CN101597334A - 蓝舌病病毒单克隆抗体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。本发明所述的蓝舌病病毒单克隆抗体是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，分别用纯化的BTV抗原、基因工程表达的BTV VP7蛋白抗原和正常仓鼠肾传代细胞(BHK21)对照抗原包被的间接ELISA进行筛选，经有限稀释法筛选克隆，获得能稳定传代并分泌抗特异性BTV VP7蛋白的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株，并制备BTV VP7蛋白的McAb小鼠腹水，制备而成的抗BTV VP7蛋白的单克隆抗体。本发明提供的BTV VP7蛋白单克隆抗体的特异性强，腹水效价高，亲和力高，制备方法简单，BTV VP7蛋白单克隆抗体可以用于BTV抗体和抗原的检测方法，为我国蓝舌病的防控提供重要的技术手段。

Description

蓝舌病病毒单克隆抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是有关蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体，以及制备方法和用途。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease，BLU)是由呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(Obivirusgenus)的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一种烈性动物传染病，由库蠓传播，主要危害绵羊、山羊、牛等家畜，并在世界范围内广泛流行，世界动物卫生组织(Worldorganisation for animal health，OIE)将BLU列为重要动物传染病。在很多国家动物贸易协定中，BLU是必须进行检疫的传染病之一。近年来，随着气候变暖，BLU在欧洲许多国家的发病率增加，严重影响着国际动物贸易。

BTV共有24个血清型，BTV基因组含有10个双链RNA片段(dsRNA)，由19218bp组成，编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7种结构蛋白的4种形成双层蛋白衣壳，外壳主要由VP2和VP5构成，而内壳主要由VP3和VP7构成。VP2是病毒型特异性抗原和血凝蛋白，诱导产生中和抗体，还与病毒的毒力和细胞吸附作用有关。VP5也与中和抗体的产生和病毒毒力有关。VP7是核芯衣壳表面壳粒的主要成分，约占病毒总蛋白的1/3，是病毒可溶性群特异性抗原。在BLU检测方法中，琼脂扩散试验(Agar Gel Immuno Diffusion，AGID)因其操作简便、成本低而在世界范围内被广泛推广应用，也是迄今OIE推荐使用的方法之一，但该方法使用的抗原与相关病毒如鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus ofdeer，EHDV)存在一定的交叉反应性，所以AGID检测的特异性较差。竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)可将蓝舌病与相关病毒病区别，而双抗体夹心法ELISA可直接进行病毒抗原的检测。因此，制备BTV VP7特异性单克隆抗体，不仅对研究BTV VP7蛋白的功能有重大意义，而且对建立特异、敏感、快速的BTV免疫血清学检测方法(如ELISA)也有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗蓝舌病病毒的蓝舌病病毒单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供这种单克隆抗体的制备方法。

本发明的再一目的是提供这种单克隆抗体的用途。

本发明所述的蓝舌病病毒单克隆抗体是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，分别用纯化的BTV抗原、基因工程表达的BTV VP7蛋白抗原和正常仓鼠肾传代细胞(BHK21)对照抗原包被的间接ELISA进行筛选，经有限稀释法筛选克隆，获得能稳定传代并分泌抗特异性BTV VP7蛋白的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株，并制备BTVVP7蛋白的McAb小鼠腹水，制备而成的抗BTV VP7蛋白的单克隆抗体。

本发明所述的蓝舌病病毒单克隆抗体是由小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞产生的、只针对蓝舌病病毒VP7蛋白特异性抗原决定簇的抗体，它是一种免疫球蛋白-IgG，由重链和轻链构成，其结构相同，成分均一，特异性强，生物活性高。

本发明所述的蓝舌病病毒单克隆抗体的制备方法由以下步骤组成：

一、蓝舌病病毒的纯化；BTV接种BHK-21细胞，出现细胞病变后收获病毒，反复冻融3次，二次离心将细胞碎片和病毒液分开，采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度超速离心3h，以纯化BTV病毒；

二、用提纯的蓝舌病病毒免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，纯化的BTV病毒注射剂量分别100μg、100μg和200μg；

三、取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗BTV VP7蛋白的阳性孔；

四、用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗BTV VP7蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

五、杂交瘤细胞注射入BALB/c鼠腹腔制备单抗腹水，取12周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入5～10×10⁵个杂交瘤细胞；

六、用间接ELISA所述的方法鉴定制备单克隆抗体仅与BTV病毒的VP7蛋白有特异性免疫反应，而与其它相关病毒没有任何免疫反应。

所述的蓝舌病病毒的纯化：BHK-21细胞长成单层后接种BTV，37℃反应1h。加入无血清的基础培养基继续培养，2～3d后细胞病变(CPE)达75％以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融3次，以8000r/min离心30min，取上清液。以28000r/min 4℃超速离心3h。沉淀用1/100原体积的PBS溶解，然后采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/min4℃超速离心3h，收获提纯的病毒条带作为免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析仪测定蛋白含量，-20℃保存备用。

所述的用提纯的蓝舌病病毒免疫BALB/c鼠：首次免疫后，每隔2周免疫1次，共免疫3次，注射剂量分别100μg、100μg和200μg。首免时加等体积弗氏完全佐剂乳化，二免和三免时加等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免后第15d，断尾采血分离血清，用间接ELISA检测抗BTV血清抗体效价。于融合前3d，通过尾静脉注射BTV强化免疫一次，剂量为100μg。

所述的间接ELISA筛选阳性克隆：分别用BHK细胞增殖的BTV病毒、VP7基因工程表达产物和BHK细胞建立间接ELISA。首先用DU 800核酸蛋白分析仪测定各种抗原的蛋白浓度。再用方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度，并对包被时间及温度进行优化。3种ELISA方法分别命名为：BTV-ELISA、BTV VP7-ELISA和BHK-ELISA，这3种ELISA方法用于对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，以获得抗VP7的单克隆抗体。

所述的杂交瘤细胞注射入BALB/c鼠腹腔制备单抗腹水：取12周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入5～10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7～10d可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000r/min离心5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水，测定抗体效价，分装后-80℃冻存备用。

本发明涉及蓝舌病病毒单克隆抗体在制备可特异性检测蓝舌病抗体的竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)中的应用。

本发明涉及蓝舌病病毒单克隆抗体在检测蓝舌病抗原的双抗体夹心ELISA中的应用。

本发明的优点在于：本发明提供的BTVVP7蛋白单克隆抗体的特异性强，腹水效价高，亲和力高，制备方法简单，BTV VP7蛋白单克隆抗体可以用于BTV抗体和抗原的检测方法，为我国蓝舌病的防控提供重要的技术手段。

本发明的优点还在于：提供一种简便易行的方法制备和纯化BTV VP7蛋白的单克隆抗体，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，可为BTV的诊断、检疫、检测和流行病学调查提供有力的技术和产品支持。

具体实施方式

实施例：

1、病毒的纯化和免疫原的制备

BHK-21细胞长成单层后接种BTV，37℃反应1h。加入无血清的基础培养基继续培养，2～3d后细胞病变(CPE)达75％以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融3次，以8000r/min离心30min，取上清液。以28000r/min 4℃超速离心3h。沉淀用1/100原体积的PBS溶解，然后采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/min 4℃超速离心3h，收获提纯的病毒条带作为免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析仪测定经差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化的蓝舌病病毒蛋白含量为3.268g/L，分装后置-20℃保存备用。

2、BTV VP7蛋白表达抗原的制备

根据GenBank上公开发表的BTV VP7基因序列，设计、合成一对引物，扩增长度为1044bp。引物序列如下：VP7-P1：5’-GAC ACTATC GCT GAC AGA GCACT-3，VP7-P2：5’-CACATAGGC GGC GCGTGCAATAG-3’，PCR产物在1％琼脂糖上进行电泳检测。回收纯化的PCR目的片段插入pBAD/ThioTOPO，转化TOP10感受态细菌，经PCR和DNA测序鉴定为含有BTV VP7基因的阳性重组质粒转化LMG194感受态细菌。按pBAD/Thio TOPO载体试剂盒说明书进行目的蛋白的阿拉伯糖诱导表达，用pBAD/Thio载体作为阳性表达对照，无载体的LMG194细胞作为阴性对照，同时进行表达条件的筛选，经SDS-PAGE、ELISA确定最佳诱导表达条件。扩大培养，收集表达菌体，用细胞压力破碎仪进行处理，离心后取上清，对表达产物进行纯化。纯化的BTV VP7蛋白可作为c-ELISA和间接ELISA的包被抗原(VP7-ELISA)。

3、BALB/C小鼠免疫

选择8-12周龄的纯系雌性BALB/c小鼠。用纯化的BTV作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，将纯化后BTV与等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化，充分混匀后经背部皮下注射健康BALB/c小鼠，0.2mL/只；首免后第2周和第4周分别用BTV加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免；三次免疫的抗原注射剂量分别100μg、100μg和200μg。三免后2周，断尾取血并分离血清，用间接ELISA检测血清效价，待效价达到2¹²以上再以不加佐剂的抗原(0.2mL/只)进行加强免疫一次，剂量为100μg，即可进行细胞融合。

4、小鼠骨髓瘤细胞的培养

骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：细胞融合前，应将处于对数生长期的骨髓瘤细胞维持在含10％小牛血清的培养基中传代1周。于融合前48～36h，将骨髓细胞扩大培养；融合当d，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内；1000r/min离心5～10min，弃去上清；加入30mL 1640培养基，同法离心洗涤一次，然后将细胞重悬浮于10mL 1640培养基，混匀；取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台盼蓝染液作活细胞计数后备用，细胞计数时，取细胞悬液0.1mL加入0.9mL台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数，计算细胞数目的公式为：每mL细胞数＝4个大方格细胞数×10⁵/4；或每mL细胞数＝5个中方格细胞数×10⁶/2。

5、小鼠免疫脾淋巴细胞的准备

取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，在超净工作中眼科剪和镊子掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL1640培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10mL1640培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1mL注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5～10min，用1640培养液离心洗涤1～2次，然后将细胞重悬于10mL 1640培养液混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。每只小鼠可得1×10⁸～2.5×10⁸个脾细胞。

6、饲养细胞的制备

以小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在细胞融合前1～2d制备并培养饲养细胞，使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。其制备方法如下：按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10mL不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1min，随后吸出注入的培养液。3000r/min离心5～10min，弃上清。先用5mL HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×10⁵/mL，加入96孔板，每孔0.1mL(相当于2滴)，然后置37℃5％CO2的培养箱中培养。通常96孔培养板每孔需2×10⁴个细胞，24孔板每孔需10⁵细胞，每只小鼠可得3～5×10⁶个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。

7、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

将计数后的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按1∶5～10的比例混合，500r/min离心10min，去上清，轻轻的弹离心管底部使细胞分散，缓慢地向离心管中加入1mL预热的50％聚乙二醇(MW4000)融合剂，静置3min，在5min向离心管中加入30mL 1640培养基，终止融合作用。500r/min离心10min，去上清，加入适量的含HAT的选择性培养基，悬浮融合后的细胞，将融合细胞加入已有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，每孔再补加100μL用HAT培养液。将细胞板置于含5％二氧化碳的培养箱中，于37℃进行培养，每隔3d，用每孔半量HAT选择性培养液换液一次。7～10d后用HT培养基换出HAT培养基。经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

8、阳性杂交瘤细胞的筛选及其克隆

当观察到培养孔中出现杂交细胞集落时(约7-8d)，取培养上清液，用BTV-ELISA、VP7-ELISA和BHK-ELISA同时进行筛选。选取BTV-ELISA和VP7-ELISA检测为阳性，且BHK-ELISA检测为阴性的孔，连续3d进行检测。取可以稳定分泌VP7单抗的阳性孔进行克隆。采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞；提前1d制备并培养饲养细胞；将计数后的待克隆杂交瘤细胞悬液用含20％血清的HT培养基准确地进行系列稀释，直至每mL含10个细胞，按每孔接种0.1mL细胞悬液，即每孔含1个细胞；37℃、7.5％CO2湿润培养7～10d，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清用ELISA作抗体检测；每次克隆均随机挑选30个孔进行三重ELSIA检测，直至克隆孔100％为阳性，选取抗体效价高的单克隆抗体阳性孔，将细胞扩大培养并冻存备用，并且连续冻存-复苏数次，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

9、单克隆抗体的特异性检测

用BTV-ELISA、VP7-ELISA和BHK-ELISA同时进行阳性克隆的检测，选取BTV-ELISA和VP7-ELISA检测为阳性，且BHK-ELISA检测为阴性的孔。同时将阳性孔培养上清分别与用纯化的EHDV、VSV、AKV、PPRV建立的间接ELISA进行反应，从而评价单克隆抗体的特异性。

进行单克隆抗体特异性检测的间接ELISA操作步骤：分别用纯化的BTV、EHDV、AKV、VSV、PPRV作为包被抗原，经方阵滴定试验，确定抗原最佳包被浓度、待检抗体和酶结合物的最佳工作浓度及判定标准。(1)包被：用包被液将纯化的病毒抗原稀释，包被96孔ELISA板，50μL/孔，于4℃过夜。(2)封闭：弃去96孔ELISA板中包被液，用0.01mol/L pH7.4含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗3遍，向每孔中加入200μL 3％牛血清白蛋白(BSA)溶液，于37℃，反应2小时。(3)弃去封闭液，用PBST洗3遍，可以用于检测或于4℃保存备用。(4)向ELISA板中加入待检测的上清液、或阳性血清、阴性血清，50μL/孔，37℃，反应30min。用PBST洗3遍。(5)加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃，反应30min。用PBST洗3遍。(6)加入底物(TMB+H₂O₂)50μL/孔，避光反应10min。(7)加入2mol/L H₂SO₄溶液，50μL/孔，终止反应。(8)于酶标仪读取OD₄₅₀值。

经方阵试验测得最佳的包被抗原稀释浓度为5μg/mL，4℃反应过夜。用30g/L BSA溶液于37℃封闭2h效果较好，一抗(单抗)和二抗(羊抗鼠IgG-HRP)的作用最佳时间均为30min，底物显色时间为15min。

用BTV、其它相关病毒和BHK细胞分别建立间接ELISA方法来检测3株单抗的特异性。3株单抗(1F5、4E5和6A1)细胞培养上清与BTV-ELISA反应时呈阳性，而与用其它病毒和BHK建立的ELISA反应时均为阴性。3株杂交瘤细胞接种BALB/c小鼠后均产生腹水，经多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞生长状态良好，分泌单抗性能稳定。3株单克隆抗体(1F5、4E5和6A1)的腹水分别与BTV(血清10、1、3、5、8、11、12、17、22型)、BTV-VP7和EHDV(血清1、2型)、VSV、PPRV、AKV包被的ELISA板反应，表明3株单抗与BTV和BTV-VP7包被ELISA板反应时呈强阳性，与其他病毒包被ELISA板反应时均为阴性，结果见表1。证实3株单抗可与BTV VP7蛋白特异性结合，为针对BTV VP7蛋白的特异性单克隆抗体。

表1：单克隆抗体(腹水)特异性试验结果

10、杂交瘤细胞的染色体分析

在加秋水仙素前48～36h将杂交瘤细胞传代。秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素(100μg/mL，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为0.1～0.4μg/mL；继续培养4～6h，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min 10min，弃上清。加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5mL，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15～20min。向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1mL，混匀，然后1000r/min 10min，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。加入固定液5mL，将细胞悬浮并混匀，室温静置20～30min，然后1000r/min 10min，弃去上清液；重复操作一次；其后加5mL固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。取出离心管，1000r/min 5min，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5～1mL固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的10％Giemsa染色液(Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33mL，55～60℃保温2h，加甲醇33mL混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/LpH6.8PBS 9份，即成10％Giemsa染液)染色10～20min，然后用自来水洗去染液，自然干燥。镜检，选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。结果3株单抗(1F5、4E5和6A1)的染色体为104。

11、单克隆抗体腹水制备及纯化

用常规方法将筛选的阳性杂交瘤细胞株扩大培养，选择与杂交瘤细胞同源同系的小鼠诱导腹水法大量制备单克隆抗体。选取12周龄以上的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只。一周后，取处于对数生长期的杂交瘤细胞，进行腹腔注射，剂量为5×10⁶细胞/只。约10d后，待小鼠腹部明显突起时，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2～3次，通常每只小鼠可采3～10mL腹水，将腹水以2000r/min离心5min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存备用，或冻干保存。

采用硫酸铵沉淀法纯化McAb：吸取10mL处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液(500g硫酸铵加入500mL蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8)5.0mL；继续缓慢搅拌30min；10000r/min离心15min；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1～2次；沉淀物溶于1.5mL 0.01mol/L pH7.2PBS缓冲液中。用柱层析或透析法进行饱和度硫酸铵粗提物的脱盐。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每min 1mL。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2％NaHCO₃，1mmol/L EDTA溶液中煮10min，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10min，冷至室温即可使用(并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4℃保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50～100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析(4℃)12～24h，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50mL，待溶解后，再加20％NaOH 50mL)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。用蛋白质测定仪测定蛋白质含量：(Pr)(mg/mL)＝(1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀)×稀释倍数；或(Pr)＝OD₂₈₀×稀释倍数/1.3。测得纯化腹水IgG的含量为1.97g/L。分装冻存备用。

12、单克隆抗体的亚类鉴定、细胞培养上清和腹水效价测定

利用鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对3株单抗进行亚型鉴定，1F5、4E5和6A1分别为IgG1、IgG2a和IgG1，3株单抗轻链均为κ链。

单克隆抗体培养上清及纯化腹水效价测定：将筛选为阳性孔的细胞培养上清及对应腹水进行系列稀释后，用BTV-ELISA法测定阳性孔细胞培养上清的效价和腹水效价。3株单抗(1F5、4E5和6A1)的上清ELISA效价分别为1∶512、1∶256和1∶512，腹水ELISA效价分别为1∶512000、1∶128000和1∶512000。结果见表2。

表2：3株单抗(1F5、4E5和6A1)的细胞上清液和腹水ELISA抗体效价

13、单抗相对亲和力测定

采用竞争性ELISA测定McAb的亲和力常数：取优化的最佳工作浓度的BTV纯化抗原包被聚苯乙烯酶标板，0.1mL/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液，0.1mL/孔，37℃孵育60min。取已测定浓度的McAb，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡。将感作平衡后的抗原抗体复合物加入到上述已用抗原包被并封闭过的聚苯乙烯酶标板中，0.1mL/孔，37℃孵育60min。洗涤后，加入适宜浓度HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，0.1mL/孔，37℃孵育30min。洗涤后，加入底物溶液(TMB底物)，0.1mL/孔，37℃避光显色30min。用终止液终止反应后，于450nm波长测定各孔的吸收率。按下列公式计算各McAb的亲和常数(K)：A0/(A0-A)＝1+Ka0(A0＝无抗原时A值；A＝采用不同浓度抗原时A值；a0＝抗原总量；K＝亲和力常数)。经过亲和力测定，计算出1F5、4E5和6A1的亲和力分常数别为5.14×10⁷mol/L、6.71×10⁶mol/L和3.58×10⁷mol/L。

14、HRP-抗BTV VP7蛋白单克隆抗体结合物的制备与鉴定

用辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗，采用方法是过碘酸钠法。标记程序如下：将5mg HRP溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO₃溶液中；加0.5mL 10mmol/L NaIO₄溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h。加0.75mL 0.1mol/L Na₂CO₃混匀。加入0.75mL纯化单抗(15mg/mL)，混匀。称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5mL注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，4℃过夜。用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制的5mg/mL NaBH₄溶液，混匀，室温作用30min；再加入3/20NaBH₄溶液，混匀，室温作用1h(或4℃过夜)。将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。测定克分子比值和标记率，鉴定酶结合物质量，用ELISA法测定酶活性和抗体活性。HRP抗体酶结合物的保存时，加入等量甘油后，小量分装-20℃存放。

15、杂交瘤细胞的冻存与复苏

细胞冻存是细胞在加血清和二甲基亚砜(DMSO)的培养基中以一定的缓慢速度下降温度(0℃～-20℃，每分钟下降1℃；-20℃～-40℃每分钟下降2℃)，可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。杂交瘤细胞冻存时，将处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞离心，重新悬浮于预冷的冻存液(含10～20％血清、5～10％DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右)中，浓度为10⁶～10⁷左右/mL，分装安瓶，每瓶1mL，置冰浴上；冻存管上标明细胞名称、冻存日期、批号等。冻存管封口后仍置冰浴上。将冻存管放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。2～4h后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。

杂交瘤细胞复苏时，速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃～0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5～10mL HT培养基稀释，1000r/min 10min，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5％CO₂培养。如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加10⁴～10⁵/mL小鼠腹腔细胞进行培养。

16、用单抗建立c-ELISA方法检测蓝舌病抗体操作步骤

酶标板抗原包被，50μL/孔，4℃过夜，PBST洗三次；加血清(被检、阳性、阴性)50μL/孔，37℃湿盒感作60min；加入McAb 50μL/孔，37℃湿盒感作30min；加入兔抗鼠IgG-HRP 50μL/孔，37℃感作30min；PBST洗五次；加入底物液，100μL/孔，37℃暗盒中显色20min，加入终止液50μL/孔，于酶标仪450nm下测定OD值。按下列公式计算抑制百分比(PI)：

在同样条件下，用蓝舌病、鹿流行性出血热、、赤羽病、水泡性口炎、小反刍兽疫阳性血清进行c-ELISA。所有被检血清均作1∶10稀释，BTV1-24型阳性血清和当地被检阳性血清的抑制百分比均在64％～97％之间，其它血清的抑制百分比在-37％～43％之间。BTV1-24型阳性血清之间的抑制百分比差别不大，其中BTV11型、BTV10型、BTV17型阳性血清的抑制百分比最大(95％～97％)，而BTV1型、BTV22型、BTV7型、BTV19型阳性血清的抑制百分比最小(64％～76％)。

17、用单抗建立双抗体夹心ELISA方法检测抗原操作步骤

用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化后的单抗(1F5)稀释至0.01mg/mL，包被ELISA板，50μL/孔，4℃过夜，用洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS pH7.2，PBST)洗3次。加入30mg/mLBSA溶液，200μL/孔，37℃封闭1h。用PBST洗3次，加入待检样品50μL/孔，同时用BHK细胞培养物作为阴性对照，37℃反应30min，加入1∶500稀释兔抗BTV IgG，50μL/孔，37℃反应30min，用PBST洗3次，加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，37℃反应30min，用PBST洗3次，最后加入底物溶液(TMB+H₂O₂)，50μL/孔，室温反应10min，用0.2mol/LH₂SO₄溶液终止反应，检测OD_450NM值。

ELISA结果判定标准的确定：用建立的ELISA检测30份BTV阴性样品，测定OD₄₅₀值，计算平均值(X)和标准差(SD)，以OD₄₅₀值X+2SD作为阳性和阴性的分界线。用ELISA检测30份BTV阴性样品，测定OD₄₅₀值，平均值为0.143，标准差为0.036，根据公式X+2SD计算，阳性和阴性结果判定的临界值为0.215。

ELISA方法的特异性：用建立的ELISA分别检测BTV(血清1、3、5、8、10、11、12、17、22型)标准阳性样品各20份和其它病毒阳性样品及阴性样品各10份，评价ELISA的特异性。

ELISA特异性试验结果：用ELISA分别检测BTV(血清1、3、5、8、10、11、12、17、22型)标准阳性样品各20份，结果全为阳性。用ELISA方法检测EHDV、VSV、PPRV、AKV阳性样品各10份及阴性样品10份，结果全为阴性，表明该ELISA具有良好的特异性。详细结果见表3。

表3特异性试验结果

重复性试验结果：从同一批制备的ELISA试剂盒中随机取4个分别对10份样品进行检测，结果批内变异系数在3.76％～9.41％之间，表明ELISA批内重复性很好。用3批ELISA试剂盒同时检测10份样品，结果批间变异系数在4.23％～9.61％之间，表明ELISA批间重复性很好。

18、两种ELISA方法的临床样品检测与应用

18.1应用BTV VP7蛋白特异性单克隆抗体建立的c-ELISA方法，对采自全国各地区动物共计1377份血清样品进行检测，结果c-ELISA阳性的血清样品282份。与琼脂免疫扩散试验(AGID)检测和用美国(BLUETOUGUE ANTIBODY TEST KIT，cELISA)和澳大利亚(Trop-Bio cELISA KIT)的诊断试剂盒检测结果完全一致。

18.2应用BTV VP7蛋白特异性单克隆抗体建立的双抗体夹心法ELISA，对采自全国各地区259份临床样品进行检测，用RT-PCR进行比对检测，其中ELISA检测26份阳性样品，233份为阴性；RT-PCR检测28份为阳性，231份为阴性。24份两种方法检测均为阳性，229份两种方法检测均为阴性。计算得出ELISA的特异性和敏感性分别为99.1％(229/231)和85.7％(24/28)；两种方法检测结果的符合率为97.7％(253/259)。详细结果见表4。

表4临床样品检测结果

上述具体实施例的实验数据表明，本发明的一种抗蓝舌病病毒VP7蛋白的特异性单克隆抗体制备方法制备的单克隆抗体，不仅特异性强，敏感性高，亲和力好，效价高，而且稳定，特别适合用于建立蓝舌病c-ELISA抗体检测和双抗体夹心ELISA抗原检测方法，以用于蓝舌病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。

Claims (4)

1、一种蓝舌病病毒单克隆抗体，其特征在于是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，分别用纯化的BTV抗原、基因工程表达的BTV VP7蛋白抗原和正常仓鼠肾传代细胞(BHK21)对照抗原包被的间接ELISA进行筛选，经有限稀释法筛选克隆，获得能稳定传代并分泌抗特异性BTV VP7蛋白的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株，并制备BTV VP7蛋白的McAb小鼠腹水，制备而成的抗BTV VP7蛋白的单克隆抗体。

2、如权利要求1所述的蓝舌病病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

一、蓝舌病病毒的纯化；BTV接种BHK-21细胞，出现细胞病变后收获病毒，反复冻融3次，二次离心将细胞碎片和病毒液分开，采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度超速离心3h，以纯化BTV病毒；

二、用提纯的蓝舌病病毒免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，纯化的BTV病毒注射剂量分别100μg、100μg和200μg；

三、取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗BTV VP7蛋白的阳性孔；

四、用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗BTV VP7蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

五、杂交瘤细胞注射入BALB/c鼠腹腔制备单抗腹水，取12周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入5～10×10⁵个杂交瘤细胞；

六、用间接ELISA所述的方法鉴定制备单克隆抗体仅与BTV病毒的VP7蛋白有特异性免疫反应，而与其它相关病毒没有任何免疫反应。

3、权利要求1所述的蓝舌病病毒单克隆抗体在制备可特异性检测蓝舌病抗体的竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)中的应用。

4、权利要求1所述的蓝舌病病毒单克隆抗体在检测蓝舌病抗原的双抗体夹心ELISA中的应用。