JPS5943360A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫学的測定方法、詳しくは、抗原抗体反応
全利用してサンプル抗原（抗体）の量を測定する免疫学
的測定方法に関する。

抗原抗体反応を利用してサンプル液中に含まれる抗原や
抗体の定量分析を行なう免疫学的測定方法には、従来か
ら数多くの方法があり、標識物質の違いによって、ラジ
オイムノアッセイ法（放射性物質免疫測定法）、エンザ
イムイムノアッセイ法（酵素免疫測定法）、フルオロイ
ムノアッセイ法（螢光抗体免疫測定法）等に大別される
。また、測定時における反応形態自体の性質により競合
反応と非競合反応とに分けられる。いずれの方法におい
ても測定に際しては、試薬もしくはサンプル中の抗原（
抗体）と標識物質で標識した抗体（抗原）とが抗原抗体
反応を起して形成される免疫複合体（バウンド・・・ｂ
ｏｕｎｄ）と、抗原抗体反応に関与しない標識抗体（抗
原）（フリ・・・ｆｒｅｅ）とを分離する操作、いわゆ
るｂ−ｆ分離が必要であり、測定精度はこのｂ−ｆ分離
に大いに関係する。ところで非競合反応の一つにサンド
イッチ去がある。次に、この従来のサンドイッチ法につ
いて説明する。

第１図に示すように、試験管などの容器１の底には、例
えば、ＨＢｓ抗原などのサンプル抗原２に対して特異的
に反応しる抗体３を固相化したガラスビーズなどの固相
担体４が入れられている。、まず、この容器１内に被測
定物質であるサンプル抗原２を含んだ反応液を注入する
と、第２図に示すように、同サンプル抗原２は、上記抗
体３と抗原抗体反応を起して結合し固相担体４に捕捉さ
れる。

このあと、例えば、酵素であるβ−Ｄガラクトシダーゼ
を標識物質５として結合させた上記サンプル抗原２に特
異的に反応する抗体６、即ち標識抗体６を試薬として上
記容器１内に注入すると、第３図に示すように、標識抗
体６は上記固相化抗体３と結合したサンプル抗原２に抗
原抗体反応により結合される。そして、このとき、サン
プル抗原２に対して、試薬である標識抗体６および固相
化抗体３を多量に用いることによって、サンプル抗原２
と結合した標識抗体６は比重の大きい固相担体４に捕捉
されて容器１の底に沈んだ状態となるが、余剰分の標識
抗体６はサンプル抗原２と結合しないでフリー（ｆｒｅ
ｅ）の状態で反応液８中に浮遊しているので、第４図に
示すように、反応液８を除去し、上記サンプル抗原２お
よび標識抗体６を捕捉した固相担体４を洗浄することに
より、上記ｂ−ｆ分離が行なわれる。このあと、容器１
内に、第５図に示すように、酵素標識物質５と反応する
酵素基質液９を加えると、酵素基貿反応が行なわれてあ
る特定の波長の光を発する（酵素活性）ので、この酵素
活性度、即ち、吸光度を測定することにより上記サンプ
ル抗原２の量を知ることができる。

しかし、上記従来の測定方法は工程が多く、従って、測
定に要する時間が長くなるという欠点があるので、上記
方法を簡略化した方法がしばしば用いられている。この
方法はワンステップサンドイッチ法と呼ばれ、第６図に
示すように、上記固相担体４を有した容器１内にサンプ
ル抗原２および標識抗体６を反応液８と共に、同時に注
入する。

このとき、サンプル抗原２に対して、固相担体４の表面
の固相化抗体３と標識抗体６とが競合的に反応すること
になるので、サンプル抗原２は上記固相化抗体３と結合
もするが、同固相化抗体３と結合する以前に上記標識抗
体６と結合する機会も有している。特に、固相化抗体３
は容器１の底で固相担体４の表面にしか存在せず反応系
としては不均一な状態にあるのに対し、標識抗体６は個
々の分子が反応液８中に均一に分散するので、同じく反
応液８中に均一に分散したサンプル抗原２は、まず第７
図に示すように標識抗体６と反応して結合し免疫複合体
１０を形成する。このあと、免疫複合体１０中のサンプ
ル抗原２が第８図に示すように固相化抗体３と反応する
ことにより免疫複合体１０は固相担体４に捕捉されて反
応液８中で不溶化することになる。しかし、サンプル抗
原２の抗原決定基は標識抗体６と反応しやすく、容器１
の底にしか存在しない固相化抗体３とは反応しにくいの
で、上記免疫複合体１０にさらに標識抗体６が結合した
状態となりやすく、第８図に示すように、サンプル抗原
２の抗原決定基が全て標識抗体６と反応した免疫複合体
１１数多く形成されてしまう。

この免疫複合体１１は固相化抗体３とは反応しないので
上記固相担体４から遊離した状態となって反応液８中に
浮遊することになる。この結果、上記第４図で示したよ
うに、反応液８と共に余剰分の試薬である標識抗体６を
除去してｂ−ｆ分離を行なう際に、上記複合体１１も流
出してしまい、正確なｂ−ｆ分離が行なわれなくなり、
従ってサンプル抗原２の変化量に対する酵素活性の変化
が小さくなって感度低下をもたらしたり、測定値の変動
が大きくなるという欠点を有していた。

本発明の目的は、上記の問題点に鑑み、測定対象のサン
プル抗原（抗体）に対する抗体として複数種の免疫抗体
を使用することにより、高精度、高感度でかつ簡便に測
定を行なうことのできる免疫学的測定方法を提供するこ
とにある。

以下、本発明を図示の実施例に基いて説明する。

第９〜第１３図は本発明方法の一実施例における測定反
応作用の順序を示す図である。測定対象のサンプル抗体
２２として血清中のヒトＩｇＥを用いている。そして、
測定に用いる試薬としては、標識抗サンプル抗体２６と
非標識抗サンプル抗体２７の２種の抗サンプル抗体と、
非標識抗サンプル抗体２７に対する抗体２３を固相化し
た担体２４が用いられる。

第１の試薬である標識抗サンプル抗体２６は、上記ヒト
ＩｇＥを例えばウサギなどの動物に注射し、この免疫さ
れたウサギより得られたウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体のＩｇ
Ｇ分画であって、これに酵素のβ−Ｄガラクトシダーゼ
を標識物質２５として結合させたものである。なお、β
−Ｄガラクトシダーゼの他に標識物質として用いられる
酵素としては、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、
ホースラデッシュパーオキシダーゼ、β−Ｄグルコシダ
ーゼ、ウレアーゼ、グルコース　オキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼなどがある。また酵素以外の標識物
質２５としてフルオレセインイソチオシアネートなどの
螢光物質や色素、或いは放射性物質などを使用すること
ができる。第２の試薬である非標識抗サンプル抗体２７
は、上記ヒトＩｇＥを上記動物とは異種の動物、例えば
、ヤギなどに注射し、この免疫されたヤギより得られた
ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体のＩｇＧ分画である。

一方、試験管などの容器２１の底には、ガラスビーズな
どの比重の大きい固相担体２４が入れられていて、同固
相担体２４の表面には上記非標識抗サンプル抗体２７に
対する抗体２３が固相化されている。

即ち、この固相化抗体２３は、上記ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗
体（ＩｇＧ分画）に対して特異的に反応する抗ヤギＩｇ
Ｇ抗体である。なお、固相担体２４にはガラスビーズの
他、ガラスや合成樹脂からなるボール、ディスクなどを
用いることができ、しかもその大きさや個数は自由であ
る。また、上記試験管などの容器２１に直接、抗体２３
を固相化してもよい。抗体２３を同相化する方法として
は、物理的吸着法、化学的架橋法などがあり、例えば、
ガラスビーズを固相担体２４として使用した場合、３−
アミノプロピルトリエトキシシランの試薬で固相担体２
４の表面をアミノ化したのち、グルタルアルデヒドを用
いて上記抗ヤギＩｇＧ抗体を架橋して固相化することが
できる。

測定は次のような手順で実施される。まず、第９図に示
すように、上記固相担体２４を入れた容器２１内に、サ
ンプル抗体２２と、試薬としての標識抗サンプル抗体２
６と非標識抗サンプル抗体２７とを、反応液２８と共に
同時に注入する。このとき、サンプル抗体２２対して、
標識抗サンプル抗体２６と非標識抗サンプル抗体２７と
が競合的に反応することになる。即ち、サンプル抗体２
２、標識抗サンプル抗体２６、非標識抗サンプル抗体２
７を容器２１内に注入することによって、これら３者は
反応液２８中で均一に分散するので、サンプル抗体２２
であるヒトＩｇＥは標識抗サンプル抗体２６および非標
識抗サンプル抗体２７とそれぞれ抗原抗体反応を起して
結合し、第１０図に示すように免疫複合体３０を形成す
る。

非標識抗サンプル抗体２７は固相担体２４の表面の固相
化抗体２３と反応するので、第１１図に示すように免疫
複合体３０の非標識抗サンプル抗体２７およびサンプル
抗体２２と結合しない余剰分の非標識抗サンプル抗体２
７は固相化抗体２３と結合して固相担体２４の表面に捕
捉され容器２１の底に沈んだ状態となる。

そして、サンプル抗体２２と結合しない余剰分の標識抗
サンプル抗体２６が反応液２８中に浮遊した状態となる
ので、このあと、第１２図に示すように、反応液２８を
除去して上記免疫複合体３０を捕捉した固相担体２４を
洗浄することによりｂ−ｆ分離が行なわれる。そして、
第１３図に示すように、容器２１内に酵素標識物質２５
と反応する酵素基質液２９に加えて酵素基質反応を行な
わせ、その酵素活性度を測定して上記サンプル抗体２２
の量、即ち、ヒトＩｇＥの量を知ることができる。

ところで、サンプル抗体２２が標識抗サンプル抗体２６
および非標識抗サンプル抗体２７と共に容器２１に入れ
られ反応液２８中に分散されると、第１４図に示すよう
に、サンプル抗体２２は上記標識抗サンプル抗体２６お
よび非標識抗サンプル抗体２７と結合した免疫複合体３
０を形成するほかに、標識抗サンプル抗体２６のみ結合
して免疫複合体３１を形成するものもある。この免疫複
合体３１が形成されると、同免疫複合体３１は非標識抗
サンプル抗体２７を有していないことにより同相担体２
４に補捉されず反応液２８中に浮遊することになるので
ｂ−ｆ分離の際に反応液２８と共に流出してしまうこと
になる。しかし、実際には、反応液２８中には標識抗サ
ンプル抗体２６と非標識抗サンプル抗体２７とが均一に
分散しているので、サンプル抗体２２に標識抗サンプル
抗体２６だけが結合する可能性は非常に少なく、このた
め、上記免疫複合体３１の形成される数は上記免疫複合
体３０の形成される数に比較して極めて僅かである。そ
して、免疫複合体３０が形勢されてしまえば、回免疫複
合体３０は確実に上記固相担体２４に捕捉されて反応液
２８中で不溶化するのでｂ−ｆ分離は高精度で行なわれ
ることになる。従って、このあと、上記酵素基質液２９
を用いて酵素活性を行なうと、サンプル抗体２２および
試薬である標識抗サンプル抗体２６、非標識抗サンプル
抗体２７は上記ｂ−ｆ分離の際に無駄な流出がないため
、高感度でしかも安価に測定が行なわれることになる。

なお、測定反応の手順としては、上記反応手順のほか、
サンプル抗体２２、標識体サンプル抗体２６および非標
識抗サンプル抗体２７を、まず、容器２１内に注入して
上記免疫複合体（バウンド）３０を形成させ、このバウ
ンドとフリーの混在した状態の反応液内に、あとから固
相担体２４を入れてｂ−ｆ分離を行なわせるようにして
もよい。また、上記固相担体２４は固相化抗体２３に上
記非標識抗ザンプル抗体２７を充分に吸着させるに足る
だけの分量を用いるようにすれば、確実に感度の高い測
定が行なわれることになる。

上記第９図〜第１４図によって説明した本発明の免疫学
的測定方法は標識抗サンプル抗体２６および非標識体サ
ンプル抗体２７に異種の動物の免疫抗体を使用した場合
の実施例であるが、次にこれらの抗体に同種の動物の免
疫抗体を用いる場合について説明する。

第１５、１６図は本発明方法の他の実施例における測定
反応作用の手順を示す図である。まず、ヒトＩｇＥのサ
ンプル抗体２２に対する抗体を、ある１種の動物から２
種類採取し、これをそれぞれ標識抗サンプル抗体３６（
３６Ａ、３６Ｂ）、非標識抗サンプル抗体３７として用
意する。即ち、例えば、その動物としてウサギを選んだ
場合、上記ヒトＩｇＥをウサギに注射し、この免疫され
たウサギより得られたウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体のうち、
そのＩｇＧから上記標識抗サンプル抗体と非標繊抗サン
プル抗体とを得る。ＩｇＧの基本構造を模式化すると、
第１７図のように図示され、ＩｇＧは抗体活性基を有す
る２つのＦａｂフラグメントと、Ｆｃフラグメントによ
って構成されている。従って、上記ウサギ抗ヒトＩｇＥ
抗体のうちＩｇＧを取り出し、その１つのＦａｂフラグ
メントを用い、これに酵素、或いは螢光物質などからな
る標識物質３５を結合させて標識抗サンプル抗体３６Ａ
とするか、若しくはＦａｂフラグメントを２つ有したＦ
（ａｂ′）２フラグメントを用いてこれに標識物質３５
を結合させて標識抗サンプル抗体３６Ｂとする。即ち、
この場合の標識抗サンプル抗体３６（３６Ａ、３６Ｂ）
にはＩｇＧのＦｃフラグメントを除去した抗体が用いら
れる。また、上記免疫ウサギより得られたウサギ抗ヒト
ＩｇＥ抗体のうちそのＩｇＧを、即ちＦｃフラグメント
を有した抗体を非標識体サンプル抗体３７とする。

そして、容器３１の底に入れられた固相担体３４の表面
には、上記非標識抗サンプル抗体３７に対して特異的に
反応するＦｃレセプタ３３が固相化されている。このＦ
ｃレセプタ３３としては、例えばウサギＩｇＧのＦｃフ
ラグメントをヤギに注射し、この免疫されたヤギより得
られるヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）抗体などのほか、抗
体以外でも上記Ｆｃフラグメントに対して特異性を示す
物質、例えばプロティンなどのタンパク質が用いられる
。

測定に際しては、上記実施例の場合と同様に、第１５図
に示すように、表面にＦｃレセプタ３３を固相化された
固相担体３４、サンプル抗体２２、標識抗サンプル抗体
３６（３６Ａ又は３６Ｂ）、非標識体サンプル抗体３７
を反応液３８と共に容器３１に注入すると、ヒトＩｇＥ
のサンプル抗体２２は上記標識抗サンプル抗体３６およ
び非標識抗サンプル抗体３７と反応して第１６図に示す
ように、免疫複合体４０（４０Ａ又は４０Ｂ）を形成す
ると共に、同免疫複合体４０中の非標識抗サンプル抗体
３７のＦｃフラグメントが固相担体３４上のＦｃレセプ
タ３３と反応し、これによって免疫複合体４０は固相担
体３４に捕捉されて反応液３８中で不溶化する。このと
きも、第１８図に示すように、上記免疫複合体４０のほ
か、サンプル抗体２２が標識抗サンプル抗体３６（３６
Ａ又は３６Ｂ）とのみ結合した免疫複合体４１（４１又
は４１Ｂ）を形成するが、前述した理由により、この免
疫複合体４１が形成される割合は上記免疫複合体４０に
比較して非常に少ない。

このため、前述したと同様に、ｂ−ｆ分離は高精度で行
なわれ、このあと、酵素活性などにより標識物質３５の
測定が高感度に行なわれて正確にサンプル抗体２２、即
ち、血清中のヒトＩｇＥの量を測定することができる。

このように、上記実施例の測定方法においては、標識抗
サンプル抗体３６にＩｇＧのＦａｂフラクメント或いは
Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを用い、非標識抗サンプル
抗体３７にＦｃフラグメントを有したＩｇＧを用いてい
るので、１種の動物から２種の抗サンプル抗体を得るこ
とができるが、この実施例の方法においても上記両抗サ
ンプル抗体を異種の動物から採取してもよいこと勿論で
ある。

なお、本発明方法においては、血清中のヒトＩｇＥに限
らず、抗原抗体反応を呈する全ての生理活性物質の測定
に用いて有効である。

以上述べたように、本発明によれば、標識抗サンプル抗
体と非標識抗サンプル抗体とがサンプル抗原（抗体）と
共に反応液中に均一に分散し、非標織抗サンプル抗体が
固相担体上の固相化物質と特異的に反応するようになっ
ているので、確実に上記２種の抗サンプル抗体を有した
免疫複合体が極めて高い確率で数多く形成されて固相担
体に捕捉されてｂ−ｆ分離されることになり、このため
、少ない工程で高精度かつ高感度の測定を行なうことが
できる等の優れた効果を発揮する。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図は、従来の免疫学的測定方法の一例にお
ける反応順序を説明する図、 第６図〜第８図は、上記第１図〜第５図に示す測定方法
を簡便化した方法における反応順序を説明する図、 第９図〜第１３図は、本発明の免疫学的測定方法の一実
施例における反応順序を説明する図、第１４図は、上記
第９図〜第１３図に示す測定方法によって形成される免
疫複合体の形態図、第１５、１６図は、本発明の免疫学
的測定方法の他の実施例における反応順序を説明する図
、第１７図は、抗体分子（ＩｇＧ）の基本構造を模式化
した図、 第１８図は、上記第１５、１６図に示す測定方法によっ
て形成される免疫複合体の形態図である。 ２、２２・・・・・・・・・・・・・・・サンプル抗原
（抗体）４、２４、３４・・・・・・・・・固相担体６
、２６、３６（３６Ａ、３６Ｂ）・・・・・・・・・標
識抗サンプル抗体２３・・・・・・・・・　固相化抗体
（非標識抗サンプル抗体に特異的に反応する物質） ２７、３７・・・・・・・・・・・・非標識抗サンプル
抗体３３・・・・・・・・・Ｆｃレセプタ（非標識抗サ
ンプル抗体に特異的に反応する物質） ％３区２ ７％４１θ　　７％５ヨ ・′徳６閃 ρ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原抗体反応を利用してサンプル抗原（抗体）の
   量の測定を行なう免疫学的測定方法において、上記サン
   プル抗原（抗体）を、標識抗サンプル抗体と非標識抗サ
   ンプル抗体とに反応させ、この非標識抗サンプル抗体を
   、同抗体に特異的に反応する物質を表面に固相化した担
   体と反応させてｂ−ｆ分離を行なうようにしたことを特
   徴とする免疫学的測定方法。
2. （２）上記標識抗サンプル抗体および上記非標識抗サン
   プル抗体に、互いに異種の動物で免疫した抗体を用いて
   なることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫
   学的測定方法。
3. （３）上記標識抗サンプル抗体に、免疫抗体のＦａｂフ
   ラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの少なくとも
   いずれかを用い、上記非標識抗サンプル抗体にＦｃフラ
   グメントを有した抗体を用いてなることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の免疫学的測定方法。