CN105372426A - 胃蛋白酶原ii（pgii）定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明还公开了该试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法。本发明以异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物APLS为底物，提高了试剂盒的灵敏度和特异性性能。本发明的检测试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使用。

Description

胃蛋白酶原II（PGII）定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法

技术领域

本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中胃蛋白酶原II(PGII)的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测血液中胃蛋白酶原II(PGII)的方法。

背景技术

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。

通常情况下，约有1％的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，进入血液循环的PG在血液中非常稳定；血清PGI和PGII反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能；当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变；因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。

血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，联合测定PGI和PGII比值可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。

在国内，胃蛋白酶原II(PGII)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产胃蛋白酶原II(PGII)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。

因此，有待开发对胃蛋白酶原II(PGII)检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新的可定量检测胃蛋白酶原II(PGII)的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一方面，本发明提供了一种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。

其中：

一、胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)质控品的配制方法如下：

用标准品缓冲液溶解胃蛋白酶原II(PGII)，配置胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)校准品，其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；

二、抗试剂的制备方法如下：

(1)、抗试剂缓冲液的制备：

Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；

(2)、异硫氰酸荧光素与胃蛋白酶原II(PGII)的偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体：

首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，来调整浓度，然后按照胃蛋白酶原II(PGII)抗体与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体；紫外监测，记录仪记录纯化图谱，同时注意确认含有连接物的试管，注意、避光防护。

(3)、碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II(PGII)抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体：

首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可以根据分光光度计在280nm处读取吸光值，将碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的范围内。然后按照碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II(PGII)的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体；注意含有连接物的试管的避光防护。

(4)、将步骤(2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体和和步骤(3)中获得的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体，加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液充，分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。

三、磁微粒试剂的制备：

将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。

(1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2～5倍于反应瓶中羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，混匀20-30min。再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；所述磁微粒缓冲液的配置方法是：Tris：12.12mg，氯化钠5.82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；

(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1的比例，在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，2～8℃内保持混匀状态反应18小时；

(3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲液清洗3遍，然后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。

四、发光底物的制备

将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物。

用4～10倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS，所述发光底物缓冲液的配置方法是：Tris12.12g～121.14g，氯化钠5.82g，光泽精0.03g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5。

进一步的，本发明的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒还包括清洗液。该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应后的样品，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween20和ProcLin300的混合溶液，在试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配置方法是：Tris12.12g，氯化钠5.82g，Tween-2050mL，曲拉通-100，50mL，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。

另一方面，本发明提供了这种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤。

分别配制胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到胃蛋白酶原II(PGII)的定量测定试剂盒。

本试剂盒的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体为能与人体内胃蛋白酶原II(PGII)抗原特异结合的单克隆抗体，所述碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体为能与胃蛋白酶原II(PGII)抗原特异结合的单克隆抗体。包被抗体和标记抗体除能与胃蛋白酶原II(PGII)抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。

再一方面，本发明提供了利用这种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法，该方法包括步骤：

(1)取三支试管分别加15μL胃蛋白酶原II(PGII)的校准品、15μL胃蛋白酶原II(PGII)的质控品、15μL待测样本；

(2)每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴15分钟；

(3)每一试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5分钟；

(4)将三支试管在磁分离器上沉淀2分钟，缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)每一试管中加入200μL发光底物溶液，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。

本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、一些必要的缓冲液等)、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，例如，在检测前，可将各试剂放至室温(18～25℃)，加样前充分混匀；所用检测仪器设备例如化学发光类测定仪的使用按照说明书操作进行；

本发明中，未特别注明单位的比例与含量，固体组分为质量比例与含量，液体组分为体积比例与含量；

本发明的有益效果是：

本发明的胃蛋白酶原II(PGII)定量检测试剂盒(磁微粒分离化学发光法)各试剂组分包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，具有以下有益效果；

1、本发明以碱性磷酸酶(AP)为标记酶，通过化学反应标记抗体，并使用凝胶层析分离纯化，提高了反应的灵敏度；

2、本发明以抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度；

3、本发明以APLS为底物，该底物是辉光性底物，灵敏度高，可以快速达到平台期，平台稳定期长且信号较强，有利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度和特异性性能；并进一步优化了化学发光增强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小；

4、本试剂盒稳定性良好，有效期可至一年以上。

5、本试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达95％以上，且费用仅为其1/5。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1是胃蛋白酶原II(PGII)的标准曲线；

图2是胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒与进口检测试剂的检测效果相关性曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说为了更清楚地理解本发明，参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各仪器设备也是所属领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1：

各种缓冲液的配置，具体如下：

1、Tris盐pH8.0缓冲液

Tris：12.12g，氯化钠5.82g,加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调整最终pH为7.5。

2、校准品缓冲液的制备

在1L新生牛血清中加入0.01g四环素和0.1g硫酸新霉素，充分溶解后经过0.22μm滤膜处理获得。

3、抗试剂缓冲液

Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；

4、磁微粒缓冲液

Tris：12.12mg，氯化钠5.82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。

5、发光底物缓冲液

Tris12.12g～121.14g，氯化钠5.82g，光泽精0.03g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5；

6、清洗液的浓缩液的配置

Tris12.12g，氯化钠5.82g，Tween-2050mL，曲拉通-100，50mL，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。

实施例2：胃蛋白酶原II(PGII)的定量测定试剂盒的制备

1、校准品和质控品的制备

首先：用标准品缓冲液溶解胃蛋白酶原II(PGII)，配置成如表1所示的目标浓度的校准品和质控品；本实施例所用的胃蛋白酶原II(PGII)采购自国内外知名厂家fitzgerald公司。

表1：校准品和质控品的制备

2、抗试剂的制备方法如下：

(1)、异硫氰酸荧光素与胃蛋白酶原II(PGII)抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体：

首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为2.5mg/mL异硫氰酸荧光素溶液，按照胃蛋白酶原II(PGII)与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中，，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体；

(2)、碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II(PGII)抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体：

首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II(PGII)的摩尔比为1:2的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体；紫外监测，记录仪记录纯化图谱，注意、避光防护。

(3)、将步骤(1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体和和步骤(2)中获得的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体，加入含有0.1％Tween20的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；

3、磁微粒试剂的制备：

将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基偶联制得磁微粒试剂。

(1)、取10mL的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入5倍于反应瓶中羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；

(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1的比例，，在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；

(3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液清洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。

4、发光底物的制备

用7倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS。

5、将胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到胃蛋白酶原II(PGII)的定量测定试剂盒。

实施例3：用胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的步骤

利用这种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法，该方法包括步骤：

(1)取三支试管分别加30μL胃蛋白酶原II(PGII)的校准品、30μL胃蛋白酶原II(PGII)的质控品、30μL待测样本；

(2)每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴15分钟；

(3)每一试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5分钟；

(4)将试管在磁分离器上沉淀2分钟，缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)每一试管中加入200μL发光底物溶液，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度；

(8)数据的处理：

通过四参数非线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线的四参数Logistic方程：Y＝131888.6225+(3072197.7258-131888.6225)/(1+(X/24.7611)＾-1.4902(R＝0.999957)，标准曲线如图1所示，其中，横轴代表校准品的浓度值，纵轴代表发光值。

临床数据：

1、为了评价本发明的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒的稳定性和准确性，每隔2个月对本实施例的试剂盒性能进行测定。测试结果如表2所示，由表2可以看出：胃蛋白酶原II(PGII)与发光值的相关性连续15个月保持在0.99以上，本发明的试剂盒的最低检测限和准确度的相对偏差以及每批次的质控品的变异系数也符合国家标准。表2的数据表明本发明的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒的有较好的稳定性和准确性。

表2：本实施例的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒分析性能和稳定性表。

2、胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒与进口检测试剂的检测效果的比较

选取240份标本，将标本中的低中高值分离后，对低中高值样本进行单独的线性回归分析，得到了线性回归方程y＝1.0167X+0.0977，R²＝0.9609。该回归曲线方程如图2所示，其中，横轴代表对照测值，纵轴代表参考测值。图2表明，本发明的试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用。

3、采用本实施例的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，对120份正常人样本进行检验；用SPSS19.0forwindows软件对正常人样本的测定结果进行正态性检验，数据整体分布基本属于非正态分布。

表3：本实施例的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒正态性检验表

	自由度	p值
			正常人血清	120	0.01

4、本实施例的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒临床参考值范围；以正常人样本检测值的双侧95百分位数作为参考值。

表4：本实施例的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒临床参考值范围表

	95％计算基本范围(mIU/mL)	修正参考值范围(mIU/mL)
			正常人血清	0.4128～26.95	0～27

可以看出，本发明的试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用。

Claims (7)

1.一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述试剂盒中各组分按照如下方法制备：

一、校准品、质控品的配制：

用校准品缓冲液溶解胃蛋白酶原II，配置胃蛋白酶原II校准品和胃蛋白酶原II质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；

二、抗试剂的配制：

(1)、抗试剂缓冲液的制备：

Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；

(2)、将异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II标记抗体加入到所述述抗试剂缓冲液中充分搅拌至完全溶解；

三、磁微粒试剂的制备：

将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂；

四、发光底物的制备

将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制得发光底物。

2.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，所述抗试剂是按照以下步骤制备：

(1)、异硫氰酸荧光素与胃蛋白酶原II抗体的偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II包被抗体：

首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照胃蛋白酶原II与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1的量，将二者转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时；充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II包被抗体；

(2)、碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II标记抗体：

首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II标记抗体；

(3)、将步骤(1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II包被抗体和和步骤(2)中获得的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II标记抗体，加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。

3.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：

(1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2～5倍于反应瓶中羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20-30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；所述磁微粒缓冲液的配置方法是：Tris：12.12mg，氯化钠5.82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；

(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1的比例，在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；

(3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。

4.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，所述发光底物是按照以下步骤制备的：

用4～10倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS，所述发光底物缓冲液的配置方法是：Tris12.12g～121.14g，氯化钠5.82g，光泽精0.03g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5。

5.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法为：Tris12.12g，氯化钠5.82g，Tween-2050mL，曲拉通-100，50mL，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。

6.根据权利要求1-4任一项所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒的制备方法，该方法包括:分别配制胃蛋白酶原II校准品、胃蛋白酶原II质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将胃蛋白酶原II校准品、胃蛋白酶原II质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到胃蛋白酶原II的定量测定试剂盒。

7.利用权利要求1～6任一项所述的一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒定量检测胃蛋白酶原II的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取三支试管分别加15μL胃蛋白酶原II的校准品、15μL胃蛋白酶原II的质控品、15μL待测样本；

(2)每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴15分钟；

(3)每一试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5分钟；

(4)将试管在磁分离器上沉淀2分钟，缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液；把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)每一试管中加入200μL发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。