CN106596963A - 一种测定甲胎蛋白的试剂盒 - Google Patents

一种测定甲胎蛋白的试剂盒 Download PDF

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庄庆华
吴铮
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Abstract

本发明涉及一种测定甲胎蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：HEPES缓冲液 40~260 mmol/L，氯化钠 120~380 mmol/L，EDTA 20~80 mmol/L，牛血清白蛋白 28~60 g/L，聚乙二醇‑6000 5~25 g/L，吐温‑80 4~16 mL/L，叠氮钠 0.6~0.9 g/L，抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L，其溶剂为纯化水；试剂R2：HEPES缓冲液 50~150 mmol/L，氯化钠 180~500 mmol/L，EDTA 20~80 mmol/L，牛血清白蛋白 28~60 g/L，叠氮钠 0.6~0.9 g/L，乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 0.1~2.0 %，其溶剂为纯化水。

Description

一种测定甲胎蛋白的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定甲胎蛋白的试剂盒。
背景技术
甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。
甲胎蛋白主要在胎儿肝中合成，分子量6.9万，在胎儿13周时AFP约占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平。
甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临床经验结合，以免出现假阳性的错误。
在成人，AFP可以在大约80%的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50%。在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。
但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。
目前临床上使用较为广泛的甲胎蛋白的检测方法为酶联免疫吸附法。但酶联免疫吸附法操作过程繁琐，耗时长，且对操作人员有较高的专业技能要求，不适合临床大量标本的快速检测，且检测精度不足。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中甲胎蛋白检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，提供一种测定类风湿因子的试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是： 一种测定甲胎蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
HEPES缓冲液 40~260 mmol/L
氯化钠 120~380 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
聚乙二醇-6000 5~25 g/L
吐温-80 4~16 mL/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
HEPES缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 180~500 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
优选的，所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
HEPES缓冲液 150mmol/L
氯化钠 250 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
聚乙二醇-6000 15 g/L
吐温-80 10 mL/L
叠氮钠 0.7 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 340 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体为含有能与人甲胎蛋白特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
作为优选，所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体的粒径在30~200nm之间。
作为优选，试剂盒的制备方法和使用方法包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
HEPES缓冲液 40~260 mmol/L
氯化钠 120~380 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
聚乙二醇-6000 5~25 g/L
吐温-80 4~16 mL/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
HEPES缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 180~500 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应，进一步优选的，试剂R1与试剂R2的体积比为2：1，待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：5到1：30之间；
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的甲胎蛋白的值。
作为优选，所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b） 将步骤（a）的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗人甲胎蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0 g/L；
（c） 将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液分散胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0 %超声分散，制得乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体。
本发明先将含有抗人类风湿因子抗体的试剂R1与样本相混合，在37℃下孵育5分钟，使得样本中的类风湿因子抗原与试剂R1中的抗人类风湿因子抗体结合形成抗原抗体复合物，并凝集成大颗粒，以达到将类风湿因子抗原清除的目的。再将含有包被了高特异性的抗人甲胎蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯微球的缓冲液即试剂R2与上述中去除过类风湿因子的样本中相应的甲胎蛋白抗原发生特异性结合，在促凝剂作用下形成不溶性的聚苯乙烯微球-抗原-聚苯乙烯微球颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的甲胎蛋白抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测甲胎蛋白的含量。
样本中甲胎蛋白（AFP）的活性（ng/mL）=CS×（ng/mL）
式中：ΔAT/min以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS/min以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中AFP的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：在R1液中添加一定浓度的抗人类风湿因子抗体，可以去除内源性的人类风湿因子的干扰，避免由于风湿因子的干扰出现假阳性的结果，使得检测结果更加准确，另外检测过程也比较方便。
附图说明：
图1为本试剂盒与化学发光法的检测结果对比。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
HEPES缓冲液 150mmol/L
氯化钠 250 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
聚乙二醇-6000 15 g/L
吐温-80 10 mL/L
叠氮钠 0.7 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 340 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
实施例2
试剂盒的制备和使用方法
1、乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体制备：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b） 将步骤（a）的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗人甲胎蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0 g/L；
（c） 将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液分散胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0 %超声分散，制得乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体。
2、按照下列组分含量配制好试剂：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
HEPES缓冲液 150mmol/L
氯化钠 250 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
聚乙二醇-6000 15 g/L
吐温-80 10 mL/L
叠氮钠 0.7 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 340 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长570nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与24μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入90μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 样本甲胎蛋白（AFP）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的甲胎蛋白的活度。
参照附图1，附图1为用实施例1所制得的一种测定甲胎蛋白的试剂盒多次测定不同样本中甲胎蛋白的测定结果，以及在同等条件下与化学发光法测定结果的对比分析。从相关性实验结果可见，本试剂盒与化学发光检测结果相关性很好，相关方程 y=0.9929x+0.2691，R2=0.9974，从结果可以看出本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可以应用于甲胎蛋白的检测。

Claims (8)

1.一种测定甲胎蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其特征在于：所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
HEPES缓冲液 40~260 mmol/L
氯化钠 120~380 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
聚乙二醇-6000 5~25 g/L
吐温-80 4~16 mL/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
HEPES缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 180~500 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
HEPES缓冲液 150mmol/L
氯化钠 250 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
聚乙二醇-6000 15 g/L
吐温-80 10 mL/L
叠氮钠 0.7 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 340 mmol/L
EDTA 50 mmol/L
牛血清白蛋白 44 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体为含有能与人甲胎蛋白特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
4.根据权利要求1所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体的粒径在30~200nm之间。
5.根据权利要求1所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于：试剂盒的制备方法和使用方法包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
HEPES缓冲液 40~260 mmol/L
氯化钠 120~380 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
聚乙二醇-6000 5~25 g/L
吐温-80 4~16 mL/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
HEPES缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 180~500 mmol/L
EDTA 20~80 mmol/L
牛血清白蛋白 28~60 g/L
叠氮钠 0.6~0.9 g/L
乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水；
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的甲胎蛋白的值。
6.根据权利要求1所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗人甲胎蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0g/L；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液分散胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0 %超声分散，制得乳胶包被抗人甲胎蛋白抗体。
7.根据权利要求5所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中,所述的试剂R1与试剂R2的体积比为2：1。
8.根据权利要求5所述的一种测定甲胎蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：5到1：30之间。
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