオキシダーゼを得る。次に、
抗ＨＢｓモノクローナル抗体（２５ｗ／ｍｌＮ、５−及
び２０ｍＭ　Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ１５０μｌと混合し、３０
分放置後、セファデックス２５でゲル濾過して５ＰＤＰ
抗ＨＢｓ干ツクロ一ナル抗体を得る。

この様にして得た５ＰＤＰグルコースオキシダーゼと５
ＰＤＰ抗ＨＢｓモノクロ一ナル抗体を等量混合し、−夜
放置後、ゲル濾過してグルコースオキシダーゼ標識抗Ｈ
Ｂｓ抗体を得る。このグルコースオキシダーゼ標識抗体
（２５０μＩｌ／ｍｌ）を粒径０．０９μｍの２−と０
．２％ラテックス懸濁液２艷を混合し、１時間シェイキ
ングした後、１４０００ｒｐｍ　ｘ２０分遠心し、その
後、沈澱部分に０．５％カゼインを含む５０ｍＭ　）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を１ｍｌ加えて、１時間ブ
ロッキングした後、再び１４０００ｒｐｍ　ｘ２０分遠
心し、ラテックス濃度０．２５％になるようにカゼイン
液を加えて希釈してグルコースオキシダーゼ標識抗体感
作ラテックスを得る。

（２）　　グルコースオキシダーゼ活性の確認（１）で
得たグルコースオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体感作ラテ
ックス懸濁液を２０μｐとり、これをグルコース３３ｍ
Ｍ、フェノール１４ｎ＋Ｍ、４−アミノアンチピリン０
．８２ｍＭ及びパーオキシダーゼ８Ｕ／ｒｄを含む０．
ＩＨリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）３−に加え、３７℃に
おけるΔＡ３００を測定したところ、３．６Ｕ／ｌｎｌ
のグルコースオキシダーゼ活性がラテックス上に存在す
ることを認めた。

（３）抗ＨＢｓモノクロナール抗体活性の確認（１）で
得たグルコースオキシダーゼ標識抗体感作ラテックスを
２０μｌとり、これに被検物（抗原）であるＨＢｓを１
０μｌ加えたところ凝集が認められた。

以上の結果によりグルコースオキシダーゼ標識抗体感作
ラテックスが生成していることが確認できた。

実施例３ 抗ＨＢｓモノクロナール抗体１０μｇ／ｍｌをマイクロ
　（タイター用）プレートの各ウェルに８０μｌ加えて
、３７℃で２時間放置後、吸引し、０，５％カゼインを
含む５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（＋）Ｈ８，０）２
００μｅを加えて一昼夜放置する。このプレートにＨＢ
ｓ、　０．５０．１００．２００．５００　ｍｇ／−を
各々含む血清を３５μｌ加え、更にパーオキシダーゼ標
識抗体感作ラテックスを３５μｌ加えて、３７℃１時間
放置して洗浄後、過酸化水素０．３ｍＭ、フェノール１
０ｍＭ及び４−アミノアンチピリン０．５ｍＭを含む５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２００μｌ
を加えて、３０分後のΔＡ　５００を測定した。

同様の操作で従来法により作製したパーオキシダーゼ標
識抗体も反応させて比較例とした。

その結果は、第１図に示す通り同一のパーオキシダーゼ
活性及び同一の抗体量である場合、著しい感度の増加を
認めた。

実施例４ 実施例３と同様に作製したマイクロプレートを用いパー
オキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体惑作うテンクスの代わり
にグルコースオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体感作ラテッ
クスを用いてＨＢｓを反応させた。グルコースオキシダ
ーゼ活性はグルコース３３ｍＭ、フェノール１４ｍＭ、
４−アミノアンチピリン０．８２ｍＭ及びパーオキシダ
ーゼ８０／ｍ１を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用
いてΔＡ３００を測定した。

その結果は第２図に示す通リバーオキシダーゼ標識抗体
感作ラテックスと同様、著しい感度の増加を認めた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ本発明の実施例３及び実
施例４において測定したＨＢｓ濃度と吸光度（５００ｎ
ｍ）との関係を示した検量線を示すものである。 図中の記号は下記の意味を有する。 □　本発明の標識抗体 ｍ＝　従来の標識抗体 特許出願人　株式会社ジノテスト研究所代理人　弁理士
　平　木　祐　輔 銅１図 ΔＡｓｏｏ　　　　　　　　Ｐ　Ｉ　Ｌを用いたＨＢｓ
測定ＨＢｓ　　８度（ｎｇ／ｍυ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検物に対応する抗体と定量信号を与えるための酵
   素とを化学的に結合してなる酵素標識抗体を、さらに、
   ラテックス粒子に結合したことを特徴とする酵素標識抗
   体感作ラテックス。 ２、酵素標識抗体のラテックス粒子への化学的結合が、
   酵素標識抗体を緩衝液中でラテックス懸濁液と混合する
   ことにより行われたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の酵素標識抗体感作ラテックス。 ３、酵素標識抗体を用いて被検物を免疫学的に定量する
   酵素免疫測定法において、前記酵素標識抗体として、被
   検物に対応する抗体と定量信号を与えるための酵素とを
   化学的に結合してなる酵素標識抗体を、さらに、ラテッ
   クス粒子に結合したことを特徴とする酵素標識抗体感作
   ラテックスを用いて行うことを特徴とする酵素免疫測定
   法。 ４、酵素免疫測定法がサンドイッチ法、競合法又はエン
   ザイムチャンネリング法により行われることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項記載の酵素免疫測定法。