CN112903998B - EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种EB病毒NA1‑IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，包括有酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA，使用纯化基因重组EB病毒NA1包被的微孔板和酶标抗人lgA及其它试剂制成，利用ELISA间接法原理定性检测人血清中的EB病毒NA1IgA抗体，具有灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强的优点，同时本申请结构简单、检测成本低、准确性好。

Description

EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，具体地说是一种利用间接法原理的酶联免疫法实现定性检测人血清中EB病毒核抗原1(NA1)的IgA抗体。
背景技术
EB病毒是嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病毒，主要侵犯B淋巴细胞，对人的B淋巴细胞、上皮细胞(包括腮腺管、咽以及宫颈等)和腺细胞有亲和力。目前的研究发现EB病毒感染与多种人类肿瘤如鼻咽癌、淋巴癌等相关。NA1(NuclearAntigen1)是EB病毒核抗原，所有EB病毒感染和转化的B细胞核内都可以检出这种核抗原。
现有用于EB病毒核抗原1(NA1)的IgA抗体的检测试剂存在灵敏度低、特异性差、抗干扰能力弱的缺点，时常出现试剂诊断假阴性、假阳性的困扰，这不仅困扰着诊断环节，也存在于康复环节，没有精准的诊断难以有精准的治疗，因此如何精准地筛查病例，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强的EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫测试方法。
本发明提供技术方案如下：一种EB病毒IgG抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板；
所述包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA。
本申请提供一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，包括有酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA，使用纯化基因重组EB病毒核抗原1(NA1)包被的微孔板和酶标抗人IgA及其它试剂制成，利用ELISA间接法原理定性检测人血清中的EB病毒核抗原1(NA1)的IgA抗体，具有灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强的优点，对EB病毒VCA IgA阳性、EB病毒VCA IgM阳性、EB病毒Zta IgA阳性样本具有很好特异性，对巨细胞、单纯疱疹病毒1型、Ⅱ型、肝癌、肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤疾病等疾病无明显交叉反应，干扰物质(如高脂血、高胆红素、溶血、枸橼酸钠抗凝血、EDTA-2Na抗凝血样本)不干扰本产品检测，同时本申请结构简单、检测成本低、准确性好。
作为本发明的进一步改进，所述EB病毒NA1重组抗原采用基因工程技术制备。本申请的所述EB病毒NA1重组抗原具有灵敏度高、特异性好的优点。
作为本发明的进一步改进，所述EB病毒NA1重组抗原采用以下方法制备：选择EB病毒NA1(开放读码框架BKRF1)蛋白的后237个氨基酸部分作为靶抗原，以EB病毒NA1相应的mRNA序列为模板，通过RT-PCR获得目的基因片段，然后转入pGEX-2T基因融合表达系统，经酶切测序鉴定后，将重组菌落用IPTG诱导表达，表达产物经GST亲和层析纯化，用凝血酶切去GST部分，最终得到所述EB病毒NA1重组抗原。优选EB病毒NA1 DNA序列共有714个碱基对，237个氨基酸，本申请的包被抗原具有灵敏度高、特异性好的优点。
作为本发明的进一步改进，所述EB病毒NA1重组抗原的分子量为33～35kD、纯度≥90％。本申请用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对EB病毒NA1重组包被抗原纯度与分子量进行检定，结果如图1所示，“NA1”为EB病毒NA1重组抗原经SDS-PAGE电泳鉴定：5μg时呈一条带，分子量为34kD，纯度>90％。
作为本发明的进一步改进，所述包被板上包被EB病毒NA1重组抗原的制备方法为：
(1)包被：将EB病毒NA1重组抗原用包被缓冲液稀释后，按95～105μL/孔包被到包被板的孔内，在18～28℃下温育吸附18～24小时；
(2)封闭：弃去包被液，洗板后用封闭液按145～155μL/孔在2～8℃下温育封闭18～22小时；
(3)干燥及保存：弃去封闭液，经30～37℃干燥处理4小时以上后，密封保存。
作为本发明的进一步改进，所述封闭液为含5wt％蔗糖、2wt％液体明胶、0.25wt％干酪素钠、0.1wt％ProClin300的0.07mol/L硼酸-硼砂缓冲液；
步骤(2)中，所述洗板是用10mmol/L的洗涤液按300μL/孔洗板。
包被时间的确定：
按确定的浓度配制包被液，将包被液加入到微孔板中后，分别在18-28℃下放置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26小时，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的包被时间。结果如表1所示：
表1.不同包被时间厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000031
从表1可以看出，当包被时间≥16小时后，3份阳性质控品A值都趋于平缓，说明包被抗原已达到最大吸附量；2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将包被时间定为18-24小时。
包被加液量的确定:
分别以包被液加液量为25μL/孔、50μL/孔、75μL/孔、100μL/孔、150μL/孔、200μL/孔制备包被板，在18-28℃下放置20小时，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的包被加液量。结果如表2所示：
表2.不同包被液加液量厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000032
从表2可以看出，当包被液加液量≥75μL/孔时，3份阳性质控品A值都趋于平缓，说明包被抗原已达到最大吸附量；2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将包被液加液量定为95～105μL/孔。
包被温度的确定:
将加好包被液的微孔板分别放置在冰箱(2-8℃)、室温(18-28℃)、温箱(35-37℃)进行包被，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的包被温度。结果如表3所示：
表3.不同包被温度厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000041
从表3可以看出，用室温包被的包被板，灵敏度最高；三种包被条件下，2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性都很好。根据以上分析，将包被温度定为室温(18-28℃)。
作为本发明的进一步改进，所述酶结合物为采用过碘酸钠法，利用过氧化物酶进行标记得到的酶标记抗人IgA，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，当酶标记抗人IgA浓度≥1：20000时，阳性样本的A值趋于平缓，灵敏度已达到上限，当酶标记抗人IgA浓度≤1：20000时，阴性样本的A值都小于0.15，且差异不大，显示特异性很好，综上所述，将酶标记抗人IgA的使用浓度定为1:20000，优选用广州英韦创津生物科技有限公司提供的invitrogen酶标记抗人IgA，具有灵敏度高、特异性好的优点。实验结果见表4。
表4.酶标记抗人IgA不同稀释比例厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000042
作为本发明的进一步改进，所述样品稀释液为含蛋白稳定剂和防腐剂的溶液；优选所述样品稀释液为含20wt％山羊血清、0.2wt％干酪素钠、5wt％PEG6000、4wt％蔗糖、0.1wt％ProClin300的10mmol/L、pH7.4PBS。
所述浓缩洗涤液为含有Tween-20的PBS缓冲液，优选浓缩洗涤液成分为含20wt％NaCl、0.5wt％KCl、3wt％Tween-20的0.25mol/LpH6.0～6.5PB；
所述底物A液为含过氧化脲溶液；
所述底物B液为含TMB的溶液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照液为A值小于0.12的EB病毒NA1-IgA抗体阴性人血清，来自中山市肿瘤研究所的健康人体检血样，用本试剂盒检测A值小于0.12的人血清，经60℃1小时处理后加防腐剂，置-20℃保存；
所述质控血清液为己灭活的A值范围为0.6-2.2的EB病毒NA1-lgA抗体阳性人血清，来自中山市肿瘤研究所确诊的病人血样，用本试剂盒检测A值范围为0.6-2.2的人血清，经60℃1小时处理后加防腐剂，置-20℃保存。
一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测方法，包括上述的EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
S1、加样：取包被有EB病毒NA1重组抗原的包被板，设空白对照孔，加入样品稀释液100μL孔，另设阴性对照孔及质控血清孔，分别加入阴性对照液和质控血清液各100μL孔，以及设待测样孔，加入样品稀释液100μL和5μL待测样品，混匀，覆盖封板胶后，置37℃温育30分钟；
S2、加酶结合物：用浓缩洗涤液洗板，加入酶结合物100μL/孔，覆盖封板胶后，置37℃温育30分钟；
S3、显色和终止：用浓缩洗涤液洗板，加底物A液和底物B液各50μL/孔，37℃避光显色15分钟后，加入终止液50μL孔；
S4、吸光度测定：用酶标仪选择450nm波长，以空白孔校零，测定各孔A值；
S5、结果分析和判定：通过步骤S4测定结果验证试验有效性，若符合以下条件：①空白对照A值≤0.08、②0.6<质控血清A值<2.2、③阴性对照A值<0.12，则试验有效；通过临界值判定检测结果，临界值＝质控血清平均A值×20％，当待测样品检测A值＜临界值则判定为阴性，当样本检测A值≥临界值则判定为阳性。
阴性结果代表样本中未检出EB病毒核抗原1(NA1)IgA抗体，阳性结果代表样本中检出EB病毒核抗原1(NA1)IgA抗体。
作为本发明的进一步改进，所述包被缓冲液为含0.02wt％叠氮钠的0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液，按1:500～1:1000的体积比例稀释EB病毒NA1重组抗原。
样本稀释比例的确定:用样本稀释液将5份厂内质控品从原倍开始稀释，然后倍比稀释，通过分析厂内质控品的A值来确定样品稀释液和样本的加样量。结果如表5所示：
表5.不同样品稀释液和样本加样量厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000061
从表5可以看出，当样本稀释比例为1:20时，3份阳性质控品A值最大，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，将样本稀释比例定为1:20。
酶结合物加样量的确定:
将使用浓度的酶结合物按每孔25μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL加入到微孔板中，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定酶结合物的加液量。结果如表6所示：
表6.不同酶结合物加样量厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000062
从表6可以看出，当酶结合物加样量为100μL/孔时，3份阳性质控品A值高，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。所以，将酶结合物的加样量定为100μL/孔。
底物A液和底物B液加样量的确定:
将底物A液和底物B液按每孔25μL+25μL、50μL+50μL、75μL+75μL、100μL+100μL加入到微孔板中，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定显色液的加液量。结果如表7所示：
表7.不同底物A液和底物B液加样量厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000071
从表7可以看出，当底物A液和底物B液加样量为50μL+50μL时，3份阳性质控品A值高，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。所以，将底物A液和底物B液的加样量定为50μL+50μL。
反应温度的确定:
分别在4℃、25℃、37℃、42℃进行操作，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的反应温度。结果如表8所示：
表8.不同反应温度厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000072
从表8可以看出，当反应温度为37℃时，厂内质控品的灵敏度高，同时特异性好，所以将反应温度定为37℃。
样本反应时间的确定:
加样后，分别反应5、10、20、30、40、50分钟，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的样本反应时间。结果如表9所示：
表9.不同样本反应时间厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000081
从表9可以看出，当样量反应时间≥20分钟后，3份阳性质控品A值都趋于平缓，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将样本反应时间定为30分钟。
酶结合物反应时间的确定:
加入酶结合物后，分别反应5、10、20、30、40、50分钟，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的酶结合物反应时间。结果如表10所示：
表10.不同酶结合物反应时间厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000082
从表10可以看出，当酶结合物反应时间≥20分钟后，3份阳性质控品A值都趋于平缓，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将酶结合物反应时间定为30分钟。
底物A液和底物B液反应时间的确定:
加入底物A液和底物B液后，分别反应5、10、15、20、25、30分钟，以厂内质控品ZS1#、ZS2#、ZS3#、ZSN1、ZSN2为研究材料进行实验，通过分析厂内质控品的A值来确定最佳的底物A液和底物B液反应时间。结果如表11所示：
表11.不同底物A液和底物B液反应时间厂内质控品A值
Figure BDA0002904160260000091
从表11可以看出，当底物A液和底物B液反应时间≥10分钟后，3份阳性质控品A值都趋于平缓，同时2份阴性质控品A值都小于0.15，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将底物A液和底物B液的反应时间定为15分钟。
作为本发明的进一步改进，空白对照孔、阴性对照孔及质控血清孔各设置有2孔；
所述浓缩洗涤液需先用蒸馏水或去离子水作1：25稀释；
洗板具体包括以下操作：用浓缩洗涤液洗板5次，每次静置1分钟，拍干。
用酶标仪读结果时，应以空白孔校零。
测试样本类型为血清。
为确保结果准确，反应终止后应在5～10分钟内判断结果。
本申请的检测原理：先通过将EB病毒NA1重组抗原包被在包被板，检测时，将待测血清在板孔内温育，如存在特异性EB病毒核抗原1(NA1)抗体，将与固相EB病毒NA1重组抗原相结合，通过洗涤移去未结合的成份，再加入酶标抗人lgA，在板孔内温育，固相特异性的抗原-抗体复合物中IgA成份与酶标抗体相结合，再通过洗涤移去未结合的成分，加入底物(TMB)在板孔内温育，固相复合物中的酶(HRP)与底物反应后产生颜色(蓝色)，加入硫酸终止反应后(颜色由蓝色变为黄色)，用酶标仪在450nm波长测吸光度(A)值，从而定性判定样本中的EB病毒NA1-IgA抗体的存在与否，以判断是否EB病毒感染。
同时本申请设置有对照组，将空白对照组、阴性对照液和质检血清液与待测血液样本一同进行吸光度测定以验证试验的有效性，若①空白对照A值≤0.08、②0.6<质控血清A值<2.2、③阴性对照A值<0.12，则试验成立，进一步提高检测的准确性。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本申请提供一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，包括有酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA，使用纯化基因重组EB病毒核抗原1(NA1)包被的微孔板和酶标抗人IgA及其它试剂制成，利用ELISA间接法原理定性检测人血清中的EB病毒核抗原1(NA1)的IgA抗体，具有灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强的优点，对EB病毒VCA IgA阳性、EB病毒VCA IgM阳性、EB病毒Zta IgA阳性样本具有很好特异，对巨细胞、单纯疱疹病毒I型、Ⅱ型、肝癌、肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤疾病等疾病无明显交叉反应，干扰物质(如高脂血、高胆红素、溶血、枸橼酸钠抗凝血、EDTA-2Na抗凝血样本)不干扰本产品检测，同时本申请结构简单、检测成本低、准确性好。
本发明一种EB病毒NA1-IgG抗体酶联免疫检测方法，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，利用间接法原理的酶联免疫法实现定性检测人血清中EB病毒核抗原1(NA1)的IgA抗体，步骤简便，设计合理，适合推广。
附图说明
图1是本发明EB病毒NA1重组包被抗原纯度与分子量鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式说明本发明的具体技术方案。
实施例1、一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，所述包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，所述酶结合物为按工作浓度1:20000配制辣根过氧化物酶标记的抗人IgA。
所述包被板上包被EB病毒NA1重组抗原的制备方法为：
(1)包被：将EB病毒NA1重组抗原用包被缓冲液稀释后，按100μL/孔包被到包被板的孔内，在25℃下温育吸附20小时；
(2)封闭：弃去包被液，洗板后用封闭液按150μL/孔在8℃下温育封闭18小时；
(3)干燥及保存：弃去封闭液，经37℃干燥处理4小时以上后，密封保存。
所述样品稀释液为含蛋白稳定剂和防腐剂的溶液；
所述浓缩洗涤液为含有Tween-20的PBS缓冲液；
所述底物A液为含过氧化脲溶液；
所述底物B液为含TMB的溶液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照液为A值小于0.12的EB病毒NA1-IgA抗体阴性人血清；
所述质控血清液为己灭活的A值范围为0.6-2.2的EB病毒NA1-lgA抗体阳性人血清。
实施例2、一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，所述包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，所述酶结合物为按工作浓度1:20000配制辣根过氧化物酶标记的抗人IgA。
所述包被板上包被EB病毒NA1重组抗原的制备方法为：
(1)包被：将EB病毒NA1重组抗原用包被缓冲液稀释后，按95μL/孔包被到包被板的孔内，在28℃下温育吸附18小时；
(2)封闭：弃去包被液，洗板后用封闭液按155μL/孔在2℃下温育封闭22小时；
(3)干燥及保存：弃去封闭液，经30℃干燥处理4小时以上后，密封保存。
所述样品稀释液为含蛋白稳定剂和防腐剂的溶液；
所述浓缩洗涤液为含有Tween-20的PBS缓冲液；
所述底物A液为含过氧化脲溶液；
所述底物B液为含TMB的溶液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照液为A值小于0.12的EB病毒NA1-IgA抗体阴性人血清；
所述质控血清液为己灭活的A值范围为0.6-2.2的EB病毒NA1-lgA抗体阳性人血清。
实施例3、一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板，所述包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原，所述酶结合物为按工作浓度1:20000配制辣根过氧化物酶标记的抗人IgA。
所述包被板上包被EB病毒NA1重组抗原的制备方法为：
(1)包被：将EB病毒NA1重组抗原用包被缓冲液稀释后，按105μL/孔包被到包被板的孔内，在23℃下温育吸附24小时；
(2)封闭：弃去包被液，洗板后用封闭液按145μL/孔在4℃下温育封闭20小时；
(3)干燥及保存：弃去封闭液，经35℃干燥处理4小时以上后，密封保存。
所述样品稀释液为含蛋白稳定剂和防腐剂的溶液；
所述浓缩洗涤液为含有Tween-20的PBS缓冲液；
所述底物A液为含过氧化脲溶液；
所述底物B液为含TMB的溶液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照液为A值小于0.12的EB病毒NA1-IgA抗体阴性人血清；
所述质控血清液为己灭活的A值范围为0.6-2.2的EB病毒NA1-IgA抗体阳性人血清。
对上述实施例1-3所制备的试剂盒进行临床测试试验
检测步骤为：
S1、加样：取包被有EB病毒NA1重组抗原的包被板，设空白对照2孔，加入样品稀释液100μL孔，另设阴性对照孔及质控血清孔各2孔，分别加入阴性对照液和质控血清液各100μL孔，以及设待测样孔，加入样品稀释液100μL和5μL待测样品，混匀，覆盖封板胶后，置37℃温育30分钟；
S2、加酶结合物：用浓缩洗涤液洗板5次，每次静置1分钟，拍干，加入酶结合物100μL/孔，覆盖封板胶后，置37℃温育30分钟；
S3、显色和终止：用浓缩洗涤液洗板5次，每次静置1分钟，拍干，加底物A液和底物B液各50μL/孔，37℃避光显色15分钟后，加入终止液50μL孔；
S4、吸光度测定：用酶标仪选择450nm波长，以空白孔校零，测定各孔A值；
S5、结果分析和判定：通过步骤S4测定结果验证试验有效性，若符合以下条件：①空白对照A值≤0.08、②0.6<质控血清A值<2.2、③阴性对照A值<0.12，则试验有效；通过临界值判定检测结果，临界值＝质控血清平均A值×20％，当待测样品检测A值＜临界值则判定为阴性，当样本检测A值≥临界值则判定为阳性。
测试仪器为：
ThermoLabsystemsMultskanMk3酶标仪；
ThermoWELLWASH4MK2洗板机；
PYX-DHS-40×50-B隔水式电热恒温培养箱。
测试试验包括以下项目：
(1)准确性：
测试样本：15份阳性厂内质控品、15份阴性厂内质控品。
测试方法：取实施例1-3制备的EB病毒NA1-IgA抗体诊断试剂盒，分别对测试样本进行准确性测试，判断测试样本为阴性或阳性，测试结果如表12所示：
表12.实施例1-3准确性测试结果
Figure BDA0002904160260000131
Figure BDA0002904160260000141
由表12检测结果可知，阳性参考品符合率均为15/15、阴性符合率均为15/15。本申请的试剂盒具有很好的准确性。
(2)特异性检测：
a.EBV其它检测指标交叉反应
测试样本：EB病毒VCAIgA阳性、EB病毒VCAIgM阳性、EB病毒ZtaIgA阳性样本。
测试方法：在EB病毒VCAIgA阳性、EB病毒VCAIgM阳性、EB病毒ZtaIgA阳性样本中加入过量的EB病毒NA1抗原，使其中和可能存在的EB病毒NA1IgA抗体。然后进行以下检测，结果如下表13所示：
表13.各样本检测结果
Figure BDA0002904160260000142
将上述加入过量EB NA1抗原的样本用本申请实施例1-3制备的试剂盒进行检测，通过统计分析实验结果，考核本试剂盒的特异性，测试结果如表14所示：
表14.交叉反应测试结果
Figure BDA0002904160260000143
Figure BDA0002904160260000151
以上结果表明：EB病毒NA1-IgA试剂盒对EB病毒VCA IgA阳性、EB病毒VCA IgM阳性、EB病毒Zta IgA阳性样本的特异性均100％，所以EB病毒VCA IgA阳性、EB病毒VCA IgM阳性、EB病毒Zta IgA阳性的样本对本试剂盒的检测结果不会产生影响。
b.其它相关疾病交叉反应
测试方法：使用EB病毒荧光定量PCR检测为阴性的巨细胞、单纯疱疹病毒1型，Ⅱ型、肝癌、肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤样本，按照检测方法进行检测，考核实施例1-3试剂盒的特异性，测试结果如表15所示：
表15.实施例1-3特异性测试结果
Figure BDA0002904160260000152
Figure BDA0002904160260000161
以上结果表明：EB病毒NA1-IgA试剂盒对巨细胞、单纯疱疹病毒1型，Ⅱ型、肝癌、肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤疾病的特异性均近似健康人体检的特异性，即本试剂盒对以上疾病无明显交叉反应。
(3)抗干扰实验：
测试干扰样本：取5份厂内质控品各0.1mL，分别加入5μL的甘油三酯，体积百分比(V/V)为5％表示血清中甘油三酯的含量为21.54mmol/L；
取5份厂内质控品各0.1mL，分别加入6μL的胆红素溶液(5mg/mL)，体积百分比(V/V)为6％表示血清中胆红素溶液的含量为818μmol/L；
取5份厂内质控品各0.5mL，分别加入9mg的血红蛋白，使血清中血红蛋白的含量为18mg/mL；
取5份厂内质控品各0.5mL，分别按1:9加入3％枸橼酸钠溶液；
取5份厂内质控品各0.5mL，分别按0.4:5加入1.5％EDTA-2Na溶液。
测试方法：使用实施例1-3试剂盒按检测方法对以上加入了不同浓度干扰物质的样本进行检测，检测试剂盒在干扰物质(高脂血、高胆红素、溶血、枸橼酸钠抗凝血、EDTA-2Na抗凝血)存在的情况下检测样本的准确性，测试结果如表16、表17和表18所示。
表16.实施例1试剂盒抗干扰实验结果
Figure BDA0002904160260000162
Figure BDA0002904160260000171
表17.实施例2试剂盒抗干扰实验结果
Figure BDA0002904160260000172
表18.实施例3试剂盒抗干扰实验结果
Figure BDA0002904160260000173
由以上结果表明：高脂血、高胆红素、溶血、枸橼酸钠抗凝血、EDTA-2Na抗凝血样本对实施例1-3制备EB病毒NA1-IgA试剂盒的检测结果无明显影响。
综上所述，本申请对实施例1-3制备的EB病毒NA1-IgA抗体诊断试剂盒进行分析性能检测，通过研究试验结果可以看出，试剂盒的最低检测限符合要求，准确性、精密性好，阳性符合率和阴性符合率均符合要求，常见的干扰物质和交叉疾病均对检测结果没有影响，各项指标均能达到产品质量标准，具有高特异性、准确性强的特点。

Claims (4)

1.一种EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：包括酶结合物、样品稀释液、阴性对照液、质控血清液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩洗涤液，以及包被板；
所述包被板上包被有EB病毒NA1重组抗原；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA；
所述酶结合物为采用过碘酸钠法，利用过氧化物酶进行标记得到的酶标记抗人IgA，所述酶标记抗人IgA的使用浓度定为1:20000；
所述EB病毒NA1重组抗原采用以下方法制备：选择EB病毒NA1蛋白的后237个氨基酸部分作为靶抗原，以EB病毒NA1相应的mRNA序列为模板，通过RT-PCR获得目的基因片段，然后转入pGEX-2T基因融合表达系统，经酶切测序鉴定后，将重组菌落用IPTG诱导表达，表达产物经GST亲和层析纯化，用凝血酶切去GST部分，最终得到所述EB病毒NA1重组抗原；
所述包被板上包被EB病毒NA1重组抗原的制备方法为：
（1）包被：将EB病毒NA1重组抗原用包被缓冲液稀释后，按95～105μL/孔包被到包被板的孔内，在18～28℃下温育吸附18～24小时；
（2）封闭：弃去包被液，洗板后用封闭液按145～155μL/孔在2～8℃下温育封闭18～22小时；
（3）干燥及保存：弃去封闭液，经30～37℃干燥处理4小时以上后，密封保存。
2.根据权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述EB病毒NA1重组抗原的分子量为33～35kD、纯度≥90%。
3.根据权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含5wt%蔗糖、2wt%液体明胶、0.25wt%干酪素钠、0.1wt%ProClin300的0.07mol/L硼酸-硼砂缓冲液；
步骤（2）中，所述洗板是用10mmol/L的浓缩洗涤液按300μL/孔洗板。
4.根据权利要求1所述的EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含蛋白稳定剂和防腐剂的溶液；
所述浓缩洗涤液为含有Tween-20的PBS缓冲液；
所述底物A液为含过氧化脲溶液；
所述底物B液为含TMB的溶液；
所述终止液为1molL硫酸溶液；
所述阴性对照液为A值小于0.12的EB病毒NA1-IgA抗体阴性人血清；
所述质控血清液为己灭活的A值范围为0.6-2.2的EB病毒NA1-lgA抗体阳性人血清。
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