CN1935841A - 抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法，分离方法是：(1)动物免疫；(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用去离子水稀释，调节pH，加氯化钠放5～6小时，离心分离，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠进行第一次盐析，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，用凝胶柱过滤，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，经反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，本发明的分离方法，工艺简单，成本低廉，所得样品质量较好。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性抗体及其分离方法，特别是涉及一种抗乙肝病毒的免疫球蛋白及其分离方法。
背景技术
乙型肝炎是一种严重的传染性疾病，全世界约有二亿乙肝病毒携带者。乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg是一组构成病毒外膜的蛋白，其重要功能之一是识别肝细胞膜上的受体，使病毒与细胞接触，然后侵入胞内进行复制。血中HbsAg阳性时，为感染乙肝病毒HBV的标志.HbsAg出现在急性或慢性肝炎和”健康”的病毒携带者身上。因此，检测乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg对疾病的诊断及治疗具有重要意义。在免疫检测方面，从特异性抗原免疫的兔，羊等动物血液中获得特异性抗体IgG，往往能激活标本中的补体系统，使补体系统结合到抗体上，从而使免疫沉淀被补体再溶解，产生假阴性结果。此外，哺乳动物的IgG还能与标本中的类风湿因子RF结合，产生凝聚，造成假阳性结果。单克隆抗体在免疫检测中起着相当重要的作用，但依靠杂交瘤细胞产生单克隆抗体已不能满足大量的需求。鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgY则克服了IgG的上述缺点，不会活化标本中的补体系统，也不与类风湿因子结合，从而可避免上述假阳性和假阴性结果给免疫检测带来的干扰。鸡卵黄免疫球蛋白IgY还具有良好的稳定性，室温下放置几个月，抗体活性仍无明显下降，冷冻及冷冻干燥对其活性也无影响，酸性条件下pH4以上时很稳定。此外，鸡蛋卵黄免疫球蛋白的生产成本低，不需要牺牲动物，适于大规模的生产。由此可见，鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgY有可能发展成为廉价的优良的免疫诊断试剂。
制备抗乙肝病毒表面抗原HbsAg的鸡卵黄免疫球蛋白IgY未见报道。有关鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备纯化技术，国内外先后有几篇专利报道，如US6207807、US6217926、CN1201693A等。其中所述的方法较为复杂，均与我们的有所不同.。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
本发明的第二个目的是提供一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，用下述方法分离制成：
(1)动物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法，由下述步骤组成：
(1)动物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
本发明分离制成的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY具有高活性、高产量、高纯度的特点，可用于免疫检测。本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的稳定性远大于传统IgG，因而便于商业运输，贮存等流通环节的操作，可以延长试剂的使用期。另外，较低的生产成本使IgY抗体做为诊断试剂推广应用。
本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY分离方法，工艺简单，成本低廉，所得样品质量较好。
本发明选择六月龄产蛋母鸡，隔离饲养，经肌肉免疫注射乙肝病毒表面抗原，以后进行适当的几次加强免疫，卵黄中产生高滴度(40000～80000)的特异性抗体，效价维持9月以上。本发明的特点在于摸索出的水稀释脱脂--两步盐析--凝胶过滤的分离方法，简单经济，分离效果好，平均一个鸡卵黄中得到65mg电泳纯的IgY。
附图说明
图1为不同抗原浓度测定的IgY竞争ELISA曲线。
图2为本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY分离技术工艺路线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集鸡蛋于4℃储存待分离；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用8倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH为5，加入氯化钠至0.15M，4℃放置5.5小时，在3500转/分下离心分离23分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为19％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为15％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
(3)竞争ELISA实验
96孔微量板用10mg/L HbsAg按50μL/孔4℃包被过夜，10g/L BSA 37℃封闭1小时，2mg/mL IgY溶液与不同浓度的HbsAg溶液等体积混合，室温下作用30分钟，然后每孔50μL加入包被板中37℃反应1小时，用洗涤液洗三次，加入相应的HRP酶标二抗，37℃反应30min，用洗涤液洗三次，每孔加50μL显色剂0.4mmol/L TMB，含3X10-3％H2O2，37℃显色反应30min，每孔加25μL2mol/L H2SO4终止反应并测定A450值。
实施例2
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集鸡蛋于4℃储存待分离；；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH为5.5，加入氯化钠至0.2M，4℃放置5小时，在3500转/分下离心分离20分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为14％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
实施例3
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集鸡蛋于4℃储存待分离；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH为4.5，加入氯化钠至0.1M，4℃放置6小时，在3500转/分下离心分离25分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
产蛋母鸡被免疫10天左右，即产生相应的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，且很快达到高峰，产生较长时间的免疫应答，效价可维持数月至一年。IgY来源丰富、产量高，在相同的免疫时间内由一只鸡所产生的鸡蛋中提取的抗体远比一只兔血清制备的抗体多，收集应答时期所产鸡蛋可分离得到大量的特异性IgY，这一方法革新了传统应用兔、羊等动物制备抗体的方法。母鸡易于饲养，费用不高，收集鸡蛋方便，无需宰杀动物，符合现代动物保护规则。
Claims (2)
1.一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，其特征是用下述方法分离制成：
(1)动物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1MHCl调节pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
2.一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法，其特征是由下述步骤组成：
(1)动物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1MHCl调节pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
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2006
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