CN112175079A - 一种多功能抗gfap单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用，属于生物技术领域。一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，进行鼠单抗制备；S2，加入5mL的DMEM培养基混匀；S3，进行腹水制备；S4，抗体纯化；S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取；S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；S11、进行抗体验证；本发明与传统单克隆抗体相比，重组抗体具有序列已知、抗体基因可长期保存、抗体性质稳定、实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。

Description

一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
GFAP是胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞活化的标志物，神经胶质纤维酸性蛋白是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在，星形胶质细胞广泛分布于中枢神经系统各个部位，约占正常成年人脑细胞总数的40％，GFAP则是星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，研究发现星形胶质细胞在发育成熟后GFAP表达明显增加并贯穿一生，GFAP小鼠中，星形胶质细胞的中间丝显著减少甚至完全没有。因此GFAP不仅被认为是星形胶质细胞的成熟标志，也成为正常及病理情况下应用最广泛的星形胶质细胞标记物。正常情况下，在细胞胞质内的GFAP循环降解，血液中GFAP水平较稳定；然而病理条件下，如病人的中枢神经系统受到损伤，其星形胶质细胞遭受破伤或坏死时，GFAP从胶质细胞中流出，穿过血脑屏障进入血液中，使GFAP浓度上调。
目前市场上抗GFAP单抗产品数量较少，从市面上已经制备成功的例子来看，免疫原多为天然蛋白，也有大肠和293T细胞表达。市面上该项目产品可分为鼠单抗和兔单抗。市面上抗GFAP单克隆抗体应用也相对较少，其中在WB、IHC、IF、FC等实验中一般只通过一至两种验证。GFAP单抗是干细胞单克隆抗体中的一个重要项目，但是目前通过了FC验证的产品仅两个，FC区分度在10倍左右。
传统单克隆抗体，可以通过相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体，且可通过不同筛选手段，获得不同表型的特异性抗体。杂交瘤细胞具有无限增殖能力，理论上可以一直使用，不断产生完全相同的单抗，但实际在长期使用后杂交瘤细胞存在退化的情况，效价会下降，另外可能由于保存等原因，细胞株存在抗体染色体丢失、细胞复苏后停止生长或者死亡等风险。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种多功能抗GFAP单克隆抗体，其含有由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的CDR3。
优选的，该抗体可以特异性识别GFAP蛋白。
优选的，该抗体可以应用于抗体验证。
一种制备多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；
S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；
S3，进行腹水制备；
S4，抗体纯化；
S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取，复苏细胞，然后检测细胞株效价，采用半皿或者1/4皿收集细胞；
S6，加1mlTrizol，吹匀至细胞完全溶解，然后加入200μl氯仿，上下剧烈颠倒，静置2min，在12000rpm 4℃15min离心取上清；
S7，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min；然后12000rpm 4℃10min离心，弃上清；
S8，加1ml预冷75％乙醇，轻弹管底，12000rpm 4℃3min离心，弃上清，室温晾干数分钟，然后加30-50μl预冷的DEPC水至溶解即得到RNA产物，-80℃长期保存；
S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；
S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；
S11、进行抗体验证。
优选的，步骤S5-步骤S8中整个提取过程必须带口罩与手套，防止RNase的污染。
优选的，步骤S11中抗体验证的方法包括：WB验证、IF验证、FC验证、IHC验证。
一种采用多功能抗GFAP单克隆抗体的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用，具备以下有益效果：
1、该多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，与传统单克隆抗体相比，重组抗体具有序列已知、抗体基因可长期保存、抗体性质稳定、实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。
2、该多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，本文中的抗GFAP鼠单抗及重组抗体同时通过WB、IF、IHC、FC验证，对比市场上其他抗体，应用范围广，抗体特异性更好。
附图说明
图1为本发明中WB验证结果的结构示意图；
图2为本发明中IF验证结果的结构示意图一；
图3为本发明中IF验证结果的结构示意图二；
图4为本发明中IF验证结果的结构示意图三；
图5为本发明中FC验证结果的结构示意图；
图6为本发明中IHC验证结果的结构示意图一；
图7为本发明中IHC验证结果的结构示意图二。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1:
一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；
S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；
S3，进行腹水制备，腹水制备的具体方法为：
a.提前一周将小鼠腹腔注射不完全佐剂，每只注射0.5mL；
b.离心收集传代好的细胞，用1mL DMEM重悬，浓度为1×106/mL，用无菌注射器吸取细胞，注射到小鼠腹腔；
c.间隔6天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时有紧张感，即可用无菌注射器腹水针采集腹水；
d.10000rpm离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，-20℃保存；
S4，抗体纯化，抗体纯化的具体方法为：
a.取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积，乙酸钠缓冲冲洗10倍柱床体积；
b.腹水，4℃，12000rpm离心10min，收集上清，过滤，然后腹水与1％乙酸钠缓冲液1：4体积比混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；
c.上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用3.5％冰乙酸，PH＝2.7的洗脱缓冲冲洗柱床，收集洗脱峰；
d.迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性，边洗脱边加饱和碳酸氢钠，水洗10倍柱床体积，用10mLNaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；
e.将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋，置于5L PBS中4℃透析过夜，12小时换液一次；
f.24小时后4℃，12000rpm离心10min，收集上清，检测，加50％甘油和防腐剂保存；
S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取，复苏细胞，然后检测细胞株效价，采用半皿或者1/4皿收集细胞；
S6，加1mlTrizol，吹匀至细胞完全溶解，然后加入200μl氯仿，上下剧烈颠倒，静置2min，在12000rpm 4℃15min离心取上清；
S7，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min；然后12000rpm 4℃10min离心，弃上清；
S8，加1ml预冷75％乙醇，轻弹管底，12000rpm 4℃3min离心，弃上清，室温晾干数分钟，然后加30-50μl预冷的DEPC水至溶解即得到RNA产物，-80℃长期保存；
S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；
cDNA制备首先进行变性：取15μlRNA产物于预冷的PCR管中，冰浴2min，然后依次加入：
5×Buffer 4μl
Primer(DT) 1μl
E 1μl
其中Primer如下表所示：
Figure BDA0002716879550000071
Figure BDA0002716879550000081
上PCR仪37℃15min，95℃5min得到cDNA产物,NanoDrop检测浓度；4℃保存一段时间后-20℃长期保存，其中，整个过程尽可能冰上操作，检测浓度时A260/A280控制在1.8-2.0之间。
然后进行质粒制备：PCR扩增产物跑胶，根据目的片段的大小切胶，放置干净离心管，将离心管放置-80℃冰箱，15min后取出室温溶解，用1ml蓝色枪头将胶捣碎，12000r/min,2min，或者不溶解，用玻璃杵棒戳胶，直接吸取液体，将离心后上清移至的新空白EP管，做好标记，备用；
载体使用的双酶切体系(150μl)如下(单位：μL)
试剂 载体 Buffer Sfi I Hind III H20
加样量(μL) 112 15 4 4 15
体系加完后，用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20h以上为佳，在回收前4-5小时前酶可以各补加2μL，载体回收；外源DNA片段和载体的酶切产物分别经过回收后做连接反应，反应体系如下：
试剂 外源片段 载体 Buffer E 无菌水
加样量(μL) 4 1 0.5 2.5 2
用枪轻轻吹吸混匀后，冰上15min后转化；外源片段：载体大概为摩尔比为4:1为最佳，例如二者亮度一致的情况下，载体大小是片段的2倍，那么载体与片段的摩尔比为1:2；E：在用时根据所连接的项目数将E稀释30倍后10μl体系加2.5μl E连接；
然后转化和阳性克隆筛选，从-80℃冰箱中取出感受态细胞，轻轻打开盖子，加入质粒2μL或连接产物10μL；轻轻吹吸并旋转小枪头，使DNA与感受态细胞充分混匀，冰上30mi，42℃热击90s，冰上1min，加入700μL预热的NZY培养基，置37℃摇床中158r/1.5h，6000r离心4min，提前15分钟将需要的平板倒置于37度恒温培养箱，核对抗生素是否正确，15分钟的温育足以让平板加热，倒置会更好的挥发游离的水分，在超净台里面吸掉700μL上清，剩余菌液混匀，涂至含有相应抗生素的平板上，提前将需要用的玻璃棒烧好放置于无菌间台面上，注意除了手柄其他位置不要碰到其他物品，倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12-16小时后可出现菌落，对于阳性克隆的筛选，分装40μl不加抗生素的LB培养基至PCR管，每种克隆挑取6个单菌落至PCR管混匀，放置于37℃摇床中220r/2小时。每管取2μl作为模板进行菌液PCR，其中PCR回收产物和H2O分别作为阳性和阴性对照的模板，PCR反应完后进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果呈阳性，则选择3个呈阳性结果的相应PCR管的单克隆菌液接种至3ml加相应抗生素的LB培养基中培养过夜，第二天进行保种，并选取一个克隆提取质粒同时该克隆送测序，送去测序的那个菌种同时提取质粒；
S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；
S11、进行抗体验证。
步骤S5-步骤S8中整个提取过程必须带口罩与手套，防止RNase的污染，样本量与Trizol加入量要按一定比例，不可随意增加样本量或者减少Trizol的量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA的降解。
步骤S10中，转染前细胞培养的方法为：将HEK-293细胞置于5％的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养，传代时，需先做细胞计数，确认密度后无需离心细胞，可直接将细胞悬液依照所需比例兑入培养液中，若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。
步骤S10中，转染细胞的准备的方法为：
a.在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率；
b.细胞无需离心，直接兑入KOP293培养液，将细胞密度稀释成2×106个/毫升；
c.摇瓶置于5％的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。
步骤S10中，瞬时转染的方法为：
a.准备两支15ml的无菌离心管，在其中一支中加入5ml KPM和无菌质粒DNA按重链：轻链1：1比例加入，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5ml KPM和500μl TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；
b.将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；
c.室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；
d.从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养，3小时后可根据需要加入适量抗生素。
步骤S10中，产物表达与检测的方法为：
a.转染24小时后可加入600μl 293细胞蛋白表达增强剂，以增加产物表达量；
b.在转染24小时后添加瞬时转染营养添加剂；
c.转染后第6天测定产物表达量；
d.根据细胞状态及表达量选择适宜的收获时间。
步骤S11中抗体验证的方法采用WB验证。
本发明中，WB验证的实验步骤为：
蛋白样品制备，首先抽提细胞蛋白，预冷RIPA强裂解液蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，按照100:1的比例添加，在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM，细胞计数，以细胞数量1×107加入1mL裂解液，一般是1皿细胞加上1mL裂解液，10％功率，超2s休3s，超声1min，用枪头吹打充分悬起细胞，超声破碎细胞，完成后在冰上孵育20min，4℃离心，12000rpm，20min，离心完成后取上清，分装保存，待测；
然后进行组织蛋白提取，液氮研磨组织，预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，按照100:1的比例添加，在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM，每0.1g组织加入1mL裂解液，用枪头吹打充分悬起，超声破碎组织，完成后在冰上孵育20min，4℃离心，12000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。
BCA法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶的制备，配制浓度为12％的分离胶溶液：依次加入
去离子水 3.3mL
30％丙烯酰胺 4.0mL
pH8.8Tris-Hcl 2.5mL
10％APS 100μL
10％SDS 100μL
TEMED 6μL
加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀，迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上覆盖—层异丙醇，分离胶聚合完全后，尽可能排去凝胶上的液体，再用吸水滤纸的边缘吸净残留液体，配制浓度为5％的浓缩胶溶液：依次加入
去离子水 2.7mL L
30％丙烯酰胺 670μL
pH6.8Tris-Hcl 500μL
10％APS 40μL
10％SDS 40μL
TEMED 6μL
加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀，快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，小心避免混入气泡，浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液，将的样品和2×loadingbuffer混合，沸水煮5min，用移液枪慢慢将10μL混合物加至样品槽中，预染Maker一般加10μL，上样完成后，连接好电泳仪，正负极对应，打开电源，用80V的电压跑浓缩胶30min，调电压120V电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部，关闭电源，停止电泳；
取胶后去掉上层浓缩胶，将分离胶浸入转膜buffer中，将PVDF膜浸泡于异丙醇1min后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中，且PVDF膜和滤纸均剪成与胶相同大小，避免两端滤纸接触造成短路，当蛋白小于20KD时，可选用0.22μm的PVDF膜；若蛋白较大，可选用0.45μm的PVDF膜，用转膜buffer淋洗石墨电极，铺三张滤纸，滴少许转膜buffer，铺上分离胶，滴少许转膜buffer；铺上膜，再滴少许转膜buffer，最后铺三张滤纸，滴少许转膜buffer，用涂棒赶出气泡，盖上电极，电压调至最大，以1.5mA/cm2凝胶体积转膜1.5h，负载电压不宜超过1V/cm2；
将膜从转膜仪中取出，PBST漂洗5min，水平摇床上震荡，将膜取出，浸没于封闭液中37℃，2h或4℃过夜，封闭液为1％酪蛋白或2％OVA，进行孵育一抗，将膜取出，PBST洗三次，每次10min，水平摇床上震荡，将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的一抗稀释液中，25℃，1h，一般一抗稀释1：1000如结果不好可调整一抗稀释比例，然后孵育二抗，将膜取出，PBST洗三次，每次10min，水平摇床上震荡，将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的二抗抗稀释液中，25℃，1h；将A、B发光液等比例稀释混合均匀，各500mL，将膜平铺于保鲜膜上，混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，避光静置3min，打开保鲜膜，用滤纸小心吸干膜表面残留液体，置于保鲜膜内，不要产生气泡与皱褶，平铺并固定于暗盒中，将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速置于暗盒内膜上，不要移动胶片，避免产生重影，关闭暗盒，一般曝光时间为4min，若条带较弱可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新显影，打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中4min，取出胶片，清水漂洗后侵入至定影液中1min，取出胶片，用水漂洗后烘干。
实施例2：
一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其中，抗体验证选择IF验证，实验步骤为：
进行细胞固定：铺完96孔板后，PBS洗涤细胞1次，洗涤过程中不用等待，加入PBS过程中动作尽可能的缓慢，防止细胞大面积脱落，PBS加入150μL。洗涤完毕后加入常温的4％多聚甲醛室温固定15min；固定完毕后吸去多余的多聚甲醛，用PBS洗涤4遍，每次静止3min，加入多聚甲醛时尽量缩短操作时间，防止细胞干片造成细胞形态变差；细胞通透：0.2％Triton-x-100覆盖细胞，定位在胞质室温通透8min，PBS洗涤4遍，每次静止3min。
然后封闭：采用10％的山羊血清37度封闭40min，加入封闭液体积为50μL，封闭时间不宜过长，防止干片，进行配制一抗，用5％正常山羊血清稀释一抗，至终浓度为20ug/mL，加入一抗覆盖细胞，4℃孵育过夜，取出96孔板复温至室温大约15min，用PBS洗涤4遍，每次4min；配制荧光标记二抗：5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比1:200，稀释比可根据96孔板的细胞密度适当进行调整，配制完毕后用0.22μm孔径的过滤器过滤，37℃孵育45min，孵育完毕后用PBS洗涤3遍，每次3min，洗涤完毕后DAPI染核，根据DAPI母液浓度，将其稀释至1mg/mL，稀释液50μL覆盖细胞10分钟；
最后进行封片：染核后PBS洗涤一遍，加入抗荧光淬灭剂，稀释比为1:3，覆盖细胞即可约20μL；然后拍照。
实施例3：
一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其中，抗体验证选择FC验证，实验步骤为：
首先准备样本和试剂，然后进行细胞固定，使用75％预冷的乙醇固定细胞，4℃过夜，以1mL为例加入250μLPBS重悬后，沿管壁缓慢加入无水乙醇，然后混合均匀，固定后，1000rmp/min，3min离心细胞，弃上清，用PBS重悬，1000rmp/min，3min离心，弃上清，10％正常非免疫山羊血清重悬，4℃孵育45min，在静音混合器上孵育，经1000rmp/min，3min离心，弃上清。
进行孵育一抗，首先进行配制一抗：用5％正常山羊血清稀释一抗，至终浓度为0.02μg/μL，加入一抗稀释液100μL，4℃孵育45min，在静音混合器上孵育，经1000rmp/min，3min离心，弃上清，用PBS重悬后，静置2min。经1000rmp/min，3min离心，弃上清，重复两次；然后进行孵育二抗，配制荧光标记二抗：用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:100，加入二抗稀释液50μL，4℃孵育30min，，在静音混合器上孵育，注意避光，经1000rmp/min，3min离心，弃上清，用PBS重悬，1000rmp/min，3min离心，弃上清，仪器检测：加入400μL的PBS重悬细胞，转移液体至流式上样管，立即上流式仪检测。
实施例4：
一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其中，抗体验证选择IHC验证，实验步骤为：
用2％APES-丙酮溶液固定玻片，烘箱60℃，15min，180mL环保型透明组织脱蜡剂，1h，进行脱蜡，然后水化，依次放入浓度比为100％，100％，95％，85％，75％，60％的200mL的酒精中，每次5min，放入0.3％Triton-100中打孔，5分钟，消除组织内源性过氧化物酶的活性，3％H2O2，5min，放入PBS溶液中进行缓冲，静置，高压修复，500mL柠檬酸-柠檬酸钠溶液，水沸腾后将玻片放入溶液中，盖上盖，待上汽后计时2min关闭，取出后自然冷却，PBS洗涤3次，每次5分钟，用10％非免疫山羊血清封闭，室温静置30min，一抗按体积稀释比1:100稀释，4℃过夜，含0.5％的吐温20的PBST洗涤3次，每次5min；二抗孵育，鼠1:500的稀释比进行添加，37℃1h，含0.5％的吐温20的PBST洗涤3次，每次5min，三抗孵育，1:1000稀释比，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5分钟，然后PBS洗涤2次，每次5min，DAB染色，待组织颜色染至黄棕色停止，染色时间最多8min，PBS洗涤2次，每次5min，苏木素染色，静置30min后放入PBS溶液中过夜，纯水洗涤3次，每次5min，然后依次放入浓度比为60％，80％，95％，100％的无水乙醇中静置10min，再置于脱蜡剂中静置10min透明、沥干，然后封片。
参照图1，可知GFAP鼠单抗在大鼠小鼠的脑组织均具有目的条带，50KD，其中GFAP鼠单体稀释比例为1:1000。
参照图2-4，可知GFAP鼠单抗定位正确，检测到强阳性信号。
参照图5，可知GFAP鼠单抗在细胞上流式细胞检测细胞信号呈现强阳性。
参照图6-7，可知GFAP鼠单抗在人脑、神经胶质瘤中定位正确，呈明显阳性。
重组抗体重链、轻链序列如下表所示：
Figure BDA0002716879550000171
Figure BDA0002716879550000181
GFAP重组单抗CDR区的氨基酸序列如下表所示：
Figure BDA0002716879550000182
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，其含有由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，该抗体可以特异性识别GFAP蛋白。
3.根据权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，该抗体可以应用于抗体验证。
4.一种制备权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；
S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；
S3，进行腹水制备；
S4，抗体纯化；
S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取，复苏细胞，然后检测细胞株效价，采用半皿或者1/4皿收集细胞；
S6，加1mlTrizol，吹匀至细胞完全溶解，然后加入200μl氯仿，上下剧烈颠倒，静置2min，在12000rpm 4℃15min离心取上清；
S7，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min；然后12000rpm4℃10min离心，弃上清；
S8，加1ml预冷75％乙醇，轻弹管底，12000rpm 4℃3min离心，弃上清，室温晾干数分钟，然后加30-50μl预冷的DEPC水至溶解即得到RNA产物，-80℃长期保存；
S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；
S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；
S11、进行抗体验证。
5.根据权利要求4所述的多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S5-步骤S8中整个提取过程必须带口罩与手套，防止RNase的污染。
6.根据权利要求4所述的多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S11中抗体验证的方法包括：WB验证、IF验证、FC验证、IHC验证。
7.一种采用权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体的应用。
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