CN109521004A - 用于检测胶质纤维酸性蛋白(gfap)的磁微粒分离化学发光免疫测定法 - Google Patents

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郭健夫
桂颖
袁方
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence

Abstract

本发明公开了一种人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂A、试剂B、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成；试剂A为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；试剂B为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(ALP)催化的发光底物溶液。本发明极大地提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

Description

用于检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微粒分离化学发光免 疫测定法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，提供了用于检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁分离化学发光免疫测定法，适用于人血清胶质纤维酸性蛋白(GFAP)定量检测。
背景技术
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经系统星形胶质细胞(AS)胞质内特异性酸性蛋白。近年来，众多研究发现，血清及脑脊液GFAP水平在神经系统疾病的诊断、治疗及预后方面有重要的指导意义，越来越引起人们的重视。
1.GFAP概述
人类GFAP基因定位于第17号染色体长臂2区2带(17q21)，有8个内含子和9外显子，与小鼠、大鼠基因编码区有高度同源性。GFAP最初是由Eng从成熟的AS中分离出来，是一种单体中间丝蛋白，几乎唯一存在于AS内，在AS中有丰富的表达，形成AS重要的骨架蛋白，可以作为脑部的特异性物质。GFAP相对分子质量为(50～52)×103，等电位点在5.7～5.8。GFAP单体聚合形成聚合体，属细胞质内中间丝(IFs)的一种成分，与波形蛋白、结蛋白、外周蛋白同属IFs超家族第Ⅲ型，它们之间有70％以上的同源性。GFAP在人脑中最早出现于胚胎发育的第8周，以后逐渐表达于胶质细胞中。胚胎神经增殖早期AS前体的胶质丝一般以波形蛋白为主，到了妊娠晚期胶质丝发生转变，波形蛋白等就由GFAP所取代，在AS成熟时波形蛋白的表达水平降低，呈动态变化，随之GFAP表达增加，并通过分化中的AS进行表达。
2.GFAP的生理作用及检测技术
GFAP被认为是AS特有的标志物，其在维持AS形态和功能上都有作用。它在细胞核和细胞膜之间形成连接，参与细胞内细胞骨架重组、细胞黏附、维持脑内髓鞘形成和神经元的结构，以及作为细胞信号转导通路等。GFAP可能还为一些能识别关键性底物的激酶提供引入位点，这些底物能使GFAP与微丝、整合蛋白受体及细胞外基质形成一个动力学统一体。GFAP作为AS活化的一个重要特征，其表达的高低可反映AS的功能状态。
目前检测GFAP的技术有半定量的免疫印迹、免疫组织化学法、定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)、质谱法、基于荧光的多重技术等。这些检测方法主要源于众多研究的实验报道，但是这些方法取得临床资格仍需要多次印证，并具有可重复性。
3.GFAP在中枢神经系统疾病的临床意义
3.1脑外伤
血清GFAP在外伤性颅脑损伤(TBI)中升高，对TBI的早期诊断、鉴别诊断和判断预后有重要的意义。Di-az-Arrastia等研究报道，GFAP在检测TBI中有较好的灵敏度和特异度，受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.88。Vos等提出GFAP和S100β可以作为诊断TBI的依据，并且GFAP和S100β在血液中的浓度可以作为预测临床预后的一个指标；此外，在比较死亡病例和存活病例中发现，死亡病例血GFAP的中位浓度水平是存活者的33.4倍；同样比较了较差预后和较好预后的病例，较差预后者血GFAP浓度是较好预后者的19.8倍。Honda研究表明，早期血清GFAP水平预测值要高于S100β。Petzold提出在早期神经损伤时S100β可以在多个组织中有表达，而GFAP则不会出现。
3.2脑卒中
脑卒中严重威胁着人类健康及生活质量，然而至今对于这种疾病的治疗和干预仍然十分有限。脑卒中早期、快速、准确的诊断，对其治疗和预后有着积极的意义。GFAP作为反映脑部损伤的新型标志物被广泛地研究。魏素平等研究发现，急性缺血性脑卒中患者的血浆GFAP水平明显高于健康对照，且与患者的脑梗死体积间有明显相关性，GFAP水平越高，患者的神经缺损程度越高。通过测定血浆GFAP水平能够反映急性缺血性脑卒中患者中枢神经细胞的损伤和死亡情况，且能提供判断脑梗死范围大小的定量信息及预后。Wunderlich等同样表明GFAP水平与脑梗死面积有关，且脑梗死血栓溶解再通后，GFAP水平的增加量减少。Sun等对GFAP水平在急性脑卒中的鉴别诊断进行了Meta分析，得出血清GFAP诊断急性脑卒中的特异度和阳性似然比分别为97.0％和24.97，在发病出现临床症状前6h内即可升高，GFAP的升高可以及时地提示临床并对患者采取积极治疗。3.3其他神经系统疾病
在阿尔兹海默病(AD)中AS增生是一个非常突出的中枢神经病理变化，众多研究报道AD患者瓜氨酸化或氧化的GFAP升高。而且AD脑脊液中的GFAP水平与年龄呈正相关。亚历山大病是一种由于星型胶质细胞功能异常导致的脑白质营养不良性疾病，属于中枢神经系统退行性病变。Bren-ner等提出亚历山大病的发生与GFAP基因突变有关。由于GFAP基因突变导致GFAP装配发生改变，GFAP聚集并在细胞内发生病理性沉积。
因此，无论是血液还是脑脊液中GFAP浓度测定用于多种神经系统疾病的诊断，病情轻重的估计、治疗监测和预后判断都有着重要的意义。目前对GFAP的研究非常活跃，随着研究的不断深入，GFAP检测技术的不断提高和完善，其作用机制将进一步研究阐明，新的检测方法也将应用于临床，GFAP将有望成为神经系统疾病的新指标。
目前已知的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测方法主要有RIA(radioimmunoassay放射免疫测定法)法、均相酶免疫检测法、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法(GC-MS)。但是，这些方法都存在一定的缺陷，RIA法污染大、ELISA法自动化程度低且操作复杂繁琐，高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法不适合广泛用于临床检测。
因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的快速定量检测方法。
发明内容
本发明旨在开发一种灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的快速定量检测方法。
基于上述目的，本发明提供一种人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂A、试剂B、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成；试剂A为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；试剂B为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(ALP)催化的发光底物溶液；检测方法包括：
(1)免疫反应：将待测样品与质控品、50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液150μl，碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)算出含量：将待测样本的发光强度与校准品的标准曲线比对，使用四参数Logistic方程拟合可计算出待测样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量。
另一方案，所述人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述试剂A的配置方法包括：将表面含有羧基(COOH-)活性基团的磁微粒进行磁分离，然后用活化缓冲液清洗3次；混悬后加入活化剂，活化后的磁微粒溶液与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体按比例混合，使得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体被共价偶联在磁微粒表面。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述活化缓冲液为摩尔浓度0.05M的(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)MES，pH6.0，所述活化剂为1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述比例为20：1。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述试剂B的配置方法包括：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、碱性磷酸酶(ALP)分别加入活化剂，除盐；活化后的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、碱性磷酸酶(ALP)按比例混合；分离纯化，除去未连接的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和碱性磷酸酶(ALP)，将连接物保存于4℃。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体加入的活化剂为2-Iminothiolanehydrochloride(2-IT)，碱性磷酸酶(ALP)加入的活化剂为Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述比例为1：1。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述除盐为使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，所述分离纯化为使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，建立标准曲线的方法包括：
(1)免疫反应：将不同浓度的50μl的校准品分别与质控品、50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液150μl，碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的数值使用四参数Logistic方程拟合，获得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)浓度-发光值标准曲线。
另一方案，人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，校准品的系列浓度分别为0ng/ml，0.8ng/ml，2.5ng/ml，9.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml。
上述步骤表明，本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
附图说明
图1为本发明人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法流程图。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种具有检测范围宽、灵敏度高、操作简便的检测人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)管式磁微粒分离化学发光免疫检测方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法原理如下：
本发明为双抗体夹心法，应用磁微粒分离技术与化学发光免疫分析系统相结合定量检测血清样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量。如图1所示，反应的技术原理为：磁微粒连接的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体与碱性磷酸酶(ALP)(AP)标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体同待测样本或校准品或质控品中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)发生免疫反应，结合形成“三明治”结构的复合物。随后在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质磁分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。发光强度与样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的浓度成正比，使用四参数Logistic方程拟合可计算出样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量。
测定人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的组成
本发明生成的人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫测定的试剂盒组成包括：1、校准品(含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线)；2、质控品(含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成)；3、试剂A(含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液)；4、试剂B(含一定浓度碱性磷酸酶(ALP)标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液)；5、清洗液浓缩液(用于配制清洗液)；6、底物溶液(酶催化的发光底物)。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但并不限定本发明。
试剂
本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。本发明中所用标记碱性磷酸酶单克隆抗体为Meridian公司生产，货号为M86425M；标记磁微粒单克隆抗体为Meridian公司生产，货号为MAM27-719；抗原为HyTest公司生产，货号为：8GF23；碱性磷酸酶购自英国BBI公司，货号为：ALPI12G；SMCC购自Thermofisher scientific公司，货号为：22360；2-IT购自Thermo fisher scientific公司，CAS：4781-83-3；货号为:26101；羧基修饰微粒购自Thermo fisher scientific公司；EDC购自SIMGA公司，CAS：25952-53-8，货号：E7750。发光底物、清洗浓缩液均来自北京利德曼生化股份有限公司成品试剂盒。
实施例1：磁微粒标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体
取20mg羧基修饰微粒溶液，将具有超顺磁性，粒径均匀，表面含有羧基(COOH-)活性基团的磁微粒在磁场作用下沉降(磁分离)10分钟，去上清，沉降的磁微粒用活化缓冲液摩尔浓度0.05M的(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)MES，pH6.0缓冲液清洗3次，每次用量2ml。
将洗涤后磁微粒用1.0ml活化缓冲液摩尔浓度0.05M的(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)MES，pH6.0的缓冲液充分混悬后加入活化剂1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)，室温混悬反应30分钟，EDC反应摩尔浓度为7.5mM。
取1.0mg的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体，浓缩至2.5mg/mL。
将浓缩至2.5mg/mL的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体按1.0mg的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体加入20mg活化后的磁微粒溶液混合，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应6.5小时，使得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体被共价偶联在磁微粒表面，制得试剂A。
实施例2：碱性磷酸酶(ALP)标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体
取1.0mg的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为13.76mg/mL的活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT)溶液5μL，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗体。
取1.2mg碱性磷酸酶(ALP)，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为6.69mg/mL的活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)溶液12μL，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶(ALP)。
将活化后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体与碱性磷酸酶(ALP)按1.0mg的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体加入1.0mg碱性磷酸酶(ALP)的比例混合，放置4℃下反应18小时。
使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和碱性磷酸酶(ALP)，将连接物保存于4℃，制得试剂B。
实施例3：人体Tau蛋白(TAU)磁微粒分离化学发光免疫检测方法
(1)免疫反应：将实施例1的50μl的校准品系列(浓度分别为0，0.8，2.5，9.5，25，50ng/ml)分别与质控品、实施例1的50μl试剂A、实施例2的50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液150μl，碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的数值使用四参数Logistic方程拟合，获得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)浓度-发光值标准曲线。
(5)将50μl的待测样品与实施例1的50μl试剂A、实施例2的50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(6)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(7)读值：加入发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(8)将待测样本的发光强度与步骤(4)的标准曲线比对，使用四参数Logistic方程拟合可计算出待测样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量。
实施例4：试剂盒性能测试
检测本试剂盒的灵敏度、线性范围、准确性、精密度。具体操作步骤如下：
一、试剂准备：
实验前，先取出试剂A(磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液)、试剂B(碱性磷酸酶(ALP)标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液)、校准品、发光底物。
二、仪器准备：
本试剂盒适用于北京利德曼生化股份有限公司CI1000、CI2000全自动化学发光免疫分析仪、英国IDS型化学发光免疫分析仪。
三、操作步骤：
1、剂量-反应曲线线性：用试剂盒最高浓度点校准品(F点)用该项目校准品稀释液倍比稀释到接近该项目分析灵敏度，形成若干浓度点样本。试剂盒定标后测试梯度样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)。
合格标准：1.0-200ng/ml内，r>0.9900。
2、准确度：新配制并检验合格的试剂(包括STD，R1，R2，M)放入37℃温箱共放置7天(可超过7天)。若干天取出试剂，定标后(用4℃保存合格校准品)检测试剂准确性，质控偏差小于20％。
合格标准：校准品降幅小于10％，试剂盒降幅小于50％，准确度符合要求。
3、最低检测限：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度(RLU)值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD(正反应)或M-2SD(负反应)的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
4、精密度：分析方法(分析内)：用高、低两个水平浓度的质控血清或新鲜人血清检测试剂，重复测试10次，按以下公式计算测定结果的均值和变异系数(CV)。
式中：Xi──待测血清样本的测定结果；──待测血清样本的均值；n──测定次数，此处为10。
分析方法(分析间)：分三次实验，用高、低两个水平浓度的质控血清或新鲜人血清检测试剂，重复测试10次，每一样本均得到30个结果，按以下公式计算测定结果的均值(X)和变异系数(CV)。
式中：Xi──待测血清样本的测定结果；──待测血清样本的均值；n──测定次数，此处为30。
合格标准：分析内：不大于10％；分析间：不大于15％。
5、特异性:按试剂盒产品标准要求，配制一定浓度的交叉反应物作为样本用试剂盒进行检测，检测结果与样本配制浓度的比值(％)即为对该样本的交叉反应率。
合格标准：＜1.0％。
性能指标检测结果：
1、剂量-反应曲线线性：使用四参数Logistic方程拟合，在0.5-500ng/mL范围内，剂量-反应曲线相关系数r≥0.99。
2、准确度：通过稀释回收评价其准确度，所得结果稀释回收率在85％-115％之间。
3、最低检测限：＜0.05ng/mL。
4、精密度：分析内≤8％,分析间≤10％。
5、特异性:交叉率均小于0.1％。
上述步骤表明，本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
本发明提供的人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂A、试剂B、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成；试剂A为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；试剂B为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(ALP)催化的发光底物溶液；检测方法包括：
(1)免疫反应：将待测样品与质控品、50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液150μl，碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)算出含量：将待测样本的发光强度与校准品的标准曲线比对，使用四参数Logistic方程拟合可计算出待测样本中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量。
2.根据权利要求1所述人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述试剂A的配置方法包括：将表面含有羧基(COOH-)活性基团的磁微粒进行磁分离，然后用活化缓冲液清洗3次；混悬后加入活化剂，活化后的磁微粒溶液与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体按比例混合，使得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体被共价偶联在磁微粒表面。
3.根据权利要求2人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述活化缓冲液为摩尔浓度0.05M的(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)MES，pH6.0，所述活化剂为1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)。
4.根据权利要求2人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述比例为20：1。
5.根据权利要求1人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述试剂B的配置方法包括：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、碱性磷酸酶(ALP)分别加入活化剂，除盐；活化后的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、碱性磷酸酶(ALP)按比例混合；分离纯化，除去未连接的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和碱性磷酸酶(ALP)，将连接物保存于4℃。
6.根据权利要求5人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体加入的活化剂为2-Iminothiolanehydrochloride(2-IT)，碱性磷酸酶(ALP)加入的活化剂为Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)。
7.根据权利要求5人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述比例为1：1。
8.根据权利要求5人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述除盐为使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，所述分离纯化为使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化。
9.根据权利要求1人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，建立标准曲线的方法包括：
(1)免疫反应：将不同浓度的50μl的校准品分别与质控品、50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液150μl，碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的数值使用四参数Logistic方程拟合，获得胶质纤维酸性蛋白(GFAP)浓度-发光值标准曲线。
10.根据权利要求9人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法，其特征在于，校准品的系列浓度分别为0ng/ml，0.8ng/ml，2.5ng/ml，9.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml。
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